03/04/2014 Una volta identificato qualitativamente il rischio, dovranno essere definiti gli aspetti quantitativi del problema, mediante lo studio della relazione tra la dose efficace del composto in esame e la probabilità che si verifichino effetti tossici nell’uomo I risultati verranno confrontati con quelli relativi all’esposizione umana (stima dell’esposizione), per ottenere una stima quantitativa del rischio Teofrasto Bombastro Von Hohenheim (1493-1541) detto PARACELSO Sono possibili diversi modelli dose-risposta Omnia Venenum sunt Nec sine veneno quicquam existit. Dosa sola facit ut venenum non fit Qualsiasi sostanza è velenosa e nessuna è priva di capacità venefica. Solo la dose fa la sostanza velenosa 1 03/04/2014 Importanza della forma della curva e della pendenza della retta curva/retta ripida: piccole variazioni di concentrazione determinano grandi differenze nella risposta Ormesi: la rivoluzione dose/risposta Descrive l’effetto bifasico che una sostanza provocato a seconda della dose Dose soglia = concentrazione al di sotto della quale non si manifesta tossicità (dipende dall’endpoint in esame) Ormesi indica la capacità di una sostanza di agire in modo diverso a seconda della dose (tipica degli estratti vegetali) La dose soglia sull’effetto critico è la base per estrapolare i limiti di sicurezza da applicare all’uomo La curva di risposta ormetica è una curva a U Per valutare la relazione dose/risposta generalmente non sono disponibili dati sull’uomo Sostanze non cancerogene Vengono ottenute informazioni da sperimentazioni condotte in vitro o in vivo su animali da esperimento studi condotti saggiando concentrazioni molto elevate necessità di effettuare estrapolazioni per dosi più basse Consente di valutare i seguenti parametri EC50 - concentrazione di una sostanza tossica in grado di produrre, per un determinato tempo di trattamento (ad esempio 4, 12, 24, 48, 96 ore), un’incidenza pari al 50% dell’effetto scelto sugli organismi utilizzati in prova (ratti, conigli, ecc.) LD50 - quantità di sostanza tossica che effettivamente entra nell’organismo (si distingue per tipologia, cioè per via orale, per iniezione, ecc.) in grado di provocare la morte del 50% degli organismi utilizzati in prova 2 03/04/2014 Esistono numerosissimi test di tossicità acuta e cronica per la valutazione di EC50 e LD50 Test di tossicità acuta con i batteri bioluminescenti della specie Vibrio fischeri Test di tossicità con Daphnia magna Si possono eseguire test di citotossicità usando linee cellulari umane Test LDH (dosaggio nel terreno di coltura dell’enzima che si libera per lisi della parete cellulare) Colorazione con Tripan Blu Colorazione con sostanze fluorescenti NB- necessità di preparare controlli negativi e positivi Studi su topi, ratti e conigli consentono di valutare i valori di LD50, NOAEL e LOAEL NOAEL (No Observed Adverse Effects Level) dose massima di sostanza che non produce effetti tossici LOAEL (Low Observed Adverse Effect Level) dose/concentrazione più bassa testata alla quale si manifesta un effetto dannoso 3 03/04/2014 LOAEL e NOAEL variano con l’effetto tossico osservato Dai valori di NOAEL e LOAEL si estrapolano con opportune procedure i parametri applicabili all’uomo, introducendo coefficienti di sicurezza, che consentono di tenere conto dell’incertezza dei dati di partenza e della procedura stessa Si esprimono generalmente come mg/kg peso corporeo/giorno I livelli di esposizione umana di riferimento (reference exposure levels, REL) sono concentrazioni o dosi a livello delle quali o al disotto delle quali non si osserva effetto negativo per la salute umana La EPA (Environmental Protection Agency) ha identificato 5 fattori di incertezza (H, A, S, L, D): H: (10) tiene conto delle variazioni umane dovute alla suscettibilità Tutti i REL vengono calcolati dividendo NOAEL o LOAEL per i fattori di incertezza ADI (admissible daily intake) = NOAEL/FI A: (10) estrapola i dati dall’animale all’uomo: si basa sul fatto che l’uomo può essere più suscettibile dell’animale da esperimento a particolari sostanze S: (10) estrapola i dati da una esposizione subcronica ad una esposizione cronica L: (tra 1 e 10) usato per studi in cui il NOAEL non è stato identificato ed è basato sulla presunzione che una dose che sia 1/10 del LOAEL dovrebbe rientrare nel NOAEL D: può essere applicato quando il database è incompleto, si basa sulla presunzione che quando il database per una sostanza xenobiotica è limitato, si potrebbe definire un NOAEL più basso se fossero effettuati degli studi più completi 4 03/04/2014 Esempi di ADI (o DGA) per dolcificanti Mannitolo (effetto Sostanze cancerogene lassativo) - DGA, 50 mg/kg peso corporeo/die Aspartame - DGA , 40 mg/kg Saccarina - DGA, 2,5 peso corporeo/die mg/kg peso corporeo/die Acesulfame potassico - DGA è di 9 mg/kg peso corporeo/die Fruttosio (levulosio) - DGA non stabilita Non è possibile stabilire un valore sotto il quale non vi sia effetto L’unica condizione sicura è l’assenza dell’esposizione Per stimare il rischio viene utilizzato il grado di potenza cancerogena (cancer slope factor – CSF) che rappresenta la pendenza di una retta dose/probabilità cancerogena più è elevata la pendenza della retta e più è alta la probabilità di sviluppare un tumore assumendo per tutta la vita una determinata sostanza alla dose (unitaria) di 1 mg/kg peso corporeo/giorno In pratica: Tutti i tipi di modelli dose/risposta Benchmark dose - BMD (dose di riferimento) definita come l’esposizione alla quale corrisponde uno specifico incremento della probabilità di un effetto avverso quando messa a confronto con un background 0 si ‘fittano’ i dati sperimentali della curva dose-risposta si estrapola la dose associata ad un effetto in una determinata percentuale di animali (1,5 o 10%) (o ad un effetto pari al 1, 5 o 10% dell’effetto massimo) → BMD si calcola l’intervallo Lower one-sided confidence limit of benchmark dose - BMDL (dose di riferimento) Il più basso livello di confidenza del 95% legato alla BMD di confidenza di questa dose il limite inferiore dell’intervallo di confidenza è il BMDL Lachenmeier D W et al. Int. J. Epidemiol. 2011;40:210-218 5 03/04/2014 Secondo la EFSA il metodo della BMD è applicabile a tutte le sostanze chimiche contenute negli alimenti (pesticidi, additivi, contaminanti, ecc.) indipendentemente dalla categoria o dall’origine Il metodo è particolarmente La valutazione dell’esposizione è il processo di misura o stima della grandezza, frequenza e durata dell’esposizione umana a un agente utile: nei casi in cui la determinazione del NOAEL sia incerta per fornire un punto di riferimento per il margine di esposizione in caso di sostanze che sono sia genotossiche sia cancerogene per una valutazione dose-risposta dei dati epidemiologici osservazionali suggerito per rimpiazzare il NOAEL ISMEA - Istituto di Servizi per il Mercato Agricolo Alimentare Studi di dieta totale (DTS) Insieme delle indagini che si propongono di misurare nel modo più reale possibile l’assunzione di nutrienti e/o di xenobiotici in un dato periodo di tempo in una popolazione stratificata per variabili demografiche e/o variabili socio-economiche Un rapporto FAO/WHO indica 2 procedure: Market-Basket Duplicato della dieta Market-Basket Sulla base dei dati sui consumi alimentari rilevati a livello nazionale, vengono ricavati quali sono gli alimenti che costituiscono la dieta dei principali gruppi di popolazione (bambini, adolescenti, adulti, anziani ecc.) Attraverso “regole di associazione” si ricostruisce la spesa giornaliera 6 03/04/2014 Market-Basket gli alimenti che compongono la spesa giornaliera vengono acquistati nei negozi della piccola, media e grande distribuzione e cucinati secondo le ricette maggiormente in uso i prodotti cucinati vengono inviati al laboratorio di analisi per le determinazioni che si vogliono effettuare Market-Basket Vantaggi Svantaggi non forniscono dati sulle ingestioni individuali (no informazioni sulla frequenza di consumo e sulle grandezze delle porzioni) richiedono una notevole organizzazione ed una forte disponibilità finanziaria noti i consumi, dai valori di concentrazione misurati, si risale al dato di esposizione alimentare che viene confrontato con lo standard di riferimento Duplicato della dieta I soggetti aderenti allo studio devono raccogliere un esatto duplicato (sia in termini di tipologia che di peso) di tutti gli alimenti consumati nell’arco della giornata (colazione, pranzo, cena, inclusi snack e bevande), per un periodo dell’ordine di qualche giorno Ai partecipanti sono fomite bilance casalinghe, vaschette in alluminio e contenitori di plastica per pesare il cibo e bottiglie di plastica per lo stoccaggio in freezer o in frigorifero Gli stessi sono tenuti a compilare un diario su cui annotare tutta una serie di informazioni utili: descrizione dell’alimento ora e luogo di consumo uso di qualsiasi integratore dietetico o di medicinale etc. permettono una sorveglianza continua su grandi popolazioni ed evidenziano eventuali problematiche nutrizionali e/o tossicologiche Duplicato della dieta Al termine della raccolta, i campioni sono trasportati in contenitori termici refrigerati al laboratorio dove sono nuovamente pesati, omogeneizzati e congelati a -20°C fino al momento delle analisi I valori di esposizione dietetica sono calcolati a partire dai valori di concentrazione degli xenobiotici ritrovati nei duplicati della dieta moltiplicati per i pesi dei campioni e successivamente comparati con i valori di riferimento 7 03/04/2014 Gli studi di dieta totale sono condotti con regolarità negli Stati Uniti (FDA: Food and Drug Administration) e in Gran Bretagna (MAFF: Ministry of Agriculture and Fischeries and Food) Schema di studio di dieta totale della FDA In Italia dati frammentari derivati da studi condotti con diverse modalità e poco confrontabili tra loro Categorie alimentari della FDA Gruppi di soggetti 8 03/04/2014 Riassumendo questi studi consentono di conoscere, per i contaminati monitorati , la dose assunta sulla unità di tempo (giorno): ADD (average daily dose) (mg Kg-1 Analiti ricercati dalla FDA CDI (Chronic Daily Intake) dose di esposizione giornaliera di un genotossico mediato su 70 anni di vita (mg Kg-1 giorno -1) Studi ripetuti ogni 3/4 anni Si effettua combinando le informazioni della valutazione doserisposta e della valutazione dell’esposizione Alcune agenzie (EPA) hanno indicato i seguenti principi cardine: trasparenza: dovrebbero essere giorno -1) esplicitate tutte le metodiche utilizzate nelle fasi predenti chiarezza: i risultati delle elaborazioni delle fasi predenti dovrebbero essere facilmente comprensibili ragionevolezza: la valutazione finale dovrebbe basarsi su giudizi solidi Sostanze non cancerogene Si valuta calcolando l’indice di pericolo individuale (HQ: hazard quotient) costituito dal rapporto tra la quantità giornaliera di contaminante assunto (ADD) e la dose quotidiana accettabile o tollerabile (ADI) HQ = ADD/ADI Se HQ>1 significa che la situazione espositiva è considerata preoccupante ed è necessario intraprendere misure di contenimento Se HQ<1 significa che la situazione espositiva NON è considerata preoccupante 9 03/04/2014 Dati Italiani: Sostanze cancerogene Pb – ADI 0,05 mg/kg peso (= 3,5 mg/giorno per un soggetto di 70 Kg) Cd – ADI 0,0083 mg/kg peso (= 0,581 mg/giorno “ “ “ ) Il rischio cancerogeno inteso come incremento di probabilità di contrarre un tumore nel corso della vita per l’esposizione a una sostanza Y, attraverso una specifica via di esposizione, si calcola applicando la seguente formula: R = CDI x CSF Il numero di eventi così determinato rappresenta l’eccesso rispetto al numero di casi di cancro che normalmente colpiscono un’analoga popolazione non esposta (popolazione di controllo) ADD Sostanze cancerogene Con questo calcolo si valuta la probabilità di casi incrementati di tumore in una popolazione causati dall’esposizione per tutta la vita ad un determinato fattore Es. un livello di rischio di 1/100.000, vuol dire che esiste la probabilità che l’esposizione provochi un caso di cancro ogni 100.000 persone esposte È necessario definire un criterio di tollerabilità del rischio: R < 1x 10-6 = rischio insignificante R tra 1 x 10-6 R >1 x 10-4 e 1 x 10-4 esiste una situazione di rischio = rischio inaccettabile In alternativa si può valutare il Margin of Exposure – MOE è il rapporto tra la BMDL10 e il livello di esposizione umana ritenuto dall’EFSA un approccio praticabile e utilizzabile in modo trasparente per la definizione di priorità per la gestione del rischio l’EFSA ha concluso che un MOE di 10.000 o più grande possa essere ragionevolmente associato ad un basso rischio e a bassa priorità per interventi correttivi Il valore 10.000 è il risultato del prodotto tra: variabilità inter- e intraspecifica nella suscettibilità individuale agli effetti mutageni e cancerogeni (attribuito un fattore 100) fattori aggiuntivi di incertezza relativi al processo di cancerogenesi (attribuito un altro fattore 100) 10 03/04/2014 Esempio: L’etilcarbammato è naturalmente presente: negli alimenti fermentati (pane, salsa di soia e yogurt) nelle bevande fermentate (vini, birre, liquori e, in particolar modo, nei distillati di frutta con nocciolo) nei vini l’etilcarbammato si forma spontaneamente per reazione tra l’urea e l’etanolo L’etilcarbammato è genotossico ed è un agente cancerogeno multipotente negli animali e probabilmente cancerogeno nell’uomo Processo, distinto dalla valutazione del rischio Tiene conto dei risultati della valutazione del rischio, e in particolare dei pareri dell’Autorità (l’Autorità europea per la sicurezza alimentare) e del principio di precauzione Consiste nell’esaminare possibilità di intervento consultando le parti interessate, tenendo conto della valutazione del rischio e di altri fattori pertinenti e, se necessario, compiendo adeguate scelte di prevenzione e di controllo Il “prodotto” è una decisione politica (norme e controlli) Stimando i consumi di alimenti contenenti etilcarbammato ed utilizzando come reference point il BMDL10 ottenuto da studi in vivo di cancerogenesi, sono risultati i seguenti valori di MOE: popolazione generale: MOE = 18.000 consumatori di bevande alcoliche: MOE = 5.000 Si conclude che……. Insieme di regole e di normative elaborate dalla Codex Alimentarius Commission La Commissione (suddivisa in numerosi comitati) è stata istituita nel 1963 dalla FAO e dall’OMS (attuali finanziatori) È intergovernativa, costituita dai governi di 181 Paesi più la Comunità Europea e si riunisce una volta all'anno per revisionare ed aggiornare il Codex Alimentarius Procedural Manual La commissione determina gli standard di sicurezza alimentare e le regole per il 97% della popolazione mondiale Scopo proteggere la salute dei consumatori e assicurare la correttezza degli scambi internazionali 11 03/04/2014 Alle riunioni periodiche del comitato del Codex partecipano i rappresentanti di ogni Paese membro Autorità di controllo del cibo Esperti di diverse discipline scientifiche dell’alimentazione Tecnici alimentari COMMISSIONE Rappresentanti di associazioni dei consumatori alimentari Attualmente fissa 3.200 limiti massimi sui residui di pesticidi e farmaci veterinari ed è formato da 200 codici in materia di alimenti e 41 di prassi igieniche o tecnologiche Rappresentanti di associazioni dei produttori dell’industria e del commercio Tutti contribuiscono alla stesura delle regole del Codex, che poi possono servire da base per le normative nazionali Es: i canoni che stabiliscono quanto burro di cacao deve essere presente nel cioccolato perché sia “vero” cioccolato, o quanta buccia può essere tollerata in una scatola di “pomodori pelati interi” Ma anche, l’utilizzo e le quantità non dannose per la salute di sostanze come: conservanti coloranti pesticidi OGM integratori In ogni Stato però, queste norme sono in vigore in maniera parziale il Codex mette a punto gli standard per tutti gli alimenti possibili, siano essi preparati, semipreparati o crudi, e per la distribuzione verso il consumatore e tutto ciò che concerne l'igiene alimentare, gli additivi alimentari, i pesticidi, i fattori di contaminazione, l'etichettatura e la presentazione, i metodi di analisi e di prelievo ogni Nazione recepisce i dettami “producendo” le proprie leggi per quanto riguarda la varietà di additivi e la concentrazione massima permessa negli alimenti sia destinati all'essere umano che agli animali 12 03/04/2014 L'ultima riunione si è tenuta nei giorni 26-30 Marzo 2012 in Olanda, a Maastricht, e ha avuto come oggetto la valutazione/ridefinizione dei massimi livelli di contaminanti industriali, ambientali e alimentari quali: Melamina in formulati liquidi per l´infanzia Piombo, Cadmio, Arsenico Micotossine (Aflatossine nel riso totali in fichi secchi, Aflatossina M1, deossinivalenolo in cereali e prodotti derivati, Patulina, Ocratossina A) Scambio interattivo, di informazioni e pareri riguardanti gli elementi di pericolo e i rischi, i fattori connessi al rischio e la percezione del rischio, tra responsabili della valutazione del rischio, responsabili della gestione del rischio, consumatori, imprese alimentari e del settore dei mangimi, la comunità accademica e altri interessati Comprende la spiegazione delle scoperte relative alla valutazione del rischio e il fondamento delle decisioni in tema di gestione del rischio Occhio alla spesa, 1 febbraio 2011 TG1 28 marzo 2011 13 03/04/2014 Miller et al. BMDL10 in topi compresa tra 9.200 and 32.700 µg/kg bw/day Raffo et al. hanno quantificato l’estragolo contenuto in tisane a base di semi di finocchio considerando 3 porzioni al giorno per gli adulti e 100 ml (1 baby bottle) per i neonati, hanno calcolato una massima esposizione di estragolo pari a: 10 µg/kg bw/day per gli adulti 23 µg/kg bw/day per i neonati RISCHIO PER LA SALUTE MOE per i neonati compreso tra 400 e 1.421 14 03/04/2014 Test di citotossicità Test di genotossicità Test della cometa Test del MN Valutazione dell’apoptosi 15
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