Tat-‐PTD-‐Modified Oncoly3c Adenovirus Driven by the SCG3 Promoter and ASH1 Enhancer for Neuroblastoma Therapy Chuan Jin,* Di Yu,* Matko C ˇ ancer, Berith Nilsson, Justyna Leja, and Magnus Essand VeQori microbici e applicazioni in terapia genica e cellulare A.A. 2013/2014 Amore Silvia Di Leo Angelapina Scopo del lavoro Lo scopo di questo lavoro di ricerca è di riuscire a costruire un adenovirus oncoli3co in grado di replicarsi ed uccidere seleZvamente le cellule tumorali di neuroblastoma e in par3colare quelle cellule resisten3 agli agen3 chemioterapici Neuroblastoma ü Il neuroblastoma, neoplasia maligna del sistema nervoso autonomo, trae origine dalle cellule neuroectodermiche della primi3va cresta neurale ü Rappresenta il tumore solido più frequente nei soggeZ d’età inferiore ai 5 anni ü L’età media alla diagnosi è aQorno ai 2 anni ü Il traQamento oggi si basa su chirurgia, chemioterapia e radioterapia ed è determinato dal rischio di recidiva definito da età, estensione alla diagnosi, e caraQeris3che biologiche di malaZa. ü Inizialmente i pazien3 rispondono alla chemioterapia, ma alla fine il 50-‐60% di essi, ad alto rischio di neuroblastoma, hanno una recidiva. Ad5PTD(ASH1-‐SCG3-‐E1A) " Adenovirus oncoli3ci in cui l’espressione del gene E1 e, quindi la replicazione virale è controllata da promotori tumore-‐ o tessuto-‐specifico si stanno affermando come efficien3 agen3 terapeu3ci contro il cancro " L’infezione con adenovirus appartenente al siero3po 5 dipende dalla presenza del receQore CAR sulle cellule bersaglio " Down-‐regula3on del receQore CAR che rende le cellule resisten3 all’infezione " I ricercatori hanno sviluppato un Ad5 con capside modificato con il dominio PTD della proteina Tat del virus umano HIV-‐1 " L’espressione del gene E1A è stata posta soQo il controllo del promotore SCG3,un promotore specifico per tumori neuroendocrini e neuroblastoma " In più hanno aumentato l’espressione del virus u3lizzando l’enhancer ASH1 Primers usa3 nel lavoro Il promotore SCG3 e l’enhancer ASH1 sono sta3 oQenu3 mediante amplificazione con PCRa par3re da DNA genomico umano u3lizzando i primers rappresenta3 nella seguente tabella VeQori e virus u3lizza3 in questo lavoro Ad5PTD(ASH1-‐SCG3-‐E1A)uccide seleZvamente le cellule di neuroblastoma Diverse linee cellulari sono state trasdoQe con Ad5PTD(ASH1-‐ SCG3-‐E1), Ad5PTD(WT), Ad5(MOCK). La vitalità cellulare è stata valutata dopo 4 giorni. • Linee cellulari di neuroblastoma(SH-‐SY-‐5Y,IMR-‐32,SK-‐N-‐DZ,SK-‐N-‐AS,Kelly,SK-‐N-‐FI,SK-‐ N-‐SH • Linee tumorali non neuroblastoma(Mel526,A549,Hela) • Cellule di fibroblasto(1064Sk) Ad5PTD(ASH1-‐SCG3-‐E1A) si replica seleZvamente nelle linee cellulari di neuroblastoma Tre linee cellulari : ü SK-‐N-‐FI (neuroblastoma) ü Hela (linea tumorale non neuroblastoma) ü 1061K (fibroblas3 normali) Sono state trasdoQe con i tre virus a 10 EVG/cell . Il sovranatante con la progenie virale è stato raccolto a vari tempi e aggiunto alle cellule 911 per la 3tolazione della progenie virale infeZva. Ad5PTD(ASH1-‐SCG3-‐E1A) uccide le cellule di neuroblastoma resisten3 ai farmaci Non resistente ai farmaci Resistente ai farmaci Linee cellulari di neuroblastoma sensibili e non sensibili ai farmaci sono state traQate con virus o farmaco. La rela3va vitalità cellulare è stata analizzata dopo 4 giorni. A. Virus oncoli3co e cispla3no uccidono le cellule SK-‐N-‐FI B. Virus oncoli3co ed etoposide uccidono le cellule SH-‐SY-‐5Y C. Virus oncoli3co e doxorubicina uccidono le cellule della linea cellulare SH-‐SY-‐5Y D. Virus oncoli3co e vincris3na uccidono le cellule della linea cellulare SH-‐SY-‐5Y Non resistente ai farmaci Resistente ai farmaci Dai test in vitro alla sperimentazione in vivo Iniezione di cellule SK-‐ N-‐FI in topi nudi Formazione del tumore Iniezioni peritumorali di Ad5PTD(MOCK) o Ad5PTD(ASH1-‐SCG3-‐E1A) Questa procedura è stata u3lizzata per valutare diversi parametri, quali ad esempio la grandezza del tumore o la sopravvivenza dei topi e per dimostrare l’efficienza del virus ricombinante in vivo. TraQamento con Ad5PTD(ASH1-‐SCG3-‐E1A) ritarda la crescita tumorale e prolunga la sopravvivenza dei topi con neuroblastoma umano trapiantato Conclusioni I ricercatori sono riusci3 ad oQenere un adenovirus oncoli3co derivante dal siero3po 5 con promotore ed enhancer tumore-‐specifico che uccide seleZvamente ed efficientemente le cellule di neuroblastoma ed è capace di agire anche sulle linee cellulari resisten3 ai farmaci chemioterapici. Si può concludere inoltre che il virus Ad5PTD(ASH1-‐SCG3-‐E1A) potrebbe essere u3lizzato per il traQamento del neuroblastoma, insieme alle cellule staminali mesenchimali e in combinazione con una terapia standard.
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