1-2. ΔNp63 ノックダウンが OSCC 細胞の増殖、分化、遊走 - 九州大学

1-2. ΔNp63 ノックダウンが OSCC 細胞の増殖、分化、遊走およびアポトーシ
ス与える影響
次に、ΔNp63 ノックダウンによる OSCC 細胞の増殖、分化、遊走およびアポトー
シスへの影響について検討した。
HSC-2 細胞への ΔNp63 siRNA を導入により、ΔNp63 の発現は著明に抑制された
（図 3）。ΔNp63 siRNA 導入 48 時間後の細胞形態を観察したところ、多角形であっ
た HSC-2 の形態は ΔNp63 ノックダウンにより紡錘形へと変化した（図 4）。WST-1
assay において、ΔNp63 siRNA 導入群は対照群と比べ細胞増殖が有意に抑制されて
いた（図 5 A; ANOVA, *p<0.05）。BrdU incorporation assay では、ΔNp63 siRNA 導入
群の BrdU 陽性細胞率は対照群と比較して有意に低下していた（図 5 B;
Mann-Whitney U-test, *p<0.05）。アポトーシスが誘導されていることを示す annexin
V 陽性細胞は、有意差は認められなかったものの、対照群と比較して ΔNp63 siRNA
導入群において多く認められた（図 6）。また、Bcl-2 の発現量を real-time PCR によ
り検索した結果、ΔNp63 ノックダウンにより Bcl-2 の発現量は有意に低下した（図
7; Mann-Whitney U-test, *p<0.05）。wound healing assay による遊走能の比較では、
ΔNp63 siRNA 導入群は間隙形成後 24 時間で間隙がほぼ消失したが、対照群では間
隙が残存し、ΔNp63 ノックダウンにより遊走能の亢進が認められた（図 8）。さら
に、real-time PCR において EMT 関連遺伝子の発現量を検索したところ、ΔNp63 ノ
ックダウンにより CK5 および CK14 の発現量は低下し、vimentin と N-cadherin の発
現量は増加したが（Mann-Whitney U-test, *p<0.05）、E-cadherin の発現量に変化は認
められなかった（図 9）。
- 29 -
RT-PCR
siCtrl
Western blotting
siRNA
siCtrl
ΔNp63
ΔNp63
GAPDH
β-actin
siRNA
図3 ΔNp63 siRNA導入によるΔNp63の発現
HSC-2細胞へのΔNp63 siRNA導入により、ΔNp63のmRNAおよびタンパク質の発現
はともに低下した。
siCtrl: scrambled siRNA導入HSC-2細胞 siRNA: ΔNp63 siRNA導入HSC-2細胞
siCtrl
siRNA
scale bar, 20 μm
図4 ΔNp63ノックダウンがOSCC細胞の形態に与える影響
ΔNp63ノックダウンにより、多角形であったHSC-2の細胞形態は紡錘形に変化した。
- 30 -
吸光度（A450 nm-A620 nm）
A
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
siCtrl
siRNA
*
0
24
48
72
96
時間（h）
B
PI
merge
siRNA
siCtrl
BrdU
BrdU陽性細胞率 (%)
scale bar, 50 μm
*
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
siCtrl
siRNA
図5 ΔNp63ノックダウンがOSCC細胞の増殖活性に与える影響（A; WST-1 assay, B; BrdU incorporation assay）
ΔNp63ノックダウンにより、ΔNp63 siRNA群は対照群に比べ細胞増殖が有意に抑制された。 WST-1におけるグラフは、独立した3回のデータの平均および標準偏差を示して
おり、2群間に統計学的有意差を認めた。BrdU incorporation assayにおけるグラフは、
無作為に選択した5視野のBrdU陽性細胞率の平均および標準偏差を示しており、2群
間に統計学的有意差を認めた（WST-1 assay; ANOVA *p<0.05, BrdU incorporation
assay; Mann-Whitney U-test *p<0.05）。
- 31 -
hoechst
PI
merge
siRNA siCtrl
annexin V
annexin V陽性細胞率 (%)
scale bar, 50 μm
20
15
10
5
N.S.
0
siCtrl
siRNA
図6 ΔNp63ノックダウンがOSCC細胞のアポトーシスに与える影響
annexin V陽性細胞率は、ΔNp63 siRNA導入群において有意な差を認めなかったもの
の高かった。
グラフは、無作為に選択した5視野におけるannexin V陽性細胞率の平均および標準
偏差を示している（Mann-Whitney U-test）（N.S.: not significant）。
Bcl-2
*
相対的発現量
4
3
2
1
0
siCtrl
siRNA
図7 ΔNp63ノックダウンがOSCC細胞のBcl-2発現に与える影響
ΔNp63ノックダウンにより、Bcl-2の発現量は有意に低下した。
グラフは、独立して行った3回のデータの平均および標準偏差を示しており、 2群間に統計学的有意差を認めた（Mann-Whitney U-test *p<0.05）。
- 32 -
siCtrl
siRNA
0h
24h
scale bar, 200 μm
図8 ΔNp63ノックダウンがOSCC細胞の遊走能に与える影響
ΔNp63 siRNA群の遊走能は対照群と比較して亢進していた。
- 33 -
ΔNp63
*
1.2
1
0.8
89.0%
0.6
0.4
相対的発現量
1.2
相対的発現量
E-cadherin
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0.2
0
0
siCtrl
siRNA
*
相対的発現量
相対的発現量
0.8
0.6
0.4
0.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
siCtrl
0
siRNA
*
siCtrl
siCtrl
siRNA
N-cadherin
*
20
相対的発現量
相対的発現量
vimentin
8
7
6
5
4
3
2
1
0
siRNA
*
1.2
1
0
siCtrl
CK14
CK5
1.2
N.S.
siRNA
15
10
5
0
siCtrl
siRNA
図9 ΔNp63ノックダウンがOSCC細胞におけるEMT関連遺伝子の発現に与える影響
ΔNp63ノックダウンにより、上皮系マーカーであるCK5およびCK14の発現量は有
意に低下したが、間葉系マーカーであるvimentinおよびN-cadherinの発現量は有意に
増加した。E-cadherinの発現量に変化は認められなかった。グラフは、独立して
行った3回のデータの平均および標準偏差を示しており、2群間に統計学的有意差を
認めた（Mann-Whitney U-test *p<0.05）（N.S.: not significant）。
- 34 -
1-3. ΔNp63 過剰発現が OSCC 細胞の増殖、分化、遊走およびアポトーシスに
与える影響
さらに、ΔNp63 過剰発現が OSCC 細胞の増殖、分化、遊走およびアポトーシスに
与える影響について検討した。
ΔNp63 の発現を認めなかった SQUU-B 細胞に ΔNp63 発現ベクターを導入し、
ΔNp63 過剰発現細胞株（SQUU-BO）を樹立した。陰性対照として empty ベクター
を導入した細胞株（SQUU-BC）を用いた。RT-PCR および Western blotting により、
SQUU-BO 細胞は ΔNp63 を発現していることが確認された（図 10）。ΔNp63 過剰発
現による細胞形態の違いを観察したところ、SQUU-BC 細胞は紡錘形を示していた
が、SQUU-BO 細胞では多角形の細胞を多く認め、敷石状の増殖を示した（図 11）
。
WST-1 assay では、播種後 120 時間までは両群間に差を認めなかったが、144 時間
後以降において、SQUU-BO 細胞は SQUU-BC 細胞と比較して有意に細胞増殖が亢
進していた（図 12 A; Student’s t-test, *p<0.05）。また BrdU incorporation assay におい
て、SQUU-BO 細胞は SQUU-BC 細胞と比較して BrdU 陽性細胞率が有意に高かっ
た（図 12 B; Mann-Whitney U-test, *p<0.05）。annexin V 陽性細胞率の比較では、
SQUU-BO 細胞は SQUU-BC 細胞と比較して陽性率が有意に低く、アポトーシスが
抑制されていた（図 13; Mann-Whitney U-test, *p<0.05）。さらに、real-time PCR にて
Bcl-2 の発現量を比較したところ、SQUU-BO 細胞では SQUU-BC 細胞に比べ Bcl-2
の発現量が有意に高かった（図 14; Mann-Whitney U-test, *p<0.05）。wound healing
assay による遊走能の比較では、間隙形成 24 時間後において、SQUU-BO 細胞は
SQUU-BC 細胞と比較し間隙の幅が大きく、遊走能の低下が認められた（図 15）。
real-time PCR を用いて EMT 関連遺伝子の発現量を検索したところ、SQUU-BO 細胞
は SQUU-BC 細胞と比較して CK5 および CK14 の発現量が高く、vimentin と
N-cadherin の発現量は低かった（Mann-Whitney U-test, *p<0.05）。E-cadherin の発現
- 35 -
量に有意な差は認められなかった（図 16）。
- 36 -
RT-PCR
Western blotting
SQUU-BC SQUU-BO
SQUU-BC SQUU-BO
ΔNp63
ΔNp63
GAPDH
β-actin
図10 ΔNp63発現ベクター導入によるΔNp63の発現
ΔNp63発現ベクターを導入したSQUU-BOにおいてΔNp63の発現を認めた。
SQUU-BC: emptyベクター導入SQUU-B細胞 SQUU-BO: ΔNp63発現ベクター導入SQUU-B細胞
SQUU-BC
SQUU-BO
scale bar, 20 μm
図11 ΔNp63過剰発現がOSCC細胞の形態に与える影響
SQUU-BC細胞は紡錘形を示したが、SQUU-BO細胞は多角形を示し、敷石状に増
殖していた。
- 37 -
0.4
吸光度（A450 nm-A620 nm）
A
SQUU-BO
SQUU-BC
0.3
*
*
0.2
0.1
0
0
24
48
72
96
120
144
168
時間（h）
B
PI
merge
SQUU-BO
SQUU-BC
BrdU
BrdU陽性細胞率 (%)
scale bar, 50 μm
60
*
50
40
30
20
10
0
SQUU-BC SQUU-BO
図12 ΔNp63過剰発現がOSCC細胞の増殖活性に与える影響（A; WST-1 assay, B; BrdU incorporation assay）
WST-1 assayおよびBrdU incorporation assayにおいて、SQUU-BO群は対照群に比
べ、細胞増殖が有意に亢進していた。
WST-1におけるグラフは、独立した3回のデータの平均および標準偏差を示して
おり、2群間に統計学的有意差を認めた。BrdU incorporation assayにおけるグラフ
は、無作為に選択した5視野のBrdU陽性細胞率の平均および標準偏差を示してお
り、2群間に統計学的有意差を認めた（WST-1 assay; Student’s t-test *p<0.05, BrdU
incorporation assay; Mann-Whitney U-test *p<0.05）。
- 38 -
hoechst
PI
merge
SQUU-BO
SQUU-BC
annexin V
annexin V陽性細胞率 (%)
scale bar, 50 μm
12
*
10
8
6
4
2
0
SQUU-BC SQUU-BO
図13 ΔNp63過剰発現がOSCC細胞のアポトーシスに与える影響
ΔNp63を過剰発現したSQUU-BO細胞は、SQUU-BCと比較してannexin V陽性細胞数
が有意に低かった。
グラフは、無作為に選択した5視野におけるannexin V陽性細胞率の平均および標準
偏差を示しており、2群間に統計学的有意差を認めた（Mann-Whitney U-test *p<0.05）。
Bcl-2
相対的発現量
5
*
4
3
2
1
0
SQUU-BC SQUU-BO
図14 ΔNp63過剰発現がOSCC細胞のBcl-2発現に与える影響
ΔNp63を過剰発現したSQUU-BO細胞は、SQUU-BCと比較してBcl-2の発現量が
有意に高かった。
グラフは、独立して行った3回のデータの平均および標準偏差を示しており、 2群間に統計学的有意差を認めた（Mann-Whitney U-test *p<0.05）。
- 39 -
SQUU-BC
SQUU-BO
0h
24h
scale bar, 200 μm
図15 ΔNp63過剰発現がOSCC細胞の遊走能に与える影響
SQUU-BO細胞の遊走能は対照群と比較して低下していた。
- 40 -
相対的発現量
800
600
400
200
0
12
相対的発現量
E-cadherin
SQUU-BC SQUU-BO
CK5
*
10
8
6
4
2
0
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
N.S.
SQUU-BC SQUU-BO
8
相対的発現量
相対的発現量
1000
ΔNp63
*
6
4
2
0
SQUU-BC SQUU-BO
相対的発現量
相対的発現量
*
2
1.5
1
0.5
0
SQUU-BC SQUU-BO
N-cadherin
vimentin
2.5
CK14
*
SQUU-BC SQUU-BO
2
*
1.5
1
0.5
0
SQUU-BC SQUU-BO
図16 ΔNp63過剰発現がOSCC細胞におけるEMT関連遺伝子の発現に与える影響
上皮系マーカーであるCK5およびCK14の発現量は有意に高く、間葉系マーカー
であるvimentinおよびN-cadherinの発現量は有意に低下した。E-cadherinの発現量に
変化は認められなかった。グラフは、独立して行った3回のデータの平均および標
準偏差を示しており、2群間に統計学的有意差を認めた（Mann-Whitney U-test
*p<0.05）（N.S.: not significant）。
- 41 -
研究 2
OSCC 生検材料における ΔNp63、vimentin および E-cadherin の免疫組織化学的検
討
2-1. OSCC 生検材料における ΔNp63、vimentin および E-cadherin の発現様式
OSCC 生検材料を用いて ΔNp63、E-cadherin および vimentin の発現を免疫組織
化学的に二重染色を用いて検索した。OSCC の腫瘍中心部では、ΔNp63 および
E-cadherin はほぼ全ての癌細胞に発現を認めたが、vimentin の発現は認めなかっ
た（図 17 b, c）。一方、浸潤先端部では、ΔNp63 および E-cadherin の発現が減弱
している癌細胞を認め、これらは vimentin の発現が亢進していた（図 17 e, f）。
2-2. 浸潤先端部における vimentin の発現および ΔNp63 発現強度の減弱の有無
と臨床病理組織学的所見との関連
浸潤先端部の癌細胞の vimentin 陽性細胞率を算出し、臨床病理組織学的所見との
関連について検討した。vimentin 陰性群（<5%）に比べ、陽性群（≥5%）では、頸
部リンパ節転移と遠隔転移の発生頻度が有意に高かった。また、Stage 分類では
vimentin 陰性群に比べ陽性群では病期が進行した症例が多かった。さらに、浸潤先
端部の癌細胞における ΔNp63 発現強度の減弱の有無についても同様に検討を行っ
た。ΔNp63 発現強度の減弱を有する群では頸部リンパ節転移と遠隔転移の発生頻度
が有意に高かった（表 5）。その他の臨床病理組織学的所見には関連が認められなか
った。
疾患特異的累積 5 年生存率は、vimentin 陽性群で 69.8%、vimentin 陰性群では 88.6%
であり、vimentin 陽性群は陰性群と比較し有意に低かった。同様に浸潤先端部で
ΔNp63 発現強度の減弱を有する群の疾患特異的累積 5 年生存率は 67.6%、認めない
群は 87.7%であり、ΔNp63 の発現強度の減弱を有する群は認めない群と比較して有
- 42 -
意に低く予後不良であった（図 18; log-rank test *p<0.05）。
- 43 -
a
A
d
scale bar, 200 μm
HE
腫瘍中心部
浸潤先端部
d
a
B
HE
e
b
ΔNp63 / vimentin
f
c
scale bar, 50 μm
E-cadherin / vimentin
図17 OSCC生検材料におけるΔNp63、vimentinおよびE-cadherinの発現様式（A; 弱拡大像、B; 強拡大像、a-c; 腫瘍中心部、d-f; 浸潤先端部）
ΔNp63とvimentinの二重染色では、腫瘍中心部の癌細胞のほぼすべてにΔNp63の発現を認めたが、vimentinの発現は認めなかった（b）。一方、浸潤先端部の癌細胞ではΔNp63の発現強度の減弱を認め、これらの細胞ではvimentinの発現が亢進していた（e）。 E-cadherinとvimentinの二重染色では、ΔNp63と同様に浸潤先端部の癌細胞でE-cadherinの発現強度の減弱を認め、vimentinの発現が亢進していた
（f）。
bとeの青色はΔNp63、茶色はvimentinを示し、cとfの青色はE-cadherin、茶色はvimentinを示す。
- 44 -
表 5 OSCC 浸潤先端部における vimentin の発現および ΔNp63 発現強度の
減弱の有無と臨床病理組織学的所見との関連
vimentin の発現
陽性
陰性
p-value
性別
男性
女性
原発部位
舌
歯肉
口底
頬粘膜
臨床発育様式
表在型
外向型
内向型
T 分類
T1
T2
T3
T4
臨床病期分類
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
分化度（Grade 分類）
Grade 1
Grade 2
Grade 3
浸潤様式（ YK 分類）
Grade 1
Grade 2
Grade 3
Grade 4C
Grade 4D
局所再発
無
有
頸部リンパ節転移
無
有
遠隔転移
無
有
(%)
54 (69.2)
24 (30.8)
32
11
22
13
42 (53.9)
24 (30.8)
9 (11.5)
3 (3.8)
18
14
8
3
24
10
1
0
8 (10.2)
13 (16.7)
57 (73.1)
2
6
35
6
7
22
16
34
8
20
(20.5)
(43.6)
(10.3)
(25.6)
4
19
7
13
12
15
1
7
15
27
12
24
(19.2)
(34.6)
(15.4)
(30.8)
3
14
9
17
12
13
3
7
59 (75.6)
14 (18.0)
5 (6.4)
28
11
4
31
3
1
2 (2.6)
16 (20.5)
41 (52.6)
15 (19.2)
4 (5.1)
1
6
19
13
4
67 (85.9)
11 (14.1)
ΔNp63 発現強度の減弱
有
無
p-value
N.S.
23
14
31
10
N.S.
N.S.
20
11
4
2
22
13
5
1
N.S.
N.S.
5
5
27
3
8
30
N.S.
N.S.
10
15
4
8
6
19
4
12
N.S.
p<0.05
9
12
5
11
6
15
7
13
N.S.
N.S.
31
3
3
28
11
2
N.S.
1
10
22
2
0
N.S.
2
2
20
10
3
0
14
21
5
1
N.S.
38
5
29
6
N.S.
31
6
36
5
N.S.
41 (52.6)
37 (47.4)
15
28
26
9
p<0.01
11
26
30
11
p<0.01
70 (89.7)
8 (10.3)
35
8
35
0
p<0.01
30
7
40
1
p<0.05
症例数
OSCC 患者において、vimentin 陰性群に比べ陽性群は頸部リンパ節転移および遠隔
転移の発生頻度が有意に高かった。ΔNp63 発現強度の減弱を有する群においても同様
にこれらの発現頻度が有意に高かった。なお、統計処理には𝑥2 test または Fisher’s exact
test を用いた（N.S.: not significant）
。
- 45 -
A
vimentin 陰性群（n=35）
vimentin 陽性群（n=43）
B
浸潤先端部における
ΔNp63 発現強度の減弱
無（n=41）
有（n=37）
図 18 疾患特異的累積 5 年生存率（A; vimentin 陽性群と陰性群の比較、
B; ΔNp63 発現強度の減弱の有無による比較）
浸潤先端部における vimentin 陽性群は、陰性群と比較し生存率が有意に低か
った。同様に、ΔNp63 発現強度の減弱を有する群は、減弱がない群と比較し生
存率が有意に低く、予後不良であった（log-rank test *p<0.05）。
- 46 -
考
察
近年、癌の浸潤・転移において器官形成に必須の現象である EMT が関与してい
ることが明らかになってきた（21, 22, 33）。EMT が誘導された細胞は線維芽細胞
様の形態変化、上皮系マーカーの発現量減少、間葉系マーカーの発現量増加、遊
走能の亢進、増殖能の低下および細胞間接着の減弱などの表現型を示し、このよ
うな細胞特性が癌の浸潤・転移に寄与していることが示唆されている（24, 25, 60）
。
癌抑制遺伝子 p53 のホモログである ΔNp63 は癌の増殖や分化に関与していること
が報告されているが、EMT に関連している可能性も示されている（61）。しかし
ながら、その詳細については不明な点が多い。本研究では ΔNp63 に着目し、EMT
と癌の浸潤・転移との関連について検討を行った。
Hay（1995）により初めて提唱された EMT という概念は、多くの研究者により
実証され、様々な EMT の形質が報告されてきた（26, 27, 29, 30）。そのため、近年
では、EMT の定義についても議論がなされており、2008 年の Cold Spring Harbor
で開催された EMT のコンセンサス会議の後、Zeisberg（2009）らは以下の特徴を
EMT を獲得した細胞の形質として定義した（62）。
・vimentin の発現
・E-cadherin が消失し N-cadherin が発現する cadherin スイッチ
・Snail や Slug などの転写因子の発現
・cytokeratin などの上皮系マーカーの発現消失
・紡錘形の細胞形態
・遊走能の亢進
・アポトーシスへの抵抗
本研究で用いた SQUU-B 細胞や ΔNp63 をノックダウンした HSC-2 細胞は、上
- 47 -
記の形質の多くを有しており、
EMT が誘導されている可能性が示された。しかし、
上記の定義に合致しない事象が 2 点認められた。まず第 1 点は、SQUU-B 細胞に
おいて E-cadherin の発現を認め、ΔNp63 をノックダウンした HSC-2 細胞において
も E-cadherin の発現量に変化を認めなかったこと、すなわち E-cadherin の消失が
認められなかった点である。E-cadherin は、上皮細胞に特異的に発現している細胞
間接着因子であり、その消失は代表的な EMT の形質と考えられている（26, 63, 64）
。
E-cadherin は、増殖抑制因子である形質転換増殖因子 β（transforming growth factor β:
TGFβ）との関連が最も良く知られており、TGFβ が発現すると下流の転写因子で
ある Snail および Slug の発現が誘導され、その結果 E-cadherin の発現が低下するこ
とが判っている（65-69）。また、TGFβ により誘導された Snail や Slug は ΔNp63
の発現も抑制すると考えられており、実験的に Snail などの転写因子を癌細胞に過
剰発現させると、E-cadherin や ΔNp63 は消失し、EMT が誘導されることが示され
ている（70-72）。しかしながら、今回の研究において E-cadherin の発現消失が認め
られなかったことは、E-cadherin が ΔNp63 とは異なる因子により制御されている
か、ΔNp63 の上流で制御されている可能性が示された。また、E-cadherin の発現が
消失しなかったことを別の観点から考えると、SQUU-B 細胞が均一な集団ではな
く、様々な EMT の段階を獲得した細胞が混在した不均一な細胞集団であることが
推察される。これは、免疫細胞化学的染色において、vimentin の発現が亢進してい
る細胞の一部で E-cadherin の発現が減弱している細胞を認めたことから裏付けら
れる。Grunert（2003）らは、癌細胞における EMT の形質は段階的に獲得されると
し、一部の形質のみを示す場合を“部分的な EMT の獲得”と述べている（73）。ま
た、Klymkowsky（2009）らは、癌細胞における EMT の獲得はその種類や固有の
微小環境の違いにより獲得する形質が異なるとし、癌における EMT 獲得細胞を
“EMT-like phenotype”と称している（74）。これらの報告からも、SQUU-B 細胞や
- 48 -
ΔNp63 をノックダウンした HSC-2 細胞で E-cadherin の発現が認められたことは、
完全な（complete）EMT の獲得ではなく、部分的な（partial）EMT の獲得であっ
た可能性が示された（図 19）。
第 2 点は、ΔNp63 ノックダウンによりアポトーシスが亢進した点である。ΔNp63
は TAp63 や p53 に対し、ドミナントネガティブに作用し、TAp63 や p53 の標的遺
伝子の発現を抑制することで抗アポトーシスに働く（40-47, 75）。ゆえに、本研究
で得られた結果のように、ΔNp63 ノックダウンによりアポトーシスが誘導された
細胞が増加することは想像に難くない。しかしながら、前述したとおり、complete
EMT の形質を獲得した細胞ではアポトーシスに抵抗性を示すとされている（76）。
これらの相反する結果は、complete EMT におけるアポトーシス抵抗性が、ΔNp63
とは異なる因子により制御されている可能性を示している。
ΔNp63 の発現低下が EMT を獲得した細胞に与える他の影響として、細胞増殖活
性の低下がある。Vega（2004）らは Snail の発現がサイクリン依存性キナーゼ
（cyclin-dependent kinase: CDK）インヒビターである p21cip1 を誘導し、細胞周期の
G1 から S 期への移行が阻害され、細胞増殖が低下するとしている（60）。ΔNp63
に関しても、その発現低下が p21cip1、p27kip1、および p57kip2 の発現を亢進し細胞増
殖が低下するとされている（77-79）。今回の研究においても、ΔNp63 ノックダウ
ンにより細胞増殖の抑制が認められたことから、細胞増殖活性の低下は、EMT 獲
得細胞の形質の 1 つである可能性が示されたと同時に、ΔNp63 が OSCC 細胞の増
殖に関与していることも示唆された。
ΔNp63 の発現低下が EMT を獲得した細胞に与える影響として、cytokeratin の発
現低下も認められた。Yang（1999）らは、p63 ノックアウトマウスで表皮形成異
常が生じたことから、上皮の分化に ΔNp63 が重要であることを示した（80）。Koster
（2004）らも ΔNp63 が基底層に発現し、有棘層や顆粒層に分化した際に発現が消
- 49 -
失することを示している（81）。また、ΔNp63 は CK5 の 5’末端に位置し、エンハ
ンサーとして機能する DNase I Hypersensitive site や CK14 のプロモーターおよびエ
ンハンサー領域に結合することによって、これらの発現を誘導していることが示
されている（82-84）。本研究においても、ΔNp63 の発現と CK5 あるいは CK14 の
発現の間に相関性が認められた。ことから、ΔNp63 は CK5 や CK14 の発現を直接
的に制御することで、重層扁平上皮細胞としての形質維持に役割を担っていると
考えられた。
研究 1 での in vitro の結果をもとに、研究 2 では in vivo において EMT が誘導さ
れた癌細胞を同定することが可能かどうかについて免疫組織化学的に検索を行っ
た。その結果、OSCC の浸潤先端部において、vimentin 発現亢進と ΔNp63 および
E-cadherin の発現が減弱した癌細胞を認め、これらは partial EMT を獲得している
と考えられた。しかし、in vivo において完全に間葉系細胞に形質転換した癌細胞
は病理組織学的に特定が難しく、その特異的な分子マーカーもないことから、
complete EMT を獲得した細胞の存在を今回の研究では確認出来なかった。臨床病
理組織学的所見との関連についての検討では、浸潤先端部において partial EMT を
生じた細胞の存在が転移ならびに予後と強く関連していることが示された。また、
本研究で使用した OSCC 細胞株のうち Morifuji（2000）らが樹立した SQUU-B 細
胞は、ヌードマウスの舌へ SQUU-B 細胞を同所性移植した結果、86.7%の頸部リン
パ節転移を認め、他の細胞株と比較し極めて高い転移能を有することが分かって
いる（54-57）。これらの結果を考慮すると、ΔNp63 発現減弱および消失が EMT を
誘導し、OSCC の転移に関与していることが明らかとなった。
近年、Mani（2008）らは不死化した乳腺上皮細胞に EMT を誘導した結果、これ
らの細胞が幹細胞のマーカーである CD44high/CD24low の発現様式を示し、in vitro に
おいて幹細胞の特徴である mammosphere を形成したことを報告している（85）。
- 50 -
また、Santisteban（2009）らは、乳癌細胞に EMT を誘導させた細胞は
CD44high/CD24low/-を示すことを報告している（86）。これらの結果は、EMT が誘導
された細胞と組織幹細胞が極めて類似した細胞形質を持つことを意味し、さらに
は癌細胞において極めて少数存在すると言われている癌幹細胞とも関連している
ことを示唆している。現在、様々な癌で癌幹細胞が同定されつつあるが、OSCC
においてはその存在が示唆されているものの、同定には至っていない（87-93）。今
後は、OSCC の浸潤・転移の分子機構における ΔNp63 を介した EMT の関与につ
いてさらに解明を進めるとともに、OSCC における癌幹細胞の同定についても検
索を行う予定である。
- 51 -
@ABC!
"Np63(!
)/012343(!
)*+56(!
),7123438!
)*+9:;8!
partial EMT!
?!
E-cadherin(!
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partial EMT!
complete EMT!
<=)>?!
図19 浸潤・転移におけるΔNp63を介したEMTの関与 !17 !Np63"#$%EMT&E-cadherin"#$%EMT!
'
- 52 -
謝
辞
稿を終えるにあたり、このような研究の機会を与えて頂きましたとともに終始御
懇篤なる御指導、御校閲を賜りました九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学
講座顎顔面腫瘍制御学分野中村誠司教授に深甚なる謝意を表します。さらに、直接
御指導、御校閲を頂きました九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学講座顎顔
面腫瘍制御学分野川野真太郎助教に謹んで感謝の意を表します。また、常に研究の
協力ならびに励ましの言葉を頂きました九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病
態学講座顎顔面腫瘍制御学分野の教室員の皆様に深く感謝いたします。最後に研究
を蔭ながら支えてくれた家族に感謝いたします。
- 53 -
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