Workshop DIAGNOSTICHE MOLECOLARI PER L'ANALISI DI ANEUPLOIDIE E DI FIBROSI CISTICA Analisi retrospettiva, confronto cariotipo Vs QF-PCR Barbara Minuti SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Regione Toscana Diagnosi Prenatali Invasive Età materna > 35 anni al parto NT + biochimico 6 500 DP invasive 1 650 DP invasive 5% di tutte le gravidanze Circa 33 000 gravidanze / anno (2011) SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Progetto 2008-2011 TECNOLOGIE AVANZATE PER LA DIAGNOSI PRENATALE NON INVASIVA DI MALATTIE GENETICHE E CROMOSOMICHE E PER LA PREDITTIVITA' DELLE COMPLICANZE DELLA GRAVIDANZA UN NUOVO PROTOCOLLO PER LA DIAGNOSI PRENATALE Responsabile Scientifico Torricelli Francesca Struttura di appartenenza Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi SOD Diagnostica Genetica Introduzione della QF-PCR nella routine diagnostica ottimizzare i sistemi di screening ecografici e biochimici anticipare la DP invasiva al primo trimestre e diminuirla nel II rivedere l’iter di accesso alla Diagnosi prenatale invasiva definire a livello regionale i centri per i vari livelli di assistenza SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Diagnosi Prenatali SOD Diagnostica Genetica 3500 3000 2500 2000 CVS LA Totale DP 1500 1000 500 0 2002 2003 SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Percorso tecnico-analitico elettroforesi PCR kit Devyser complete CVS Chelex Interpretazione dei risultati Marcatore omozigote Marcatore triallelico 1:1:1 LA Estrazione SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze 2:1 Marcatore diallelico 1:1 Marcatore triallelici 1:2 Casistica n° 566 QF su liquido amniotico negli LA si esegue QF solo nel caso di screening positivo con richiesta specifica del genetista gravidanze a rischio per patologie mendeliane (per le quali si utilizza il DNA già estratto per lo studio della malattia specifica) gravidanze oltre la 20esima settimana. n° 6900 QF su villo coriale tutti i CVS, tranne quelli con indicazione di presenza di traslocazioni familiari e quelli fortemente contaminati da decidua. Per entrambi i tipi di tessuto alla QF-PCR viene affiancata la coltura cellulare per la determinazione del cariotipo. SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Patologici identificati in QF su liquido amniotico 2008-2012 Trisomia 13 1 Trisomia 18 8 Trisomia 21 28 Sindrome di Turner 1 X/XY 1 Triploidia 3 Totale casi 566 42 100% di concordanza tra QF-PCR e cariotipo 0% di fallimenti di coltura SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Patologici identificati in QF su villo coriale 2008 2009 2010 2011 2012 Trisomia 13 10 5 7 4 6 Trisomia 18 15 18 24 10 13 +2 (T18p) Trisomia 21 37 49 56 40 43 Sindrome di Turner 5 8 4 6 2 XXX - - - - 1 XXY 1 - - - 1 Triploidia 3 3 4 1 1 1078 1321 1462 1653 1386 a fine Totale casi 6900 SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze ottobre Patologici identificati in QF su villo coriale 0,58% di discordanza tra QF-PCR e cariotipo 1,3% di fallimenti di coltura Discordanza quasi sempre dovuta a….. Mosaicismo Analisi del solo citotrofoblasto SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze MOSAICISMO Tipo I: citotrofoblasto (metafasi del metodo diretto) Tipo II: mesenchimale (metafasi ottenute dopo coltura cellulare) Tipo III: sia nel citotrofoblasto che nel mesenchima Cariotipo normale Cariotipo aneuploide Cariotipo aneuploide a mosaico SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Casi in cui il risultato QF non ha dato risposta conclusiva per uno dei cromosomi analizzati 0.8% 4 3 derivativi Trisomie complete 44 cariotipo normale 6 Cariotipo a mosaico 1 no crescita cellulare (LA di controllo OK) SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze 5 di questi forte sospetto di mosaico sessuali in QF, la scelta è stata di non eseguire controllo su LA e nessun follow-up Mosaicismo evidenziato con cariotipo da CVS 26 CASI 15 NON CONFERMATI SU LA/SF (non evidenziati in QF) • • • • • • • 5 Trisomia 2 2 Trisomia 8 1 Trisomia 7 1 Trisomia 18 2 Trisomia 21 1 Trisomia 13 3 Cr. sessuali SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze 6 NON ESEGUITO controllo •5 ITG •1 nessun follow-up 5 CONFERMATI SU LA • 47,XXX [13]/45,X [7] • mos 47,XX,+der(4)[34]/46,XX[21] • mos47,XX,+idic(15;15)(q12;q12)[30]/48,XX,+idic(15;15)(q1 2;q12),+idic(15;15)(q11.1;q11.1)[6]/46,XX [13] • mos 47,XY,+i(5)(p10)[1]/46,XY[10] • mos 47,XY,+mar[5]/46,XY[9] QF: mosaicismo non definibile nel cromosoma X FRUSTOLO 1 FRUSTOLO 2 «IPOTESI QF » XX/X oppure XXX/X COLTURA: 47,XXX[13]/45,X[7] Confermato mosaico su LA SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Patologici identificati su CVS raggruppati per motivo di invio 70,00% 2,60% 60,00% 50,00% 39,80% 40,00% 11,70% 30,00% 20,00% 13% 2,30% 10,00% 0,00% 1,20% età >35 anni test positivo precedente Precedente gravidanza gravi aneuploidia aneuploidia malattie mendeliane 2,30% malformazio ni ecoevidenzia te 39,80% PATOLOGICI 2,60% 11,70% MOTIVO 58,20% 27,30% 5,90% 3,90% 1,10% 1,20% genitore portatore riarrangiame nto 13% altro 1,10% 3% 0,50% 1,20% Motivo invio età materna età materna Screening + Screening + Screening + malformazioni malformazioni Età materna Screening + Screening + Screening + Screening + QF-PCR mosaico? NO RISPOSTA 21 T18 T21 mosaico? T21 mosaico? XXX/XX mos.? T18 T18 mosaico? OK OK (lieve sbil. 21) OK (sbil. 21 solo in alcuni loci) T18 braccia corte T18 braccia corte età materna X/XX mos.? malformazioni del parziale13? SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Cariotipo CVS 46,XX mos47,XX,+18[16]/46,XX[42] 47,XX,+21 47,XY,+21 47,XXX mos47,XX,+18[16]/48,XXX,+18[15] 47,XY,+18 46,XX,idic(18;18)(18pter ->18q21::18q21->18pter) 47,XX,+21 46,XX,+21,rob(21;21)(q10;q10) mos47,XX,+iso18p[10]/46,XX[15] Traslocazione 13;18 (solo 1 area di crescita-> no risposta cariotipo) CGH array conferma trisomia parziale mos45,X[3]/46,XX[37] 46,XX,der(13) Motivo invio QF-PCR Cariotipo CVS età materna età materna Screening + Screening + Screening + malformazioni malformazioni Età materna Screening + Screening + mosaico? NO RISPOSTA 21 T18 T21 mosaico? T21 mosaico? XXX/XX mos.? T18 T18 mosaico? OK OK (lieve sbil. 21) OK (sbil. 21 solo in alcuni loci) 46,XX mos47,XX,+18[16]/46,XX[42] 47,XX,+21 47,XY,+21 47,XXX mos47,XX,+18[16]/48,XXX,+18[15] 47,XY,+18 46,XX,idic(18;18)(18pter ->18q21::18q21->18pter) 47,XX,+21 46,XX,+21,rob(21;21)(q10;q10) Screening + Screening + T18 braccia corte T18 braccia corte mos47,XX,+iso18p[10]/46,XX[15] Traslocazione 13;18 (solo 1 area di crescita-> no risposta cariotipo) CGH array conferma trisomia parziale età materna X/XX mos.? malformazioni del parziale13? SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze mos45,X[3]/46,XX[37] 46,XX,der(13) CASO 1 Solo qualche marcatore un poco sbilanciato e solo su uno dei due frammenti Ipotesi: In QF analizzato solo Citotrofoblasto= 46,XX Mesenchima 46,XX,+21,rob(21;21)(q10;q10) Controllo su Liquido amniotico: 46,XX,+21,rob(21;21)(q10;q10) SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Motivo invio età materna età materna Screening + Screening + Screening + malformazioni malformazioni Età materna Screening + Screening + Screening + Screening + QF-PCR mosaico? NO RISPOSTA 21 T18 T21 mosaico? T21 mosaico? XXX/XX mos.? T18 T18 mosaico? OK OK (lieve sbil. 21) OK (sbil. 21 solo in alcuni loci) T18 braccia corte T18 braccia corte età materna X/XX mos.? malformazioni del parziale13? SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Cariotipo CVS 46,XX mos47,XX,+18[16]/46,XX[42] 47,XX,+21 47,XY,+21 47,XXX mos47,XX,+18[16]/48,XXX,+18[15] 47,XY,+18 46,XX,idic(18;18)(18pter ->18q21::18q21->18pter) 47,XX,+21 46,XX,+21,rob(21;21)(q10;q10) mos47,XX,+iso18p[10]/46,XX[15] Traslocazione 13;18 (solo 1 area di crescita-> no risposta cariotipo) CGH array conferma trisomia parziale mos45,X[3]/46,XX[37] 46,XX,der(13) CASO 2 Referto QF-PCR: trisomia di tutti i marcatori analizzati delle braccia corte del cromosoma 18. Necessario il cariotipo per corretta definizione dell’assetto cromosomico. Cariotipo: mos47,XX,+iso18p[10]/46,XX[15] Tutti gli altri marcatori in 18q informativi con rapporto 1:1 SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Tetrasomia delle braccia corte a mosaico Motivo invio età materna età materna Screening + Screening + Screening + malformazioni malformazioni Età materna Screening + Screening + Screening + Screening + QF-PCR mosaico? NO RISPOSTA 21 T18 T21 mosaico? T21 mosaico? XXX/XX mos.? T18 T18 mosaico? OK OK (lieve sbil. 21) OK (sbil. 21 solo in alcuni loci) T18 braccia corte T18 braccia corte età materna X/XX mos.? malformazioni del parziale13? SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Cariotipo CVS 46,XX 47,XX,+18[16]/46,XX[42] 47,XX,+21 47,XY,+21 47,XXX 47,XX,+18[16]/48,XXX,+18[15] 47,XY,+18 46,XX,idic(18;18)(18pter ->18q21::18q21->18pter) 47,XX,+21 46,XX,+21,rob(21;21)(q10;q10) 47,XX,+iso18p[10]/46,XX[15] Traslocazione 13;18 (solo 1 area di crescita-> no risposta cariotipo) CGH array conferma trisomia parziale 45,X[3]/46,XX[37] 46,XX,der(13) CASO 3 13A 13q12.12 13F 13q12.2 13D 13q13.3 13G 13q14.11 13B 13q21.32-33 13E 13q22.1 13C 13q31.1 Risposta QF: non è possibile interpretare chiaramente il risultato del cromosoma 13. Necessario il cariotipo per corretta definizione dell’assetto cromosomico Tutti i loci con 1 solo picco e di altezza bassa 46,XX,der(13) SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Importanza del Cariotipo QF-PCR = aneuploidie OK Età 46,XY,der(7)(7pter->7q31.3::5q34->qter) Screening I trim 46,XX, der(5)(5qter->5p13::17q24->17qter) Portatore trasl. 46,XY,del(4)(p16.3) QF-PCR = TRISOMIA 21 S.Wolf-Hirschhorn Cariotipo coltura CVS 46,XY,rob(14;21)(q10;q10),+21 CAMBIA IL RISCHIO DI RICORRENZA SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Importanza del corretto iter diagnostico CVS QF-PCR Negativa per età materna Controllo su Liquido amniotico Cariotipo coltura a lungo termine Trisomia 15 a mosaico su CVS Disomia Uniparentale compatibile con feto affetto da Sindrome di Prader Willi SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze 46,XY Ricerca UDP cromosoma 15 Limiti della QF-PCR •Legati alla metodica ed al tessuto analizzato: Presenza di Mosaicismi Presenza di tetraploidie Presenza di riarrangiamenti strutturali Analisi mirata solo ai cromosomi indagati (13, 18, 21, XY) •Legati alla qualità del prelievo: Se presente decidua non eseguire QF-PCR ma allestire il preparato per la lettura del cariotipo da metafasi spontanee SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Vantaggi della QF-PCR Possibilità di automatizzare parte del processo Metodica rapida e con ottimo rapporto qualità / prezzo Bassa percentuale di fallimenti Possibilità di condurre l’analisi anche a partire da un prelievo molto scarso e di qualità non ottimale Valido approccio nei casi di gravidanze gemellari SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze Gravidanze gemellari Kit profiler plus per determinazione zigosità Da quando è stata inserita la QF-PCR mediante kit Devyser Complete non eseguiamo più l’esame aggiuntivo La QF è utile per definire la zigosità e le eventuali contaminazioni SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze CONCLUSIONI Valutando i dati mostrati : • Indicazione età materna: patologici identificati circa 3%, quindi indicazione con ridotto significato predittivo • Malformazioni ecoevidenziate: più frequentemente associate ad anomalie cromosomiche 40% • Screening I trimestre positivo: associate nel 27%, ad anomalie cromosomiche; in particolare quando il parametro alterato è l’NT e non il dato biochimico RICORDO che nel caso di anomalie cromosomiche familiari la metodica utilizzata è il metodo diretto e non la QF-PCR SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze CONCLUSIONI QF-PCR associata a citogenetica su coltura cellulare Esecuzione di villocentesi: esperienza dei prelevatori Test di laboratorio: esperienza dell’operatore nella gestione di grandi numeri di diagnosi su CVS Consulenza Genetica: esperienza nelle consulenze genetiche di diagnosi prenatale SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze SOD Diagnostica Genetica AOUC Firenze
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