乳酸菌バクテリオシンを用いた清酒の火落ち防止に関する研究石山洋平＊ St udi es on Pr event i on ofHi ochii n Sake Br ewi ng Pr ocess Usi ng Bact er i oci ns f r om Lact i c Aci d Bact er i a byYo he iI SHI YAMA 抗菌ペプチドは動物，植物，昆虫，微生物などの造の概略について解説した。防御機構において重要な役割を担っている。これらまた本研究の目的および本論文の構成を述べた。のペプチドは既存の抗生物質に抵抗性を示す病原菌菌の選抜，および清酒製造工程へのバクテリオシンに対する新奇な抗菌物質として注目されている。この応用について検討した。のような抗菌ペプチドの１つとして，主に乳酸菌が第一章は緒言であり，本研究の背景ならびに既往生産する『バクテリオシン』が挙げられる。バクテの研究を概観し，抗菌ペプチドの構造と機能，乳酸リオシンの多くは高温や低 pH環境下においても安菌とバクテリオシンの有用性，清酒製造の概略につ定であり，プロテアーゼによって分解され，近縁のいて解説した。また本研究の目的および本論文の構細菌だけに対して抗菌効果を示す。このような性質成を述べた。から，バクテリオシンは食品保存料としての利用が培地を用いた S t a p h y l o c o c c u ss p .NPSI3 8 （NPSI3 8 ）期待されている。一方，清酒製造工程において，アルコール耐性乳酸菌（火落菌）による腐敗現象（火落ち）が問題となっている。火落ちは，酸味の増加，混濁，オフフレーバーの発生により，清酒の品質や風味に深刻な第二章「米タンパク質加水分解物を添加した麹汁によるバクテリオシンの生産およびそのバクテリオシンの火落菌に対する増殖阻害効果」では，バクテリオシン生産菌 NPSI3 8 を用いて，麹汁培地中でバクテリオシンを生産するために必要な窒素源につい影響を及ぼす。この火落ちを防ぐ手段として，火入て検討した。また，生産されたバクテリオシンの火れと呼ばれる低温での加熱殺菌や，無菌ろ過などが落菌に対する増殖阻害効果について評価した。行われている。しかし，現在でも火落ちを完全には防止できていないのが現状である。麹汁培地を用いたバクテリオシン生産において，ポリペプトンや肉エキスの添加が有効であることを本論文では，清酒の火落ちを防止することを目的明らかにした。また，ポリペプトンや肉エキスの代に，複数の乳酸菌によるバクテリオシンの生産と，ことによって，NPSI3 8 が高活性なバクテリオシンそれらのバクテリオシンの火落菌に対する抗菌効果について研究を行った。具体的には麹汁培地を用いたバクテリオシンの生産，火落菌に有効なバクテリオシンを生産する乳酸テリオシンの有用性，清酒製＊替として，米タンパク質加水分解物（RPH）用いる（1 6 0U/ ml ）を生産することを明らかにした。得られたバクテリオシン含有培養上清液は，対数増殖期あるいは定常期の火落菌 La c t o b a c i l l u sh i l g a r d i i 新潟大学大学院自然科学研究科現在ミヤトウ野草研究所株式会社研究部〔新潟大学博士（工学）平成2 1 年３月2 3 日授与〕 ― 3 5― 新潟大学工学部研究報告 T NBRC 1 5 8 8 6 の増殖を静菌的に阻害することを明らかにした。第３章「複数の乳酸菌によるバクテリオシン生産およびそれらの火落菌の増殖阻害への応用」では，火落ちした清酒から単離した火落菌を分類・同定し，火落菌に対する複数のバクテリオシンの増殖阻害効果について検討した。単離した火落菌を1 6 Sr DNAの部分配列に基づい第5 9 号（2 0 1 0 ）の活性を維持することを明らかにした。また p H3 ， 0 ° Cの麹抽出液に C1 0 1 9 1 0 と NBRC 1 2 0 0 7 のバクテ 1 リオシン溶液をそれぞれ５％（v / v ）と１％（v / v ）の割合で添加したとき，L.h i l g a r d i iの生菌数を検出限界 ml ）以下にまで減少できることを明ら（1 . 0 ×1 02 CFU/ かにした。一方，乳酸と米麹を含む水麹（p H3 ， 1 0 ° C）にバクテリオシン溶液を添加した場合，麹抽出液の場合と比較して，L.h i l g a r d i iに対するバクテリオシて同定した結果，火落菌がそれぞれ La c t o b a c i l l u s ンの増殖阻害効果の低下が観察された。しかし，各に，RPHを添加した麹汁培地を用いて，いくつかの減少することを明らかにした。 f r u c t i v o r a n s ，L.h i l g a r d i iおよび La c t o b a c i l l u sp a r a c a s e iの３グループに属することを明らかにした。次乳酸菌によるバクテリオシン生産を試みた。その結果，En t e r o c o c c u sd u r a n sC1 0 2 9 0 1 （C1 0 2 9 0 1 ），La c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p .l a c t i sC1 0 1 9 1 （ 0C1 0 1 9 1 0 ）および La c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p .l a c t i s NBRC 1 2 0 0 7 （NBRC 1 2 0 0 7 ）が高活性なバクテリオシンを生産すバクテリオシン溶液を水麹に1 0 ％（v / v ）の割合で添加したとき，L.h i l g a r d i iの生菌数は２オーダー以上第５章「乳酸菌バクテリオシンによる生酒中での火落菌の増殖阻害」では，C1 0 1 9 1 0 と NBRC 1 2 0 0 7 の生産したバクテリオシンを用いた，生酒中における火落菌の増殖阻害について検討した。 C1 0 1 9 1 0 と NBRC 1 2 0 0 7 のバクテリオシンは生酒ることが明らかになった。これらのバクテリオシン中において非常に安定であることを示した。生酒中を含む培養上清液（バクテリオシン溶液）を添加し c a s e iの生菌数はそれぞれ1 8 ，3 5 および3 5 0U/ mlのたときの，火落菌の増殖阻害効果について評価した。その結果，C1 0 1 9 1 0 と NBRC 1 2 0 0 7 のバクテリオシンを1 0 ％（v / v ）の割合で添加したとき，L.f u r c t i v o r a n s T 2 の生菌数が検出限界（1 . 0 ×1 0 NBRC 1 3 9 5 4 において， L.h i l g a r d i i ， L.f r u c t i v o r a n sおよび L.p a r a C1 0 1 9 1 0 のバクテリオシンが存在するとき，あるいはそれぞれ5 . 6 ，5 . 6 および1 4 0U/ ml の NBRC 1 2 0 0 7 のバクテリオシンが存在するとき，検出限界以下 CFU/ ml ）以下まで減少することを示した。また， 2 CFU/ ml ）まで減少することを明らかにし（1 . 0 ×1 0 T L.h i l g a r d i iNBRC 1 5 8 8 6 と H1 3 0 の増殖を殺菌的にセイにおいて，バクテリオシンによって誘導される C1 0 2 9 0 1 ，C1 0 1 9 1 0 および NBRC 1 2 0 0 7 のバクテリオシンを１％（v / v ）の割合で添加することによって，阻害できることを明らかにした。第４章「乳酸菌バクテリオシンによる水麹中でのた。また，膜電位感受性色素を用いた膜脱分極アッ火落菌細胞膜の脱分極がエタノールによって促進されることを明らかにした。さらに，1 5 ％のエタノールを含む Mc I l v a i n e緩衝液にバクテリオシンを添加火落菌 L.h i l g a r d i iの増殖阻害」では，酒母工程におした場合，生酒の場合と比較して，火落菌に対するけるバクテリオシンの利用を検討するために，バク増殖阻害効果が低下することを示した。以上のことテリオシンの抗菌活性に対する麹プロテアーゼの影から，エタノールとエタノール以外の清酒成分が火響について検討した。さらに，麹抽出液と水麹中で落菌に対するバクテリオシンの増殖阻害効果を高めのバクテリオシンによる火落菌の増殖阻害効果につていることが示唆された。いて評価した。 p H3 ，1 0 ° Cの麹抽出液中において，第3 章において調製した C1 0 1 9 1 0 と NBRC 1 2 0 0 7 のバクテリオシン溶液は，混合後1 2 時間目にそれぞれ約5 0 ％，約7 0 ％第６章は総括であり，本研究で得られた結果をまとめた。終わりに，指導を賜った谷口表します。 ― 3 6― 正之教授に謝意を