（SEC）による分析法開発 - Waters

モノクローナル抗体とその凝集体のサイズ排除クロマトグラフィー
（SEC）による分析法開発
Paula Hong and Kenneth J. Fountain
Waters Corporation, 34 Maple St., Milford, MA, USA
アプリケーションの利点
モノクローナル抗体とその凝集体の
頑健性の高い分析
SEC 分析のハイスループット化
はじめに
バイオ医薬品などバイオテクノロジーを利用した医薬品を用いる療法では、導入当
初より、タンパク質の凝集体によって、安全性や効能が損なわれる可能性が懸念さ
れてきました 1。
信頼性の高い純度データ
このため医薬品製造過程では、
タンパク質の凝集体モニタリングが行われています。
簡便な SEC 分析法開発
モニタリングには様々な分析法が用いられてきましたが、最も多く用いられている
分析法は SEC2 です。
従来、SEC にはジオール基をもつシリカベースのカラムと HPLC が使用されてきまし
たが、拡散を最小限に抑えた UPLC と 2 µm 以下の粒子を充填したカラムの導入に
より、分離、分析スピード、感度のすべての向上が可能になっています 3。しかし、
SEC 分析においても、よりよい分離を得て、分析法の頑健性を高めるためには、様々
なパラメーターの調整が求められます。本アプリケーションでは、移動相組成、流速、
カラム長などのパラメーターについて SEC における影響を検討しました。分離の評
価は、較正曲線、分離度、凝集体の量に基づいて行いました。
ウォーターズのソリューション
ACQUITY UPLC® H-Class Bio システム
ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7 µm カラム
Auto・Blend Plus™ テクノロジー
Empower™ 3 ソフトウェア
キーワード
サイズ排除クロマトグラフィー、UPLC、モノクロー
ナル抗体、分析法開発、凝集体
1
結果および考察
実験方法
SEC の分析法開発においても様々な要因を評価する必要があります。理想的には溶
サンプル調整 :
ウシサイログロブリン（5 mg/mL）、
ウシγ- グロブリン
（5 mg/mL）、トリオボアルブミン（5 mg/mL）、ウマ
ミオグロビン（2.5 mg/mL）、ビタミン B12（0.5 mg/
mL）を含むタンパク質標準品（バイオラッド社製）
は脱イオン水で溶解し試料としました。マウスモノ
クローナル抗体はプロテイン A アフィニティーで精
製し、0.1 M 重炭酸ナトリウム /0.5 M 塩化ナトリウム
液中のタンパク質の大きさによって SEC の分離が決まるため、生体分子のサイズ排
除クロマトグラフィーは水系の非変性条件下で行われます。しかしながら、他の分
離モードによる相互作用の存在が大きさのみに基づく分離を妨げることもあります 4。
具体的には、充填剤の電荷をもつ部分がタンパク質と相互作用し、イオン交換的な
効果をもたらすことが挙げられます。 SEC の移動相条件の評価は、このような充填
剤とタンパク質との相互作用の影響を見極めるためにも必要なのです。また、分離
条件がタンパク質の構造や状態を変化させてしまうことがあります。バッファー濃
pH8.2 で濃度 10 mg/mL の試料としました。実験条件
度や塩のイオン強度、pH はタンパク質の 3 次元構造やタンパク質間の相互作用に
間で試料のコントロールは行っていません。
影響を与えることもあります。このような理由から SEC の分析法を評価する際には、
生体分子の生物学的活性などの情報も考慮する必要があるのです。
このアプリケーションでは、SEC の分析法開発における考え方と検討すべきパラメー
分析条件
ターについて概要を述べます。 SEC 分析法開発は UPLC を用いた UP-SEC を例にとっ
LC 条件：
システム：
ACQUITY UPLC H-Class Bio TUV
システム（チタンセル使用）
検出波長：
カラム：
214 nm, 280 nm
ACQUITY UPLC BEH200 SEC
1.7 µLm、4.6x150 mm
（P/N 186005225）
カラム温度：
30℃
サンプル温度：
4℃
注入量：
2 µL
（その他の条件は文中に記載）
流速：
0.4 mL/min
（その他の条件は文中に記載）
移動相：
Auto・Blend Plus 機能により
調製
最終移動相組成：
25 mM リン酸ナトリウム pH
6.8/200 mM 塩化ナトリウム
てご紹介していますが、HPLC（HP-SEC）の場合も原理は同じです。分析法の評価は、
ピーク形状、分離、較正確度、定量について行いました。移動相のイオン強度や
pH の最適化は 4 種類の溶媒を自在に混合する 4 液混合送液システムとシステムの
利点を活かしたソフトウェアをあわせて利用することにより、効率的に行いました 5。
本アプリケーションに示すすべての実験でこの手法を利用しています。
移動相のイオン強度
移動相のイオン強度はカラム充填剤とタンパク質試料との二次的相互作用を最小化
するように調整する必要があります。較正曲線における移動相の塩濃度の影響を調
べるため、50 – 250 mM の塩化ナトリウム存在下で、タンパク質標準品の分析を実施
しました。塩化ナトリウムは SEC 分析で最もよく使用されていることから選択しまし
た。バッファー（リン酸ナトリウム）濃度および pH は 25 mM、pH6.8 で固定しました。
図 1 に示したように検討した塩濃度範囲では、各タンパク質の保持時間の変動は最
大 0.07 分であり、最も変動が大きかったのはオボアルブミンでした。この結果は、
較正曲線が塩濃度の影響をさほど受けていないことを示唆しています。
（その他の条件は文中に記載）
データ管理
ソフトウェア：
2
Empower3
モノクローナル抗体とその凝集体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による分析法開発
6.5
50 mM
Protein
MW
200 mM
Thyroglubulin
670000
250 mM
Gamma Globulin 158000
Log MW
5.5
4.5
Ovalbumin
44000
Myoglobin
17000
Vitamin B12
1350
3.5
2.5
1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
溶出容量 (mL)
図 1 SEC 較正曲線における塩化ナトリウムの影響
（注記：溶液中のタンパク質の形状の影響により、各ポイントは直線には乗りません。）
タンパク質標準品に加え、マウスモノクローナル抗体（mAb）についても、50-250 mM の範囲で塩化ナトリウム
濃度に関する評価を行いました（図 2）。ゲルろ過充填剤に一般的におこることですが、高イオン強度の移動相に
よりピークテーリングが改善し mAb モノマーピークのピーク幅が細くなっていく様子が見られます。塩化ナトリウム
濃度を 50 mM から 200 mM に高めることで、mAb のピーク高さは 0.189 AU から 0.289 AU に変化し、USP テーリング
ファクターも 1.64 から 1.22 に減少しました。一方、塩化ナトリウム 200 mM から 250 mM への変更では大きな変
化は見られませんでした（250 mM で USP テーリングファクター =1.20）。
0.3
50 mM
凝集体= 1.19%
USP分離度= 0.92
USP テーリング = 1.64
0.2
0.1
0.2
0.1
0.0
0.2
0.1
0.0
0.0
0.2
0.3
0.1
200 mM
凝集体= 5.27%
USP分離度= 1.57
USP テーリング = 1.22
AU
0.0
0.2
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0 min
0.1
0.0
0.3
250 mM
凝集体= 5.39%
USP分離度= 1.58
USP テーリング = 1.20
0.2
0.1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0 min
図 2 マウス mAb の SEC 分離における塩化ナトリウムの影響
モノクローナル抗体とその凝集体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による分析法開発
3
凝集体の量についても、バッファーのイオン強度の影響を調べました。先の実験と同様に塩化ナトリウム濃度を 50 mM から 250 mM に高めるに
従い、凝集体の回収率が改善し、凝集体の面積 % は 1.18% から 5.27% となりました（図 2 の挿入図）。しかし、塩化ナトリウム濃度 200 mM
以上では顕著な変化はありませんでした。このことから 2 次的相互作用は 200 mM 以上で最小となると考えられました。
保持時間の変動とピーク形状の変化は、SEC 充てん剤の基材として用いられる材料（シリカなど）で見られるのと同様に、タンパク質とカラム
充填剤との間に二次的相互作用があることを示唆します。保持時間の増大、ピーク形状の悪化をもたらすこのような相互作用は、バッファー
イオン強度を高めることで容易に最小化することができるのです。
移動相の pH
pH は二次的相互作用とタンパク質の構造の両方に影響を与えるため、SEC の分析法開発ではタンパク質の分離や定量に対する pH の影響を評
価する必要があります。 BEH200 カラムを用い、pH 6.0 から 7.6 の範囲でタンパク質標準品による評価を行いました。この分析では pH が較正
曲線に与える影響を評価する方法をとっており、リン酸ナトリウムバッファー濃度は 200 mM で固定し、pH 範囲はリン酸ナトリウムバッファーの
緩衝能を考慮して決定しました。この結果、各タンパク質について顕著な保持時間の変動はありませんでした。図 3 に示しましたように、
すべてのタンパク質で保持時間は 0.02 分の範囲内に収まり、今回の試験条件では較正曲線に pH が与える影響は小さいと考えられました。
6.5
pH 6.0, 200 mM
Protein
MW
pH 6.8, 200 mM
Thyroglubulin
670000
pH 7.6, 200 mM
Gamma Globulin 158000
Log MW
5.5
4.5
Ovalbumin
44000
Myoglobin
17000
Vitamin B12
1350
3.5
2.5
1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
溶出容量 (mL)
図 3 移動相の pH が与える SEC 較正曲線への影響
（注記：溶液中のタンパク質の影響により、各ポイントは直線には乗りません。）
代表的なバイオ医薬品に対して pH が与える影響を調べるため、同条件（ pH 6.0-7.6 、 200 mM 塩化ナトリウム）にて mAb の分析を行いま
した（図 4）。 pH を 6 から 7.6 に高めると、mAb のモノマーのピーク高さは減少し、保持時間は早まる傾向が見られました（図 4）。しかし、pH 6.0
から 7.6 の範囲で、凝集体の定量値の変化は 0.4% 以内であり（5.7% から 5.3% に変化）、移動相の pH は面積比率にはさほど大きな影響は与
えていないことが示唆されました。
4
モノクローナル抗体とその凝集体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による分析法開発
pH 6.0
USP分離度 = 1.3
凝集体 = 5.3%
0.24
0.22
0.20
pH 6.8
USP分離度 = 1.3
凝集体 = 5.7%
0.18
0.16
AU
0.14
0.12
pH 7.6
USP分離度 = 1.1
凝集体 = 5.3%
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8 min
図 4 移動相の pH がマウス mAb の SEC 分離に与える影響
移動相：25 mM リン酸ナトリウム /200 mM 塩化ナトリウム , pH 6.0-7.6
バッファーの pH は二次的相互作用にも影響しますが、今回の結果では、モノマーの溶出パターンは変化しまし
たがダイマーでは変化が見られませんでした。このことは二次的相互作用による変化よりも pH により立体構造
に変化があったことを示唆しています。
流速
分子サイズに基づく分離手法では、線速度も分離に影響を与えます。流速を下げることで分析時間は長くなり
ますが、分離は増大し、凝集体定量の信頼性も高まります。さらに、UP-SEC では 2 µm 以下の充填剤の起用に
より、カラム長を短くすることが可能です。このため、流速を下げた条件下においても従来の HP-SEC と比較し、
スループットを増大することができます。
分析法の信頼性、頑健性を調べるため、mAb の SEC 分離において流速の影響を評価しました。 0.2 mL/min、0.4 mL/min
の 2 条件の流速で、それぞれ 3 回ずつ mAb の分析を行いました（図 5）
。凝集体定量において流速による顕著な
差異は見られませんでした。しかし、流速を減少させることで、モノマーとダイマーの分離度を 15% 改善するこ
とができました。すなわち、より低い流速では分離を向上させることができ、より高い流速では分析時間を短縮
しスループットを向上させることができます。
モノクローナル抗体とその凝集体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による分析法開発
5
0.4 mL/min
0.030
凝集体 = 3.14%
USP分離度 = 2.0
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5 min
0.2 mL/min
凝集体 = 3.16 %
USP分離度 = 2.3
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5 min
図 5 マウス mAb の SEC 分析における流速の効果
カラム長
SEC の分離はカラムを長くすることでも向上します。SEC の分離は、カラム充填剤の細孔内外の拡散に基づいています。大きなタンパク質は
細孔に入り込めないため速く溶出します。小さいタンパク質ほど細孔内により長く滞留するので、保持時間がより長くなります。この原理に
よって、より長いカラムではより高い分離度が得られます。
このような効果を実証するため、タンパク質標準品を 4.6 x 150 mm カラムと 4.6 x 300 mm カラムとで分析しました。較正曲線を比較しますと、
150 mm カラムに比べ 300 mm カラムでは、傾きがゆるやかになることがわかります。このことは、より長いカラムで分析することでより高い
分離が得られることを示しています（図 6）。
6.5
150 mm
Protein
MW
300 mm
Thyroglubulin
670000
Gamma Globulin 158000
Log Mw
5.5
4.5
Ovalbumin
44000
Myoglobin
17000
Vitamin B12
1350
3.5
2.5
1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
溶出容量(mL)
図 6 SEC 較正曲線におけるカラム長の効果
（注記：溶液中のタンパク質の影響により、各ポイントは直線には乗りません。）
6
モノクローナル抗体とその凝集体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による分析法開発
カラム長の影響をマウス mAb でも、4.6 x 150 mm カラムと 4.6 x 300 mm カラムとで確認しました。タンパク質標
準品と同条件において、4.6 x 300 mm カラムで凝集体の定量値は同等ながらモノマーとダイマーの分離の改善が
見られました（分離度 2.07 から 2.80 に改善）（図 7）。 300 mm カラムでの分離の向上はモノマーピークにも表
れており、低分子側に 150 mm カラムでは検出されていない小さなピークが未分離ながら検出されています。
分離の向上に伴い、保持時間も増大しますが、モノマーピークは 6.0 分（150mm カラムでは 3.0 分）に溶出し
ています。
0.040
150 mm
0.030
USP 分離度 = 2.07
凝集体 = 1.12%
0.020
0.010
0.000
1.0
1.5
2.0
3.0
2.5
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5 min
0.040
300 mm
0.030
0.020
0.010
USP 分離度 = 2.81
凝集体 = 1.22%
0.000
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0 min
図 7 マウス mAb の SEC 分析におけるカラム長の効果
以上の結果より、カラム長は分析法開発において便利なパラメーターであることがわかります。より高い分離
を求めるのか、より高いスループットを求めるのかという分析法の要求の度合によって、カラム長を選択すれば
よいのです。たとえば、製造環境下ではより長いカラムで分離を向上させ、探索、開発段階では短いカラムで
分析時間を短縮し、ハイスループットで分析するというような使い分けが考えられます。
モノクローナル抗体とその凝集体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による分析法開発
7
結論
参考文献
サイズ排除クロマトグラフィーは、今後もモノクローナル抗体とその
凝集体分析の標準的な分析法であり続けます。また一方では、いか
なる SEC 分析法においても、最適な分離を得るため様々な評価を行
う分析法開発が要求されます。しかし、HP-SEC での分析法開発は非
常に時間のかかる作業です。 UP-SEC の採用により、より高レベルの
分離と信頼性を保った上での分析法開発の最短化が実現します。加
えて、Auto・Blend Plus の自動溶媒調製技術の導入により、移動相が
タンパク質の構造や二次的相互作用に与える影響を、より簡便に、
より体系的に精査することが可能となります。
これまで述べてきましたように、分析法の最適化には、移動相の pH
1. Rosenberg, A.S., “Effects of Protein Aggregates: An Immunologic Perspective,”
AAPS Journal 8(3): article 59 [2006].
2. Philo, J.S., “Is Any Measurement Method Optimal for All Aggregate Sizes and
Types?” AAPS Journal, 8(3), article 65 [2006].
3. Fountain, K.J., Hong, P., Serpe, S., Bouvier, G.S.P., Morrison, D., “Analysis of
Biomolecules by Size-Exclusion UltraPerformance Liquid Chromatography,”
Waters Application Note [2010]; Part Number WA64266.
4. Golovchenko, N. P., Kataeva, I.A., Akimenko, V. K., “Analysis of pH- Dependent
Protein Interactions with Gel Filtration Medium,” J. of Chromatogr. 591: 121
[1992].
5. Hong, P., Fountain, K.J., Wheat, T.E., Morrison, D., “IEX Method Development
of a Monoclonal Antibody and Its Charge Variants,” Waters Application Note,
[2011]; Part Number 720003836EN.
やイオン強度、流速、カラム長といった様々な条件の評価が要求さ
れます。さらに、ここでは詳細は述べませんでしたが、注入量や負
荷量、温度も SEC 分離に影響を与えますので、以下の項目について
評価することを推奨します。
1. イオン強度
2. pH
3. カラム長
4. 流速
5. その他のパラメーター（負荷量、注入量、温度など）
これらの実験の実施にあたっては、タンパク質の生物学的活性に関
する情報についての考慮も必要です。もし、タンパク質の生物学
的活性に影響する要因が限られたものであれば、移動相としてまず
PBS を試すことを推奨します。
日本ウォーターズ株式会社 www.waters.co.jp
東京本社 ࠛ140-0001 東京都品川区北品川 1-3-12 第 5 小池ビル TEL 03-3471-7191 FAX 03-3471-7118
大阪支社 ࠛ532-0011 大阪市淀川区西中島 5-14-10 サムティ新大阪フロントビル 11FࠉTEL 06-6304-8888 FAX 06-6300-1734
ショールーム
東京大阪
テクニカルセンター東京大阪名古屋福岡札幌
Waters、ACQUITY UPLC および UPLC は Waters Corporation の登録商標です。 Auto・Blend Plus、Empower
および The Science of What’
s Possible は Waters Corporation の商標です。その他すべての登録商標は
それぞれの所有者に帰属します。
©2012 Waters Corporation. Printed in Japan. 2012 年 06 月 720004076JA PDF

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