MRSA の arbekacin に対する感受性とアミノグリコシド不活化酵素産生

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MRSA の arbekacin に対する感受性とアミノグリコシド不活化
酵素産生遺伝子との関連性
田端麻紀子・清水正樹・荒明美奈子・小川弘
明治製菓株式会社薬品総合研究所
（2002 年 9 月 9 日受付）
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) のアミノグリコシド不活化酵素産生
遺伝子の一つである aac(6Ј)/aph(2Љ)保有と arbekacin (ABK) 感受性との関連性を，ABK の
MIC 値が 0.125ϳ64 m g/ml を示す MRSA 計 49 株を用いて検討した。その結果，aac(6Ј)/
aph(2Љ)を保有しない 11 株はすべて ABKの MIC が 0.5 m g/ml 以下と感受性であった。一方，
この遺伝子を保有する 38 株に対する ABK の MIC は 0.25ϳ64 m g/ml と幅広い分布を示し，
aac(6Ј)/aph(2Љ)保有株の中には ABK 感受性株と耐性株が存在した。また，アミノグリコシ
ド系抗菌薬不活化酵素産生遺伝子のうち aac(6Ј)/aph(2Љ)および aad(4Ј,4Љ)を保有し，かつ
ABKの感受性が異なる3株より調製した粗酵素液作用後のABKおよびgentamicin (GM) の
残存率はいずれもMIC値を反映しており，MICが高い株ほど抗菌活性残存率が低かった。
また，すべての株で ABK の抗菌活性残存率は GM のそれより高かった。
臨床におけるaac(6Ј)/aph(2Љ)保有株の分離頻度とABKの感受性を確認するため，1999年
に神奈川県内で臨床分離された MRSA について検討した。その結果，97 株中 28 株が
aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有していたが，それらはすべて ABK 感受性であった。
以上の結果から，臨床で分離される MRSA は aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有していてもほとんど
の株は ABK 感受性であることが明らかとなった。
aureus
酵素による薬剤の不活化であるが2,3)，ABKはこの
(MRSA) は b - ラクタム薬のみならず多くの抗菌薬
AG 不活化酵素に安定な化合物の開発を目的とし
に耐性であり，MRSA起因感染症は治療に難渋し，
た種々の研究により合成・開発された薬剤であり，
院内感染の原因となるなど，臨床の現場で大きな
ブドウ球菌を代表とするグラム陽性菌およびグラ
Methicillin-resistant
Staphylococcus
1)
問題となっている。
ム陰性菌の産生するほとんどの AG 不活化酵素に
現在，わが国で MRSA 感染症に使用されている
安定である4,5)。ABKに対し耐性を示すMRSAは上
抗菌薬は arbekacin (ABK), vancomycin および teico-
市当初から数 % 認められていたが，多くが中等度
planinの3薬剤あり，このうち最も早く，1990年に
耐性であり，その分離頻度はその後ほとんど変化
上市されたのがアミノグリコシド系抗菌薬 (AG)
していない6,7)。しかし，高度耐性株7)や従来の報告
の ABK である。AG に対する耐性機序は主に修飾
と異なる構造部位を修飾する不活化酵素を持つ
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ABK 耐性 MRSA も報告されている 8)。堀田らは
MRSA のうち ABK 耐性菌は aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有
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3. 最小発育阻止濃度 (minimum inhibitory
concentration; MIC) 測定
していたと報告している 9)。しかし，この報告は
MIC は Mueller-Hinton broth (MHB, Difco)および
ABK 耐性株からの考察であり，逆に aac(6Ј)/
Mueller-Hinton agar (MHA, Difco) を用い，日本化
aph(2Љ)保有が ABK 耐性に結びつくかは検討され
学療法学会標準法に準じた寒天平板希釈法 10)によ
ていない。今回我々はMRSAのaac(6Ј)/aph(2Љ)保有
り測定した。
とABKの感受性との関連性について，臨床分離株
を用いて検討したので報告する。
4. 各遺伝子の検出
遺伝子の検出は土崎らの方法 11)に従い，マルチ
I．実験材料と方法
プレックスコロニー PCR 法にて行った。プライ
マーは表1に示したメチシリン耐性遺伝子(mecA)9)
1. 使用菌株
と AG 修飾酵素産生遺伝子 aac(6 Ј )/aph(2 Љ ) 9) ,
1) ABK 感受性と AG 不活化酵素産生遺伝子保
aad(4Ј,4Љ)12) および aph(3Ј)-III12)を標的遺伝子とす
有との関連の検討
るものを用いた。
当研究所保存臨床分離 MRSA の中から ABK の
MHA 平板に接種し，35°C 一夜培養後に生育し
MIC 値が 0.125ϳ64 m g/ml の各値を示す 49 株を選
た菌体をPCR反応液［1ϫPCR buffer，dNTPs 各0.2
び，実験に用いた。
mM , 1 m M MgSO4・H2O, KOD-plus-DNA poly-
2) 最近の臨床分離株における ABK 感受性と
AG 不活化酵素産生遺伝子保有
1999 年に神奈川県内の 7 施設より分離された
MRSA 97 株を使用した。
merase (TOYOBO) 0.4U，プライマー 0.2 または 0.5
m M］20 m lに加えた。
PCR はサーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，宝酒造）を用いて，95°C・
3 分 Æ（95°C・30 秒 Æ50°C・30 秒 Æ72°C・60 秒）
2. 使用薬剤
ϫ30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物
ABK（明治製菓）およびgentamicin（GM, 明治製
は1.4%アガロース電気泳動後，エチジウムブロマ
菓）はそれぞれ力価の明らかな原末を用いた。
イド染色し，観察した。
表 1．コロニー PCR に使用したプライマー
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5. 粗酵素液の調製
粗酵素液は，生方ら13)，澤井ら14)の報告を参考に
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を停止させた。
残存力価の測定はバイオアッセイにて行った。
して調製した。すなわち，一夜培養菌液 10 ml を
すなわち，Bacillus subtilis ATCC 6633 を混釈培養
MHB 200 ml に接種し，37°C で 5 時間振盪培養後，
した感受性ディスク用アガー-N（SDA, 日水）を用
遠心分離により集菌した。生理食塩液で菌体を洗
いて，これに反応液または対照液を含むペーパー
浄した後，TMK buffer［100 mM Tris-HCl, 10 mM
ディスクを置いて 4°C，1 時間予備拡散した後，
Mg(CH3COO)2, 60 mM KCl, 6 mM 2- メルカプトエタ
32°C，18ϳ20 時間培養し，発育阻止円径を測定し
ノール，pH 7.0］
1 mlに菌体を懸濁した。Lysostaphin
た。この条件における標準曲線をもとに阻止円径
（和光純薬工業）を 25 m g/ml となるように添加し，
から残存薬剤量を算出し，対照を100%とした抗菌
37°C, 30 分反応させて溶菌後，さらに超音波破砕
活性残存率を計算した。
し，4°C, 30,000ϫg， 30分遠心分離後の上清を粗酵
素液とした。
II．結果
粗酵素液の蛋白濃度は Bio-Rad protein assay
(Bio-Rad) を用いて測定した。
1. ABK 感受性と AG 不活化酵素産生遺伝子
3 種類の AG 不活化酵素産生遺伝子の保有と
6. 抗菌活性残存率の測定
ABKのMIC値との関係を図1に示した。ABKに対
TMK buffer 20 m l に 40 mM ATP 10 m l, 2 mM acetyl
して種々の感受性を示す MRSA 49 株の中では，
CoA 10 m lを加えた中に，被験薬液 10 m l，粗酵素液
aac(6Ј)/aph(2Љ)のみを保有する株が6株，aad(4Ј,4Љ)
50 m lを加えて37°C，2時間反応させた。対照はATP
のみを保有する株が 10 株， aac(6Ј)/aph(2Љ)と
およびacetyl CoAの代わりにTMK bufferを加えた。
aad(4Ј,4Љ)の両方を保有する株が 30 株，aac(6Ј)/
その後，この反応液の 20 m l をペーパーディスク
aph(2Љ)と aph(3Ј)-III の両方を保有する株が 2 株で，
（ADVANTEC, 8 mm，薄型）に滴下し，マイクロ
いずれの遺伝子も保有しない株は1株であった。こ
オーブン（600W，15 秒 ϫ2 回）にて加熱し，反応
のうち， aad(4Ј,4Љ)保有の有無にかかわらず，
図 1．Arbekacin に対する感受性の異なる MRSA 49 株におけるアミノグリコシド不活化酵素産
生遺伝子の有無と arbekacin の MIC 分布
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図 2．Arbekacin に対する感受性の異なる MRSA 49 株における gentamicin と arbekacin の
MIC の関係
aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有しない 11 株は ABK の MIC が
0.25ϳ64 m g/mlに分布し，GMのMICはABKのMIC
0.5 m g/ml以下と低い値であった。aac(6Ј)/aph(2Љ)を
の約 64ϳ128 倍であった。
保有する 38 株の MIC は 0.25ϳ64 m g/ml と幅広く分
布しており，4 m g/ml 以下の ABK 感受性株の中に
aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有する株が26株認められた（図
1）。
3. AG 不活化酵素作用後の ABK および GM の
抗菌活性残存率
ABK に対する感受性の異なる 49 株の中で，
aac(6Ј)/aph(2Љ)と aac(4Ј,4Љ) の両方を保有する 30 株
2. ABK と GM の感受性相関
の中から，ABK 感受性株 (MIC: 0.5, 4 m g/ml) およ
ABK に対する感受性の異なる MRSA 49 株につ
び耐性株 (MIC: 32 m g/ml)，計3株を選択し，それぞ
いて，ABK および GM の MIC 値の相関を図 2 に示
れの菌株より粗酵素液を調製し，ABKおよびGM
した。このうち，aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有しない11株
と反応後の抗菌活性残存率をそれぞれ測定した
は GM の MIC が 0.5 m g/ml 以下であり ABK の MIC
（図3）
。ABK，GMいずれもその残存率はMIC値を
とほぼ同様の値を示した。一方，aac(6Ј)/aph(2Љ)を
反映しており，MICが高い株ほど抗菌活性残存率
保有する 38株はすべて GM のMICが16 m g/ml 以上
が低かった。また，すべての株でABKの抗菌活性
であったが，ABK の MIC は先に述べたように
残存率は GM より高かった。
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図 3．アミノグリコシド不活化酵素作用後の gentamicin (GM)および arbekacin (ABK)の残存率
図 4．1999 年に臨床で分離された MRSA 97 株におけるアミノグリコシド不活化酵素産生遺伝
子の有無と arbekacin の MIC 分布
4. 1999年の臨床分離株におけるABK感受性と
受性であった（図 4）。
不活化酵素産生遺伝子保有
1999年の臨床分離株97株では，90株がaad(4Ј,4Љ)
III．考察
を保有し，このうち24株がaac(6Ј)/aph(2Љ)も保有し
ていた。また，aac(6Ј)/aph(2Љ) のみを保有する株は
臨床分離菌では AG の耐性機構は耐性菌が産生
4 株，いずれの遺伝子も保有しない株は 3 株で，
する AG 修飾酵素による薬剤の不活化が主体であ
aph(3Ј)-IIIを保有する株はなかった。使用した97株
り，リボゾームなどの作用点の変化や細胞膜の薬
に対するABKのMICはすべて1 m g/ml以下であり，
剤透過性の低下に基づくものは少ない3,5)。AG修飾
aac(6Ј)/aph(2Љ)の有無にかかわらず，すべてABK感
酵素にはアセチル化酵素 (aminoglycoside acetyl-
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transferase; AAC)，アデニリル化酵素 (aminoglyco-
を保有する株の中にも ABK 感受性株が存在する
side adenylyltransferase; AAD, またはaminoglycoside
ことが明らかとなった。
nucleotidyltransferase; ANT)，およびリン酸化酵素
(aminoglycoside phosphotransferase; APH)があり，グ
また，ABK と GM の感受性の関係をみると，
aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有しない株はABKとGMのMIC
ラム陽性および陰性菌に広く分布している。黄
がほぼ同等であるのに対し，aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有
色ブドウ球菌が産生する主な酵素は kanamycin 耐
するほとんどの株は ABK の MIC が GM の 1/64ϳ1/
性菌が産生する APH(3Ј)，GM 耐性菌が産生する
128であった。aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有する株のABK
AAC(6Ј)/APH(2Љ)，および tobramycin 耐性で GM 感
とGMに対する感受性の違いは，山下らの報告17)に
受性菌が産生する AAD(4Ј,4Љ)がある 15)。不活化酵
あるように，AG不活化酵素に対する基質特異性の
素による修飾を受けにくい薬剤の開発を目的に合
違いにより，ABK が GM より AAC(6Ј)/APH(2Љ)の
成された ABK は APH(3Ј)による不活化部位を持た
基質となりにくいためと考えられる。今回の検討
ず，AHB (4-amino-2-hydoroxybutyryl)基による立体
で不活化酵素作用後の ABK の抗菌活性残存率が
障害により AAC(6Ј)/APH(2Љ)および AAD(4Ј,4Љ)に
GMより高い結果も，ABKがGMと比較し，AAC(6Ј)/
3)
16)
不活化されにくいことが明らかとなっている。
APH(2Љ)の基質となりにくいことを示唆してる。
今回，我々はマルチプレックスコロニー PCR 法
ABK 耐性は AAC(6Ј)/APH(2Љ)産生遺伝子の増加
を用い， MRSA から AG 不活化酵素産生遺伝子を
や転写活性の上昇によるものと考えられてい
検出し，AG 不活化酵素産生遺伝子と ABK 感受性
る 18,19)。今回，ABK および GM の感受性が低い株
の関係を検討した。感受性から耐性までABK感受
ほど不活化酵素作用後の抗菌活性残存率が低い結
性の異なる株で検討した結果，aac(6Ј)/aph(2Љ)を保
果であった。これはAAC(6Ј)/APH(2Љ)産生量が株に
有しない株は ABK と GM の両者に感受性であり，
よって異なり，産生量の増大により酵素活性が非
aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有する株はすべてGMに耐性を
常に高くなった株が ABK 耐性になると考えられ
示した。一方，aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有する株はABK
た。ABK耐性株はほとんどがGM高度耐性株であ
に対しては感受性から耐性まで幅広い感受性分布
ると報告されているが7,9,17)，今回の検討でも，ABK
を示し，aac(6Ј)/aph(2Љ)保有株の中には ABK 感受
耐性株はすべてGM高度耐性株であった。これは，
性株と耐性株が存在した。また今回の結果では
ABK 耐性株は AAC(6Ј)/APH(2Љ)産生量が多くなっ
aac(6Ј)/aph(2Љ)保有の有無にかかわらず，aad(4Ј,4Љ)
ているため，ABKより基質となりやすいGMに対
の保有は ABK の感受性に影響を与えていなかっ
し，高度耐性を示すと考えられた。しかし池本ら
た。aph(3Ј)-III の保有については ABK が APH(3Ј)-
は，1998年から1999年にかけて呼吸器感染症患者
III の作用点を持たないため，この酵素の産生によ
より分離された MRSA 51 株についての検討で，
る直接的な影響は無いと思われる。しかし，
GM 高度耐性株 (MIC: м256 m g/ml) が 5 株検出さ
aph(3Ј)-III を保有している 2 株がいずれも aac(6Ј)/
れたが，ABK 耐性株は1株のみであったと報告し
aph(2Љ)を同時に保有しABK耐性であったため，両
ている 20)。出口ら 7)および鈴木ら18)の報告でもGM
者の保有が耐性化に何らかの関係がある可能性も
高度耐性株のうち，ABK耐性株は約2割であった。
考えられた。
このことからも，ABK耐性となるのはGM高度耐
これらの結果は堀田らの aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有
9)
しない株は ABK 感受性株であるとの報告と一致
していた。さらに今回の検討によりaac(6Ј)/aph(2Љ)
性株の中の一部であり，必ずしも GM 高度耐性株
がすべて ABK 耐性株ではないと考えられた。
一方，山下ら17)および出口ら7)はABK耐性でGM
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とABKのMICが同じ株を各1株ずつ報告している。
7)
我々の検討でも 49 株のうち 1 株が ABK の MIC が
64 m g/ml，GM の MIC が 128 m g/ml であった。これ
8)
は ABK の耐性メカニズムが AAC(6Ј)/APH(2Љ)によ
る修飾以外にもあることを示唆しており，今後，更
9)
なる検討が必要である。
臨床における aac(6Ј)/aph(2Љ)保有株の分離頻度
10)
とABKの感受性を確認するため，1999年に神奈川
県内で臨床分離された MRSA について検討した。
11)
その結果，97 株中 28 株が aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有し
ていたが，それらはすべて ABK 感受性であった。
12)
また，ABKはGMと比較し不活化酵素の基質とな
り難く，ABK耐性となるためには多量のAAC(6Ј)/
APH(2Љ)産生が必要であると考えられた。
13)
以上の結果から，臨床で分離される MRSA は
aac(6Ј)/aph(2Љ)を保有していてもほとんどの株は
ABK 感受性であることが明らかとなった。
14)
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RELATIONSHIP BETWEEN ARBEKACIN-SUSCEPTIBILITY AND
AMINOGLYCOSIDE-RESISTANT GENE OF METHICILLINRESISTANT Staphylococcus aureus (MRSA)
MAKIKO TABATA, MASAKI SHIMIZU, MINAKO ARAAKE and HIROSHI OGAWA
Pharmaceutical Research Center, Meiji Seika Kaisha, Ltd.
760 Morooka-cho, Kohoku-ku, Yokohama, Kanagawa 222-8567, Japan
The susceptibility to arbekacin (ABK) of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was investigated to find out how it related to aac(6Ј)/aph(2Љ) gene.
In 49 isolates of MRSA for which MIC of ABK ranged from 0.125 to 64 m g/ml, the MICs of ABK for 38
strains carrying aac(6Ј)/aph(2Љ) gene were widely distributed from 0.25 to 64 , whereas those for 11 strains without that gene were all Ϲ0.5 m g/ml.
Residual rate of ABK activity was higher than that of gentamicin after the reaction with each crude enzyme
preparation extracted from 3 isolates of MRSA, carrying aac(6Ј)/aph(2Љ) and aad(4Ј,4Љ) genes.
Furthermore, 97 strains of MRSA isolated at Kanagawa prefecture in Japan in 1999 were all sensitive to
ABK, although 28 strains of them carried aac(6Ј)/aph(2Љ) gene.
These results showed that ABK resistance was not necessarily related to carrying aac(6Ј)/aph(2Љ) gene in
clinical isolates of MRSA.

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