P. Cassandro

Utilità della matrice cheratinica nella diagnosi differenziale
tra uso/non uso di farmaci o sostanze illecite:
Contributo casistico
P. Cassandro , A. Carfora, R. Petrella, R. Borriello
Tossicologia Forense- Dipartimento di Medicina Sperimentale
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Seconda Università di Napoli (SUN)
L’Analisi del Capello
rappresenta il “Gold standard approach” dell’indagine tossicologica
finalizzata alla diagnosi differenziale di
uso/non uso pregresso di sostanze illecite
Tale approccio si avvale
 della stabile persistenza nella matrice cheratinica di droghe e/o farmaci in forma
immodificata, in concentrazioni prevalenti rispetto ai metaboliti rinvenibili
 della possibile esecuzione dell’analisi segmentale, utile a definire l’eventuale
cronologia dell’ assunzione
 della possibilità di porre diagnosi differenziale tra uso abituale e/o inquinamento
aspecifico ambientale.
Tali peculiarità possono conferire particolare rilevanza alla “prova dell’eventuale
assunzione ” ovvero definire lo “stile di vita” di un soggetto specie quando una
sanzione ( penale o amministrativa ) viene applicata a distanza di tempo rispetto
al sospetto uso di sostanze o quando le altre matrici tradizionali non sono più
disponibili o utilizzabili (assenti o delay nel prelievo).
Nella nostra casistica l’analisi del capello
non rappresenta una “ analisi di routine”
ma viene richiesta per casi specifici in relazione a:
 Ricorsi al TAR per il reinserimento in graduatorie di concorso (polizia,
magistratura, agenti penitenziari, carabinieri , corpo dei vigili del fuoco etc);
 Idoneità a mansioni lavorative (indagini di II livello);
 Idoneità alla mansione militare;
 Affidamento di minori o limitazioni della patria podestà;
 Controversie in casi di divorzio;
 Procedimenti penali (violenza carnale , decessi o altre fattispecie)
 Esposizione prenatale a sostanze d’abuso; (proc. Penali e final. clinica ).
 Procedimenti dinanzi al GM per violazione degli art. 187 CdS;
 Richieste di privati.
Protocollo metodologico (1- droghe ) in GC/MS
 Decontaminazione : Diclorometano
 Standard interno : Δ8 THC, Scopolamina, Nalorfina, D-L Amfetamina d6,
BEG d3, Cocaina d3, Morfina d3, Buprenorfina d4.
 Idrolisi a caldo: acida per le droghe basiche e basica per il THC
 Estrazione: L/L con Cloroformio /Isopropanolo (9:1) per droghe basiche
oppure con esano/etileacetato (9:1) per THC
SOSTANZE
 Complessante: MSTFA
 Analisi strumentale:
In GC/MS (Agilent)
su colonna MS5
Acquisizione in SIM
 Cut.-off Linee Guida GTFI
6-MONOACETILMORFINA-TMS
MORFINA-TMS
CODEINA-TMS
COCAINA
BENZOILECGONINA-TMS
ECGONINA METILESTERE
NALORFINA TMS (IS)
SCOPOLAMINA (IS)
MDA-TMS
MDMA-TMS
MDEA-TMS
AMFETAMINA-TMS
METAMFETAMINA-TMS
METADONE
BUPRENORFINA
NORBUPRENORFINA
THC
468, 500, 524
315 , 371, 386
Δ8 THC
303, 330, 386
Δ9
Δ9
IONI
287, 340, 399
401, 414, 429
313, 343, 371
82, 182, 303
82, 240, 361
82, 96, 240
414, 440, 455
94, 138, 154
116, 135, 236
91, 130, 250
135, 144, 264
91, 116, 192
91, 130, 206
72, 91, 293450, 482, 506
THC-COOH
371, 473, 488
Protocollo metodologico (2 - Farmaci) LC/MS/MS
Spettrometro: API 3200 AB Sciex con sorgente Turbo Ion
Spray operante in ioni positivi (4500V; 400°C, cur. 15);
Multiple
Reaction Monitoring (MRMs)
Cromatografo liquido (Agilent 1200) nelle seguenti condizioni:
Colonna LC: Agilent Zorbax XDB-C18 (4.6 x 50 mm x 1.8 µ particle size)
Eluente A : H2O + Ac. Formico 0,5% + Ammonio Formiato (2 mM)
Eluente B : Aceto nitrile + Ac. Formico 0,5% + Ammonio Formiato (2 mM)
Flusso: 900 µL/ min
Volume iniettato: 10 µL
STEP
Minuti
%A
%B
Gradiente:
0
0
95
5
1
5
0
100
2
7
0
100
3
7.1
95
5
4
10
95
5
Protocollo metodologico (2 - Farmaci) LC/MS/MS
Metodo multiresiduale previa sonicazione in metanolo :
 Benzodiazepine : Alprazolam, Bromazepam, Clonazepam, Delorazepam,
Diazepam, Estazolam, Flunitrazepam, Flurazepam, Lorazepam,
Lormetazepam, Medazepam, Nitrazepam, Nordazepam, Norflunitrazepam,
Oxazepam, Pinazepam, Prazepam, Temazepam, Trazodone, Triazolam ;
 Antidepressivi: Amitriptilina, Citalopram, Clomipramina, Fluoxetina,
Norfluoxetina, Nortriptilina, Sertralina;
 Antiepilettici: Carbamazepina, Lamotrigina, Orfenadrina, Zolpidem
 Neurolettici /Antipsicotici: Clozapina, Clotiapina, Flufenazina,
Meprobamato, Olanzapina, Promazina, Quetiapina, Risperidone, Tioridazina
 Amfetamine e Cannabinoidi
Idoneità a mansione militare
L.A. Anni 32 (Militare in servizio) rinvenuto dai CC
alle ore 04:40 del 26 Febbraio 2011, accanto alla sua auto
posta di traverso sul ciglio di una Statale, con ferita alla fronte e sospetto trauma
cranico. Interviene il 118 .
Diagnosi in Pronto Soccorso : Stato confusionale di n.d.d.; Miosi; Sospetta
intossicazione da stupefacenti ; trauma cranico; ferita lacerocontusa alla fronte.
Terapia in P.S. : Pratica infusione di Narcan
Quando viene diminuita la velocità di infusione si manifesta agitazione
psicomotoria, trattata con Midazolam e.v. (5 mg) + infusione lenta (5 mg).
Non eseguiti controlli tossicologici in quanto il soggetto, al risveglio, dichiara
di aver subito una aggressione da persona sconosciuta cui aveva dato un
passaggio .
Dimissione alle ore 6:50 per espressa volontà del paziente.
17 Maggio: La Commissione Medica del Comando Militare Esercito Campania
“in relazione alla segnalazione del 118 di sospetta sindrome pregressa da
overdose di oppiacei, valutata solo clinicamente” richiede l’Analisi del capello
per le principali droghe d’abuso, onde definire l’eventuale uso/non uso pregresso.
CAPELLI
Risultati
0 - 3,5 cm
GC/MS
6MAM
0,9 ng/mg
Morfina
0,4 ng/mg
Cocaina 3,0 ng/mg
BEG
0,6 ng/mg
Metadone 2,8 ng/mg
THC
Negativo
LC-MS/MS
Negativo
per Amfetamine
Esito
Militare sospeso dalle funzioni
Applicati benefici previsti dall‟art. 109 DPR 309/90 e succ. mod.
Caso di violenza sessuale
Paziente ricoverata in ospedale (R.I. Anni 28) il 16/12/2010 (ore 16,40)
per crisi ipertensiva e tachicardia.
Alle sei del mattino successivo la paziente riferisce al medico di guardia che alle ore
22,30 della sera precedente, un infermiere, dopo il controllo della pressione, le aveva
somministrato una camomilla nella quale, in sua presenza, aveva versato circa 20 gocce di
un farmaco, da lui definito ansiolitico. Dopo circa 30 minuti tale infermiere si era ntrodotto
nella sua stanza e le aveva usato violenza sessuale.
All’alba era ritornato minacciandola di ritorsioni in caso di denuncia.
La paziente veniva presa in carico dai CC che sequestrato il suo pigiama imbrattato di
tracce biologiche, la conducevano presso il Centro antiviolenza di un altro ospedale ove
veniva sottoposta a prelievo di sangue, visita ginecologica e consulenza psicologica e
psichiatrica.
L‟infermiere al PM che gli contestava la violenza carnale aggravata, non negava
l’evento (identificato dal DNA eseguito sulle tracce biologiche), ma dichiarava che la
paziente era consenziente e definiva la vittima “ persona inaffidabile perché affetta da
patologia psichiatrica e abituale assuntore di BDZ e altre sostanze”.
Dalla Cartella Clinica si desume :
Terapia praticata in accettazione al P.S. : Somministrazione di Diltiazem (antiaritmico)
Terapia in Reparto: non risulta prescritto alcun ansiolitico.
Quesito posto dal PM : verificare sulle matrici biologiche disponibili, l‟eventuale
somministrazione di farmaci sedativi e definire se la vittima fosse assuntrice abituale
di BDZ, Farmaci antipsicotici o altre sostanze d‟abuso.
Matrici disponibili:
Sangue prelevato alle ore 9:00 del 17/12/2010 (circa 11 ore dalla violenza subita)
Capelli prelevati il 1 Marzo 2011 (cm 17) sottoposti ad analisi segmentale (3 cm cad. ).
Risultati
Esito :
Esito
Reperto
LC-MS/MS
GC/MS
Sangue
Diazepam 13,6 ng/ml
Nordiazepam 7,7 ng/ml
STA negativa per altri
farmaci e droghe
Diltiazem in tracce
Capelli
Tutti i segmenti negativi
per BDZ, Antipsicotici,
Neurolettici
Tutti i segmenti negativi
per droghe d’abuso
è stata confermata la somministrazione di Diazepam su sangue ;
è stato escluso l„uso abituale pregresso di BDZ, droghe o psicofarmaci
 l’esito negativo su capello, a seguito di somministrazione singola di BDZ, è
possibile ed ampiamente descritto in letteratura*.
La tesi difensiva dell‟infermiere è stata smentita dall‟analisi del capello
* Xiang et al.: Segmental hair analysis using liquid chromatografy-tandem mass spectrometry after a
single dose of benzodiazepines, P. Doi: J.For. Sci. Intern. 2010,04.046)
Violazione art. 187 Codice della Strada
Incidente con feriti: il 29/01/2012 - ore 02:00 con intervento del 118
Guidatore : L.U. Anni 57 - Cardiopatico (n. 3 by-pass), Diabetico, Iperteso, affetto
da Broncopneumopatia.
Diagnosi : Fratture multiple (anca sin. e sinfisi pubica, diafisi peroneale e tibia sin.;
zigomo sin.), Ferita lacerocontusa orecchio sin. e regione temporo-mastoidea.
Terapia in P.S.: Infiltrazione di Lidocaina per le suture al viso, Tramadolo,
antitetanica.
Su richesta dei CC : eseguite indagini tossicologiche e Alcolemia
I Prelievo di urina ore 04:24 = Positivo per Metadone, Alcolemia Negativa.
II Prelievo di urina ore 07:58 = positivo per Metamfetamina
Metodo dichiarato sul Referto : Immunocromatografico su card
1 Febbraio: Notifica del provvedimento della Prefettura di sospensione della
Patente per 1 anno (violazione art. 187 (c.1) C.d S), sequestro dell’auto e
deferimento A.G.
20 Marzo: Su richiesta di parte viene eseguita l’analisi segmentale del
capello (0-2; 2- 4 cm) per Metadone e Metamfetamina .
Esito Negativo per entrambi le sostanze.
30 Marzo : Sulla base dell’esito negativo delle indagini su capello il PM, tenuto
anche conto delle condizioni di salute del soggetto, consente il riesame degli stessi
campioni di urina (in GC/MS), in regime di contraddittorio alla presenza del
Responsabile del laboratorio ospedaliero dove erano state eseguite le prime indagini.
30 Maggio: Assenza di catena di custodia ma campioni di urina congelati. Risultati
dell’analisi in GC/MS (total Ion e SIM)
Prelievo
Metadone
Metamfetamina
Sostanze rilevate STA
Urina ore 04:24
Negativo
Negativo
Lidocaina, Diltiazem, Tramadolo,
Urea, Creatinina, Mannosio
Urina ore 07:58
Negativo
Negativo
Lidocaina, Diltiazem, Tramadolo,
Urea, Creatinina, Mannosio
Esito
13 Giugno: Archiviazione del procedimento penale
per insussistenza della prova.
Evitato il rifiuto del risarcimento da parte dell’ Assicurazione
Risolto in 6 mesi l’iter valutativo in ambito penale
Abuso di ufficio e violenza carnale aggravata
Ottobre 2005: il Direttore di un carcere femminile viene accusato da 8 agenti penitenziari di
intrattenere (da circa 4 mesi) rapporti sessuali con una detenuta cui aveva fatto ottenere
uno sconto di pena e l’affidamento ai servizi sociali.
Viene inoltre affermato che la ex detenuta lo rifornisse di cocaina, per il comune utilizzo,
durante gli incontri.
Al sopralluogo, effettuato dalla Polizia, nel residence dove temporaneamente
alloggiava il Direttore, viene effettivamente rinvenuto un sacchetto
contenente circa 1,5 grammi di polvere a base di Cocaina
Alla detenuta vengono revocati i benefici ottenuti e per il Direttore, oltre la
sospensione dall’incarico, scatta l‟azione penale per abuso di ufficio e violenza
carnale aggravata .
Sentiti dal PM entrambe gli accusati negano tutto con vigore
Il Direttore sostiene che la cocaina è stata certamente introdotta da sconosciuti nel suo
residence (privo di porta ed infissi di sicurezza) e che gli agenti hanno architettato tutto a
suo danno per vendicarsi del Regolamento disciplinare da lui imposto, sin dalla sua
recente nomina in quel carcere (10 mesi).
Nell’Aprile 2006, su insistenza della difesa, il PM affida consulenza tossicologica
sui capelli di entrambe gli accusati.
Quesito: Diagnosi differenziale tra uso/non uso abituale di Cocaina o di altre
droghe a datare dall’Aprile 2005.
Matrici disponibili :
Detenuta : Capelli lunghi cm 46, sottoposti ad analisi segmentale (4 cm cad.)
Direttore : Capelli lunghi cm 13,5 sottoposti ad analisi segmentale (3,5 cm cad. ).
Risultati delle indagini su matrice cheratinica (GC/MS):
Per entrambi i soggetti: esito Negativo per Cocaina ed altre sostanze d’abuso.
In considerazione della lunghezza dei capelli prelevati, viene escluso
l’uso pregresso sia per la detenuta che per il Direttore.
ESITO
La negatività dell’ analisi del capello sostenne la tesi difensiva degli imputati
(ritorsione del personale).
 Ulteriori indagini (ordini di servizio, note di biasimo, modifiche ai turni di guardia
etc.) fornirono riscontri alla tesi del Direttore.
 Tre degli 8 agenti penitenziari ammisero di aver tentato di ottenere un
provvedimento sanzionatorio e l’allontanamento del Direttore, per rancore personale.
CONCLUSIONE
 Nei casi selezionati l‟esame del capello ha consentito l‟accertamento della
veridicità dell‟accusa ovvero ha garantito le potenzialità difensive dei soggetti
coinvolti, evitando o sostenendo l‟applicazione di una sanzione penale o di un
provvedimento amministrativo.
L‟indagine tossicologica su matrice cheratinica, ha assunto un ruolo sempre
dirimente nella valutazione del caso
sia come dato complementare, in
presenza di altre matrici tradizionali utilizzabili, che come unico dato
disponibile.
Grazie per l’attenzione

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