プラスミドDNAのDpnⅠ処理による形質転換効率の影響東洋紡績（株）敦賀バイオ研究所小松原秀介はじめに形質転換効率（コロニー／μgDNA） 1.0×109 制限酵素 Dpn Ⅰは5‘-GATC-3’配列を認識し、アデニンが N6メチル化されている場合に切断します。一般的に使用されている大腸菌宿主から抽出したプラスミドDNAは、内在性のdamメチラーゼによりこの配列のアデニンがメチル化されており、Dpn Ⅰで切断されます。一方PCR等で合成されたDNAはメチル化されていないため、切断されません。今回はプラスミドDNAをDpnⅠで処理した場合の大腸菌の形質転換効率、更に各種PCR buffer中でのDpnⅠの酵素活性につ 1.0×108 1.0×107 1.0×106 1.0×105 0 いてご紹介いたします。 10 20 30 40 Dpn Ⅰ量（units）図2．DpnⅠ処理したpUC18（dam-）の形質転換効率方法 2．各種PCR buffer中でのDpnⅠ活性 DH5α（dam＋）およびJM110（dam-）から抽出したpUC18 各種PCR buffer中におけるDpnⅠ活性をDpnⅠに添付してい DNA（pUC18（dam+）、pUC18（dam-））1μgを50μl反るTA bufferと比較した結果を表1に示します。KOD#2,KOD 応系で37℃、1時間DpnⅠで処理し、常法に従い形質転換効率を Dash ® buffer以外測定しました。では80％以上の活 buffer 相対活性（%） TA 100 KOD#1（1mM Mg++） 80∼100 KOD#2（1mM Mg++） 30∼50 KOD -Plus-（1mM Mg++） 80∼100 KOD Dash® 60∼80 rTaq 80∼100 Blend TaqTM 80∼100 性を示しました。結果及び考察 1．DpnⅠ処理と形質転換効率図1にpUC18（dam+）DNAをDpnⅠで処理したときの形質転換効率を示します。形質転換効率は1units、1時間処理で 1/500、20units、1時間処理で1/10000に低下していました。一方pUC18（dam-）をDpnⅠで処理したときに形質転換表1．PCR buffer中でのDpnⅠ活性効率の低下は認められませんでした（図2）。 3．各種PCR buffer中でのDpnⅠ過剰処理による形質転換効率の影響 pUC18（dam-）を40units、4時間反応させた場合の形質転換効率は未処理に比べてKOD#2 bufferで約10％に低下していました。その他のbufferでは70％以上の効率を示しました（図3）。 1.0E＋0.8 1.4E＋08 1.0E＋0.7 形質転換効率（コロニー／μg）形質転換効率（コロニー／μgDNA） 1.0E＋0.9 1.0E＋0.6 1.0E＋0.5 1.0E＋0.4 0 10 20 30 40 Dpn Ⅰ量（units） 1.2E＋08 1.0E＋08 8.0E＋07 6.0E＋07 4.0E＋07 2.0E＋07 0.0E＋00 図1．DpnⅠ処理したpUC18（dam+）の形質転換効率未処理 TA KO D# 1 KO ® 2 sD# -Plu Dash D D O K KO TM q aq rTa dT n Ble 図3．各種PCR buffer中でのDpnⅠ過剰処理による形質転換効率の影響以上のことから、プラスミドDNAを鋳型としたPCR等の後処理でDpnⅠ処理を行う場合は、50μlの反応系で20∼40units、1時間程度行うことが良いと思われます。品名及び内容 Dpn Ⅰ 78 vol. 包装保存温度 Code No. 価格 1000U×1本 -20℃ DPN-101 ¥11,000 19