透析液中エンドトキシンの測定 −よりよい透析医療のために− E N D O T O X I N 透析医療現場における高性能膜の普及や HDF の施行に伴い、 透析液の清浄化が重要視されています。 近年、透析に用いられる高性能膜の逆濾過、逆浸透に伴い 透析液中のエンドトキシンが血中に移行する危険性が明らかにされてきました。 また、透析時に極めて微量のエンドトキシンによって繰り返される慢性的なサイトカインの誘導が、 透析アミロイド症などの長期透析合併症に関与する可能性も報告されています。 これらに基づき、ISO、日本透析医学会（JSDT）、日本臨床工学技士会（日臨工）などから、 透析用水や各種透析液の清浄化の指標の一つとして、 エンドトキシン管理基準や測定法に関しての指針が報告され、より厳しい水質管理が求められています。 生化学バイオビジネスは透析液中エンドトキシン測定に必要な試薬をはじめ、 測定用機器、安定化剤入り透析液採取管を含む器具類まで幅広いラインナップで、 エンドトキシン測定を通じ、透析液の清浄化をサポートしています。 高感度測定システム 透析医学会基準対応 エンドトキシン濃度0.001∼0.1EU/mLを 30分間で測定 2 エンドトキシンとは？ エンドトキシン （細菌内毒素） はグラム陰性菌の外膜を構成する成分のひとつで、経口的に摂取しても毒性は示しませんが、血液中に 入るとマクロファージからの炎症性サイトカインの産生を誘導し、発熱、低血圧症、全身的な血液凝固、致死的ショック等、極めて微量で 多彩な生物活性を示します。エンドトキシンの管理には、カブトガニの血球から抽出された成分より作られたLAL 試薬 （ライセート試薬） が 用いられています。 3 ▶▶▶ 透析液水質基準 日本透析医学会 基準 2008 日本臨床工学技士会 ガイドラインVer1.07 ISO 基準案 2009 生菌数 ET 活性値 生菌数 ET 活性値 生菌数 ET 活性値 （CFU/mL）未満 （EU/mL） 未満 （CFU/mL）未満 （EU/mL） 未満 （CFU/mL）未満 （EU/mL）未満 10 0.01 0.25 目標 1 目標 0.001 1 0.001 100 透析用水 100 Dialysis water アクション 0.050 レベル 50 100 透析液 100 Dialysis fluid 0.050 0.5 アクション レベル 50 超純粋透析液 0.1 Ultrapure 0.001 0.03 0.1 Dialysis fluid 注射用水の水質レベルを推奨する 適切な局方の 置換用透析液 10-6 Substitution 0.001 要求事項に準じ、 検出限界未満 生存する微生物が 但し、専用の装置を用いる場合は、装置 0.03 各施設の透析液安全管理委員会で適切に いないこと 生菌数測定 検体量 ・超純粋透析液 10mL 以上 製造販売メーカーの定める管理基準に準じ、 管理し臨床運用する ・透析液 10∼25mL 以上 1000mL ・透析用水 1∼100mL ・透析液 1∼100mL ・逆ろ過透析液を用いたマシーン 10∼100mL サンプリングスケジュールは、各装置が 測定頻度 ・透析用水 1回／ 3カ月 少なくとも年 1 回サンプリングされる ・透析用水 1 回／月以上 ・透析液 2 台／月以上、1年で全台 ようにし、頻度は月 1 回モニタリングする ・透析液 1 回／月以上、1 年で全台 ことが多い 透析液水質基準 （文献 2より, 一部改変） ▶▶▶ 透析ラインからのエンドトキシンサンプル採取ポイント ★ 水道水 ★ 活性炭 軟水化装置 ★ 逆浸透装置（RO） ★ ROタンク ★ ★ A 液タンク セントラル透析液供給装置 ★ B 液タンク ★ ★ エンドトキシン捕捉フィルター （ETRF） エンドトキシン捕捉フィルター （ETRF） ★ エンドトキシン捕捉フィルター （ETRF） エンドトキシン捕捉フィルター （ETRF） ★ エンドトキシン捕捉フィルター （ETRF） ★ ★ エンドトキシン捕捉フィルター （ETRF） ★ ★ルーチンモニターで確認するポイント ★必要に応じて確認するポイント A、B 原液のエンドトキシン濃度を測定する場合は、A 原液は 40 倍以上、B 原液は 20 倍以上希釈した後、測定を行ってください。 4 ★ EN D OT O X I N エンドトキシン測定用試薬・機器 カブトガニ血球抽出液（ライセート） より調製された LAL 試薬（ライセート試薬） を用いてエンドトキシンを検出または 定量できます。これはライセートにエンドトキシンが加わるとエンドトキシン感受性のセリンプロテアーゼ前駆体である C 因子が活性化され、それに続くカスケード反応が活性化されることに基づいています。 透析液はこの反応系に対して、阻害あるいは促進的に作用する場合があります。 また、透析液中のエンドトキシンは各種素材の容器に吸着されやすく、その活性はサンプルを保存することで低下することが 知られています。したがって、透析液中のエンドトキシン測定には、阻害・促進の影響を受けにくく正確な測定を行うことが できる試薬と安定化剤を含む採取・保存容器が必要となります。 生化学バイオビジネスでは、基準に適合し、簡便かつ正確にエンドトキシン測定ができる試薬・機器および採取管を 提供しています。 ▶▶▶ 特徴 検体数に合わせてシステムを選択できる ・多検体測定用 ・少数検体測定用 ▶ 日本透析医学会基準対応 ▶ 比色法試薬で(1→3)-β-D-グルカンと反応することなく、エン ドトキシンにのみ特異的に反応 ▶ 測定時間 30 分で測定終了し、透析施行直前の測定が可能 ▶ 検出限界 0.001EU/mL （1EU/L） と高感度の測定が可能 ▶ ▶▶▶ LAL 試薬（ライセート試薬） の測定原理（概略図） Endotoxin Factor C Activated Factor C Activated Factor B Factor B Clotting enzyme Proclotting enzyme Boc-Leu-Gly-Arg-pNA Boc-Leu-Gly-Arg-pNA H-Gly・・Leu-Gly-Arg-Lys・・Arg-Gly・・Ser-OH 1 Boc-Leu-Gly-Arg-OH ＋ pNA 16 17 18 19 Coagulogen 46 47 H-Gly・・Leu-Gly-Arg-OH 1 16 17 175 Giy・・Ser-OH 47 18 175 2 （S-S） Coagulin 405nm カイネティックアッセイ 比色法 （発色合成基質法） Gel ゲル化法 比濁法 5 エンドトキシン測定用試薬・機器 −少数検体測定用− ▶▶▶ 特徴 測定に必要な本数だけ使用できるシングルタイプの比色法試薬および機器 ・EGリーダー SV-12 ・エンドスペシー ES-24Sセット ▶ 測定時間：30 分 ▶ 検出限界：0.001EU/mL （1EU/L） ▶ ▶▶▶ 必要な機器、試薬 測定装置 EGリーダー SV-12 EGリーダー SV-12はシングルバイアルを用いたエンドトキシン測定 装置で、試薬の無駄なく測定を行うことができます。シングルバイアルを 本体に挿入することにより、随時測定が開始され、加温、測定、測定 結果の算出まで、自動的に行うことができます。 1∼12 検 体の同 時 測 定が可 能で、繰り返し測 定することで最 大 48 検体までの測定が可能です。 品 名 Code 包 装 価 格 1台 ￥980,000 900630 EGリーダー SV-12 セット内容 EGリーダー SV-12 本体…………………………………………… 1 台 ソフトウェアインストール CD-ROM………………………………… 2 枚 シリアル通信ケーブル……………………………………………… 1 本 電源コード…………………………………………………………… 1 本 遮光カバー…………………………………………………………… 1 本 電源プラグ 3 極→2 極変換アダプター…………………………… 1 個 マニュアル・保証書………………………………………………… 1 本 測定用試薬 エンドスペシー ®ES-24Sセット エンドスペシー ES-24Sセットは比色法によるエンドトキシン測定用試 薬セットで、エンドトキシンのみに特異的に反応します。 少数検体測定に最適で、測定に必要な本数だけ使用できるシングル タイプ包装で、バイアルをそのまま反応管として使用することができます。 Code 品 名 ® 包 装 1セット 価 格 ￥33,000 020170 エンドスペシー ES-24Sセット セット内容 ③緩衝液…………………………………………………… 2.8mL×4 本 ④LAL 試薬 （C 系ライセート）……………………………………… 24 本 ⑤蒸留水（エンドトキシン、 β- グルカンフリー）…………… 2.8mL×2 本 エンドトキシン標準品 CSE-Lセット エンドトキシン測定用の標準品セットで、エンドスペシー ES-24Sセットと 組み合わせて使用します。添付の蒸留水 （エンドトキシン、 β-グルカンフリー） 1 本全量で溶解したとき、ラベルに記載された濃度になるよう調製されて います。 Code 6 品 名 包 装 価 格 020055 エンドトキシン標準品 CSE-Lセット セット内容 ⑤蒸留水 （エンドトキシン、 β- グルカンフリー）…………… 2.8mL×6 本 ⑥標準品 E.coli O113:H10 株由来エンドトキシン……………… 3 本 1セット ￥10,000 ※パソコンはセットには含まれません。 EN D OT O X I N 器具 品 名 包 装 900516 Code トキシペットサンプラー 200 1個 ￥25,000 マイクロピペット 900517 トキシペットサンプラー 1000 1個 ￥25,000 マイクロピペット 900540 トキシペットチップ 200 500 本 ￥27,000 エンドトキシンフリー チップ（検体の添加、希釈） 900545 トキシペットチップ 1000 100 本 ￥16,000 エンドトキシンフリー チップ（標準品の溶解、希釈） 800807 乾熱滅菌アルミキャップ 100 個 ￥9,600 ES-24Sキャップ 800804 乾熱滅菌アルミ箔 100 枚 ￥1,500 試薬瓶開封後カバー 800798 乾熱滅菌試験管 アルミキャップ付 (11.6x65mm) 100 本 ￥11,000 エンドトキシン測定用 ガラス器具 （検体採取、希釈） 800826 HDチューブ 50 本 ￥22,000 安定化剤入り透析液採取管 （透析液の採取、保存） 900675 試験管ミキサー TM-251 1台 ￥30,000 試験管ミキサー （検体、標準品の攪拌） ▶▶▶ 価 格 備 考 少数検体測定 −エンドスペシー ®ES-24S・EGリーダー SV-12を用いた測定− 測定の流れ Ⅰ. EGリーダー SV-12：ウォームアップ 1. EGリーダー SV-12 本体にパソコンを接続し、電源を入れます。 2. パソコン画面上のEGリーダー SV-12ソフトアイコンをクリックします。 3. 15 分間のウォームアップが自動的に始まります。 ウォームアップ終了後、測定を行ってください。 （温度表示部が 37.0であることを確認してください） Ⅱ. 測定準備 4. EGリーダー SV-12の設定を行います （既存ファイルを開き、適宜設定することも可能です） 。 • バイアルパターン • 標準液の濃度 5. EGリーダー SV-12のアルミブロックを遮光板で覆い、ベース補正を行います。 ＊ ベース補正は試薬バイアルをセットせずに行ってください。 6. 測定開始アイコンをクリックします。カブトガニアイコンが回転して、測定待機状態になります。 7. 必要数のエンドスペシー ES-24SのLAL 試薬バイアルを開封し、乾熱滅菌アルミキャップを被せます。 8. 標 準 品のバイアルに添 付の蒸 留 水 1 本 全 量を添 加し、アルミ箔を被せ試 験 管ミキサーで少なくとも 1 分 間 攪 拌して 標準液を調製します。 ＊ 標準液の濃度は試薬バイアル記載の濃度となります。 Ⅲ. 測定・結果確認 9. 必要数の LAL 試薬バイアルのすべてに緩衝液 200μLを添加し、アルミキャップを被せ、試験管ミキサーで2 秒程度攪拌し 溶解します。 ＊ 緩衝液で溶解後は、速やかに10、11の操作を行ってください。 10. LAL 試薬バイアルにブランク液（蒸留水、St1）200μLを添加し、アルミキャップを被せ、試験管ミキサーで2 秒程度攪拌します。 11. LAL 試薬バイアルをEGリーダーSV-12の所定のウェルに挿入します。バイアルをセットしたウェルから自動的に 37℃、 30 分で 測定が始まります。 12. 標準液 （St2） 、検体についても10、11と同様の作業を繰り返します。 13. 測定終了後は測定結果アイコンをクリックすると、測定結果が表示されます。 7 エンドトキシン測定用試薬・機器 −多検体測定用− ▶▶▶ ▶ ▶ ▶ ▶▶▶ 特徴 多検体測定に適したマルチテストタイプの比色法測定試薬および機器 ・ウェルリーダー MP-96 ・エンドスペシー ES-50Mセット 測定時間：30 分 検出限界：0.001EU/mL （1EU/L） 必要な機器、試薬 測定装置 ウェルリーダー MP-96 ウェルリーダー MP-96はマイクロプレートを用いたエンドトキシン測定 装置で、検体と試薬のミキシングから加温、測定、測定結果の算出まで、 すべてを自動的に行うことができます。 品 名 Code 包 装 価 格 1台 ￥1,700,000 900625 ウェルリーダー MP-96 セット内容 ウェルリーダー MP-96 本体………………………………………… 1 台 DOS-V 用接続ケーブル……………………………………………… 1 本 ソフトウェアインストール CD-ROM………………………………… 1 枚 電源コード…………………………………………………………… 1 本 電源プラグ 3 極→2 極変換アダプター……………………………… 1 個 マニュアル・保証書…………………………………………………… 1 本 ※パソコンはセットには含まれません。 測定用試薬 エンドスペシー®ES-50Mセット エンドスペシー ES-50M セットは比色法によるエンドトキシン測定用 試薬セットで、エンドトキシンのみに特異的に反応します。 多検体測定に適したマルチテスト包装で、マイクロプレートカイネティック法で50 回測定が可能です。 Code 品 名 包 装 価 格 1セット ￥28,000 020150 エンドスペシー®ES-50Mセット セット内容 ③緩衝液…………………………………………………… 2.8mL×1 本 ④LAL 試薬（C 系ライセート）………………………………………… 1 本 ⑤蒸留水 （エンドトキシン、 β- グルカンフリー）…………… 2.8mL×1 本 エンドトキシン標準品 CSE-Lセット エンドトキシン測定用の標準品セットで、エンドスペシー ES-50Mセットと 組み合わせて使用します。添付の蒸留水 （エンドトキシン、 β-グルカンフリー） 1 本全量で溶解したとき、ラベルに記載された濃度になるよう調製されて います。 Code 8 品 名 包 装 価 格 1セット ￥10,000 020055 エンドトキシン標準品 CSE-Lセット セット内容 ⑤蒸留水（エンドトキシン、 β- グルカンフリー）…………… 2.8mL×6 本 ⑥標準品 E.coli O113:H10 株由来エンドトキシン……………… 3 本 EN D OT O X I N 器具 Code 品 名 900510 トキシペットディスペンサー 900520 包 装 価 格 備 考 1個 ￥33,000 連続分注器 トキシペットディスペンサー用シリンジ 50 本 ￥26,000 試薬の溶解・分注 900570 トキシペットプレートLP 50 枚 ￥31,000 エンドトキシンフリー マイクロプレート （反応容器） 900516 トキシペットサンプラー 200 1個 ￥25,000 マイクロピペット 900517 トキシペットサンプラー 1000 1個 ￥25,000 マイクロピペット 900540 トキシペットチップ 200 500 本 ￥27,000 エンドトキシンフリー チップ（検体の添加、希釈） 900545 トキシペットチップ 1000 100 本 ￥16,000 エンドトキシンフリー チップ（標準品の溶解、希釈） 800804 乾熱滅菌アルミ箔 100 枚 ￥1,500 800798 乾熱滅菌試験管 アルミキャップ付 (11.6x65mm) 100 本 ￥11,000 エンドトキシン測定用 ガラス器具 （検体採取、希釈） 800826 HDチューブ 50 本 ￥22,000 安定化剤入り透析液採取管 （透析液の採取、保存） 900675 試験管ミキサー TM-251 1台 ￥30,000 試験管ミキサー （検体、標準品の攪拌） ▶▶▶ 試薬瓶開封後カバー 多検体測定 −エンドスペシー ®ES-50M・ウェルリーダー MP-96を用いた測定− 測定の流れ Ⅰ. ウェルリーダー MP-96：ウォームアップ 1. ウェルリーダー MP-96 本体にパソコンを接続し、電源を入れます。 2. パソコン画面上のウェルリーダー MP-96ソフトアイコンをクリックします。 3. 15 分間のウォームアップが自動的に始まります。 ウォームアップ終了後、測定を行ってください。 （温度表示部が 37.0であることを確認してください） Ⅱ. 測定準備 4. ウェルリーダー MP-96の設定を行います （既存ファイルを開き、適宜設定することも可能です） 。 • 測定時のパラメーター • ウェルパターン • 標準液の濃度 5. 標 準 品のバイアルに添 付の蒸 留 水 1 本 全 量を添 加し、アルミ箔を被せ試 験 管ミキサーで少なくとも 1 分 間 攪 拌して 標準液を調製します。 ＊ 標準液の濃度は試薬バイアル記載の濃度となります。 Ⅲ. 測定・結果確認 6. LPプレートの所定のウェルに、ブランク液（蒸留水、St1）、標準液（St2）、検体を50μＬづつ添加し、プレートの蓋を被せて おきます。 7. エンドスペシー ES-50MセットのLAL 試薬のバイアルを開封します。緩衝液 1 本全量を添加し、アルミ箔を被せ、泡立てないように 混和溶解します。 ＊ 試験管ミキサーは泡立てる原因となりますので、使用しないでください。 8. プレートのブランク液、標準液、検体が添加されたすべてのウェルに溶解したエンドスペシー ES-50Mを50μＬずつ添加します。 9. プレートの蓋を被せたまま、ウェルリーダー MP-96にセットします。 10. Measureアイコンをクリックします。自動的に測定が開始されます。 11. 測定終了後はList Resultアイコンをクリックすると、測定結果が表示されます。 9 サンプルの採取法 ▶▶▶ T 字サンプリングポート ①T 字型サンプリングポートのキャップ部分を消毒用アルコール綿できれいに拭きます。 ②注射針を付けたディスポーザブルシリンジを用いて、シリンジ全体を透析液で満たす ように吸引した後、一度破棄します。 ③再度シリンジを刺して数回ポンピングを繰り返します。 ④採取した透析液を乾熱減菌試験管に移しすぐに測定を行うか、HDチューブ＊に 採取して冷蔵保存します。 ▶▶▶ カプラーからの採取 ①10 分以上液を流します。 ②注射針を付けたディスポーザブルシリンジを用いて、シリンジ全体を透析液で満たす ように吸引した後、一度破棄します。 ③再度ディスポーザブルシリンジで、流水の透析液から吸引採取します。 ④採取した透析液を乾熱減菌試験管に移しすぐに測定を行うか、HDチューブ＊に 採取して冷蔵保存します。 HD チューブ 透析液中エンドトキシン測定用の透析液の採取および保存用真空採取管 （安定化剤入り） です。安定化剤を含んでいますので、透析液中エンドトキシン の経時的な失活や容器への吸着を防ぎます。採取された透析液は4℃保存で 7日間安定です。 日本 HDF 研究会「透析液エンドトキシン測定に関するバリデーション指針 （草案）」適合品です。 10 EN D OT OX I N 関連商品 透析液中エンドトキシン測定用ゲル化法試薬 パイロセート −透析用水及び透析液の水質管理に関する国際基準案 ISO CD 23500 対応− ・Step-by-Stepの簡単操作 ・0.25EU/mLを約 30 分で判定 Pyrosate® Code 010320 品 名 パイロセート(0.25EU/mL) 【キット内容】 包 装 価 格 10テスト ￥35,000- 試薬 備 考 ￥5,000- 器具 サンプル用試薬 陽性コントロール用試薬 パイロセート用ディスポーザブルピペット 900549 パイロセート用ディスポーザブルピペット 50 本 参考文献 1）秋葉隆，他：透析液水質基準と血液浄化器性能評価基準 2008. 透析会誌，41 （3） , 159-167（2008） 2）日本臨床工学技士会事業部透析液等 WG: 透析液清浄化ガイドライン Ver. 1.07（2010） 3）HDF 研究会 HDF 技術叢書編集委員会編：透析液エンドトキシン測定（阻害・促進試験、安定化剤、外注検査） に関する バリデーション指針 （草案 96D）．HDF 技術叢書 （1）透析液水質管理の指針（第 2 版） pp. 56-73：HDF 研究会（1996） 4）金成泰：透析液調製過程におけるラインの実際．竹沢真吾編．透析液エンドトキシンがよくわかる本，pp. 55-77, 東京医学社 （1995） 5）Yamamoto, C. and Kim, S.T.: Validation of limulus tests for endotoxin evaluation in dialysate. Nephrology, 2, 429-434（1996） 6）渡 邉 真 紀，他：透析液エンドトキシン安定化方法．臨牀透析 12 別冊 HDF 療法 96: 149-158 （1996） 7）相 沢 真 紀，他：新規エンドトキシン特異的比色法リムルス試薬の性能．腎と透析 55 別冊，68-70 （2003） 8）岡本まどか，他：少数検体用新規エンドトキシン測定システムの性能．腎と透析 59 別冊，283-285 （2005） 9）相 沢 真 紀，他：透析液清浄化におけるエンドトキシン測定の役割．日本血液浄化技術研究会会誌，14（1） , 169-173（2007） 10）日本臨床工学技士会透析液等 WG 編：透析液安全管理マニュアル, 先端医学社（2010） 11 2010年9月1日発行 2T（NE）
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