Preparazione del paziente e raccolta dei materiali biologici Diagnostica biochimico-clinica Lezione 1 La biochimica clinica La biochimica clinica è una scienza applicata che studia l'effetto di una malattia sui processi biochimici degli organi, dei tessuti e dei fluidi biologici. Prende in esame qualunque materiale biologico facilmente disponibile per la misura di sostanze o proprietà che possono presentare qualche interesse al fine di prevenire, diagnosticare o curare uno stato di malattia nell'individuo. La biochimica clinica Contributo relativo a malattie che risultano spiegabili su una base puramente biochimica (es. talassemia). Contributo attinente la classificazione nosografica, permettendo di classificare condizioni morbose apparentemente simili sul piano clinico ma diverse sul piano fisiopatologico (es. diabete mellito insulino-indipendente e insulino-dipendente). Contributo alla clinica, fornendo reperti statisticamente significativi sotto l'aspetto medico, basandosi su cognizioni di fisiopatologia e di clinica, utilizzando il concetto di probabilità statistica di malattia. Ruolo nel controllo e nell'aggiustamento della posologia di farmaci molto attivi e ad indice terapeutico ristretto (es. antibiotici, antiblastici ecc.). Controllo di fattori di rischio nell'ambiente di lavoro (assorbimento di piombo e altri metalli, solventi organici, pesticidi, anticrittogamici, CO, ecc.) così da poter evitare mediante idonei provvedimenti l'insorgenza di alterazioni patologiche irreversibili. La biochimica clinica La biochimica clinica è una scienza applicata multidisciplinare. Infatti per comprendere i principi fondamentali delle tecniche operative di cui si avvale nella pratica c'è bisogno di conoscenze di fisica, di chimica, di chimica analitica, di chimica-fisica, di statistica e di bioingegneria. D'altro canto per comprendere i meccanismi fisiopatologici nei quali la biochimica clinica è in grado di far luce, risultano indispensabili conoscenze di genetica, di biologia, di biochimica, di fisiopatologia, di patologia, di farmacologia. La biochimica clinica Unità di base nel Sistema Internazionale Lunghezza Metro m Massa Chilogrammo Kg (g) Tempo Secondo s Quantità di sostanza Mole mol Multiplo Prefisso Simbolo 1012 109 106 103 Tera Giga Mega Kilo T G M K 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 10-21 milli micro nano Pico femto atto zepto m µ n p f a z Esempi di applicazione dei prefissi Lunghezza (m) Massa (g) Tempo (s) Quantità di sostanza Concentrazione (M) mm mg ms mmol mM μm μg μs μmol μM nm ng ns nmol nM 0,1nm= 1 Å Angstrom pg ps pmol pM Concentrazione: M = mol/L soluzione % = g/100 ml soluzione mg/ml Biochimica clinica PERCHÉ SI RICHIEDE UN ESAME DI LABORATORIO? Per confermare un sospetto clinico Per stabilire o escludere una diagnosi Per monitorare la terapia Per monitorare i livelli terapeutici di un farmaco Per formulare una prognosi Per lo screening di una malattia tra persone apparentemente sane Per definire l’estensione o la gravità di una malattia Biochimica clinica Biochimica clinica Un esame di laboratorio comprende una serie ordinata di passaggi: 1. Richiesta dell'esame 2. Preparazione del paziente 3. Raccolta del campione 4. Fase pre-analitica 5. Fase analitica 6. Fase post-analitica interpretativa 7. Controllo di qualità 8. Referto 9. Compatibilità dei dati ottenuti Biochimica clinica Preparazione del paziente Evitare l’interferenza da farmaci che può essere: 1. Biofarmacologica e metabolica Farmaci epatotossici: alterano il livello della fosfatasi alcalina Vitamina K: diminuisce il tempo di protrombina ed il tempo di emorragia Diuretici: alterano la concentrazione degli elettroliti nei liquidi biologici 2. Fisica Vitamina A, riboflavina, carote ed alimenti contenenti pigmenti gialli alterano la misura della bilirubina 3. Chimica Il farmaco può interagire con l’analita, i reagenti o le tecniche di misura E’ necessario il digiuno per non alterare la glicemia, lipemia, potassemia, azotemia L’assunzione di alimenti contenenti tiocianati (es. senape) abbassa gli ormoni tiroidei Agrumi, caffè, carote e spinaci possono interferire con la determinazione urinaria dell’aldosterone Banane ed ananas che contengono serotonina aumentano il tasso di acido 5idrossiindolacetico escreto con le urine tanto da far sospettare la presenza di tumore carcinoide Preparazione del paziente Preparazione del paziente Preparazione del paziente: postura Preparazione del paziente: postura Postura e riposo fisico: Possono influenzare la concentrazione di numerose sostanze nel sangue In posizione ortostatica diminuisce il volume plasmatico del 10% ed aumenta quello del liquido interstiziale. In pazienti ambulatoriali, aumenta dunque la concentrazione di emoglobina, di proteine totali e di tutte le sostanze che in circolo sono legate a proteine (es. calcio, colesterolo, NEFA, bilirubina) L’immobilizzazione determina demineralizzazione del tessuto scheletrico con aumento del calcio, fosforo ed idrossiprolina nelle urine L’attività fisica può influenzare le attività enzimatiche localizzate nella muscolatura scheletrica (es. aspartato-ammino transferasi, aldolasi, lattato-deidrogenasi). Ritmi cronobiologici Ultradiani (< 24 h) Infradiani (> 24 h) Circadiani (24 h) 7 giorni (settani) 1 mese (mensili) 1 anno (annuali) Le concentrazioni di alcuni analiti variano anche a seconda della stagionalità (es. colesterolo aumenta in inverno) Preparazione del paziente Preparazione del paziente Preparazione del paziente Preparazione del paziente Prelievo di campioni biologici Sangue Urine Liquor Liquido sinoviale Liquidi di versamento delle cavità sierose (Pleurica, Pericardica, Peritoneale) Liquido amniotico Liquido seminale Succo gastrico Prelievo urine Prelievo liquor LIQUOR (LCR, Liquido Cefalorachidiano) Riempie tutti gli spazi lasciati liberi dall’encefalo e dal midollo spinale all’interno della dura madre ovvero la parte più esterna e più spessa delle meningi (membrane che avvolgono l'encefalo e il midollo spinale). Prelievo liquor (rachicentesi) Prelievo (Adulto ∼ 160 mL, Neonato ∼ 40-60 mL): Spazio intervertebrale tra la quarta e la quinta vertebra lombare; più raramente tra atlante ed osso occipitale. Permette anche di iniettare farmaci direttamente all'interno dello spazio sub aracnoideo e ridurre la pressione intracranica in caso di idrocefalo (accumulo di liquor nei ventricoli cerebrali che si dilatano). Prelievo liquor Permette di accertare infezioni sospette a carico del cervello (es. meningiti), verificare patologie demielinizzanti e rilevare la presenza di eventuali cellule neoplastiche. Sufficienti ∼ 3-4 mL per esami chimici e citologici Pressione liquorale dipendente dalla postura (>seduti) Colore limpido “acqua di roccia” Parametri del liquor nelle meningiti Prelievo liquido sinoviale Ultrafiltrato plasmatico prodotto dalle cellule che rivestono internamente la membrana sinoviale delle grosse articolazioni. Ha funzione lubrificante e protettiva delle cartilagini che rivestono i capi articolari delle ossa Prelievo liquido sinoviale (Artrocentesi) Puntura percutanea delle cavità intra-articolari. Il materiale prelevato è posto in un contenitore sterile ed esaminato immediatamente. Si eseguono valutazioni su vari parametri. Condizioni normali → cristalli = assenti; leucociti = 200/ml; mucine = normale; viscosità = normale. Condizioni patologiche → Tumefazione intra-articolare con aumento della quantità di fluido. Prelievo liquidi di versamento delle cavità sierose PLEURICA-PERICARDICA-PERITONEALE Svolgono funzione lubrificante favorendo lo scorrimento endocavitario dei visceri a loro volta rivestiti da membrana sierosa come le cavità che li contengono. Si formano per ultrafiltrazione del plasma e vengono riassorbiti attraverso i capillari delle sierose. Aumentano in seguito ad infiammazioni o neoplasie. Visceral pleura Parietal pleura Prelievo liquidi di versamento delle cavità sierose Prelievo a scopo diagnostico → ∼ 50 mL Prelievo liquidi di versamento delle cavità sierose Prelievo a scopo terapeutico → Volume variabile Prelievo liquido amniotico Prelievo: Puntura transaddominale del sacco amniotico dopo la 12° settimana o prima sotto controllo ecografico Permette di: Valutare la funzionalità di organi e apparati fetali Rivelare malformazioni fetali Accertare eventuali malattie genetiche o cromosomiche Prelievo liquido seminale Permette di ottenere lo spermiogramma, spermiogramma ossia l’analisi del liquido seminale finalizzata a valutare la qualità degli spermatozoi, attraverso la verifica della forma, del numero e della motilità. Tale esame rappresenta lo strumento principale per la valutazione della fertilità maschile. Il paziente deve effettuare almeno 2-3 giorni di astinenza prima del prelievo, preferibilmente in laboratorio. Il campione va tenuto a 37°C ed analizzato entro un’ora dal prelievo. Prelievo succo gastrico Il succo gastrico è rappresentato dalle secrezioni acide dello stomaco a digiuno. L'esame è indicato in tutte le situazioni nelle quali ci sia il sospetto di alterazioni della qualità/quantità della secrezione acida dello stomaco. Prelievo succo gastrico Prelievo mediante sondaggio gastrico di pochi mL. Si introduce una sonda ed il contenuto gastrico viene aspirato ed eliminato. Con un'aspirazione manuale continua si raccolgono poi quattro campioni di succo gastrico prodottosi in 15 min (secrezione acida basale, Basal Acid Output, BAO). In seguito, viene somministrata la pentagastrina (6 mg/kg) SC e quindi si ripete il prelievo di altri quattro campioni di succo gastrico in 15 min (secrezione acida massima o di picco, Maximal Acid Output, MAO). Sui 4 campioni si misura volume ed acidità mediante titolazione con idrossido di sodio per calcolare la BAO e le variazioni secretorie della MAO dopo la stimolazione. Occorre sospendere l’assunzione di farmaci almeno 24 ore prima del prelievo che deve avvenire a digiuno da almeno 12 ore. Prelievo sangue TIPO DI PRELIEVO DI SANGUE Venoso: da 1-2 mL a 10-20 mL, da vena periferica, con vacutainer; per indagini chimico-cliniche di routine. Capillare: da qualche µL a 1 mL, da polpastrello, lobo dell’orecchio, con capillari; utile per l’equilibrio acido-base. Arterioso: circa 5 mL, da arteria radiale, con vacutainer; per lo studio dei parametri dell’equilibrio acido-base e dei gas nel sangue. Sangue Il sangue è un tessuto che costituisce circa 1/12 del peso corporeo, circa quindi 5-6 litri che svolge numerose ed importanti funzioni: Respiratoria: per mezzo dell'emoglobina contenuta negli eritrociti, porta l'ossigeno ai vari tessuti e ne preleva l'anidride carbonica (CO2) Nutritizia ed escretrice: trasporta sostanze nutritive (amminoacidi, zuccheri, sali minerali) e raccoglie quelle escrete dai vari apparati che verranno eliminate attraverso il filtro renale od elaborate dal fegato Regolazione: Il sangue trasporta inoltre ormoni, enzimi e vitamine Difesa: Presiede anche alla difesa dell'organismo attraverso l'azione svolta dai globuli bianchi Termoregolatrice Mantenimento del tasso idrico Regolazione dell’emostasi Mantenimento della pressione osmotica (minerali) e oncotica (proteine) Sangue Il trasporto dell’O2 avviene mediante l’emoglobina, una proteina specializzata che è contenuta all’interno dei globuli rossi. Sangue Il sangue è formato da elementi figurati (eritrociti, leucociti e piastrine) e da una sostanza intercellulare liquida, denominata plasma. Il plasma è la componente fluida del sangue, cioè il sangue deprivato degli elementi figurati, ma che contiene i fattori della coagulazione Il siero identifica quel liquido normalmente chiaro che si separa dal sangue quando questo viene lasciato coagulare. Quindi il siero è la componente liquida del sangue che rimane dopo la rimozione degli elementi figurati e del coagulo di fibrina. Sangue Per ottenere il plasma bisogna aggiungere al sangue contenuto in una provetta, una sostanza anticoagulante e sottoporre il campione a centrifugazione; in questa maniera la parte corpuscolata si deposita sul fondo della provetta e sopra questa abbiamo un fluido che e' il plasma. Se invece al campione non viene aggiunto anticoagulante, alla parte corpuscolata si lega il fibrinogeno; centrifugando, o semplicemente attendendo un certo tempo, la parte solida si deposita e sopra resta un liquido che si chiama siero Sangue • Nel corpo umano sono presenti circa 5 L di sangue (8% del volume corporeo). • Di questi, solamente 2,25 L (45%) sono cellule, mentre il resto è plasma. • Dei 2,25 L di elementi corpuscolati, solamente circa l’1,6% sono leucociti, le piastrine anche meno (circa 0,0065 L). Prelievo sangue 1. Vena cubitale mediana - spesso utilizzata per drenare il sangue (venipuntura) 2. Vena basilica - solitamente è la vena più grande presente nelle braccia, spesso viene utilizzata come punto d'accesso per l'emodialisi 3. Vena cefalica - corre lungo i bicipiti, è la vena che contraddistingue tutti i bodybuilder. Preparazione del materiale Assicurarsi che sia disponibile tutto il materiale per il prelievo ovvero cotone, laccio, sistema per provette sottovuoto (ago a doppia punta o ago Butterfly, camicia, provette), contenitori per l'eliminazione del materiale usato per il prelievo, supporti per provette. Prelievo sangue È una tecnica che permette l’accesso alle vene attraverso un ago o un catetere Disinfezione della cute prima del prelievo Introduzione dell’ago nella vena e drenaggio del sangue nella provetta sterile sottovuoto Prelievo sangue VACUTAINER Provette pre-etichettate, dotate di vuoto precalibrato e sterili. Sono dotate di chiusure di sicurezza che riducono drasticamente l’esposizione al rischio biologico sia nel momento del prelievo, sia durante il trattamento dei campioni ematici, consentendo agli Operatori Sanitari di operare nella massima sicurezza. Possono contenere diversi additivi, indicati da specifici colori regolamentati da accordi internazionali. The VACUTAINER system Prelievo sangue Prelievo sangue Prelievo sangue Il sangue, una volta prelevato, viene poi dispensato nelle varie provette al fine di ottenere i campioni da utilizzare per le diverse metodiche, che sono: Siero chimica clinica, immunometria Plasma chimica clinica, immunometria Plasma citratato test coagulativi Sangue citratato VES Sangue con EDTA emocromo Additivi Additivo → Tipo di analisi Senza additivo • azotemia, creatininemia, colesterolo, acido urico, ecc Eparina • anticoagulante naturale, antitrombinico Na+Citrato • velocità di eritrosedimentazione, VES NaF • glicemia EDTA • emocromo, alcuni ormoni Additivi Na+Citrato Soluzione alla concentrazione di 3.4-3.8 g/dL miscelato con sangue nel rapporto volumetrico 1:10. Ha effetti reversibili, è anticoagulante. Usato per misurare il tempo di protrombina (tempo di Quick PT), tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT o PTT), fibrinogeno, aggregazione piastrinica. Additivi EDTA Concentrazione finale di 1-2 mg/mL (soluzione 0.1% essiccata in provetta miscelato con sangue nel rapporto opportuno). Chela gli ioni Ca++, è anticoagulante. Usato per analisi di ematologia, ha ampia applicazione (no per calcio, ferro, ALP, CK). Additivi NaF Concentrazione finale di 2 mg/mL (soluzione 0.1% essiccata in provetta miscelato con sangue nel rapporto opportuno). Inibisce gli enzimi della via glicolitica (senza agente anti-glicolitico il livello di glucosio diminuisce di 10 mg/dL ovvero 0.56 mmol/L, per ora a 25°C); è un debole anticoagulante, si usa in associazione con l’EDTA. Usato per analisi della glicemia. Additivi Ossalato Concentrazione finale di 1-2 mg/mL. E’ un anticoagulante, complessa gli ioni Ca++. Ha ampia applicazione, ma non viene utilizzato per ematocrito, calcio, ALP, ACP, LDH; può causare precipitazione dei Sali di ossalato. Additivi Prelievo sangue Il campione di sangue prelevato può essere analizzato immediatamente oppure conservato. Richiede la preparazione/separazione del plasma o siero o altro. Deve essere suddiviso in aliquote e si conserva a temperatura ambiente, a 4°C, a -20°C oppure a -80°C a seconda della stabilità degli analiti da determinare. Prima dell’analisi, se congelato, il campione va scongelato correttamente. Prelievo sangue Bisogna eseguire il prelievo di sangue venoso evitando una eccessiva stasi venosa che può indurre fenomeni di emoconcentrazione Inoltre, è importante far defluire il sangue spontaneamente e delicatamente per evitare l’emolisi. nella provetta E’ la causa più frequente di inadeguatezza qualitativa del prelievo di sangue (60% dei campioni non processati) Prelievo sangue EMOLISI: Passaggio nel siero (o nel plasma) dell’emoglobina e di tutte le sostanze contenute all’interno degli eritrociti. Ciò provoca interferenze fisiche (Abs a 405 nm, Banda di soret) e chimiche (inibizione di reazioni o di attività enzimatiche). MECCANICA (eccessiva pressione o depressione dello stantuffo della siringa nelle fasi di aspirazione o espulsione del sangue) FISICA (es. errata conservazione del campione, riscaldamento-congelamento) BIOLOGICA (es. deficit di enzimi eritrocitari) OSMOTICA o CHIMICA (presenza di acqua, alcool o disinfettanti nell’ago, siringa o contenitori) Il plasma presenta il vantaggio di una emolisi inferiore rispetto al siero Emolisi osmotica Prelievo sangue Dati da allegare sempre al prelievo di sangue Dati anagrafici del paziente (Nome, sesso e data di nascita) Clinica/reparto di provenienza o indirizzo (se esterno) Telefono/indirizzo del medico che ha disposto il test Diagnosi clinica o motivazione del test Tipo di materiale inviato Data/ora del prelievo Eventuale trattamento farmacologico in corso Prelievo sangue Refertazione Refertazione Refertazione Sottosistemi Espettorato Eritrociti Feci Leucociti Liquor Plasma Proteine Sangue Siero Urine Abbreviazioni Ex Er F Lc LCR P Pr Sg [arterioso (a), venoso (v), capillare (c)] S U Refertazione Profilo d’ingresso Glucosio Creatinina Acido Urico Sodio Potassio Cloro Bicarbonato Calcio Fosforo Bilirubina diretta Bilirubina totale LDH AST (GOT) ALT (GPT) Fosfatasi alcalina Albumina Proteine totali Colesterolo Trigliceridi Organo/Sistema interessato Metabolismo, equilibrio idricosalino, valutazione di rischio cardiaco rene, equilibrio idrosalino rene rene, equilibrio irosalino rene, equilibrio idrosalino rene, equilibrio idrosalino rene, equilibrio idrosalino osso, equilibrio idrosalino rene, osso fegato fegato fegato, muscolo fegato, muscolo fegato fegato, ossa nutrizione, fegato, rene nutrizione, fegato nutrizione, valutazione di rischio cardiaco nutrizione, valutazione di rischio cardiaco
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