平成 20 年 12 月 23 日東海大バイオフォトニクス千葉大院融合椎名９．医療光計測技術 ̶フローサイトメーター̶ ・コールター原理コールター原理は、W.H.Coulter が発明した電気抵抗を利用した粒子測定原理で、粒子が細孔を通過する際に生じる、2 電極間の電気抵抗の変化を測定する。この電気抵抗は、通過する粒子の体積に正確に比例している。細孔を通して流れるサンプル懸濁液の量は精密に制御されていて、粒子の正確な体積から粒径と濃度を極めて高精度で測定することができる。この技術に基づいた分析装置は、1953 年に製品化された。当初は、用途が見つからず、やがて細胞や血液の算定分析を自動化する医学部や検査室向けの用途が見つかり、爆発的に普及した。その後、改良が加えられ、電気パルスを解析して、ヒストグラムにすることにより、精密な粒度分布が測定できるようになった。コールター原理は、細孔電気抵抗法と呼ばれ、電解質溶液（電解質の溶けた水溶液または有機溶剤）中の小さな径の細孔（アパチャー）に一定の電流を流し、その系の電気抵抗を計測する。電解質溶液中に粒子を均一に懸濁させ、陰圧により細孔を粒子が細孔を通過するようにする。粒子が細孔を通過すると、粒子体積分の電解質溶液が置き換えられたことになる。この置き換えられた電解液の体積によって、細孔の電気抵抗（インピーダンス）が増加する。一定電流を供給することにより、インピーダンスの変化は、電圧パルスの変化によって計測できる。この電圧パルス高を 1 個ずつ計測処理して、粒子の体積分布ヒストグラムが得られる。 33 平成 20 年 12 月 23 日東海大バイオフォトニクス千葉大院融合椎名・フローサイトメトリー顕微鏡に代わる細胞係数の自動化のため、1948年に世界初の自動細胞計数装置 コールターカウンター（コールター原理）がWallace Coulterによって発明されて以来、細胞などの微小な粒状物質における情報を、フローを用いて容易に得ることが可能になった。1960年代の後半には、レーザーと層流を利用した装置として、フローサイトメーター（Flow Cytometer）が登場し、より多くの情報が得られるようになった。その後、コンピュータなどのエレクトロニクス技術の進歩とともに、より高機能で簡便な操作の製品が次々に誕生し、従来行われてきたアナログ処理をデジタル化した高精度な装置まで登場した。フローサイトメーターは細胞などの粒子1個ずつから、大きさと形態の情報、ならびに、 DNA／RNA 蛍光染色や、タンパクなどを蛍光抗体で染色した蛍光の情報を1秒間に数千個以上の速度で取得し、それらの相関を解析するヒストグラムとして作成し、さらに目的の2種類の細胞集団などを1秒間に5千個以上の速度で分取することが可能な装置で、生命工学や臨床検査などの分野において、重要な役割を果たす装置として、なくてはならないものとなっている。フローサイトメトリーは、サンプル中に存在する細胞や細菌などの特性を、光や蛍光色素などを利用して1個ずつ、迅速かつ高感度に測定する方法である。測定可能なサンプルは、1個づつの状態の細胞や粒子などの浮遊液であることが必要となる。この条件を満たしていれば、通常のシステムの場合、個々の大きさが 0.3—40µm位までの範囲であれば、様々なものが測定可能である。血球細胞（白血球、赤血球、血小板など）動物細胞（培養細胞、単離組織など）植物細胞微生物（細菌、原虫など）海洋生物（プランクトンなど）精子、酵母などラテックスビーズ（マルチプレックスによるサイトカイン定量解析など） 34 平成 20 年 12 月 23 日東海大バイオフォトニクス千葉大院融合椎名測定原理細胞がレーザーを横切る度に散乱光や蛍光が生じ、検出器から電圧パルスが発生する。通常のシステムには5個から11個の検出器がついており、この電圧パルスは検出器が受け取った光の強度に比例する。電圧パルスは、ピークパルス、面積パルス、パルス幅に分類される。検出された電圧パルスを処理し定量する方法は、パルスの高さ、幅、面積の3種類の方法がある。パルスの高さ（PeakまたはHeight）は、細胞がレーザー光を通過する間で、最も強く光を発した際の瞬間的な明るさに相当する。初期のフローサイトメーターは、この方法でしかパルスを処理できなかった。パルスの幅（Time of FlightまたはWidth）は、細胞がレーザー光を通過するのにかかった時間に相当するので、細胞の大きさ（長さ）を反映する。パルスの面積（IntegralまたはArea）は、細胞がレーザー光を通過する間に発した光の合計量に相当する。フローサイトメーターで測定可能なパラメータは、次のようなパラメータである。これらのパラメータは解析と分取の両方で使用可能である。各パラメータには、リニアスケールとログスケールのパラメータがある。前方散乱光（Forward Scatter、FS）＝細胞の大きさの目安側方散乱光（Side Scatter、SS）＝細胞内部の複雑さ蛍光（Fluorescence、FL）細胞容積（Cell Volume CV）高分解能型セルアナライザーのみ可能 RATIO（比率）＝2つのパラメータの比率例：蛍光1/蛍光2、蛍光/細胞容積 TIME（時間）＝測定時間（経時変化） 35 平成 20 年 12 月 23 日東海大バイオフォトニクス千葉大院融合椎名 Memo 36