Interazioni non covalenti

Interazioni non covalenti
Energia
di legame
Idrogeno alifatico
- C - H· · ·H - C -
-0.03 kcal/mol
Ponte salino
- COO-· · ·+H3N -
-5
Dipolo-dipolo
C=O · · · O=C
+0.3
Ghiaccio
- O - H· · ·O -
-4
N - H· · ·O=
-3
Backbone delle prot.
Catena laterale della Phe
Cambio di
energia libera
Acqua etanolo
-1
-2.4
•  L’IMPORTANZA DELLE CARICHE
Legge di Coulomb
ΔE =
1
ε
q1 · q2
R12
µ=d·z
E = -1.32 kcal/mol
E = +1.32 kcal/mol
E = +0.66 kcal/mol
E = -0.66 kcal/mol
HCl completamente ionizzato
d = 1.27 Å
µ = 6.1 Debye
µ exp = 1.03 D
17%
Preferenziali: Ala Glu Leu Met
Sfavoriti:
Pro Gly Tyr Ser
µ = 3.5 D
Interazione elettrostatica tra NH3+ e COO- in Ala che
diminuisce all’aumentare della distanza (Ala)4
+ Ala-
Ala+
NH3+-CH(CH3)-COO-
NH3+-CH(CH3)-COOH
Ala+
+ Ala-Ala
+Ala-Ala-
+ Ala-Ala-Ala-Ala
NH2-CH(CH3)-COO-
Ala-
+ Ala-
+ Ala-Ala-Ala
Ala-
Ala-Ala-
+Ala-Ala-Ala-
+Ala-Ala-Ala-Ala-
Ala-Ala-Ala-
Ala-Ala-Ala-Ala-
pK1
pK2
2.34
9.69
3.12
8.30
3.39
8.03
3.42
7.94
In un sistema non perturbato
pKα = ΔGo/2.303 RT
ΔGc = 2.303 RT (pK’α - pKα)
i.e. Alanina
pKα imperturbato COO- (Ala)4
3.42
pK’α perturbato COO- Ala
2.34
=> ΔGc = 2.303 · 0.6 (2.34-3.42) = -2.5 kcal/mole
Interazione elettrostatica abbassa l’energia libera della
molecola di 2.5 kcal/mole =>
dissociazione piu’ facile
pKα piu’ basso
Effetto dell’ambiente su alcuni gruppi di alcune proteine
Lys
Acetato-decarbossilasi
6.0
10.4
Glu
Carbossi-peptidasi
7.0
4.5
Cys
Papaina
3.3
9.5
Subtilisina
Proteasi a serina
His 64 Agisce da base durante la catalisi accettando un protone da Ser 221
Enzima attivo a pH alcalino quando His 64 non e’ protonata
=> Attivita’ catalitica varia con il grado di ionizzazione di questo residuo
Strategia:
Mutagenesi sito-diretta su residui carichi
Osservare influenza su pk di His 64
Puo’ questo essere previsto da un modello elettrostatico?
Elimino
Asp
Ser 99
Glu
Ser156
Abbassano il pK
Dipendenza di kcat/kM dal pH
Asp
Ser99
Subtilisina
Calcolo il potenziale dell’His in presenza di Asp; Calcolo il potenziale dell’His in
presenza di Ser: La differenza mi permette di conoscere il
ΔpK
Nature - 1985 - 314 - p.235
-le interazioni elettrostatiche sono interazioni deboli e quindi
dell’ordine di qualche kcal/mol;
-le interazioni elettrostatiche possono essere utili nel
riconoscimento molecolare: infatti una definita distribuzione
delle cariche sulla proteina crea un potenziale elettrostatico
utile all’interazione con il suo partner molecolare;
-introduzione o eliminazione di cariche possono essere
utilizzate per modulare i pK di singole catene laterali;
la misura di un parametro in funzione della forza ionica
permette di comprendere la sua dipendenza da fattori
elettrostatici.
Espande quando congela
espansione = 1.6 cm3 mole-1
Contrae quando si scioglie
fino a 4oC, poi espande
nuovamente
H-bond in ghiaccio
~ -7 kcal/mole
O
2.76 Å
µ = 1.8 D
O
Paragone tra melting e boiling points
per molecole di grandezza simile
Composto
Melting point (K)
Boiling point (K)
H 2O
273
373
H 2S
190
211
Acido acetico
290
391
Propanone
178
330
Etanolo
156
351
Propano
63
231
Metanammina
181
267
Etano
101
185
L’acqua forma legami idrogeno anche nello stato liquido
Affinche’ due molecole in soluzione interagiscano favorevolmente, esse
devono superare una perdita di entropia e devono interagire l’una con
l’altra in maniera piu’ forte di quello che fanno individualmente con l’acqua.
Come esempio, piccole molecole che interagiscono tra esse parimenti che
con l’acqua, hanno un KAB = 1/55 M = 0.02 M-1, dove
55 M e’ la
concentrazione delle molecole d’acqua, nell’acqua in fase liquida.
•  KAB= [AB] / [A ] [ B] M-1
•  Piccole molecole che interagiscono
tra esse parimenti che con l’acqua,
hanno un KAB = 1/55 M = 0.02
M-1, dove 55 M e’ la
concentrazione delle molecole
d’acqua, nell’acqua in fase liquida.
CH3
NMA
C=O
HN
CH3
CH3
HN
C=O
CH3
N-MethylAcetamide
Cambiamenti di energia libera per il trasferimento di vari
composti dall’etanolo all’acqua a 25OC
COMPOSTO
ΔG (kcal/mole)
ΔG1 (kcal/mole)
Glicina
-4.63
0
Alanina
-3.90
+0.73
Valina
-2.94
+1.69
Leucina
-2.21
+2.42
Isoleucina
-1.69
+2.97
Fenilalanina
-1.98
+2.65
Prolina
-2.06
+2.60
Contributo di un gruppo CH2
Etano
+3.02
-
Metano
+2.26
-
Etano-Metano
-
+0.76
Alanina-Glicina
-
+0.73
Leucina-Valina
-
+0.73
ΔGOTR = -RT ln SH2O / Setan
ΔGOTR = -RT ln SH2O
Sbenz
transferimento di metano da benzene ad acqua
ΔH
ΔS
ΔG
CH4 benzene
CH4 acqua
-2.8
-18
+2.6
CH4 etere
CH4 acqua
-2.4
-19
+3.3
C2H6 benzene
C2H6 acqua
-2.2
-20
+3.8
Queste molecole non vogliono essere trasferite verso l’ambiente
Idrofilico per un motivo entropico
Relazione inversa tra solubilita’ e area richiesta per
accomodare il soluto
20 cal mol-1 Å-2
I residui apolari tendono ad aggregare per minimizzare
dimensioni clatrato
Creazione di cavita’
T4 Lisozima
Leu
Ala
ΔΔG=a+b Δsurf
b=20 cal mol-1 Å-2
SCIENCE 1992 - 255 - p.178
processo:
Soluto idrofobico in
solvente idrofilico1.
l1. creazione di una cavità
nel solvente;
2. introduzione del soluto
nella cavità;
3. riarrangiamento del soluto
per ottimizzare interazione e
del solvente in modo da
ottimizzare l’interazione.
1) Creare cavita’ nel solvente. 2) Introdurre il soluto nella cavita’.
3) Riarrangiamento soluto e solvente per massimizzare interazioni.
Il’effetto idrofobico diminuisce al diminuire della temperatura
Hydrophobic Effect – causes non-polar compounds to minimize
their interaction with water – this is the MAJOR driving force in
folding a protein into its native structure
Hydrogen Bonds
Hydrogen Bond determina specificità
E’ importante l’energetica totale
-------“Hydrogen Effect”
Differente dall’energia di dissociazione del legame
idrogeno di un singolo legame, che è equivalente
all’entalpia di quel legame
L’energetica dipende dall’entalpia di formazione di
ognuno dei legami e dai cambi di entropia nel solvente
e nei reagenti
Analisi di proteine mutanti
Ks Costante di dissociazione
ΔΔGB negativo => Proteina mutante lega il ligando meno
fortemente del wild-type => Ks(mut)>Ks(wt)
E+S---ES---E+P
ΔGT# = = RT ln ( kBT/h) – RT ln ( kcat/KM)
• ΔGT# = ΔGB + ΔG#
ΔGT#
è costituito da un termine energetico favorevole ΔGB, associato
con il legame del substrato e da un termine sfavorevole ΔG#, associato
con l’attivazione chimica.
KM può essere usato per calcolare ΔGB, mentre kcat può essere utilizzato
per determinare ΔG#
Cinetica enzimatica
ΔGT# = ΔGB + ΔG#
• 
•  ΔΔGT= = ΔGT= ( WT) - ΔGT= ( mut)
ΔΔGT= = RT ln ( kcat/KM)mut/( kcat/KM)WT
ΔΔGT= sarà negativo per mutazioni che hanno
diminuito ( kcat/KM) sia per aumento di KM che per
Mutazioni che portano ad una riduzione di kcat
Tirosil-tRNA sintasi - aminoacilazione del tRNAtyr con tirosina
E + Tyr + ATP
ETyr-AMP + tRNAtyr
[E·TyrAMP] + PPi
E + Tyr-tRNAtyr + AMP
Strategia:
• Eliminare legame idrogeno con mutazione
• Verificare struttura
• Misura catalitica
Ks ≈
10-9 M
ΔΔG=-RTln[(kcat/KM)MUT/(kcat/KM)WT]
Fersht et al Nature 1985, 314, 235-238
La delezione di una catena che interagisce con un gruppo non
carico del substrato porta ad una perdita di 0.5-1.5 Kcal/mol
indipendentemente dalla catena usata.
In specificità variazioni da 2-12 volte
Elimanata la catena che faceva legame idrogeno
Stessa situazione se elimino la catena carica
Carica-dipolo
Carica-dipolo
La elimino da ambedue le parti
Delezione di un gruppo che forma un legame idrogeno con un
gruppo carico del substrato
Interazione
carica-dipolo
≠
ΔΔGT ≈ 4 kcal/mol
Variazione specificita’ ≈ 103
Interazione
dipolo-dipolo
Stretching
Alcune caratteristiche delle catene laterali
δ
ε
•  Studi NMR mostrano che H
normalmente su Nε
•  pK di protonazione ≈ 7
•  La carica risuona tra i due N atomi
•  Deprotonazione pK ≈ 14.4

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