Il virus e la diagnosi di laboratorio Maria Rosaria Capobianchi Laboratorio di Virologia WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis, response and training on Highly Infectious Diseases The virus • Pleiomorphic, elongated, enveloped virus particle, 80nm x 130-14,000nm long • Genome: single stranded, linear, nonfragmented, negative sense RNA, 18,959 bp. • Coding for 7 proteins Le proteine virali NP: L: GP: proteina NP strutturale di 83.3 Kd RNA-polimerasi RNA dipendente glicoproteina GP (2 forme: trans-membrana e secretoria) VP40: proteina di matrice per la sua carica positiva facilita la gemmazione VP30: proteina fosforilata con funzione di attivazione e modulazione della trascrizione (incapsidamento RNA) VP35: proteina coinvolta in eventi trascrizionali; inibisce l’attivazione del sistema IFN contribuendo alla patogenicità dei filovirus VP24: proteina associata alla matrice; la funzione rimane ambigua The dangerous kiss!!!! Filovirus pathogenesis GP media l’ingresso del virus nella cellula ospite e favorisce i meccanismi di escape. Il virus si diffonde attraverso il torrente circolatorio e si replica attivamente in: • macrofagi/monociti • cellule dendritiche • cellule endoteliali • organi (fegato, rene, milza, ovaio, testicoli ed organi linfatici) le lesioni principali sembrano essere a carico dell’endotelio vascolare. Feldmann, Lancet 2011 La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 FAQ 1. Possono essere eseguiti test diagnostici nei laboratori locali (urgenza, microbiologia, virologia, ecc.) prima di avere il risultato del test per Ebola? SI: se si adottano le adeguate misure di protezione il rischio per i laboratoristi è molto basso in caso di “bassa probabilità” di MVE, e basso in caso di “elevata probabilità” Prelievi Prelievi •Valutazione del rischio Unlikely to have a VHF Low possibility of VHF High possibility of VHF Confirmed VHF • Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire l’adozione di adeguate misure di biosicurezza •Inviare i campioni al laboratorio locale in contenitori primari chiusi e infrangibili, racchiusi in un secondo contenitore infrangibile Indagini chimico cliniche Emocromo elettroliti transaminasi PCR coagulazione ecc. • Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco, privilegiando POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove necessario, in modo automatico • Le provette contenenti i campioni vanno sempre aperte sotto cappa, proteggendo occhi e mucose da eventuali spruzzi • Se non si dispone di un laboratorio in grado di osservare queste misure, inviare i campioni allo Spallanzani La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola Diagnostica differenziale • Malaria • Dengue • • • • • • • • • Febbre tifoide Shigellosi Colera Leptospirosi Peste Rickettsiosi Febbre ricorrente Borreliosi da pidocchi Meningiti e sepsi • Epatiti • Altre febbri emorragiche virali FAQ 2. Il test di malaria può essere eseguito in loco? Si, se si adottano adeguate precauzioni Privilegiare il test rapido (POCT) • le positività vanno confermate con i test convenzionali In PS l’operatore è protetto dai dispositivi di protezione e dalle procedure In laboratorio il POCT va eseguito in BSL2, sotto cappa, proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi In caso di impossibilità di eseguire il test in loco, o in caso di elevata probabilità di MVE, la ricerca del parassita malarico può essere eseguita all’INMI Test rapido (risultato comunicato in tempo reale) Conferma con goccia spessa La diagnostica di laboratorio Outline •Diagnostica di base •Diagnostica differenziale •Diagnostica specifica per Ebola Il virus ebola, come gli altri filovirus, è un virus di gruppo di rischio 4 •Alta contagiosità •Elevata mortalità •Assenza di terapia specifica •Assenza di vaccini La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4 non è assimilabile ad analoghe procedure per microrganismi di gruppo inferiore, in quanto presenta requisiti strutturali, professionali ed organizzativi peculiari. Difficoltà del laboratorio Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di una diagnosi differenziale ad ampio spettro Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, validati Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione dei metodi diagnostici Necessità di partecipare ai network internazionali per poter accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei risultati Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma Necessità di laboratori ad alto biocontenimento Capacità diagnostiche per Ebola allo Spallanzani • Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un test iniziale di screening e vari test successivi di conferma • Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi filogenetica • Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali • Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica • Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta (IgM e IgG) • Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione • Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative, nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa, Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc. Available molecular methods: in house Target(s) Source Technique EBOV, VP24 EBOV, NP SUDV, NP EBOV, NP PanFiloviridae, L PanFiloviridae, L Pan-Ebolavirus, NP EBOV, NP EBOV, GP SUDV, NP SUDV, GP TAFV, GP 1 TAFV, GP 2 BDBV, NP REST, VP40 REST, GP Pan-Ebolavirus*, L EBOV, NP EBOV, 5' trailer region Pan-Filovirus*, L EBOV, NP SUDV, NP EBOV, SUDV, NP Pan-Ebolavirus, L Pan-Ebolavirus, GP Pan-Filovirus*, L Pan-Ebolavirus8, GP EBOV, NP RESTV, NP EBOV, GP 1 EBOV Gabon, L Gire Euler Euler Huang Grard Grard 2011 Ogawa Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Zhai Towner 2007 Kurosaki Panning Weidmann Weidmann Towner 2004 Drosten Gibb Sanchez Sanchez Sanchez Sanchez Morvan Morvan conventional RPA RPA hydrolysis probe conventional conventional conventional hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe conventional hydrolysis probe RT-LAMP hydrolysis probe hydrolysis probe Hydrolysis probe conventional (nested) SYBR green (based (62)) hydrolysis probe conventional conventional conventional conventional Conventional (nested) Conventional (nested) EQA restricted to VHF reference BSL4 laboratories have been carried out all the known ebolavirus species (EuronetP4, GHSAG-LN) In most primer sets some mismatches with EBOV exist. Based on the alignment it can be concluded there is a 100% match for the primer sets described by Grard , Ogawa and Gibb , BUT the primer sets by Grard and Ogawa show a relatively great number of degenerative nucleotides which might decrease sensitivity. Primer sets by Gire , Zhai , Panning , Weidmann , Drosten , Sanchez EBOV-GP and Morvan have 1 or 2 mismatches but the position in the primers is such (>5 nucleotides from 3’-end) that a loss of sensitivity is not expected. Available molecular methods: commercial Filovirus Altona Real Star®Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0; Ebola Genekam Ebola (Common) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Reston) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Sudan) PCR kit Liferiver (Vacunek) (EBOV) Real Time RT-PCR kit Lipsdiag LIPSGENE® SEBOV Kit (Sudan) / ZEBOV Kit (Zaire) Sacace Ebola Zaire Real Time PCR kit Genesig Ebola Real Time PCR kit, Path-EBOV (Zaire) / Path-SUDV (Sudan) Tib Molbiol Ebola (Zaire) Real Time PCR kit Marburg Liferiver (Vacunek) (MBV) Real Time RT-PCR kit Genekam Marburg PCR kit There is no information in literature on the performances of commercial tests Algoritmo di laboratorio Blood specimens sent to BSL3/4 VHF national reference laboratory Cinetica dell’RNA (SUDV Uganda 2000) L’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi; la sensibilità dei test non è un problema rilevante Towner, J Virol 2004 Ricerca del virus mediante test di biologia molecolare (EBOV-RNA) Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA con RT-PCR Real-Time Conferma dei positivi con un metodo basato su una regione target diversa Esecuzione di una PCR classica Caratterizzazione mediante sequenziamento della regione amplificata con PCR classica La sequenza ottenuta viene confrontata con le sequenze disponibili nelle banche dati accessibili via Web Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio clinico 26 Tempi di risposta Dall’arrivo dei campioni al laboratorio di virologia dello Spallanzani, attivo h24 Test rapido malaria 1 ora Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore A meno di imprevisti…. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 A proposito di imprevisti •Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria Necessità di bonificare la superficie esterna Difficoltà a recuperare il campione residuo disponibile •Le informazioni sull’etichetta sono incongruenti con quelle della scheda Necessità di contattare chi ha inviato il campione per escludere scambi di provette •Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio Necessità di ricominciare dall’estrazione •Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della confezione) McElroy, JID 2014 A proposito di imprevisti •Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria Necessità di bonificare la superficie esterna Difficoltà a recuperare il campione residuo disponibile •Le informazioni sull’etichetta sono incongruenti con quelle della scheda Necessità di contattare chi ha inviato il campione per escludere scambi di provette •Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio Necessità di ricominciare dall’estrazione •Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della confezione) McElroy, JID 2014 Esami accessori per la conferma Il sequenziamento Dudas, PloS Curr Outbreaks 2014 Anticorpi La ricerca degli anticorpi in genere ha valore di documentazione retrospettiva •Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono fugaci (< 3 settimane) •Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive Cinetica della comparsa di IgG e IgM EBOV (Kikwit, DCR 1995) IgM IgG Ksiazek, JID 1999 Rivelazione della risposta umorale e cellulare specifica • Risposta umorale: eseguita mediante metodi appositamente allestiti in laboratorio (immunofluorescenza indiretta e test di sieroneutralizzazione. • Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica delle citochine intracitoplasmatiche. Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 33 Immunofluorescenza indiretta Negative control IgM positive sample IgG positive sample 34 Identificazione del virus • Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4) e successiva caratterizzazione degli isolati con metodi immunologici o molecolari. • In casi particolari è previsto anche lo studio morfologico in Microscopia Elettronica, sia sull’isolato che sul campione biologico iniziale. 36 Coltivazione del virus: BSL4 0< 0 -15 -5.1 -5,1 BSL3 -33 -10 -15 -33 -50 BSL3 -35 BSL4 38 Senova's prototype rapid diagnostic for Ebola virus is being tested in Guinea. G Vogel Science 2014;345:1549-1550 Partners and associated partners Coordinator and main partners Spiez, Switzerland Marburg, Germany BNITM Bernhard-Nocht-Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Germany InstMikroBioBw Institute of Microbiology of the German Armed Forces, Munich, Germany INMI National Institute for Infectious Diseases “L. Spallanzani”, Rome, Italy External Advisory Board (EEAB) WHO ECDC MSF Inserm, Lyon, France Porton, Salisbury, UK ISTH Irrua Nigeria NIMR , Dar Es Saalam, Tanzania IMI , Ljubljana, Slovenia Berlin, Germany NCE Budapest, Hungary 26.03.14: first EMLab from Munich to Guinea 05.09.14: third EMLab from Rome to Liberia Prima di inviare campioni, è necessario contattare il laboratorio. Il Laboratorio di Virologia è attivo h24. Il virologo di turno può essere reperito ai seguenti numeri: •0655170666 •3204343793 Il virologo di turno effettuerà con il richiedente la valutazione congiunta preliminare, e provvederà ad attivare le procedure interne. Preparazione dei campioni.1 • Il campione di scelta per la ricerca del virus è sangue-EDTA (no eparina) • I campioni vanno mantenuti a +4°C prima dell’invio • Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro il più breve tempo possibile, preferibilmente entro le 24 ore e a temperatura refrigerata • Per tempi di consegna più prolungati, concordare con il Laboratorio le modalità di preparazione e conservazione Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma 22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014 Preparazione dei campioni. 2 • I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda dati, riportata in calce alle istruzioni, compilata in tutte le sue parti • Su ogni singolo campione deve essere apposta un’etichetta riportante a chiare lettere il nome del paziente, la tipologia del campione (sangue, urine, altro) e la data di prelievo. • Le informazioni riportate sulle provette devono essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati. Confezionamento e trasporto dei campioni • Il campione va confezionato seguendo il principio del triplo involucro • Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito secondo le raccomandazioni per i campioni a rischio biologico (Circolare Ministeriale n°3/2003 “Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici”) L’invio va concordato con il Laboratorio x Scheda di raccolta dati per la diagnosi di Laboratorio in caso di sospetta infezione da virus Ebola Recapito del richiedente (possibilmente tel. cellulare)__________
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