熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title
関節軟骨変性の進行における小胞体ストレスの関与
Author(s)
高田興志
Citation
Issue date
2010-03-25
Type
Thesis or Dissertation
URL
http://hdl.handle.net/2298/21765
Right
学位論文
Doctoral Thesis
関節軟骨変性の進行における小胞体ストレスの関与
(The Involvement of Endoplasmic Reticulum Stress in the Progression of Articular Cartilage
Degeneration)
高田興志
Koji Takada
熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻運動骨格病態学
指導教員
水田
博志教授
熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻運動骨格病態学
２０１０年３月
学
位
論
文
Doctoral Thesis
論文題名：関節軟骨変性の進行における小胞体ストレスの関与
( The Involvement of Endoplasmic Reticulum Stress in the Progression of Articular Cartilage
Degeneration)
著者名：
（単名）
高田興志
Koji Takada
指導教員名：熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻運浮動骨格病態学
審査委員名
：
機能病理学担当教授
伊藤
隆明
分子生理学担当教授
富澤
一仁
代謝内科学担当教授
荒木
栄一
脳神経外科学担当教授
倉津
純一
２０１０年３月
水田
博志
教授
目次
1.
要旨
4
2.
発表論文
6
3.
謝辞
7
4.
略語一覧
8
5.
研究の背景と目的
5-1. 変形性関節症と関節軟骨変性
5-1-1. 変形性関節症
10
5-1-2. 関節軟骨の構造
10
5-1-3. 軟骨基質の恒常性
12
5-1-4. 軟骨変性の病態
12
5-2. 小胞体ストレス
5-2-1. 小胞体ストレスの定義
13
5-2-2. 小胞体ストレス応答とアポトーシス
14
5-3. 軟骨変性と小胞体ストレス
14
5-4. 本研究の目的
15
6.
実験方法
6-1. 試薬
16
6-2. 変性軟骨における小胞体ストレスの発生に関する検討
6-2-1. ヒト変性軟骨の採取
17
6-2-2. ラット変形性関節症モデルの作製と関節軟骨の採取
18
6-2-3. 組織標本の作製
19
6-2-4. Safranin-O 染色
19
1
6-2-5. 免疫組織化学染色
20
6-2-6. RNA の抽出と逆転写
21
6-2-7. RT-PCR と Pst1 制限酵素処理
22
6-2-8. Real-time PCR
23
6-3. 軟骨細胞アポトーシスと小胞体ストレスに関する検討
6-3-1. ヒト関節軟骨の組織標本の準備
23
6-3-2. ヒト軟骨細胞の単離・培養・刺激
23
6-3-3. 免疫組織化学染色
24
6-3-4. TUNEL 染色
25
6-3-5. 免疫組織化学染色と TUNEL 染色の二重染色
25
6-3-6. RNA の抽出と逆転写
25
6-3-7. RT-PCR と Pst1 制限酵素処理
26
6-3-8. Real-time PCR
26
6-3-9. ELISA
26
6-4. 軟骨代謝と小胞体ストレスに関する検討
6-4-1. ヒトの変性軟骨と培養軟骨細胞の cDNA の準備
27
6-4-2. ラット軟骨細胞の単離・培養・刺激
27
6-4-3. RNA の抽出と逆転写
27
6-4-4. Real-time PCR
27
6-5. 統計学的解析
7.
28
実験結果
7-1. 変性軟骨における小胞体ストレスの発生
7-1-1. 変形性関節症患者の軟骨変性度
2
29
7-1-2. ヒト変性軟骨の変性度と小胞体ストレス関連分子
30
7-1-3. ラット変形性関節症モデルの軟骨変性度
35
7-1-4. ラット変性軟骨の変性度と小胞体ストレス関連分子
36
7-2. 軟骨細胞アポトーシスと小胞体ストレス
7-2-1. ヒト変性軟骨の軟骨細胞アポトーシスと小胞体ストレス
37
7-2-2. ヒト培養軟骨細胞のアポトーシスと小胞体ストレス
40
7-3. 軟骨代謝と小胞体ストレス
7-3-1. ヒト変性軟骨における軟骨代謝と小胞体ストレス
41
7-3-2. ヒト及びラット培養軟骨細胞の軟骨代謝と小胞体ストレス
43
8.
考察
46
9.
結語
50
10. 参考文献
51
3
1. 要旨
[ 目的 ] 関節軟骨の変性は軟骨細胞アポトーシスと軟骨代謝の異常によって
進行する。小胞体ストレスは細胞にアポトーシスを誘導することで様々な疾患
に関与することが明らかにされているが、軟骨変性との関連性は詳細が不明で
ある。本研究では軟骨変性の進行、軟骨細胞アポトーシス及び軟骨代謝に対し
て小胞体ストレスがどのように関与するかを検討した。
[ 方法 ] 変形性膝関節症患者から採取した変性軟骨、またはラット変形性関節
症モデルの変性軟骨において、小胞体ストレス関連分子であるリン酸化 PERK
（ pPERK）、ユビキチン（ Ub）、GRP78、CHOP 及びリン酸化 JNK（ pJNK）の
発現、CHOP mRNA 発現及び XBP1 mRNA スプライシングをそれぞれ免疫染色、
real-time PCR 及び RT-PCR で解析し、 cleaved caspase-3 に対する免疫染色と
TUNEL 染色を行い、軟骨細胞アポトーシスを検出した。また、ヒト及びラッ
トの培養軟骨細胞を小胞体ストレス誘発剤である tunicamycin で刺激して細胞
アポトーシスを ELISA で評価し、 CHOP、アグリカン、 II 型コラーゲン及び
MMP-13 の mRNA 発現と XBP1 mRNA スプライシングをそれぞれ real-time PCR
と RT-PCR で解析した。
[ 結果 ] ヒト変性軟骨では変性度の増加と共に pPERK、 Ub、 CHOP、 pJNK の
陽性細胞率と CHOP mRNA 発現が増加した。XBP1 mRNA スプライシングは中
等度の変性軟骨で増加したが、重度の変性軟骨では中等度よりも低下した。ラ
ット変性軟骨においても変性の進行と共に pPERK、GRP78、CHOP 発現が増加
した。ヒト変性軟骨の軟骨細胞アポトーシスは pPERK や CHOP と同様に変性
度と相関して増加し、pPERK を発現する TUNEL 陽性の軟骨細胞が確認された。
ヒト、ラットともに培養軟骨細胞では tunicamycin の濃度依存的に CHOP mRNA
4
発現とアポトーシスが増加したが、高濃度の tunicamycin では XBP1 mRNA ス
プライシングは減弱した。また、 tunicamycin はアグリカンと II 型コラーゲン
の mRNA 発現を抑制し、 MMP-13 の mRNA 発現を増加した。
[ 考察 ] 小胞体ストレスは軟骨変性の進行と共に増加し、軟骨細胞アポトーシ
スと軟骨代謝の異常に関与することが示唆された。また、小胞体ストレスによ
る軟骨細胞のアポトーシス誘導には小胞体ストレス応答の保護的経路の低下
とアポトーシス経路の増大が関与することが推測された。
[ 結論 ] 小胞体ストレスは軟骨細胞アポトーシスを介して軟骨変性に関与す
る。
5
2. 発表論文
本論文は学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである
Koji Takada, Jun Hirose, Kei Senba, Soichiro Yamabe, Yuichi Oike, Tomomi
Gotoh, Hiroshi Mizuta
Enhanced apoptotic and reduced protective response in chondrocytes following
endoplasmic reticulum stress in osteoarthritic cartilage.
International Journal of Experimantal Pathology. In press
6
3. 謝辞
本研究は熊本大学大学院生命科学研究部・運動骨格病態学
水田博志教授の
ご指導の下において行いました。多面に渡りご指導を頂き、深く感謝いたしま
す。
熊本大学大学院生命科学研究部・分子遺伝学
尾池雄一教授には、研究方法な
ど多くの助言を頂きました。熊本大学教育学部養護教諭養成課程
後藤知己教
授には小胞体ストレスに関する基礎的な知識のご教授に加え、研究の進め方か
ら実験結果の解釈など熱心にご指導頂きました。熊本大学発生医学研究所・器
官構築部門
仙波圭博士には基本的な実験手技やプライマーの作製など様々
なご指導・ご協力を頂きました。熊本大学医学部付属病院・医療情報経営企画
部
廣瀬隼講師には基礎医学の研究方法を熱心にご指導頂きました。ここに深
く感謝いたしますとともに、お礼申し上げます。
ヒト軟骨組織のサンプル提供は本研究に賛同して頂いた患者様のご厚意に
よるもので、国立病院機構再春荘病院の米村憲輔先生、瀬形建喜先生、熊本機
能病院の中根惟武先生、高橋修一朗先生、清田克彦先生、高橋知幹先生、南熊
本病院の坂田浩章先生、大島卓先生、整形外科井上病院の甲斐功一先生、済生
会熊本病院の安楽喜久先生には本研究に快くご協力して頂きまして、深く感謝
いたします。
7
4. 略語一覧
本論文において、以下の略語を用いた。
ACAN
: aggrecan
Actb
: actin, beta
AEC
: 3-amino-3-ethylcarbazole
ATF6
: activating transcription factor 6
C-CASP3
: cleaved caspase 3
CHOP
: C/EBP homologous protein
COL2A1
: collagen, type II, alpha 1
DAB
: 3,3'-diaminobenzidine
DMEM
: Dulbecco's modified Eagle's medium
DNA
: deoxyribonucleic acid
EDTA
: ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA
: enzyme-linked immunosorbent assay
ERAD
: endoplasmic reticulum-associated degradation
FBS
: fetal bovine serum
GAPDH
: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas
GRP78
: glucose-regulated protein 78
HBSS
: Hank's balanced salt solution
IRE1
: inositol-requiring protein 1
JNK
: c-Jun NH2-terminal kinase
MMP-13
: matrix metalloproteinase 13
PBS
: phosphate-buffered saline
PERK
: PKR-like ER kinase
Real-time PCR
: real-time polymerase chain reaction
8
RNA
: ribonucleic acid
RT-PCR
: reverse transcription polymerase chain reaction
TUNEL
: terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated
dUTP-digoxigenin nick-end labeling
Ub
: ubiquitin
XBP1
: X-box binding protein 1
9
5. 研究の背景と目的
5-1. 変形性関節症と関節軟骨変性
5-1-1.
変形性関節症
変形性関節症は代表的な運動器疾患の一つであり、加齢、性別、肥満、遺
伝的素因などの全身的要因と関節の不安定性や関節外傷、関節への過度の力
学的ストレスなどの局所的要因を背景に発症する [1]。病理変化は関節構成
体の退行性変化を特徴とし、軟骨では初期に軟化が生じ、続いて表面の不整、
線維化や亀裂が認められ、進行すると軟骨基質が消失する。また、骨では骨
硬化と骨棘形成などの形態的変化が、滑膜には炎症性の変化が認められる。
主な臨床症状は関節痛、関節腫脹、運動機能の低下であり、対症療法として、
消炎鎮痛剤の内服、ヒアルロン酸やステロイドの関節内注射及び理学療法な
どの保存療法、あるいは骨切り術や人工関節置換術などの手術療法が行われ
ている [1]。根本的治療が確立されていないのは、変形性関節症の本質が軟
骨の変性であり、その進行機序が未だ十分解明されていないことに起因して
いる [2]。
5-1-2.
関節軟骨の構造
関節軟骨は関節運動における潤滑性と荷重緩衝のために不可欠の組織で
あり、そのために特質化した構造を有している。関節軟骨は血管、リンパ管、
神経を欠く硝子軟骨で、大部分は軟骨基質で構成され、存在する細胞は全容
積の 4%以下の軟骨細胞のみである。軟骨基質は湿重量の 70%を水分が占め
10
ており、水分以外の基質は乾燥重量で 50%のコラーゲン、30～ 35%のプロテ
オグリカン、15～ 20%の非コラーゲン性蛋白や糖蛋白質によって構成される
[3]。
関節軟骨の表面は膠原線維を欠き、糖蛋白で構成される輝板で覆われてい
る。関節軟骨は関節表面から、扁平化した軟骨細胞が関節面に平行に配列し
た浅層、円形の軟骨細胞がまばらに存在する中間層、軟骨細胞が柱状に配列
した深層、 tidemark の下層に位置する石灰化層の 4 層構造を呈する（図 1）
[4]。輝板から浅層はフィブロネクチンなどの糖蛋白によって関節表面の極
めて低い摩擦係数をもたらし、関節表面に平行なコラーゲン線維の配列が関
節面のせん断力を緩衝して潤滑な関節運動を可能にする。中間層は不規則な
コラーゲン線維網と豊富なプロテオグリカン、水分で構成され、この層の粘
弾性によって荷重エネルギーが緩衝される。深層と石灰化層では深層から垂
直に埋入するコラーゲン線維の石灰沈着によって関節軟骨を骨組織へ固定
している。
図 1. 関節軟骨の構造
関節軟骨は表面から表層、中間層、深層及び石灰化層の 4 層構造を呈する。
11
5-1-3.
軟骨基質の恒常性
軟骨細胞は軟骨代謝を司っており、軟骨基質の修復（同化作用）と分解（異
化作用）が繰り返されることによって軟骨基質は維持されている [3, 5]。軟
骨細胞は通常、代謝活性が低い状態にあるが [3]、力学的ストレスや炎症な
どによって軟骨基質が損傷すると、軟骨内に貯蔵されている transforming
growth factor, beta （ TGF-β）や insulin-like growth factor 1（ IGF-1）などの成
長因子の作用を受けて、軟骨細胞は軟骨基質の産生を増加し、損傷した軟骨
基質を修復する。一方、過剰な力学的ストレス、 interleukin 1, beta（ IL-1β）
などの炎症性サイトカイン、活性酸素種、損傷した基質分子の断片などによ
って、蛋白分解酵素である matrix metalloproteinases（ MMPs）や A disintegrin
and metalloproteinase with thrombospondin motifs（ ADAMTSs）の軟骨細胞か
らの産生が増加し、軟骨基質が分解除去される [3, 5]。特に MMP-13 は軟骨
基質の分解に最も重要な酵素と考えられている [6]。このような同化と異化
作用の均衡が保たれることによって、軟骨細胞は軟骨基質の恒常性を維持し
ている。
5-1-4.
軟骨変性の病態
関節軟骨の変性は、軟骨細胞の同化と異化作用の均衡が崩れ、軟骨代謝に
異常が生じた結果、軟骨基質の分解が亢進することで進行すると考えられて
いる [3, 5]。また、軟骨変性の進行と共に軟骨細胞のアポトーシスは増加し [7,
8]、変形性関節症の動物モデルにおいて、アポトーシスの実行過程の中心的
酵素である caspase の抑制剤が軟骨細胞アポトーシスを減少させて軟骨変性
の進行を抑制することが報告されている [9]。つまり、軟骨細胞のアポトー
12
シスは軟骨変性の進行に深く関与しており、これは軟骨基質を維持する細胞
数を減少させることに起因している [10]。現在、軟骨細胞アポトーシスの原
因として、一酸化窒素、過剰な力学的ストレス、炎症性サイトカイン、活性
酸素種、軟骨細胞の肥大化などが推測されているが [11]、特に一酸化窒素は
軟骨細胞のアポトーシス誘導を制御する重要な分子であることが軟骨変性
の動物モデルで証明されている [12, 13]。
5-2. 小胞体ストレス
5-2-1.
小胞体ストレスの定義
小胞体は分泌蛋白質の成熟を担う細胞内小器官である。新たに生成される
蛋白質は mRNA のもつ塩基配列情報に則してアミノ酸を重合する翻訳を経
てポリペプチド鎖として合成される。この新生蛋白質は小胞体へ移送され、
78kD glucose-regulated protein（ GRP78）などの小胞体シャペロンの作用によ
って折り畳まれ、高次構造を形成する。また、高次構造が適切でない異常な
蛋白質は小胞体内から細胞質へ送り出され、ユビキチン（ Ub）・プロテア
ソーム系によって分解除去される（ endoplasmic reticulum-associated protein
degradation： ERAD）。しかし、この折り畳み機構や分解機構が破綻した場
合、小胞体の機能を超える量の蛋白質が小胞体に送り込まれる場合、あるい
は遺伝子変異などによって元来正常に折り畳まれない蛋白質が合成される
場合は、小胞体の折り畳み機構と分解機構のバランスが破綻し、結果として
小胞体内に高次構造の異常な蛋白質が蓄積する。この状態が小胞体ストレス
と定義されている [14]。
13
5-2-2.
小胞体ストレス応答とアポトーシス
細胞は小胞体ストレスを小胞体膜に存在する 3 つのストレスセンサー
（ protein kinase RNA-like ER kinase：PERK、inositol-requiring protein-1：IRE1α、
activating transcription factor-6： ATF6）で感知して、小胞体ストレス応答と
総称される応答を誘導する [14]。活性化した PERK は翻訳を抑制して小胞体
の負荷を軽減する。また、活性化した IRE1α は X-box binding protein 1 (XBP1)
mRNA をスプライスし、スプライスされた XBP1 mRNA がコードする XBP1
蛋白は転写因子となり、GRP78 などの分子シャペロンの発現を増加して小胞
体の処理能力を向上させる。また、 XBP1 蛋白は、 ERAD 関連蛋白の発現を
増加して異常蛋白の分解除去を促進する。これらの異常蛋白の小胞体内蓄積
を改善する保護的応答にもかかわらず、小胞体ストレスが回避されない場合
には、小胞体ストレス応答はアポトーシスを誘導し、細胞自身を除去する。
小胞体ストレス応答によるアポトーシス誘導は少なくとも３つの経路が知
られている [15]。第一は活性化した PERK などが C/EBP-homologous protein
（ CHOP）発現を増加する経路である。第二は活性化した IRE1α が tumor
necrosis factor（ TNF） receptor-associated factor 2（ TRAF2）をリクルートし
て、 mitogen-activated protein kinase（ MAPK）である c-Jun N-terminal kinase
（ JNK）を活性化する経路である。最後は caspase-12 活性化によるアポトー
シス誘導である。ただし、ヒトの caspase-12 は機能を欠失している [16]。
5-3. 軟骨変性と小胞体ストレス
14
近年、変形性関節症の変性軟骨では小胞体シャペロン GRP78 の発現が正
常軟骨よりも増加することが報告され、小胞体ストレスの軟骨変性への関与
が推測されている [17-19]。また、軟骨細胞アポトーシスの重要な制御分子で
ある一酸化窒素のアポトーシス誘導には小胞体ストレスが関与することが、
マクロファージや膵 β 細胞の解析で明らかなっている [20, 21]。さらに、培
養軟骨細胞を使用した in vitro の実験では、小胞体ストレスを誘導すること
でラット軟骨細胞にアポトーシスを誘導し、アグリカンと II 型コラーゲン
の mRNA 発現を抑制することや [22, 23]、ヒト軟骨細胞の MMP-13 の mRNA
発現を増加することも [24] 報告されている。しかし、これまで関節軟骨に
おいて GRP78 以外の小胞体ストレス関連分子の発現や、軟骨変性の進行と
小胞体ストレス応答の関連性は検討されていない。また、軟骨変性における
小胞体ストレスの軟骨細胞アポトーシスや軟骨代謝への関与についても不
明なままである。
5-4. 本研究の目的
本研究の目的は、複数の小胞体ストレス関連分子を評価し、様々な変性度
の関節軟骨における小胞体ストレスと小胞体ストレス応答を多面的に捉えて、
小胞体ストレスと軟骨変性との関連性を明らかにすることである。まず、生
体軟骨で軟骨変性の進行と小胞体ストレス関連分子の発現の変化を評価した。
さらに、生体軟骨と軟骨細胞培養系で小胞体ストレスの軟骨細胞アポトーシ
ス及び軟骨代謝への関与を検討した。
15
6. 実験方法
6-1. 試薬
免疫組織化学染色に使用した一次抗体の購入先、希釈濃度、参考文献を表 1
に示した。
表 1. 一次抗体
免疫動物
購入先
希釈濃度
参考文献
1/200
[25, 26]
1/500
[27]
1/300
[18]
1/200
[28]
1/200
[29]
1/500
[30-32]
Santa Cruz
pPERK
rabbit
Biotechnology Inc
(Santa Cruz, USA)
Ubiquitin
mouse
MBL (Nagoya, Japan）
Santa Cruz
GRP78
goat
Biotechnology Inc
(Santa Cruz, USA）
Santa Cruz
CHOP
rabbit
Biotechnology Inc
(Santa Cruz, USA）
Santa Cruz
pJNK
mouse
Biotechnology Inc
(Santa Cruz, USA）
C-CASP3
(cleaved
caspase-3)
Cell Signaling
rabbit
Technology Inc
(Bervely, USA）
また、免疫組織化学染色に使用した二次抗体は Histofine Simple Stain
MAX-PO (R)、 Histofine Simple Stain MAX-PO (M)、 Histofine Simple Stain
MAX-PO (G)、 Histofine Simple Stain AP (R)をニチレイバイオサイエンス
（ Tokyo, Japan）から購入した。
16
Real-time PCR に使用した TaqMan ® Gene Expression Assays（ Applied
Biosystems, Foster, USA）を表 2 に示した。
表 2. TaqMan ® Gene Expression Assays
ヒト
ラット
遺伝子
製品 ID
CHOP
Hs00358796
ACAN
Hs00202971
COL2A1
Hs00156568
MMP-13
Hs00233992
GAPDH
Hs99999905
Chop
Rn00492098
Grp78
Rn01435771
Acan
Rn00573424
Col2a1
Rn01637085
Mmp-13
Rn01448197
Actb
Rn00667869
培養実験に使用した Hank’s Balanced Salt Solutions（ HBSS）、コラゲナーゼ・
タイプ II、FBS、抗生剤（ペニシリン・ストレプトマイシン）は Invirogen（ Carlsbad,
Ca, USA）から購入し、ヒアルロニダーゼ、トリプシンは Sigma-Aldrich Japan
（ Tokyo, Japan）から、 DMEM/F-12 と DMEM は Nacalai（ Kyoto, Japan）から
購入した。また、tunicamycin を Calbiochem（ San Diego, USA）から購入した。
6-2. 変性軟骨における小胞体ストレスの発生に関する検討
6-2-1.
ヒト変性軟骨の採取
17
ヒト軟骨組織の採取・解析を熊本大学生命科学研究部・倫理委員会の承認
の下に施行した。対象症例は人工膝関節置換術を施行された変形性膝関節症
患者 11例（平均年齢 71.7±6.5歳、男性 3例、女性 8例）であった。各症例の脛
骨高原から表 3に示した肉眼的変性度（ ICRS grade） [33]の異なる 1~3個の骨
軟骨組織を術中に採取し、合計 20個の骨軟骨組織を得た。骨軟骨組織を 2分
割し、片方を組織標本作製に使用し、もう片方は直ちに液体窒素で凍結して
-80℃ で保管し、遺伝子解析に使用した。
表 3. ICRS grading system
Grade
6-2-2.
所見
I
表面の損傷や亀裂、軟化
II
磨耗、 50%未満の深さの損傷
III
50%以上の深さの損傷
IV
完全な軟骨の欠失
ラット変形性関節症モデルの作製と関節軟骨の採取
10 週齢、雄の Sprague-Dawley ラットを日本 SLC（ Hamamatsu, Japan）から
購入し、熊本大学動物実験指針を尊守して実験を施行した。前十字靭帯切離
と内側半月切除による変形性関節症モデルを作製した。手術方法は過去の
報告 [34]に従って以下のように施行した。ラットをペントバルビタール（ 30
～ 40mg/kg）の腹腔内投与で麻酔し、右膝前方で皮膚を切開し、膝蓋骨から
膝蓋靭帯の内縁を切開して関節内に達した。前十字靭帯を脛骨付着部で切離
し、内側半月板を関節包から剥離して切除し、洗浄して閉創した。術後 1、
2、3 週後にラットを頚椎脱臼で安楽死させ脛骨高原の関節軟骨を採取した。
18
また、対照として 10 週齢、雄の Sprague-Dawley ラットの脛骨高原から正常
関節軟骨を採取した。
6-2-3.
組織標本の作製
ヒトおよびラットの骨軟骨組織を 4℃ のリン酸緩衝生理食塩水（ PBS）で
洗浄し、 PBS に希釈した 4%パラフォルムアルデヒドで 4℃ 、 18 時間の固定
を行った。次に 70%から 100%のエタノール系列で一晩かけて脱脂した後に、
10%エチレンジアミン四酢酸（ EDTA）を含むリン酸緩衝液に組織を浸して、
4℃ で 2 週間かけて脱灰した。組織をパラフィン包埋し、 4μm の薄切標本を
作製した。
6-2-4.
Safranin-O 染色
組織標本を脱パラフィン後、再親水化し、マイヤーヘマトキシリン液に室
温で 7 分間に浸した。次に 0.02%ファーストグリーン液に 10 分間浸した後
に、1%酢酸で 5 回浸し、0.1% Safranin-O 液で 10 分間染色を行った。キシレ
ンで疎水化し、カバーガラスで封入した。
関節軟骨の組織学的変性度を Mankin score（表 4） [35] に従ってスコア化
し、変性度を軽度変性（ Mankin score = 1 - 3）、中等度変性（ Mankin score =
4 - 7）、重度変性（ Mankin score >7）の 3 群に分類した [36]。
19
表 4. Mankin score system
Score
I
II
III
IV
構造
a.
正常
0
b.
表面の不整
1
c.
表面の不整、パンヌス形成
2
d.
中間層までの亀裂
3
e.
深層までの亀裂
4
f.
石灰化層までの亀裂
5
g.
完全な破壊
6
a.
正常
0
b.
びまん性の細胞数増加
1
c.
クローニング
2
d.
細胞数減少
3
細胞
Safranin-O の染色性
a.
正常
0
b.
軽度の低下
1
c.
中等度の低下
2
d.
重度の低下
3
e.
染色性の消失
4
Tidemark の状態
a.
正常
0
b.
血管の横断
1
総得点
6-2-5.
0～ 14
免疫組織化学染色
薄切切片（ 4 µm）を脱パラフィン後、再親水化した。pPERK、CHOP、Ub
の解析においては、PBS に希釈した proteinase K
（ Roche Diagnostics, Mannheim,
Germany）（ 20 µg/ml）で組織切片を室温、 12 分間培養して抗原賦活化を行
い、 pJNK と GRP78 に対しては抗原賦活化を行わなかった。次に 0.3%過酸
化水素を含むメタノールに切片を室温で 30 分間浸して、内生ペルオキシダ
ーゼ活性の除去を行った。非特異的反応のブロッキングのために抗 GRP78
20
抗体に対してはウサギ正常血清（ Nichirei Co. Ltd, Tokyo, Japan）を使用し、
他の抗体に対してはヤギ正常血清（ Nichirei Co. Ltd, Tokyo, Japan）を使用し
て組織切片を室温、 30 分間培養した。次に組織切片を PBS で希釈した一次
抗体で 4℃ 、18 時間培養した。PBS で洗浄後、各一次抗体に対する二次抗体
で組織切片を室温、 30 分間培養した。発色は 3,3'-diaminobenzidine（ DAB）
または 3-amino-9-ethylcarbazole（ AEC）で行い、ヘマトキシリンで対比染色
を行った。陰性コントロールには、一次抗体を Negative control Rabbit
immunoglobulin Fraction (Dako, Glostrup, Denmark)または Negative control
mouse IgG ( Dako, Glostrup, Denmark)に置き換えて同じ処理を行った組織切
片と一次抗体を使用せずに同じ処理を行った組織切片を使用した。
1mm 以上離れた 2 箇所の幅 800µm の軟骨組織全層を 300×400µm の 20~40
領域に分割したデジタル画像として得た。これらの画像内の陽性細胞と全細
胞数を計算し、組織全体の陽性細胞率を算出して、免疫染色を半定量的に評
価した。
6-2-6.
RNA の抽出と逆転写
-80℃ で凍結した関節軟骨を凍結したまま破砕し、 TRIzol reagent
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を使用して total RNA を抽出した。 RNA を
RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)と DNase (Qiagen, Valencia, CA,
USA)を使用して RNA の精製および DNA の除去を行った。RNA 100ng を High
Capacity RNA-to-cDNA（ Applied Biosystems , Foster, CA, USA）を使用して逆
転写し、 cDNA を作製した。
21
6-2-7.
RT-PCR と Pst1 制限酵素処理
XBP1 mRNA スプライシングを XBP1 mRNA に対する RT-PCR と Pst1 制限
酵素を利用した方法で評価した [37]。 XBP1 mRNA に対する PCR 増幅は
TaKaRa LA Taq (Takara, Kyoto, Japan)と GeneAmp® PCR system 9700（ Applied
Biosystems, Foster City, CA）を使用した。使用したプライマーのシーケンス
は次の通りである。
XBP1:
sense
5’- GCCTTGTAGTTGAGAACCAG-3’
antisense
5’- TTAATGGCTTCCAGCTTGGC-3’
このプライマーは spliced XBP1 と unspliced XBP1 の mRNA の両方を増幅
し、予想される PCR 産物のサイズは spliced XBP1 mRNA が 379bp、unspliced
XBP1 mRNA が 405bp である。また、このプライマーは IRE1α によってスプ
ライスされる 26 塩基の部位を unspliced XBP1 の PCR 産物が含む様に設計し
ている。この 26 塩基の部位は Pst1 制限酵素の切断部位を含んでいるため、
この部位がスプライスされた spliced XBP1 mRNA の PCR 産物では Pst1 制限
酵素の切断部位が消失している。従って、このプライマーの PCR 産物を Pst1
制限酵素で処理し、アガロース電気泳動することで、 spliced XBP1 と Pst1
制限酵素で切断された unspliced XBP1 に PCR 産物を分離することが可能と
なる。
PCR 反応は、94℃ 、30 秒間の denaturation、56℃ 、30 秒間の annealing、72℃ 、
30 秒間の extension を 33 サイクル行った。次に PCR 産物を Pst1 制限酵素で
37℃ 、2 時間培養した後に、2%アガロースに電気泳動し、濃度計（ AE-6920-MF,
ATTO, Tokyo, Japan）と CS analyzer software program (ver 2.0; ATTO, Tokyo,
Japan)を使用して、 spliced XBP1 と unspliced XBP1 の PCR 産物量を測定し、
22
XBP1 mRNA のスプライシングを spliced XBP1 と unspliced XBP1 の比
（ spliced/unspliced XBP1）で評価した。
6-2-8.
Real-time PCR
CHOP と GAPDH の mRNA 発現を評価するために real-time PCR を施行し
た。 Real-time PCR は Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR system
（ Applied Biosystems, Foster City, CA）、 TaqMan ® Gene Expression Assays
（ Applied Biosystems, Foster City, CA）、 TaqMan ® Universal PCR Master Mix
（ Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用した。Real-time PCR 反応は 50℃ 、
2 分間、続いて 95℃ 、 10 分間の培養後、95℃ 、15 秒間と 60℃ 、 1 分間を 40
サイクル行った。全ての実験でスタンダードカーブを描いて各遺伝子の発現
量を定量し、 GAPDH を内因性コントロールとして使用した。
6-3. 軟骨細胞アポトーシスと小胞体ストレスに関する検討
6-3-1.
ヒト軟骨組織標本の準備
6-2-3 で作製した 20 個のヒト軟骨組織標本を使用した。
6-3-2.
ヒト軟骨細胞の単離・培養・刺激
ヒト関節軟骨は人工膝関節置換術を施行された変形性膝関節症患者 2 例
（ 71 歳及び 75 歳、女性 2 例）の大腿骨顆部と脛骨高原から得た。
ヒト軟骨組織からの軟骨細胞単離は以下の手順で行った [38]。採取した関
節軟骨を HBSS で 3 回洗浄後、 HBSS に溶解した 0.05%ヒアルロニダーゼで
37℃ 、10 分間、滅菌ボトル内で攪拌しながら培養した。次に軟骨片を 0.03%
23
トリプシン及び 0.1%コラゲナーゼ・タイプ II を含む HBSS で 37℃ 、10 分間、
攪拌しながら培養した。最後に軟骨片を抗生剤を含む DMEM/F-12 で 3 回洗
浄し、DMEM/F-12 に溶解した 0.07%コラゲナーゼ・タイプ II で 37℃ 、16 時
間、攪拌しながら培養して完全に溶解した。軟骨の溶解液の不溶物を 70μm
の cell ストレイナー（ BD Falcom, Bedford, USA）で濾過除去し、 1500rpm、
5 分間遠心して軟骨細胞ペレットを得た。さらに軟骨細胞を DMEM/F-12 で
浮遊し、遠心してペレットにする処理を 2 回行い、最後にペレットを 10%FBS
を含む DMEM/F-12 で浮遊させ軟骨細胞を得た。
ヒト軟骨細胞は 20 x 10 4 cells/cm 2 の密度でプレートに播種し、 5% CO 2 、
37℃ の条件の下に、 10%FBS を含む DMEM/F-12 で培養し、実験には初代培
養細胞を使用した。70%以上のコンフルエントに達した後、培地を無血清の
DMEM/F-12 培地に置き換え、12 時間培養した。その後、軟骨細胞を 0.5%の
FBS を含む DMEM/F-12 に溶解した小胞体ストレス誘導剤 tunicamycin（ 0、
0.5、 1、 5、 10μg/ml）で 24 時間刺激した。
6-3-3.
免疫組織化学染色
Caspase-3 はアポトーシス実行過程の中心的酵素であり [39]、抗 C-CASP3
抗体は活性化した caspase-3 を検出するため [30-32]、この抗体を使用した免
疫組織化学染色によって変性軟骨の軟骨細胞アポトーシスを評価した。免疫
染色は組織切片を proteinase K（ 20 µg/ml）で室温、 12 分間培養して抗原賦
活化を行い、他の手順は 6-2-5 に示した方法と同様にして施行し、発色を AEC
で行った。
24
6-3-4.
TUNEL 染色
ヒト軟骨組織切片を脱パラフィンし、 PBS に希釈した proteinase K（ 20
µg/ml）で室温、15 分間培養して抗原を賦活した。3%過酸化水素を含む PBS
に室温で、5 分間浸して内生ペルオキシダーゼ活性の除去を行った。次に
ApopTag® Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit（ Chemicon International,
Temecula, CA, USA）を使用して、操作手順書に従って組織標本の TUNEL 染
色を行った。発色は AEC で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行った。陰
性コントロールは TdT Enzyme を使用せずに同じ操作を行った切片とした。
6-3-5.
免疫組織化学染色と TUNEL 染色の二重染色
組織切片を脱パラフィンし、PBS に希釈した proteinase K（ 20 µg/ml）で室
温、12 分間培養して抗原を賦活した。PBS で洗浄後、ヤギ正常血清（ Nichirei
Co. Ltd, Tokyo, Japan）を使用して切片を室温、 30 分間培養し、非特異的反
応のブロッキングを行った。次に PBS に希釈した抗 pPERK 抗体で室温、 1
時間培養した。 PBS で洗浄後、 Histofine Simple Stain AP (R)で室温、 30 分間
培養し、TBS で洗浄後、ニューフクシンによって発色を行った。水洗後、3%
過酸化水素を含む PBS に 5 分間浸して内生ペルオキシダーゼ活性の除去を
行った。次に ApopTag® Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit（ Chemicon
International, Temecula, CA, USA）を使用して TUNEL 染色を施行し、発色を
DAB で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行った。
6-3-6.
RNA の抽出と逆転写
ヒト培養軟骨細胞の total RNA を RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA,
25
USA)と DNase (Qiagen, Valencia, CA, USA)を使用して抽出し、DNA の除去を
行った。 RNA 200ng を High Capacity RNA-to-cDNA（ Applied Biosystems ,
Foster, CA, USA）を使用して逆転写し、 cDNA を作製した。
6-3-7.
RT-PCR と Pst1 制限酵素処理
6-2-7 に示した手順と同様にして XBP1 mRNA に対する RT-PCR と PCR 産
物の Pst1 制限酵素処理を施行し、 XBP1 mRNA スプライシングを評価した。
6-3-8.
Real-time PCR
ヒト軟骨細胞の CHOP mRNA 発現について、 6-2-8 の方法と同様にして
real-time PCR を使用して解析した。また GAPDH を内因性コントロールとし
て使用した。
6-3-9.
ELISA
培養細胞のアポトーシス量を Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche
Applied Science, Indianapolis, IN)を使用して、操作手順に従ってアポトーシ
ス量を解析した。 ELISA の解析は、 reference 波長を 492nm として、各サン
プルの吸光度を 405nm で測定し、アポトーシス量をサンプルの吸光度のコ
ントロール（ tunicamycin 未投与の細胞）に対する比（ enrichment factor: EF）
で評価した。また、同じ刺激実験を施行した軟骨細胞を別の well で培養し、
総蛋白量を Bradford 法で定量した。この細胞の総蛋白量でアポトーシス量を
補正した。
6-4. 軟骨代謝と小胞体ストレスに関する検討
26
6-4-1.
ヒトの変性軟骨と培養軟骨細胞の cDNA の準備
6-2-6 で作製したヒト軟骨組織の cDNA と 6-3-2 で刺激を行ったヒト培養
軟骨細胞の cDNA を解析に使用した。
6-4-2.
ラット軟骨細胞の単離・培養・刺激
ラットの関節軟骨は 5 週齢、雄の Sprague-Dawley ラット（ SLC Japan,
Hamamatsu, Japan）の大腿骨頭から採取した。ラットの関節軟骨組織を HBSS
に溶解した 0.1%トリプシンで 37℃ 、20 分間攪拌しながら培養し、次に DMEM
に溶解した 0.1%コラゲナーゼ・タイプ II で 37℃ 、 3 時間攪拌しながら培養
して溶解した。軟骨組織の溶解液から 6-3-2 の手順と同様にしてラット軟骨
細胞を回収した。ラット軟骨細胞を 25 cm 2 フラスコに播種し、5% CO 2 、37℃
の条件の下に、 10%FBS を含む DMEM で培養した。実験には 1 回継代細胞
を使用し、一回継代細胞を無血清の DMEM で 37℃ 、 12 時間培養した後に、
tunicamycin（ 0、 1、 5、 10μg/ml）で 24 時間刺激を行った。
6-4-3.
RNA の抽出と逆転写
ラット培養軟骨細胞からの RNA 抽出と逆転写を 6-3-6 と同じ方法で施行
した。
6-4-4.
Real-time PCR
ヒト変性軟骨及びヒト培養軟骨細胞の ACAN、COL2A1、MMP-13、GAPDH
の mRNA を real-time PCR で定量した。ラット培養軟骨細胞では Chop、Grp78、
Acan、 Col2a1、 Mmp-13、 Actb の mRNA 発現を real-time PCR で評価した。
27
Real-time PCR は 6-2-8 と同じ方法で施行した。またヒトの mRNA 発現は
GAPDH を内因性コントロールとして使用し、ラットの mRNA 発現の内因性
コントロールには Actb を使用した。
6-5. 統計学的解析
多群間の比較は Kruskal-Wallis test を行い、有意な場合は Mann-Whitney U
test に Bonferroni 補正を使用して post-hoc test を行った。相関解析は Spearman’s
rank correlation coefficient（ r s ）を算出して行った。 0.05 未満の p 値を統計学
的に有意とした。
表 5. 評価項目一覧
小胞体ストレス
軟骨細胞
免疫染色
PCR 解析
アポトーシス
XBP1 splicing
C-CASP3
CHOP
TUNEL
軟骨代謝
pPERK
Ub
関節軟骨
GRP78
CHOP
ヒト
ACAN
COL2A1
MMP-13
pJNK
XBP1 splicing
培養軟骨細胞
CHOP
ACAN
ELISA
COL2A1
MMP-13
pPerk
関節軟骨
Grp78
Chop
ラット
培養軟骨細胞
Grp78
Chop
28
Acan
Col2a1
Mmp-13
7. 実験結果
7-1.
変性軟骨における小胞体ストレスの発生
7-1-1.
変形性関節症患者の軟骨変性度
各症例から得た関節軟骨の ICRS grade と Mankin score の一覧を表 6 に示
し、図 2 に変性度で分類した代表的な軟骨組織を示した。 20 個のヒト変性
軟骨は変性度が軽度、中等度、重度の軟骨にそれぞれ 5 個、7 個、8 個が分
類された。また中等度変性軟骨の一部と全ての重度変性軟骨は表層を欠損
し、表面は中間層であった。
表 6.
症例
関節軟骨の ICRS grade と Mankin score
年齢（歳）
性別
ICRS grade (Mankin score)
1
71
女性
0 (1)
2
76
女性
I (3)
3
74
女性
I (6)
4
76
女性
I (6), II (8),
5
76
女性
I (3), III (4)
6
59
女性
I (5), III (10)
7
73
女性
II (7), III (9)
8
58
女性
III (9)
9
70
男性
0 (2), I (4),
10
77
男性
I (3), II (5)
11
79
男性
I (6), III (11)
図 2. ヒト変性軟骨組織の safranin-O 染色
a、 b、 c はそれぞれ軽度、中等度、重度の変性軟骨である。
29
III (9)
III (7)
7-1-2.
ヒト変性軟骨の変性度と小胞体ストレス関連分子
変性軟骨における小胞体ストレスの発生を評価するため、 pPERK、 Ub、
GRP78、CHOP、pJNK の小胞体ストレス関連蛋白の発現について免疫染色法
で評価した。
軽度の変性軟骨において、 pPERK、 Ub、 GRP78、 CHOP、 pJNK に対する
陽性軟骨細胞を表層で認めた（図 3. a、図 4. a、図 5. a、図 6. a、図 7. a）。
中間層と深層では、一部の軟骨細胞が pPERK と Ub に対して弱陽性であっ
たが、多くの軟骨細胞は GRP78、 CHOP、 pJNK に対して陰性であった（図
3. b-c、図 4. b-c、図 5. b-c、図 6. b-c、図 7. b-c）。
中等度の変性軟骨においては、表面に近い層（表層または中間層の上部）
で、 pPERK、 Ub、 GRP78、 CHOP、 pJNK の小胞体ストレス関連分子全てに
対する陽性の軟骨細胞を高頻度に認め、特に Ub に対しては強陽性を示す細
胞がみられた（図 3. d、図 4. d、図 5. d、図 6. d、図 7. d）。また、中間層下
部や深層では、pPERK、Ub、pJNK に対する陽性細胞を認めたが（図 3. e-f、
図 4. e-f、図 7. e-f）、GRP78 と CHOP に対しては陰性の軟骨細胞が多かった
（図 5. e-f、図 6. e-f）。
重度の変性軟骨では中間層全体において、 pPERK、 Ub、 CHOP、 pJNK に
対する陽性軟骨細胞を多数認め、特に pPERK と Ub に対しては強い染色性
を示す軟骨細胞を認めた（図 3. g-h、図 4. g-h、図 6. g-h、図 7. g-h）。また、
下層においても pPERK、 Ub、 CHOP、 pJNK に対する陽性の軟骨細胞を認め
た（図 3. i、図 4. i、図 6. i、図 7. i）。しかし GRP78 に対しては中間層上部
で陽性細胞が認められたが、中間層下部や深層では軽度及び中等度変性軟骨
30
と同様に多くの軟骨細胞が陰性であった（図 5. g-i）。
図 3.
ヒト変性軟骨の pPERK の発現
軽度（ a-c）、中等度（ d-f）、及び重度（ g-i）の変性軟骨を示した。 a は表層、 b は中間層、 d
と g は中間層上部、 e と h は中間層下部である。 c、 f 及び i は深層である。挿入画像は矢頭の
拡大図である。スケールバーは 100μm である。
図 4.
ヒト変性軟骨の Ub の発現
軽度（ a-c）、中等度（ d-f）、及び重度（ g-i）の変性軟骨を示した。 a は表層、 b は中間層、 d
と g は中間層上部、 e と h は中間層下部である。 c、 f 及び i は深層である。挿入画像は矢頭の
拡大図である。スケールバーは 100μm である。
31
図 5.
ヒト変性軟骨の GRP78 の発現
軽度（ a-c）、中等度（ d-f）、及び重度（ g-i）の変性軟骨を示した。 a は表層、 b は中間層、 d
と g は中間層上部、 e と h は中間層下部である。 c、 f 及び i は深層である。挿入画像は矢頭の
拡大図である。スケールバーは 100μm である。
図 6.
ヒト変性軟骨の CHOP の発現
軽度（ a-c）、中等度（ d-f）、及び重度（ g-i）の変性軟骨を示した。 a は表層、 b は中間層、 d
と g は中間層上部、 e と h は中間層下部である。 c、 f 及び i は深層である。挿入画像は矢頭の
拡大図である。スケールバーは 100μm である。
32
図 7.
ヒト変性軟骨の pJNK の発現
軽度（ a-c）、中等度（ d-f）、及び重度（ g-i）の変性軟骨を示した。 a は表層、 b は中間層、 d
と g は中間層上部、 e と h は中間層下部である。 c、 f 及び i は深層である。挿入画像は矢頭の
拡大図である。スケールバーは 100μm である。
表 7 に軟骨全層における各変性度の pPERK、 Ub、 GRP78、 CHOP、 pJNK
の陽性細胞率と、それらと Mankin socre との相関関係をまとめた。 pPERK、
Ub、CHOP、pJNK の陽性細胞率はいずれも Mankin socre と正の相関を示し、
重度変性軟骨では軽度変性軟骨と比較して陽性細胞率が有意に増加した。し
かし、GRP78 の陽性細胞率は Mankin score と正の相関を示したが、変性度の
違いによる有意な差はみられなかった。
33
表 7.
軟骨変性度と小胞体ストレス関連分子
軽度
中等度
重度
Mankin score
(n = 5)
(n = 7)
(n = 8)
rs
p-value
pPERK (%)
23.0 ± 10.4
37.0 ± 5.0
49.0 ± 7.0 * †
0.86
0.001
Ub (%)
19.1 ± 2.8
29.6 ± 6.6
59.3 ± 3.7 * †
0.81
0.001
GRP78 (%)
16.2 ± 2.9
21.2 ± 1.9
24.2 ± 2.8
0.51
0.028
CHOP (%)
8.2 ± 5.2
15.9 ±13.7
35.4 ± 9.2 * †
0.74
0.002
pJNK (%)
8.6 ± 7.5
32.7 ± 14.9 *
48.6 ± 13.8 *
0.81
0.001
各変性度の陽性細胞率の平均値 ±標準誤差を示した。 r s は Mankin socre との相関係数で
ある。 * p<0.05 vs 軽度変性軟骨、 † p<0.05 vs 中等度変性軟骨。
変性軟骨における XBP1 mRNA スプライシングと CHOP mRNA 発現の結果
である。 XBP1 mRNA は全ての変性軟骨で発現し、中等度変性軟骨で XBP1
mRNA スプライシングが最も多く、軽度及び重度変性軟骨よりも有意に増加
した（図 8. a-b）。一方、 CHOP mRNA の発現は軟骨変性の進行と共に増加
した（図 9）。
図 8. 軟骨変性度と XBP1 mRNA スプライシング
a. 各変性度の軟骨における XBP1 mRNA スプライシングの代表的な 4 例を示した。上段は total
XBP1 mRNA、中段と下段はそれぞれ spliced XBP1 mRNA と unspliced XBP1 mRNA を示す。b. 各
変性度の軟骨の spliced/unspliced XBP1 を示した。結果は軽度変性軟骨の平均値で標準化し、
軽度（ n=5）、中等度（ n=7）、重度（ n=8）の平均値 ±標準誤差を示した。 * p<0.05 vs 軽度変
性軟骨、 † p<0.05 vs 中等度変性軟骨。
34
図 9. 軟骨変性度と CHOP mRNA の発現
各変性度の CHOP mRNA 発現量を示した。結果は軽度変性軟骨の平均値で標準化し、軽度
（ n=5）、中等度（ n=7）、重度（ n=8）の平均値 ±標準誤差を示した。 * p<0.05 vs 軽度変性軟
骨。
これらの結果は小胞体ストレスと小胞体ストレス応答のアポトーシス経
路が軟骨変性の進行と共に増加し、小胞体ストレス応答の保護的経路は中等
度の変性軟骨で最も増加し、重度の変性軟骨では低下することを示した。
7-1-3.
ラット変形性関節症モデルの軟骨変性度
ラット変形性関節症モデルの脛骨高原の関節軟骨は術後経過が進むにつ
れて、表面の不整や軟骨組織の亀裂が生じ、safranin-O の染色性が低下して、
関節軟骨の変性が発症し進行する過程を再現していた（図 10. a）。正常軟
骨の Mankin score は全て 0 点であったが、術後 1~3 週の Mankin score の平均
値はそれぞれ 2.9 点、5.1 点、8.8 点であり、それぞれ軽度、中等度、重度の
軟骨変性度を示した（図 10. b）。
35
図 10.
ラット変形性関節症モデルの軟骨変性
a. ラットの正常軟骨と変形性関節症モデルの関節軟骨の safranin-O 染色。 b. 正常軟骨と術後
各週（各 n=3）における Mankin score を平均値 ±標準誤差で示した。
7-1-4.
ラット変性軟骨の変性度と小胞体ストレス関連分子
ラット変形性関節症モデルの変性軟骨の小胞体ストレス発生を調査する
ために、 pPerk、 Grp78、 Chop の 3 つについて評価した。軟骨組織の pPerk、
Grp78、 Chop の陽性細胞は術後経過が進むにつれて増加した（図 11、 12）。
この結果はヒト変性軟骨と同様であり、小胞体ストレスが軟骨変性の進行と
共に増加することを裏付けた。さらに、ラット変形性関節症モデルではこれ
ら 3 つの小胞体ストレス関連分子の陽性細胞率は術後 1 週の変性軟骨で既に
正常軟骨よりも増加しており、小胞体ストレスが軽度な変性軟骨においても
増加することを示唆した（図 11、 12）。
36
図 11.
ラット変形性関節症モデルの変性軟骨における小胞体ストレス関連分子の発現
ラットの正常軟骨と変形性関節症モデルの関節軟骨の pPerk（ a、 b、 c、 d）、 Grp78（ e、 f、 g、
h）、 Chop（ i、 j、 k、 l）の免疫染色。
図 12.
ラット関節軟骨の小胞体ストレス関連分子の陽性細胞率
ラットの正常軟骨と変形性関節症モデルの関節軟骨（各 n=3）の pPERK（ a）、 Grp78（ b）、
Chop（ c）の陽性細胞率を平均値 ±標準誤差で示した。 * p<0.05 vs 正常軟骨
7-2. 軟骨細胞アポトーシスと小胞体ストレス
7-2-1.
ヒト変性軟骨の軟骨細胞アポトーシスと小胞体ストレス
ヒト変性軟骨における変性度と軟骨細胞アポトーシスの関係を組織学的
に評価した。 C-CASP3 陽性細胞は軽度変性軟骨の表層でみられたが、中間
37
層や深層では非常に少なかった（図 13. a-c）。中等度変性軟骨では表層や中
間層上部で多数の C-CASP3 陽性細胞が認められたが、中間層下部や深層の
C-CASP3 陽性細胞は少なかった（図 13. d-f）。重度変性軟骨では、軽度お
よび中等度の変性軟骨と比較すると C-CASP3 陽性細胞が全層にわたって広
範囲に認められ、特に中間層全体で強く染色された C-CASP3 陽性細胞がみ
られた（図 13. g-i）。
図 13.
ヒト変性軟骨の C-CASP3 発現
軽度（ a-c）、中等度（ d-f）、及び重度（ g-i）の変性軟骨を示した。 a は表層、 b は中間層、 d
と g は中間層上部、 e と h は中間層下部である。 c、 f 及び i は深層である。挿入画像は矢頭の
拡大図である。スケールバーは 100μm である。
TUNEL 陽性細胞も重度の変性軟骨で軽度及び中等度の変性軟骨よりも広
範囲で認められ、 C-CASP3 陽性細胞と同様の分布であった（図 14）。
38
図 14. ヒト変性軟骨の TUNEL 染色
軽度（ a-c）、中等度（ d-f）、及び重度（ g-i）の変性軟骨を示した。 a は表層、 b は中間層、 d
と g は中間層上部、 e と h は中間層下部である。 c、 f 及び i は深層である。挿入画像は矢頭の
拡大図である。スケールバーは 100μ m である。
表 8 に軟骨変性度の違いによる C-CASP 陽性細胞率と TUNEL 陽性細胞率
の平均値と Mankin score との相関係数を示した。C-CASP3 と TUNEL 陽性細
胞率は共に Mankin score と正の相関を認め、重度変性軟骨では軽度変性軟骨
と比較して陽性細胞率の有意な増加が確認された（表 8）。また、 C-CASP
陽性細胞率と TUNEL 陽性細胞率の間には有意な相関関係を認めた（ r s =
0.65, p = 0.005）。小胞体ストレスと同様に、軟骨変性の進行と共に軟骨細
胞のアポトーシスが増加する結果から、小胞体ストレスが軟骨細胞アポトー
シスに関与することが示唆された。
39
表 8. 軟骨変性と C-CASP3 発現及び TUNEL 染色
軽度
中等度
重度
Mankin score
(n = 5)
(n = 7)
(n = 8)
rs
p-value
C-CASP3 (%)
5.4 ± 1.6
9.2 ± 1.2
13.7 ± 1.9 *
0.58
0.013
TUNEL (%)
13.4 ± 3.0
23.8 ± 3.5
29.5 ± 2.3 *
0.64
0.005
各変性度の陽性細胞率の平均値 ±標準誤差を示した。 r s は Mankin socre との相関係数で
ある。 * p<0.05 vs 軽度変性軟骨。
そこで、小胞体ストレスと軟骨細胞アポトーシスの関連性を検証するため
に、重度の変性軟骨において pPERK の免疫染色と TUNEL 染色の二重染色
を実施した。その結果、pPERK の免疫染色と TUNEL 染色の両方に対して陽
性を示す軟骨細胞が確認された（図 15）。
図 15. ヒト変性軟骨の pPERK 発現と TUNEL 染色
重度変性軟骨の pPERK に対する免疫染色と TUNEL 染色の二重染色。b は a の四角枠の拡大像
である。矢頭は pPERK 陽性の TUNEL 陽性細胞を示す。スケールバーは 50μm である。
7-2-2.
ヒト培養軟骨細胞のアポトーシスと小胞体ストレス
ヒト関節軟骨細胞の小胞体ストレス応答とアポトーシスの関係を評価す
るため、ヒト培養軟骨細胞を tunicamycin で 24 時間刺激した。 tunicamycin
刺激により軟骨細胞の XBP1 mRNA スプライシングは増加したが、 1μg/ml
40
の刺激で最も増加しており、5-10μg/ml では減少傾向を呈した（図 16. a-b）。
CHOP mRNA の発現は 1μg/ml の tunicamycin で約 30 倍に増加し、tunicamycin
の濃度依存的に増加した（図 16. c）。また、軟骨細胞のアポトーシスは
5-10μg/ml の tunicamycin によって有意に増加した（図 16. d）。これらの結
果から、 tunicamycin による軟骨細胞アポトーシスには CHOP mRNA 発現の
増加と XBP1 mRNA スプライシングの減少が関連する事が示唆された。
図 16. ヒト軟骨細胞の小胞体ストレス応答とアポトーシス
Tunicamycin（0, 0.5, 1, 5 or 10 μg/ml）で 24 時間刺激したヒト軟骨細胞の XBP1 mRNA スプライシング（a、
b）、CHOP mRNA 発現（c）、アポトーシス（d）を示した。a. 上段は total XBP1 mRNA、中段と下段
はそれぞれ spliced XBP1 mRNA と unspliced XBP1 mRNA を示す。 b-d. 結果は 0 μg/ml の
tunicamycin の平均値で標準化し、 4 回の独立した実験の結果の平均値 ±標準誤差を示した。
* p<0.05 vs tunicamycin（0 μg/ml）。
7-3. 軟骨代謝と小胞体ストレス
7-3-1.
ヒト変性軟骨における軟骨代謝と小胞体ストレス
ヒト変性軟骨の代謝状態を評価するために、軟骨変性度の違いによる
41
ACAN、 COL2A1、 MMP-13 の mRNA 発現を解析した。 ACAN 発現は中等度
及び重度の変性軟骨で軽度変性軟骨よりも有意に低下した（図 17. a）。一
方、COL2A1 と MMP-13 は変性度間で差がみられなかったが、MMP-13 は中
等度及び重度変性軟骨では軽度変性軟骨の約 2 倍の発現を認めた（図 17.
b-c）。これらの結果は、軟骨変性の進行に伴う同化作用の減少と異化作用
の亢進が生じることを示唆する。
図 17. 軟骨変性と ACAN、 COL2A1、 MMP-13 の mRNA 発現
*
*
各変性度のヒト関節軟骨の ACAN（ a）、COL2A1（ b）、MMP-13（ c）の mRNA 発現を示した。
結果は軽度変性軟骨の平均値で標準化し、軽度（ n=5）、中等度（ n=7）、重度（ n=8）の平均
値 ±標準誤差を示した。 * p<0.05 vs 軽度変性軟骨。
さらに、軟骨代謝と小胞体ストレスの関連をみるために、ヒト変性軟骨の
ACAN、 COL2A1、 MMP-13 の mRNA 発現と CHOP mRNA 発現および XBP1
mRNA スプライシングとの相関関係を評価した。 CHOP mRNA 発現と XBP1
mRNA スプライシングは 7-1-2 で定量した値を使用したが、ACAN、COL2A1、
MMP13 の mRNA 発現とはいずれも有意な相関関係を示さなかった（図 18）。
42
図 18. ヒト変性軟骨の ACAN、 COL2A1、 MMP-13 の mRNA 発現と小胞体ストレス
ヒト変性軟骨（ n=20）の XBP1 mRNA スプラシングと ACAN（ a）、 COL2A1（ c）、 MMP-13
（ e）の mRNA 発現の相関関係（ rs）と CHOP mRNA 発現と ACAN（ b）、COL2A1（ d）、MMP-13
（ f）の mRNA 発現の相関関係（ rs）を示した。
7-3-2.
ヒト及びラット培養軟骨細胞の軟骨代謝と小胞体ストレス
軟骨代謝と小胞体ストレスの関連性を検証するため、ヒトおよびラットの
関節軟骨細胞に小胞体ストレスを誘導して、 ACAN、 COL2A1、 MMP-13 の
mRNA 発現を評価した。
ヒト培養軟骨細胞において tunicamycin は ACAN、 COL2A1 の mRNA 発現
を有意に抑制した（図 19. a-b）。さらに、tunicamycin は濃度依存的に MMP-13
発現を増加した（図 19. c）。
43
図 19. ヒト軟骨細胞の ACAN、 COL2A1、 MMP-13 の mRNA 発現と小胞体ストレス
Tunicamycin（0, 0.5, 1, 5 or 10 μg/ml）で 24 時間刺激したヒト軟骨細胞の ACAN（a）、COL2A1（b）、
MMP-13（c）の mRNA 発現を示した。結果は 0 μg/ml の tunicamycin の平均値で標準化し、4 回の独立
した実験の結果の平均値 ±標準誤差を示した。 * p<0.05 vs tunicamycin（0 μg/ml）。
ラット軟骨細胞の Grp78 および Chop の mRNA 発現は 1μg/ml の tunicamycin
でそれぞれ約 40 倍および約 60 倍に増加したため、ヒト軟骨細胞と同様に、
ラット軟骨細胞においても tunicamycin の小胞体ストレス誘導性が確認され
た（図 20. a-b）。さらに、ラット軟骨細胞においても tunicamycin は Acan、
Col2a1 の mRNA 発現を抑制し、 Mmp-13 発現を増加した（図 20. a-c）。
44
図 20. ラット軟骨細胞の tunicamycin による小胞体ストレス発生と ACAN、 COL2A1、 MMP-13
の mRNA 発現
Tunicamycin（0, 1, 5 or 10 μg/ml）で 24 時間刺激したラット軟骨細胞の Grp78（a）、Chop（b）、Acan
（a）、Col2a1（b）及び Mmp-13（c）の mRNA 発現を示した。結果は 0 μg/ml の tunicamycin の平均値で
標準化し、 3 回の独立した実験の結果の平均値 ±標準誤差を示した。 * p<0.05 vs tunicamycin（0
μg/ml）。
以上のヒト及びラット培養軟骨細胞の結果は、小胞体ストレスが軟骨代謝
の異常に強く関与し、軟骨細胞の同化作用を抑制し、異化作用を亢進させる
ことを示した。
45
8. 考察
本研究では関節軟骨の変性の程度と小胞体ストレスの関連性をヒトとラッ
トの変性軟骨を用いて検討した。ヒト変性軟骨における解析では、小胞体スト
レス関連分子である pPERK、Ub、GRP78、CHOP 及び pJNK を発現する軟骨細
胞が軟骨変性の進行と共に増加することを確認した。ラット動物モデルにおい
ても、軟骨変性の進行過程における小胞体ストレス関連分子の発現増加が確認
された。これらの結果から、我々は小胞体ストレスが軟骨変性の進行に関与す
ることを明らかにした。
複数の小胞体ストレス関連分子の発現を調査した本研究は、軟骨変性におけ
る軟骨細胞の小胞体ストレス応答を保護的経路とアポトーシス経路の両面か
ら捉えている。小胞体ストレス応答の保護的経路に関しては、中等度の変性軟
骨では軽度の変性軟骨よりも XBP1 mRNAスプライシングが増加し、重度の変
性軟骨では中等度の変性軟骨と比較して、小胞体内のアンフォールド蛋白の処
理に重要な GRP78の発現は有意に増加せず、 XBP1 mRNAスプライシングは減
少した。一方、小胞体ストレス応答のアポトーシス経路である CHOP発現と
[40-42]、 JNKの活性化 [43]は軟骨変性の進行に伴って増加した。これらの結果
は関節軟骨では変性の進行に伴って小胞体ストレス応答のアポトーシス経路
が増大し、重度の変性軟骨では保護的経路が低下することを示しており、両者
の不均衡が軟骨変性に関与することが示唆された。
関節軟骨の軟骨細胞数が減少すると軟骨基質が維持できなくなるため、軟骨
細胞アポトーシスは軟骨変性の重要な病態の一つである [10]。本研究のヒト変
性軟骨では、TUNEL陽性細胞率と C-CASP3陽性細胞率の両者が軟骨変性度と正
46
の相関を示した。小胞体ストレスも同様に軟骨変性度と正の相関を示したこと
から、TUNELと pPERKの二重染色を実施したところ、TUNEL陽性細胞が pPERK
の染色性を示すことも確認された。これらの結果から、軟骨変性において小胞
体ストレスは軟骨細胞アポトーシスに関与することが強く示唆された。また、
ヒト変性軟骨の解析で、小胞体ストレス応答のアポトーシス経路である CHOP
発現が軟骨変性の進行と共に増加したのに対して、保護的経路である XBP1
mRNAスプライシングは重度の変性軟骨では低下した。さらに、ヒト培養軟骨
細胞における解析では、tunicamycinによる小胞体ストレス性のアポトーシスに
は CHOP発現増加と XBP1 mRNAスプライシングの減弱が関連することが確認
された。 Linらも軟骨細胞を除くマウス胎児線維芽細胞などの様々な細胞株で
同様の結果を報告している [44]。以上をまとめると、小胞体ストレスは軟骨細
胞にアポトーシスを誘導して軟骨変性を進行させること、その過程には小胞体
ストレス応答のアポトーシス経路の増加と保護的経路の低下が関与すること
が推測される。
軟骨代謝の異常は軟骨変性の重要な病因のひとつである [4]。本研究において、
ヒト変性軟骨の II 型コラーゲンの mRNA 発現は変性度によって変化を認めな
かったが、アグリカンの mRNA 発現は変性度と負の相関を示し、MMP-13 mRNA
発現は変性が進むと増加する傾向にあった。この結果はこれまで報告されたヒ
ト変性軟骨の遺伝子解析の結果 [45-47]と一致しており、軟骨変性の進行と共に
軟骨細胞の同化作用が低下し、異化作用が亢進することを確認した。また、Yang
ら [22]や Hamamura ら [24]の報告と同様に、ヒト及びラットの培養軟骨細胞で
は、 tunicamycin の刺激によりアグリカンと II 型コラーゲンの mRNA 発現が抑
制され、MMP-13 の mRNA 発現が増加した。つまり、小胞体ストレスは培養軟
47
骨細胞の同化作用を低下し、異化作用を増加することが確認された。しかし、
ヒト変性軟骨の解析では、CHOP mRNA 発現と XBP1 mRNA スプライシングは、
それぞれアグリカン、II 型コラーゲン及び MMP-13 の mRNA 発現と有意な相関
を示さなかった。生体内では軟骨細胞が成長因子や炎症性サイトカインなどの
影響を受けているため [45-47]、軟骨細胞の同化及び異化作用の制御には小胞体
ストレス以外の様々な分子の作用が存在する可能性が考えられる。従って、生
体内の軟骨代謝異常に関する小胞体ストレスの役割については、これらの因子
を含めた多角的な検討が必要である。
これまで培養軟骨細胞において IL-1β や TNFα などの炎症性サイトカインや
一酸化窒素が小胞体ストレスの誘因となることが報告されているが [22]、これ
らの分子が変性軟骨においても小胞体ストレスに関与しているかは明らかに
されていない。関節軟骨の表面に近い層では IL-1β や TNFα の産生が増加する
とされており [48]、本研究ではヒト変性軟骨の表面に近い層で小胞体ストレス
が増加することを確認した。また、ラット変形性関節症モデルは力学的ストレ
スによって軟骨変性を誘導するが、力学的ストレスは軟骨細胞の一酸化窒素産
生を増加することが報告されている [49]。本研究のラット変性軟骨においても
小胞体ストレスが増加しており、生体内の軟骨変性においても炎症性サイトカ
インや一酸化窒素は小胞体ストレスの発生に関与することが推測される。
現在、小胞体ストレスは糖尿病、動脈硬化、パーキンソン病など様々な疾患
の病態に関与することが報告されており [50]、一部の疾患において小胞体ストレ
スを標的とする治療の有用性が示されている。例えば、糖尿病モデルマウスに
おいて小胞体ストレスのアポトーシスシグナルである Chop の欠失は糖尿病モ
デルマウスの糖尿病発症を抑制することが示され [51]、化学的シャペロンと呼
48
ばれる 4-フェニル酪酸などの薬剤は小胞体ストレスを抑制して、肥満モデルマ
ウスの耐糖能やインスリン抵抗性を改善して糖尿病の発症を抑制することが
明らかにされている [52]。また、この薬剤はパーキンソン病モデルの神経細胞
死を抑制すること [53]、マウスの脳虚血モデルで脳神経の細胞死を抑制するこ
と [54]も報告されている。今後、軟骨変性においても小胞体ストレスやそのア
ポトーシス経路の抑制に関する検討が必要であるが、小胞体ストレスは変形性
関節症の本質的な治療標的となる可能性がある。
49
9. 結語
本研究は変形性関節症患者とラット変形性関節症モデルの変性軟骨におい
て様々な小胞体ストレス関連分子を解析し、小胞体ストレスが軟骨変性の進行
と共に増大することを示した。また、軟骨変性が進行すると小胞体ストレス応
答の保護的経路が低下し、アポトーシス経路が増大することを明らかにした。
さらに、小胞体ストレスは軟骨細胞のアポトーシスと軟骨代謝の異常を惹起す
ることにより、軟骨変性の病態に深く関与することが示唆された。
50
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