Lentiviral Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy - e

UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI ROMA “LA SAPIENZA”
Lentiviral Hematopoietic Stem Cell Gene
Therapy Benefits Metachromatic
Leukodystrophy
A. Biffi - Pediatra e membro dell'Unità di Ricerca Clinica
Pediatrica, San Raffaele (MI)
L. Naldini - Direttore della Divisione di Medicina
Rigenerativa e Cellule Staminali, Istituto Scientifico San
Raffaele, (MI)
A.Salustri, R.Santucci
Anno accademico 2013/2014 Leucodistrofia metacromatica
Malattia autosomica recessiva da accumulo lisosomiale
determinata da una mutazione del gene ARSA che coinvolge il
locus 22q13.31 del braccio lungo del cromosoma 22.
La patologia da deficit di Arilsulfatasi di tipo A si presenta
sotto tre forme cliniche:
•  la forma infantile tardiva con manifestazione dei sintomi
dopo il 2 anno;
•  la forma giovanile con manifestazione dei sintomi tra il
sesto e il quattordicesimo anno;
•  la forma dell'adulto la più rara con manifestazione dei
sintomi all'inizio dell'età adulta.
Sulfatidi + Arilsufatasi A à SO4- + Galattosilceramidi
I sulfatidi sono una componente
della guaina mielinica. Quando il
metabolismo di queste molecole
non è correttamente regolato si
innesca un'infiammazione al
livello dell'SNC e SNP.
La mancata attività del gene
ARSA determina un
drammatico accumulo di
sulfatidi all’interno degli
oligodendrociti con
conseguente basso grado di
differenziazione di
quest’ultimi. Ciò comporta
una demielinizzazione delle
fibre assonali con
conseguenti danni celebrali.
Protocollo clinico
Pazien5 tra2a5: bambini di età inferiore al secondo anno di vita i cui fratelli presentano già i sintomi della malaNa; •  MLD01 (16 mesi)à monitorato per 24 mesi dopo il tra2amento; •  MLD02 (13 mesi)à monitoraggio per 18 mesi dopo il tra2amento; •  MLD03 (7 mesi) à monitoraggio per 18 mesi dopo il tra2amento. Ve2ore u5lizzato: ve2ore len5virale di terza generazione (HIV-‐1) di 5po SIN. Cellule target: cellule staminali ematopoie5che CD34+. Gene ARSA
Cellule CD34+
trasfezione
VETTORE
Pakcaging Construct: pKL gag/pol Transfer vector: pCCLsin.cPPT.hPGK.hARSA.WPREmut6 Env construct: pK.G Rev construct: pKRev. Cellula packaging: 293T
MONITORAGGIO DEL VETTORE CON IL GENE D'INTERESSE A PARTIRE DA UN
MESE DOPO IL TRATTAMENTO
Attività ARSA
L’attività di ARSA è stata
misurata con il substrato
p-nitrocatecolo solfato.
Test cromatografici
per l’attività di ARSA
eseguiti sul fluido
cerebrospinale.
EFFETTO TERAPEUTICO
GMFM (Gross Motor Function Measure) score
Valutazione dell’ attività motoria nei
soggetti trattati in relazione ai rispettivi
fratelli malati.
NCV (Nerve conduction velocity) Le linee tratteggiate indicano per
ogni paziente trattato l’età attesa
di comparsa dei sintomi in
accordo con l’insorgenza dei
sintomi osservata nei loro fratelli
malati.
I pallini grigi rappresentano una
corte di pazienti
precedentemente esaminati.
MONITORAGGIO DEI SITI DI INTEGRAZIONE
•  I siti di integrazione (IS) del vettore all’interno del genoma sono stati recuperati
mediante PCR amplificazione-lineare mediata (LAM-PCR) utilizzando tre diversi
enzimi di restrizione (Tsp509 I, HpyCH4 IV e Aci I);
•  Attraverso analisi bioinformatica sono stati mappati i siti di integrazione:
-MLD01 (1,120,414);
-MLD02 (1,518,802);
-MLD03 (425,356);
•  Poiché sono stati recuperati molti siti di integrazione identici da più linee e / o per
diversi tempi, il numero di ISs distinte è stato ridotto a 14.482, 11.077, e 10.959
rispettivamente nei pazienti MLD01, MLD02 e MLD03.
MONITORAGGIO DEI SITI DI INTEGRAZIONE
Analisi Gene ontology (GO) delle ISs attraverso test GREAT (Genomic Regions
Enrichment of Annotation Tools ) eseguito su cellule in vitro e in vivo
provenienti dai pazienti sono stati identificati i geni preferenzialmente
targhettati dal vettore.
In tutti e tre i pazienti i geni in cui il vettore si è principalmente integrato sono :
•  Geni coinvolti nella modificazione e rimodellamento della cromatina;
•  Geni appartenenti al complesso MHCII;
•  Geni che codificano per recettori degli ormoni steroidei;
•  Geni per il processamento dell’RNA.
Queste classi di geni erano le stesse, o in
comune per più del 75% dei geni, con le
classi di geni targettate in un precedente
protocollo clinico simile per l’adreno
leucodistrofia (ALD
HSC-GT).
MONITORAGGIO DELLA SAFETY: MUTAGENESI INSERZIONALE
La frequenza di siti di inserzione
misurati in tutte le linee cellulari di
derivazione ematopoietica CD34
+, mieloide (CD13 +, CD14 +,
CD15 +) linfoide B (CD19 +) e
linfoide T (CD3 +)è stata presa
come indice di abbondanza
relativa dei cloni cellulari. Alcuni
cloni di cellule hanno mostrato
una percentuale di IS superiore in
un tempo ma poi scomparsi o
sono stati fortemente ridotti in
momenti successivi. Da questi
risultati, possiamo concludere che
non si sono verificati eventi di
dominanza clonale nei tre
pazienti.
CIS (Common Insertion Sites)
Densi clusters di integrazione in un intervallo genomico relativamente
ristretto, noti come CIS, sono stati utilizzati come indicatori di selezione
genica di cloni cellulari che ospitano integrazioni specifiche in alcuni
geni ed hanno quindi acquisito un vantaggio selettivo in vivo.
Valore p < 0,05 (calcolato tramite Grubbs test per outliers)
ANALISI IN VIVO SU LARGA SCALA DEI MARKER GENICI IN HSC
Percentuale di IS condivisa tra le linee CD34+ e mieloide o linfoide nel tempo
La diversità clonale di ricostituzione ematopoietica nel tempo è stata calcolata
tramite l'indice di diversità di Shannon. Questo indice misura l'entropia di un set di
dati (IS) tenendo conto del numero totale di ISs e il loro contributo relativo.
conclusioni
l 
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Il processo di produzione di lentivettori è stato ottimizzato in modo da ottenere
un alto titolo, alta capacità di infettare le cellule target, e maggior purezza in
modo da garantire trasduzione efficiente, limitando gli effetti negativi sulla
HSPCs;
Un altro obiettivo fondamentale è stato valutare la sicurezza a lungo termine di
questa terapia attraverso deep-sequencing e bioinformatica. Non è stata fornita
alcuna prova che cloni di cellule che ospitano ISs subiscono espansione in vivo
o selezione;
I dati suggeriscono che la distribuzione genomica di IS in cellule
ematopoietiche dei pazienti riflette l'integrazione LV nelle HSPCs reinfuse;
Questi risultati sono in netto contrasto con quelli riportate in studi precedenti
che utilizzavano HSC-GT infettate con γ-RV;
I tre pazienti MLD01, MLD02, MLD03 vengono tutt'ora monitorati ed effettuano
visite di controllo una volta all'anno;
Ad oggi il numero di bambini affetti da questa patologia sottoposti a questo trial
clinico è ulteriormente aumentato giungendo a dieci.

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