LA RIORGANIZZAZIONE DEL SISTEMA TRASFUSIONALE STATO DELL’ARTE E QUALE FUTURO” Limbiate, 25 ottobre 2014 e r t l o Dr.ssa Andrea Lobbiani SIMT A.O. G.Salvini Laboratorio NAT DMTE Milano Nord Ovest I requisiti specifici per l’Autorizzazione e l’Accreditamento dei ST e delle UdR del sangue e degli emocomponenti TEST DI QUALIFICAZIONE BIOLOGICA DEGLI EMOCOMPONENTI (O.62) Sono disponibili procedure scritte che regolamentano le attività di qualificazione biologica degli emc allogenici, in applicazione di quanto definito dalla normativa vigente. (O.63) Le procedure relaAve ai test previsA dalla normaAva vigente per la qualificazione biologica del sangue e degli emc sono formalizzate e convalidate prima della loro introduzione e riconvalidate a intervalli periodici e a seguito di modifiche rilevanA. (O.63.1) DeJe procedure definiscono: la gesAone di anomalie e discrepanze dei risultaA analiAci rispeJo ai valori di riferimento; la ripeAzione delle indagini a fronte di test inizialmente reaMvi e l’esecuzione di appropriaA test di conferma a fronte di test ripetutamente reaMvi; la gesAone del donatore con risultaA posiAvi, compresa la comunicazione delle relaAve informazioni ed il suo inserimento nel follow-‐up clinico; le misure aJe a garanAre che il sangue e gli emc i cui test di screening siano ripetutamente reaMvi vengano esclusi dall’uso terapeuAco e dalla consegna all’industria. Tali prodoM devono essere immediatamente segregaA in uno spazio dedicato, fino allo smalAmento. (O.63.2) La trasmissione dei daA analiAci relaAvi ai suddeM test dai sistemi diagnosAci ai sistemi gesAonali informaAci deve essere effeJuata con procedure che escludono passaggi di trascrizione manuale TEST PER LA QUALIFICAZIONE BIOLOGICA screening • HBsAg • HBcAb • HCV Ab • HIV 1-2 Ab/Ag • TP Ab • NAT HBVDNA/ HCVRNA/ HIV1RNA • WNV RNA TEST PER LA QUALIFICAZIONE BIOLOGICA Conferma • HBsAg • HCV Ab à à • HIV 1-‐2 Ab/Ag à • TP Ab à Neutralizzazione HBsAb Immunoblot HCV Ab Immunoblot HIV 1-‐2 Immunoblot TP • NAT • WNV RNA Discriminante HIV,HCV,HBV IgM WNV à à DEFINIZIONI Rea<vo: aMtudine di una sostanza a reagire chimicamente con un’altra in dipendenza delle condizioni del sistema reagente in uso presso il laboratorio, in genere espressa con il valore di reaMvità (sample to cutoff raAo). Cut off: secondo gli Standard di Medicina Trasfusionale SIMTI, in un test qualitaAvo di laboratorio, è il valore che nella metodica uAlizzata discrimina tra risultato reaMvo e non reaMvo Inizialmente rea<vo (IR): quando uno dei test sierologici o molecolari risulta ReaMvo e ripetuto, in doppio, risulta Non ReaMvo Ripetutamente rea<vo (RR): quando, a seguito di un primo risultato reaMvo al test di screening, il campione, nuovamente testato in doppio con lo stesso metodo analiAco, dà luogo ad esito reaMvo in una o entrambe le determinazioni. Zona Grigia: secondo gli Standard di Medicina Trasfusionale SIMTI, con riferimento ai test di qualificazione biologica, è l'insieme dei valori definiA come percentuale al di soJo e/o al di sopra del cut off, in corrispondenza dei quali il risultato del test non può essere definito non reaMvo. Test dubbio/indeterminato: equivalente ad un responso diagnosAco non definito. PosiIvo : di un risultato di analisi o di esame che conferma la presenza della patologia o della sostanza che si cercava. Un test di laboratorio ideale GesAone dei RisultaA IR → RR → *Confermato → PosiAvo → (InfeJo) *test supplementare e nuovo prelievo I test di verifica e conferma del test ripetutamente reattivo sono effettuati su un nuovo campione del donatore oppure, ove quest'ultimo non si ripresenti nei tempi previsti, sulla unità di plasma congelato allo scopo segregata. GESTIONE DEI RISULTATI • TEST INIZIALMENTE REATTIVO (IR) In caso di test inizialmente reattivo, i relativi emocomponenti vengono segregati, in attesa della ripetizione del test, da eseguire in doppio sullo stesso campione con lo stesso metodo analitico. • TEST RIPETUTAMENTE REATTIVO (RR) In caso di test ripetutamente reattivo, i relativi emocomponenti (globuli rossi, buffy coat) vengono eliminati; le unità di plasma, da aferesi o da separazione, vengono eliminate o segregate, in relazione al tipo di reattività, allo stato congelato ai fini di eventuali ulteriori accertamenti. il donatore viene temporaneamente sospeso, e richiamato per informazione e prelevato di un nuovo campione TEST RIPETUTAMENTE REATTIVO CONFERMATO = POSITIVO Al riscontro di un test ripetutamente reattivo (RR), viene eseguito un test supplementare, al fine di confermare la specificità della reattività. Se anche il nuovo campione conferma la reattività il donatore è considerato positivo, viene richiamato, informato e, eventualmente, indirizzato allo specialista di malattie infettive. Il servizio trasfusionale effettua una notifica preliminare all'Azienda di lavorazione del plasma convenzionata, conformemente alle procedure stabilite nel rapporto convenzionale con la stessa. Algoritmo diagnosAco a seguito del riscontro di un risultato ripetutamente reaMvo al test di screening In caso di test sierologico ripetutamente reaMvo valutare il test NAT: Se il test NAT risulta posiAvo confermato: l’algoritmo diagnosAco si interrompe; l’unità non è valida; il donatore viene sospeso permanentemente e avviato al necessario approfondimento clinico e al follow up; viene effeJuato il look back sulle precedenA donazioni, come riportato nel diagramma di flusso. viene inviata noAfica alla Azienda lavorazione plasma Un test di laboratorio reale Un test di laboratorio reale scelta della soglia in base al criterio della massima efficienza Un test di laboratorio reale Test di qualificazione biologica emocomponenA (scelta della soglia in base al criterio della massima sensibilità, Valore prediMvo del test negaAvo P = 1) CAUSE ASSENZA REATTIVITA’ SIEROCONVERSIONE Quando un agente infeJante penetra nell'organismo, vengono in genere prodoM, nel 70% circa dei soggeM, quindi non in tuM,anAcorpi direM contro di esso. La sieroconversione è il passaggio dallo stato di sieronegaAvità (assenza di tali anAcorpi nel plasma sanguigno ) allo stato di sieroposiAvità (presenza di tali anAcorpi nel plasma sanguigno). La sieroconversione, in generale, non avviene subito dopo l'ingresso dell'agente infeJante nell'organismo (contagio), ma può avvenire anche a distanza di tempo, per cui i test per la rilevazione di anAcorpi nel plasma sanguigno, se non trascorre un tempo sufficientemente lungo successivamente al contagio, possono risultare negaAvi. CAUSE ASSENZA REATTIVITA’ (1) Il periodo temporale che intercorre tra il contagio e la sieroconversione prende il nome di “periodo finestra” e può avere durata diversa a seconda dell'agente infeJante e del Apo di test considerato Test di qualificazione biologica emocomponenA Test di qualificazione biologica emocomponenA Il donatore con test infeMvologici border-‐line CAUSE REATTIVI-‐ FALSI POSITIVI Rea<vità aspecifica del test sierologico • Infezioni recenA • Vaccinazioni • Allergie • AutoanAcorpi • ReaMvità verso proteine non diagnosAche presenA nella preparazione può interferire con il risultato • Variazione di loJo: la specificità può variare fra loM diversi e la reaMvità può scomparire al cambiamento di loJo Test di sierologia Criteri di validazione nelle zone grigie HBV ESAMI DI IDONEITA’: Aspirante donatore HBcAb POSITIVO ABsAb a qualsiasi Atolo → DONATORE IDONEO DONAZIONE: HBsAg reaMvo con test di neutralizzazione negaAvo, fare HBcAb (se in precedenza HBcAb NegaAvo) ed HBsAb: valutare sieroconversione o innalzamento del Atolo del HBsAb; se c’è correlazione sospendere per 1 anno. CONTROLLO ANNUALE: riscontro di sieroconversione per HBcAb: sospensione dalla donazione per 1 anno, controllo partner e faJori di rischio Test di sierologia Criteri di validazione nelle zone grigie HCV Ab NegaIvo: s/co <0,80 Aspirante donatore in zona grigia negaIva o posiIva RICONTROLLO a 1 mese (HCV Ab + NAT). Se permane rea<vità sospensione per 1 anno. 1° Riscontro in donatore periodico HCV Ab s/co >0,80 e <0,99 NAT NegaIvo → UNITA’ NON VALIDA controllo a 7-‐10 giorni HCV Ab s/co >1,00 Immunoblot Neg NAT NegaIvo → UNITA’ NON VALIDA controllo a 7-‐10 giorni se permane debole rea<vità → controllo a 1 mese, a 3 mesi Donatore già noto per HCV in zona grigia: se HCV Ab s/co >0,80 e <0,99 NAT NegaIvo → DONATORE IDONEO, UNITA’ VALIDA se HCV Ab s/co >1,00 NAT NegaIvo → DONATORE SOSPESO PER 1 ANNO, UNITA’ NON VALIDA con HCV Ab in zona grigia posiIva per più di 2 volte il donatore è SOSPESO PER 1 ANNO. Test di sierologia Criteri di validazione nelle zone grigie HIV 1-‐2 Ag/Ab NegaIvo: s/co <0,80 Aspirante donatore in zona grigia negaIva o posiIva: RICONTROLLO a 1 se<mana (HIV Ab + NAT) Se HIV Ab <1 NAT NegaIvo → DONATORE IDONEO Se HIV Ab >1.00 NAT NegaIvo → RICONTROLLO a 1 mese (HIV Ab + Immunoblot + NAT). Se permane rea<vità, valutata come aspecifica, sospendere per 1 anno. 1° Riscontro in donatore periodico: HIV Ab/Ag s/co >0,80 e <0,99 NAT NegaIvo→ DONATORE IDONEO, UNITA’ NON VALIDA oppure HIV Ab/Ag s/co >1,00 e <5,0 NAT Neg Immunoblot Neg NAT NegaIvo→ DONATORE IDONEO, UNITA’ NON VALIDA Donatore già noto per HIV in zona grigia: se HIV Ab s/co >0,80 e <0,99 NAT NegaIvo→ DONATORE IDONEO, UNITA’ VALIDA se HIV Ab s/co >1,00 Immunoblot Neg NAT NegaIvo→ DONATORE IDONEO, UNITA’ NON VALIDA con HIV Ab in zona grigia posiIva per più di 2 volte il donatore è SOSPESO PER 1 ANNO . Test di sierologia Criteri di validazione nelle zone grigie TP Ab Non si considera la zona grigia negaAva Se TP Ab>1 Immunoblot Neg → DONATORE IDONEO, UNITA’ VALIDA Nelle successive donazioni se la reaMvità manAene lo stesso valore → DONATORE IDONEO, UNITA’ VALIDA Immunoblot NegaAvo viene eseguita al massimo 2 volte. Se TP Ab>1 Immunoblot Indeterminato → DONATORE NON IDONEO, UNITA’ NON VALIDA Il donatore con test infeMvologici border-‐line: ReaMvità aspecifica Test ripetutamente reaMvo RR • Test di conferma NEGATIVO • La ReaMvità aspecifica è generalmente TEMPORANEA (media di 7 mesi con un range fra 2.5 e 35 mesi) il campione risulta in un’elevata % di casi negaAvo se testato con altro test diagnosAco ugualmente sensibile Messaggio: A seguito dei test esegui2 anche sul secondo prelievo, il risultato dell'esame è superiore al valore di riferimento ma la rea?vità non è stata confermata dai test più specifici effeDua2, che sono risulta2 nega2vi. TraDasi pertanto di “risultato falsamente posi2vo che non indica infezione o mala?a"; tuDavia, NON POTENDO TRASFONDERE L’UNITA’ da Lei donata, Le comunichiamo la “SOSPENSIONE TEMPORANEA” alla donazione che verrà ripris2nata dopo gli opportuni controlli CAUSE ASSENZA REATTIVITA’ (2) vi può essere infezione da HBV anche in individui HBsAg negaAvi. Si parla in questo caso di infezione occulta da HBV OBI (Occult B InfecAon) Infezione Occulta da HBV -‐OBI Persistenza a lungo termine del genoma virale nel tessuto epaIco (e in taluni casi anche nel siero) di individui negaIvi per l’HBsAg OBI • La stabilità e la persistenza a lungo termine delle molecole di cccDNA, insieme alla lunga emivita degli epatociA, fa si che l’infezione virale, una volta avvenuta, possa persistere anche per tuJa la vita. • I portatori di HBV occulto sono HBsAg negaAvi, nonostante la presenza nel loro fegato dei genomi virali: nell’infezione occulta si realizza una forte inibizione della replicazione e dell’espressione genica virale,che è responsabile non solo della negaAvità dell’HBsAg ma anche del basso, se non nullo livello di HBV-‐DNA sierico e del fluJuare dell’aMvità virale. Nel 1999 il prof. Raimondo classificò lo stato di “Infezione occulta” che nel 2008 è stata definita infezione “ persistente” sebbene l’a?vità virale sia fluDuante. E’ dimostrato che un’infezione occulta da HBV può essere trasmessa a seguito sia di trapianto d’organo che, potenzialmente, di trasfusione di sangue. In molte regioni d’Italia è stata adojata l’esclusione, alla prima donazione, degli HBcAb posiIvo. Donatore periodico, maschio, 54 anni, ALT nella norma. 07/03 I° riscontro POS 2 ripetizioni 1 POS e 1 NEG 10 repliche 7 POS e 3 NEG Discriminante 10 repliche 5 POS e 5 NEG 30/03 15/05 26/02 7 POS e 3 NEG 8 POS e 2 NEG 2 POS e 8 NEG HBsAg negativo HBsAb 728 HBcAb positivo HBeAg negativo HBeAb negativo HBcAb - IgM negativo NAT IR 2 repliche ULTRIO NEGATIVE NO SI Determinare HBcAb e HBsAb HBcAb ASSENTE SI Esito: NAT NEGATIVO Unità VALIDA Donatore IDONEO Allarme Alle donazioni successive 1 determinazione Ultrio NO Richiedere unità di plasma e nuovo prelievo (3 provette x NAT) entro 7 giorni 8 repliche ULTRIO su plasma unità 8 repliche ULTRIO su nuovo prelievo SI NEGATIVE Esito: NAT NEGATIVO Unità NON VALIDA Donatore IDONEO Allarme Alle donazioni successive 3 repliche Ultrio NO NAT discriminante Marcatori Virali Esito: NAT POSITIVO Unità NON VALIDA Donatore NON IDONEO, Informato e avviato OBI al follow-up NAT IR HBcAb ASSENTE NAT IR HBcAb PRESENTE Esito: NAT NEGATIVO Unità VALIDA Donatore IDONEO Allarme Esito: NAT NEGATIVO Unità NON VALIDA Donatore IDONEO Allarme Alle donazioni successive 1 determinazione ULTRIO SI NEGATIVA Alle donazioni successive 3 repliche ULTRIO NO NO Esito: NAT POSITIVO Unità NON VALIDA Donatore NON IDONEO, Informato e avviato al follow-up OBI NEGATIVE SI Esito: NAT NEGATIVO Unità VALIDA Donatore IDONEO Allarme I test di verifica e conferma del test ripetutamente reattivo sono effettuati su un nuovo campione del donatore oppure, ove quest'ultimo non si ripresenti nei tempi previsti, sulla unità di plasma congelato allo scopo segregata. Prot. n. 1463.CNS.2014 per i laboratori che eseguono lo screening WNV con il TMA, prestare aDenzione ai da2 grezzi (valori di S/Co) e di “sospendere” il donatore che risul2 nega2vo alla NAT con un valore di S/CO > 0,7. In questo caso la sua donazione dovrà essere soDoposta alla ricerca di an2corpi IgM an2-‐WNV. In caso di nega2vità il donatore potrà essere riammesso In caso di posi2vità alle IgM il donatore resterà sospeso e dovrà essere convocato dopo 10 gg per un nuovo prelievo e l'esecuzione di test NAT e ricerca IgM/IgG. La sacca di plasma ed i prelievi dovranno essere conserva2 per eventuali indagini da compiere presso l'ISS. Algoritmo diagnosIco a seguito del riscontro di un risultato ripetutamente rea<vo al test di screening • 1) In caso di test sierologico ripetutamente reaMvo valutare il test NAT: Se il test NAT risulta posiAvo confermato: – l’algoritmo diagnosAco si interrompe; – l’unità non è valida; – il donatore viene sospeso permanentemente e avviato al necessario approfondimento clinico e al follow up; – viene effeJuato il look back sulle precedenA donazioni, come riportato nel diagramma di flusso. Se il test NAT risulta negaAvo: – eseguire test sierologici di conferma / supplementari; – se i test sierologici di conferma / supplementari risultano negaAvi o indeterminaA, eseguire un secondo test sierologico in doppio con altro metodo analiAco di sensibilità comparabile a quella del test uAlizzato per lo screening; – se il secondo test sierologico ha esito negaAvo il donatore può essere riammesso secondo un protocollo validato (valutare l’opportunità di eseguire per le donazioni successive test di screening con metodo alternaAvo); – se il secondo test sierologico ha esito posiAvo il donatore è permanentemente sospeso (valutare l'opportunità di un follow up periodico del donatore) e viene effeJuato il look back sulle precedenA donazioni, come riportato nel diagramma di flusso. Algoritmo diagnosIco a seguito del riscontro di un risultato ripetutamente rea<vo al test di screening • 2) In caso di test NAT posiIvo confermato valutare il test sierologico: Se il test sierologico risulta posiIvo: – l’algoritmo diagnosAco si interrompe; – l’unità non è valida; – il donatore è sospeso permanentemente e avviato al necessario approfondimento clinico e al follow up sierologico e molecolare; – viene effeJuato il look back sulle precedenA donazioni, come riportato nel diagramma di flusso. Se il test sierologico risulta negaIvo: – l’unità non è valida; – il donatore è sospeso permanentemente e avviato al necessario approfondimento clinico e al follow up per indagare se traJasi di una infezione acuta o una infezione occulta; – viene effeJuato il look back sulle precedenA donazioni, come riportato nel diagramma di flusso. Look back • Indagine retrospettiva sul donatore risultato positivo alla ricerca dei marcatori di malattie trasmissibili con la trasfusione o coinvolto in casi di presunta trasmissione d’infezione con la trasfusione • Identificazione e convocazione del paziente o pazienti che hanno ricevuto gli emocomponenti nei 6 mesi antecedenti la donazione in questione • Valutazione clinico-‐analitica del paziente • Notifica all’industria .
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