Title Author(s) Journal URL バイオフィルム中のミュータンスレンサ球菌に対するフ ッ化物の抗菌作用 羽野, 早紀 卒業研究論文集, 22(): http://hdl.handle.net/10130/2270 Right Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/ バイオフィルム中のミュータンスレンサ球菌に対するフッ化物の抗菌作用 第 60 期生 35 番 羽野 早紀 要 約 齲蝕は歯面に付着した細菌が糖を代謝して産生する酸によって引き起こされる疾患である．その 主たる原因菌は Streptococcus mutans，Streptococcus sobrinus と言われており，これらの菌種は その付着性と酸産生能から高い齲蝕病原性を示す．デンタルプラーク(バイオフィルム)は菌とその 産生した多糖により形成されており，バイオフィルムに対し抗菌薬等による除去はその浸透性の面 から難しいと言われている．フッ化物は浮遊細菌に対しては作用を示しているが，バイオフィルム に対する作用についての報告は少ない．フッ化物は抗菌薬に比べて分子量が小さく，バイオフィル ムに浸透する可能性がある．そこで今回はフッ化物のバイオフィルムに対する作用を調べるため， 歯磨剤に含まれるモノフルオロリン酸ナトリウム(MFP)をミュータンスレンサ球菌群に作用させ， その効果を調べた．バイオフィルム量を測定した実験では MFP によるバイオフィルム形成の抑制 効果はほとんど見られなかった．またバイオフィルム中の生菌数を ATP 産生量により測定した結 果，MFP を加えることによって ATP 産生量の増加が見られた．浮遊細菌数を測定した実験では MFP により発育抑制効果が見られた．これらの実験結果から歯磨剤に含まれるフッ化物濃度では バイオフィルム中の S.mutans と S.sobrinus に対し，ほとんど抑制効果が見られないということが わかった．歯磨きを行う際には取り残されたバイオフィルムに対してフッ化物の抗菌作用が期待で きないということが考えられるため，バイオフィルム中の菌への効果を期待するのならばバイオフ ィルムを確実に除去し，浮遊細菌に対して抗菌作用を働かせる必要があると考える． キーワード：Streptococcus mutans，Streptococcus sobrinus，バイオフィルム，モノフルオロリ ン酸ナトリウム(MFP)，抗菌作用 緒 言 バイオフィルムとは微生物などがコロニー れらの細菌はバイオフィルムを形成して歯面 に強固に付着し，病原性を発揮する． 状に凝集し，みずからが産生した多糖体を主 齲蝕予防の手段の１つとして様々なフッ化 成分とするグリコカリックスに囲まれ，固相 物の応用方法が行われているが，その中でも の物質表面に付着した細菌の集合体である． フッ化物配合歯磨剤は以前から行われ，その 歯の表面にはデンタルプラーク(バイオフィ 効果も認められている．2000 年３月に 21 世 ルム)が形成される．齲蝕は歯面に付着した細 紀のわが国における国民健康づくり対策とし 菌が糖を代謝して産生する酸によって引き起 て健康日本 21 が策定された２）．そのなかの目 こされる疾患である．成熟したバイオフィル 標の１つとして「学齢期におけるフッ化物配 ム中で高酸産生菌が占める割合が多いと齲蝕 合歯磨剤の使用割合を 90％以上にする」が掲 を発症する危険が高くなると言われているが げられ，フッ化物配合歯磨剤への応用が推奨 １） ， そ の 主 た る 原 因 菌 は Streptococcus されている３，４）．フッ化物配合歯磨剤はホー mutans，Streptococcus sobrinus である．こ ムケアへの導入がしやすく，日本で市販され ている歯磨剤のなかでフッ化物配合歯磨剤の またフッ化物としてモノフルオロリン酸ナト 占める割合は，1990 年台初頭の約 40％から リウム(MFP)を使用した． 現在の約 87％へと，この 10 数年間で倍増し ２．実験方法 ５） ている ．フッ化物応用は，齲蝕予防方法の 各種菌に５μg／ml ヘミン，0.5μg／ml 中でも最も効果的な手段の１つであると言わ メナディオンを加えた Tryptic Soy Broth れている．その理由として，フッ化物は形成 TSB，(Beckon Diskinson and Co， Sparks， 期におけるエナメル質の耐酸性増強，結晶性 MD ， USA) を 接 種 し ， 嫌 気 培 養 し た ． の改善，フルオロアパタイトの生成や初期脱 S.mutans および S. sobrinus の各種菌を TSB 灰部の再石灰化の促進作用をもつ．その作用 に接種したものを細胞培養用マルチプレート に加え S.mutans を中心とした齲蝕病原性菌 96Ｆ(住友ベークライト，東京)に接種した． に対して，菌体内解糖系におけるエノラーゼ バイオフィルム量を測定した実験ではこのセ の阻害と共に菌体内への基質取り込みの抑制 ットを１日間，嫌気条件下に 37℃で培養しバ によって酸産生の低下を起こすことが報告さ イオフィルムを形成させた．ここから培地を ６，７） れている ．これらの作用により齲蝕の抑 制が引き起こされると言われている． 口腔内には 500 種類以上の細菌が存在し， デンタルプラーク１mg あたり，１０８から１ 取り除き，TSB または 0.01％ MFP 添加 TSB を加え，再び１日間嫌気培養した．翌日，液 体培地を吸引し滅菌精製水で２回洗浄した後 １％ Crystal violet を加え，バイオフィルム ０ の菌が存在している ．これに抗菌薬を用 を 15 分間染色した．滅菌精製水で洗浄後エ いてもバイオフィルムに浸透することが出来 タノールを加え，バイオフィルムに吸着して ないため，浮遊細菌へ作用させた時に比べ， いる色素を抽出し，吸光度をマイクロプレー その効果が非常に低いことが報告されている トリーダー 9,10)．考えられる原因として，バイオフィルム キュラーデバイス)を用い OD595 を測定した． 中の細菌は静止状態にあり代謝活性が低いた バイオフィルム中の生菌数の測定は ATP 産 め代謝を阻害するような抗菌薬は作用できな 生量の測定によって行った．上記と同様に１ 11)，分子量の大きな物質のバイオフィ 日培養したバイオフィルムにフッ化物添加培 ルム中に浸透できないという点が挙げられて 地と非添加培地を加え，これを再び嫌気培養 いる．しかしフッ化物は抗菌薬と比較して， した．これに BACTITER kit を 100ml 加え， 分子量も小さいためバイオフィルムに浸透で 細菌の ATP 産生量を測定した．浮遊細菌数 きる可能性がある 12)．そこで今回はフッ化物 を測定した実験では予備培養した菌をフッ化 がバイオフィルムに有効かどうかを明らかに 物添加培地及び，非添加培地に接種し１日嫌 するため，フッ化物応用の中でも比較的導入 気培養したものを，OD595 をマイクロプート しやすいフッ化物配合歯磨剤に着目し，歯磨 リーダー SpectraMax M50 を用いて測定 剤に含まれるフッ化物を用いて，バイオフィ した． ９ いこと ８） SpectraMax M50(日本モテレ ルム中の S.mutans と S.sobrinus に対する抗 菌作用について，実験を行い比較検討した． 結 果 Crystal violet 染色によるバイオフィルム 方 法 １．菌種及び材料 量を測定した実験では S.mutans は MFP によ って 30.5％，S.sobrinus は 36.6％程度のバ 本 研 究 で は 齲 蝕 病 原 菌 で あ る S.mutans イ オ フ ィ ル ム 形 成 が 抑 制 さ れ て い た (P ＜ ingbritt 株と S.sobrinus 6178 株を供試した． 0.05)．ATP 産生量によるバイオフィルム中 の生菌数の測定では MFP により S.mutans で 考える． は 86.3％，S.sobrinus では 82.2％の増加が フッ化物配合歯磨剤の齲蝕予防メカニズム 見られた(P＜0.05)．浮遊細菌数を測定した実 は，おもに歯磨き終了後に歯面，歯垢，粘膜 験では S.mutans は MFP により菌量が 96.4％ 及び唾液などの口腔環境に保持されたフッ素 減少し，S.sobrinus は MFP によって 73.3％ イオンによる再石灰化作用と細菌の酸産生抑 減少した． 制効果であるといわれているが，その応用効 果は使用するフッ化物の量，作用時間，洗口 考 察 回数及び方法などによって大きく左右される 今回の実験では，浮遊細菌に対しては ことが予測される 13)．ブラッシングに関する S.mutans が 96.4％，S.sobrinus が 73.3％の 研究から，フッ化物配合歯磨剤の効果的な利 抑制が見られ，バイオフィルム中で発育させ 用法として１日２回以上使用すること，継続 た各種菌の吸光度を測定した実験では 的に使用すること，実施時間は就寝時が効果 S.mutans が 30.5％，S.sobrinus が 36.6％程 的であること，使用する歯磨剤の量を 0.5ｇ 度の抑制が見られた．また ATP 産生量を測 以上とすること，洗口回数をなるべく少なく 定 し た 実 験 で は S.mutans が 86.3 ％ ， すること，ブラッシング直後の飲食を避ける S.sobrinus が 82.2％の増加が見られた．本実 ことなどが挙げられている 14)．これらの条件 験により，ホームケアで使用される 1000ppm を満たすとともに，また確実にバイオフィル 程度のフッ化物濃度では浮遊細菌の ムを除去することで歯質の再石灰化作用だけ S.mutans と S.sobrinus に対しては抑制効果 でなく，細菌の酸産生抑制効果も期待できる が見られたが，バイオフィルム中の各種菌に のではないかと考える．歯磨きの最大の目的 は抑制効果はほとんど見られなかったことか は歯垢を除去することにあるが，小窩裂溝や ら，フッ化物は浮遊細菌に対しては抗菌作用 歯間部など清掃が不十分となる部分もあり， を示すが，バイオフィルム中の各種菌に対し 歯垢を完全に除去することは不可能と考える てはほとんど抗菌作用を示さないということ べきである 15)．その場合に，歯磨剤に添加さ がわかった．このことから MFP のバイオフ れているフッ化物が補助的効果を示すと考え ィルム中の菌への効果を期待するためには歯 られているが，取り残されたバイオフィルム 磨きを行う際にバイオフィルムを確実に除去 が厚い場合，その効果が低いと考えられる． し，浮遊細菌に対して歯磨剤に含まれるフッ 以前の研究では 1000ppm を超える濃度のフ 化物の抗菌作用を働かせる必要があると考え ッ化物配合歯磨剤については，濃度が る．今回はフッ化物配合歯磨剤で用いられて 500ppm 上昇するごとに臨床効果が６％ずつ いるフッ化物濃度のみを対象に実験を行い， 増加すると言われていることから，バイオフ その他のフッ化物局所応用であるフッ化物歯 ィルムの取り残しが多い時にはフッ化物の濃 面塗布法やフッ化物洗口法で用いられている 度を上げる必要があるということが考えられ フッ化物濃度については実験を行わなかった る 16)． が，本実験結果からフッ化物配合歯磨剤より 本研究では培地に S.mutans と S.sobrinus も低濃度のフッ化物を用いている洗口法を行 を１日嫌気条件下にて発育させたバイオフィ う際にもバイオフィルム中の細菌に対して抗 ルムを用いて行った．しかし実際の口腔内で 菌作用が期待できないと考えられるため，事 は，S.mutans と S.sobrinus のみではなく， 前にバイオフィルムを除去することで，フッ 複数の菌種によってバイオフィルムが形成さ 化物の抗菌作用の低下を防ぐことができると れるため，今後は複数の菌種で実験を行って 謝 いくこと，またバイオフィルムは形成されて 辞 から日数を増すごとに厚さも変化してくるた 稿を終えるにあたり，研究の計画と遂行に め，形成時間および厚さの異なったバイオフ ひとかたならぬ御指導，御助言を賜りました ィルムで実験を行っていくことも必要である 微生物講座石原教授をはじめ微生物学講座の かもしれない．さらに今回は歯磨剤のフッ化 先生方に厚く御礼申し上げます． 物濃度である 1000ppm で実験を行ったため， フッ化物の局所応用である歯面塗布で用いら 参考文献 れているような高濃度のフッ化物のバイオフ １)浜田茂幸，大嶋隆，高野吉郎，青葉孝昭， ィルムに対する効果については，本研究結果 竹原直道，今里聡，川端重忠，高橋信博，山 から推測出来ないが，効果が上昇する可能性 下喜久，藤原卓，佐藤裕，五十嵐武，村上幸 がある．よって今後は高濃度のフッ化物を用 孝，畑真二，飯島洋一，岡橋暢夫，香西克之， いて実験を行っていく必要もあるのではない 久保山博子，本川渉，田上順次，渡部茂，千 かと考える． 田彰：新・う蝕の科学，東京，医歯薬出版株 今回は細菌の代謝についての実験を行った 式会社，第１版，2006，67 ため，歯面への付着について実験は行ってい ２)末高武彦，安井利一，山下喜久，雫石聰， ないが，齲蝕の発症機序のなかでは，細菌の 前野正夫，廣瀬公治：新口腔保健学，東京， 歯面への付着が重要なステップとなる．用い 医歯薬出版株式会社，第１版，2009，8 たフッ化物が付着抑制効果を示すなら，発育 ３)美濃口玄，堀井正雄，牛尾光圀：弗化物混 抑制に加え，付着および定着を阻害すること 入歯磨粉のよる齲蝕予防 による齲蝕抑制の効果も期待できるかもしれ －260，1952 ない．付着抑制機序としては，直接細菌の付 ４)花田信弘，宮武光吉：21 世紀における国 着因子に作用して阻害する方法と，ミュータ 民健康づくり運動(健康日本 21)について，口 ンスレンサ球菌がスクロースから不溶性グル 腔衛生学会雑誌 50：410－418，2000 カンを産生する時に用いるグルコシルトラン ５)花田信弘，野村義明，西川原総生，奥田健 スフェラーゼの酵素活性を阻害する方法が考 太郎，岡山秀仁，坂本春生，竹内博明，冨澤 えられる．付着・定着抑制はプラーク形成阻 利予，山吹綾乃，沼部幸博，竹内寛子，川辺 害に直接結びつき，プラーク形成の阻害を通 良一，福田雅臣，伊藤中，福田準子，竹永志 して齲蝕予防に繋がる 17)．結果，後期プラー 穂，白井美智子，品田佳世子：ぺリオ･カリエ ク構成細菌である歯周病原細菌との橋渡し的 スの予防に活かす抗菌薬・殺菌薬とフッ化物， 役割をする Fusobacteriumnucleatum などの デンタルハイジーン別冊，東京，医歯薬出版 付着に影響を与えることと考える． 株式会社，東京，2005，113－119 実施成績１ 257 ６)山本秀樹，高江洲義矩，松久保隆： 結 論 歯磨剤に含まれるフッ化物濃度では浮遊細 Streptococcus mutans Ingbritt 株の解糖活 性と代謝産物に及ぼすフッ化ナトリウムの影 菌に対して抑制効果を示すが，バイオフィル 響：歯科学報 86(１)，51－67，1986 ム中の細菌に対してはほとんど抑制効果を示 ７)米満正美，本多丘人，於保秀彦，安細敏弘， さないことがわかった．バイオフィルムを除 吉田明弘，粟野俊行，花田信弘，井上昌一， 去することで，フッ化物の抗菌作用が期待で 伊藤博夫，小林清吾，小関健由，雫石聰，埴 きるものと考える． 岡隆，磯崎篤則，八重垣健，千葉逸朗，鶴本 明久，宮崎秀夫，葭原明弘，稲葉大輔，森田 学，岸本悦央，筒井明仁，川口陽子，柳沢茂， 木本一成，可児瑞夫，可児徳子，小林清吾， 尾崎哲則，平田幸夫，筒井美惠：新予防歯科 山下文夫，荒川浩久，八木稔，岩本義史，丹 学，東京，医歯薬出版株式会社，第 4 版，2010， 羽源男，平田幸夫，境脩，佐久間汐子，田浦 99－101 勝彦，筒井昭仁 日本口腔衛生学会 ８)奥田克爾，石原和幸，加藤哲男：最新口腔 物応用研究委員会編：フッ化物応用と健康― 微生物学，一世出版，第 2 版，東京，2007， う蝕予防効果と安全性― ，口腔保健協会，第 383－384 1 版，東京， 1998，125－126 フッ化 デンタ 14)八木稔，藤山友紀，佐久間汐子，宮崎秀夫： ルプラーク細菌との戦い，医歯薬出版株式会 園児および学童期におけるフッ化物配合歯磨 社，第１版，東京，2004，26 剤の使用状況，口腔衛生学会 51(４)：422－ 10)田上順次，花田信弘，桃井保子：う蝕学－ 425，2001 チェアサイドの予防と回復のプログラム－永 15)フッ化物応用の手引―フルオロライド 末書店，第 1 版，京都，2008，185－186 AtoZ―：東京都歯科医師会，第１版東京， 11)Costerton ， J ． W ． etal ．： Bacterial 2003 ，88－89 biofilm ： a common cause of persistent 16)WHO infections．Science，284：1318～1322，1999 Health Status and Fluorides Use ： 12) 脱 灰 と 再 石 灰 化 － International Tooth Fluorides and oral health，WHO technical Enamel Symposium－ ，川崎堅三，John． report series， Geneva， 1994，26－33 G．Clement，わかば出版株式会社，第 1 版， 17)デンタルバイオフィルム 東京，2009，143－144 軍団とのバトル：奥田克爾，医歯薬出版株式 13)飯塚喜一，眞木吉信，安藤雄一，森下真行， 会社，第１版，東京，2010，46 ９)奥田克爾：口腔内バイオフィルム Expert Committee on Oral 恐怖のキラー [OD595] [OD595] 80 80 70 70 60 60 50 ＊ 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 ＊ 0 mutans F＋ Ｆ－ 図１：バイオフィルム中の S.mutans に sobrinus F＋ Ｆ- 図 2：バイオフィルム中の S.sobrinus に 対するフッ化物の発育抑制 ＊(P＜0.05) 対するフッ化物の発育抑制 ＊(P＜0.05) [OD595] [OD595] 8000 8000 7000 7000 6000 6000 5000 5000 4000 4000 3000 3000 2000 2000 ＊ 1000 0 ＊ 1000 0 mutans F＋ F－ sobrinus F＋ Ｆ－ 図 3：バイオフィルム中の S.mutans の 図４：バイオフィルム中の S.sobrinus の ATP 産生量 ＊(P＜0.05) ATP 産生量 ＊(P＜0.05) [OD595] [OD595] 0.3 0.3 0.25 0.25 0.2 0.2 0.15 0.15 0.1 0.1 0.05 0.05 0 0 mutans F＋ F－ 図５：S.mutans の浮遊細菌に対するフッ化 物の発育抑制 sobrinus F＋ F－ 図６：S.sobrinus の浮遊細菌に対するフッ化 物の発育抑制
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