Lezione 4 (6 ottobre 2014)

La crescita microbica
1
Le esigenze nutrizionali dei microrganismi (fonti nutritive)
Le fonti di
carbonio: usate dalla cellula per costruire le proprie molecole organiche
Inorganiche → AUTOTROFI
(CO2; HCO3-; CO32-)
Le fonti di
Per es.
E. coli o
Oenococcus oeni
Organiche → ETEROTROFI
(le più comuni fonti sono
carboidrati come il glucosio)
azoto: usate per costruire aminoacidi (proteine) e basi azotate (nucleotidi e acidi nucleici)
Inorganiche
Organiche
(N2; NH4+; NO3-; NO2-)
(le più comuni sono aminoacidi, peptidi, proteine)
Rispetto all’AZOTO si distinguono:
• batteri AZOTOFISSATORI: da N2 a NH4+ (Azotobacter e Rhizobium)
• batteri NITROSANTI: NH4+ → NO2- (Nitrosomonas, Nitrospira e Nitrosococcus)
• batteri NITRIFICANTI: NO2- → NO3- (Nitrobacter spp., Nitrospina e Nitrococcus)
fosforo: usate per costruire i nucleotidi (ATP, ADP, AMP, acidi nucleici)
Le fonti principali sono di tipo inorganico: PO43-; HPO42-; H2PO4-
Le fonti di
Le fonti di
zolfo: usate per costruire i composti solforati (cisteina, metionina)
Le fonti principali sono di tipo organico
Le vitamine, i fattori di crescita e i sali minerali: variano molto a seconda della specie batterica; non
possono essere sintetizzati dalla cellula e devono essere assunti come tali. Comprendono, ad esempio,
alcune BASI AZOTATE, COMPLESSI VITAMINICI, SOSTANZE AROMATICHE ETEROCICLICHE
2
Le esigenze energetiche dei microrganismi
Energia solare→ FOTOTROFI
Energia chimica → CHEMIOTROFI
CHEMIOLITOTROFI
CHEMIORGANOTROFI
(traggono energia da un
composto inorganico)
(traggono energia da
un composto organico)
I microrganismi sono dunque classificati in 4 differenti TIPI FISIOLOGICI, in
base alle fonti di carbonio ed energia:
Tipo fisiologico
Fonte di C
Fonte di energia
Fotoautotrofo
C inorganico (CO2; HCO3-; CO32-)
Luce solare
Fotoeterotrofo
C organico
Luce solare
Chemioautotrofo
C inorganico
Chemioeterotrofo
C organico
(CO2; HCO3-;
CO32- )
Reazione chimica
Reazione chimica
Sono gli organismi nutrizionalmente più esigenti; necessitano di sostanze
complesse come quelle oganiche e di energia proveniente da reazioni di
ossidoriduzione (per gli ORGANOtrofi degradazione di materiali organici)
I microrganismi di cui maggiormente ci occuperemo (poiché rivestono il
ruolo più importante in ambito alimentare ed enologico) sono CHEMIOORGANOETEROTROFI (Saccharomyces cerevisiae, i batteri lattici, E. coli
e tutti le altre Enterobacteriaceae, Bacillus sp., etc.)
3
Il metabolismo energetico di alcuni batteri
Per definire il metabolismo energetico di una cellula è necessario individuare
In questo contesto, ha lo stesso
un donatore di elettroni e un accettore ultimo di elettroni
significato di «fonte di energia»
Donatore di e(molecola ridotta
che viene ossidata)
Accettore di e(molecola ossidata
che viene ridotta)
Prodotti
finali
-
H2
NO3-
N2
Bacillus sp.*
+
S
NO3-
N2 + SO42-
COT
Pseudomonas sp.
-
sostanza organica
NO3- , NO2-
N2+ (CO2)
CLT
Desulfovibrio sp.
-
H2
SO42-, S2O32-, S
H2S
+
sostanza organica
SO42-
H2S +
acetato
Metano batteri
Archea
(metanogeni)
H2
sostanza organica
CO2
CO2
CH4
CH4 + CO2
Batterio
Gram
Thiobacillus
denitrificans
chemiolitotrofo
CLT
CLT
chemiorganotrofo
COT
CLT
COT
Clostridium sp.
* I Bacillus sono generalmente anaerobi facoltativi (cioè respirano, ma in assenza di ossigeno
operano una respirazione anaerobica); in questa tabella è mostrato un esempio di respirazione
anaerobica operata da alcuni membri del genere Bacillus.
4
Vari gruppi fisiologici di chemiolitoautotrofi
Gruppo fisiologico
Fonte di
energia
Prodotti finali
ossidati
Idrogenobatteri
H2
H2O
Alcaligenes, Pseudomonas
Metanogeni
H2
H2O
Methanobacterium
Carbossidobatteri
CO
CO2
Rhodospirillum, Azotobacter
Batteri nitrosanti
NH3
NO2
Nitrosomonas
Batteri nitrificanti
NO2
NO3
Nitrobacter
Batteri solfossidanti
H2S or S
SO4
Thiobacillus, Sulfolobus
Ferrobatteri
Fe++
Fe+++
Gallionella, Thiobacillus
Organismo
5
Le esigenze chimiche e fisiche ambientali
1 Il pH del mezzo di coltura: è un fattore chimico fondamentale; ha un range e un
optimum variabili a seconda del microrganismo
Microrganismo
Range di pH
pH ottimale
Escherichia coli
4,0 – 9,0
7,2
Acetobacter aceti
4,0 – 8,0
5,8
Thiobacillus thiooxidans
1,0 – 6,0
3,0
Lactobacillus acidophilus
4,0 – 7,0
5,8 – 6,6
In base alla capacità di crescere a uno specifico pH si distinguono:
Acidofili
Neutrofili
Alcalofili
6
2
La temperatura di crescita: ogni microrganismo può crescere solo in uno specifico
range di temperature; in base ad esso si distinguono:
• psicrofili (2-20 °C)
• mesofili (10-40 °C)
• termofili (40-80 °C)
• ipertermofili (65- >90 °C)
In base alla capacità di sopravvivere ad uno specifico range di temperature, si distinguono:
batteri psicrotrofi (capacità di resitere a basse temperature) e termodurici o termoresistenti
(capacità di resitere ad alte temperature ed in particolare alla pastorizzazione {63°C per 30 min})
Cosa succede alle alte temperature:
• si riduce la stabilità dei ribosomi
• si denaturano le proteine
Cosa succede alle basse temperature:
• attività enzimatica ridotta
• si riduce l’attività dell’acqua (Aw)
• le membrane cellulari sono meno fluide
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Temperatura di crescita per alcuni Archea ipertermofili
Genere
Sulfolobus
Desulfurococcus
Methanothermus
Pyrodictium
Methanopyrus
Minimum (°C)
55
60
60
82
85
Optimum (°C)
75-85
85
83
105
100
Maximum (°C)
87
93
88
113
110
8
3 La tensione di ossigeno. In base al ruolo che l’O2 ha nella fisiologia di un
microrganismo, si distinguono:
a) aerobi, b) anaerobi, c) anaerobi facoltativi, d) aerotolleranti e) microaerofili
E. coli
Helicobacter pylori
Streptococcus thermophilus
Bifidobacterium animalis
Gluconobacter oxydans
9
L’O2 è indispensabile agli aerobi quale ultimo accettore di elettroni nella respirazione
tuttavia
negli ambienti aerobi sono presenti le SPECIE TOSSICHE DELL’O2
Anione superossido
Perossido d’idrogeno
(acqua ossigenata)
Radicale idrossile
si forma per effetto delle
radiazioni ionizzanti e la cellula
non ha difese specifiche per esso
Gli enzimi che permettono di difendersi dalle specie tossiche dell’O2
OO22
-
SUPEROSSIDO
superossidodismutasi
O2- + O2- + 2H+
DISMUTASI
H2O2 + O2
catalasi
CATALASI
H2O2 + H2O2
2H2O + O2
PEROSSIDASI
H2O2 + NADH + H+ → 2H2O + NAD+
10
Presenza di superossido-dismutasi,catalasi e
perossidasi in diversi gruppi di procarioti
Superossidodismutasi
Catalasi
Perossidasi
Aerobi obbligati e
Anaerobi facoltativi
+
+
-
Aerotolleranti
+
-
+
Anaerobi obbligati
-
-
-
11
4 La pressione osmotica
La presenza di sali o zuccheri in acqua determina l’aumento della pressione
osmotica con conseguente perdita di acqua da parte della cellula batterica
(disidratazione o avvizzimento cellulare)
I batteri capaci di resistere ad
alte concentrazioni di sale sono
definiti
ALOTOLLERANTI,
ALOFILI o ALOFILI ESTREMI:
I batteri capaci di resistere ad alte concentrazioni di zuccheri sono invece
definiti OSMOFILI
12
OSMOSI
Diffusione di acqua attraverso una membrana a permeabilità selettiva
o una qualsiasi
altra cellula
priva di parete
13
Alla pressione osmotica è strettamente connessa la disponibilità
dell’acqua (attività dell’acqua, aw)
L’attività dell’acqua (Aw) rappresenta il rapporto tra la pressione di vapore del
substrato considerato (per es. un alimento) e la pressione di vapore dell’acqua pura
nelle stesse condizioni: aw = Palimento/Pacqua (è una misura dell'acqua
disponibile per la crescita di un microrganismo)
Il valore dell’Aw va da 0 a 1 (1 = acqua pura)
L’Aw è utilizzata per prevedere la crescita dei microrganismi negli alimenti
Microrganismo
Minima aw necessaria per la crescita
Caulobacter (G -)
1.00
Spirillum (G -)
1.00
Pseudomonas (G -)
0.91
Salmonella/E. coli (G -)
0.91
Lactobacillus (G +)
0.90
Bacillus (G +)
0.90
Staphylococcus (G +)
0.85
Halococcus (Archea)
0.75
Il valore di aw si può abbassare privando il substrato (ad es. un
alimento) di acqua o aggiungendo sostanze come il sale o lo zucchero
14
La riproduzione della cellula batterica
I batteri si riproducono per SCISSIONE BINARIA (processo cellulare di MITOSI). In questo
processo si verifica:
- la duplicazione del cromosoma batterico
- l’allungamento della cellula
- la formazione di un setto trasverso in posizione centrale
- la suddivisione di una copia del cromosoma e del citoplasma nelle due cellule figlie
Formazione
del setto
divisorio
La SCISSIONE BINARIA è un processo di riproduzione
asessuata. I batteri non si riproducono sessualmente (sebbene
sia possibile un processo di scambio di informazioni genetiche
tra due cellule batteriche noto come CONIUGAZIONE
BATTERICA, che rappresenta una forma di sessualità, come
vedremo in una prossima lezione)
In seguito a scissione binaria
si verifica un aumento del
numero degli individui con
costituzione di una COLTURA
BATTERICA o
POPOLAZIONE
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Studiare la CRESCITA BATTERICA
significa analizzare come il numero
degli individui in una popolazione
varia rispetto al tempo
16
La curva di crescita batterica
numero di batteri vivi
In coltura in batch (cioè in un sistema chiuso) → esaurimento nutrienti
accumulo prodotti di rifiuto
1 – Fase di LATENZA (lag): fase di
adattamento dei microrganismi al mezzo di
coltura (sintesi di proteine, ATP, enzimi); la
velocità di crescita è considerata pari a zero
Tempo (ore)
2 – Fase ESPONENZIALE (log): fase in cui i
batteri si riproducono alla velocità massima. Il
numero di batteri raddoppia ad intervalli
regolari di tempo (= velocità costante)
3 – Fase STAZIONARIA: la mancanza di nutrienti e l’accumulo di metaboliti tossici rallentano
la crescita fino ad azzerarla (v = 0). Numero di microrganismi costante
4 – Fase di MORTE: il numero di cellule vitali decresce in modo esponenziale (il numero di
microrganismi dimezza ad intervalli costanti di tempo)
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Fattori che influenzano la presenza e
la durata della fase di latenza
Fase di latenza: non sempre è presente e la sua presenza è influenzata da:
1. stato fisiologico delle cellule
2. tipo di terreno colturale
3. modalità di inoculo
Inoculi abbondanti
riducono la fase di latenza
e inoculi diluiti la allungano
Talvolta si possono osservare fasi di latenza multiple, alternate a fasi di crescita, se il mezzo
contiene fonti di carbonio diversificate. Tale fenomeno, detto DIAUXIA, è dovuto al fatto che,
esaurita una delle fonti, la cellula deve risistemare il proprio corredo di enzimi per metabolizzare il
nuovo substrato (questi enzimi sono dunque definiti ENZIMI INDUCIBILI)
numero di batteri
consumo del secondo zucchero
(per esempio LATTOSIO o XILOSIO)
seconda fase di latenza
esaurimento del primo zucchero
(tipicamente GLUCOSIO)
tempo (ore)
18
Fattori che influenzano
la fase esponenziale
Diversi fattori possono influenzare la velocità di crescita di una coltura batterica e il suo
TEMPO DI GENERAZIONE (tempo che intercorre tra due generazioni successive)
1. FATTORI GENETICI
BATTERIO
T ottimale
TEMPO MEDIO DI GENERAZIONE (h)
2. FATTORI AMBIENTALI
- sostanze nutritive
- temperatura
- pH
- forza ionica (pressione osmotica)
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Aspetti quantitativi della crescita in fase esponenziale
La crescita batterica segue una progressione geometrica in base 2:
1 → 2 → 22 → 23 → 24 → → → 2n
Nt = N0 × 2 n
log Nt = log N0 + n log 2
- N0 = numero di batteri inoculati
- Nt = numero di batteri al tempo t
- n = numero di generazioni
n = (log Nt – log N0) / log 2
n = 3,3 log (Nt / N0)
Tempo medio di generazione (o di duplicazione)
Tgen = t / n = t / [3,3 log (Nt / N0)]
- t = intervallo di tempo
Costante media del tasso di crescita
k = n / t = 1 / Tgen
20
Il ciclo cellulare di Saccharomyces cerevisiae
Fase
stazionaria
0
G1
S
S
M
G1
ac
G1 = fase pre-sintetica
M
S = fase di sintesi del DNA
M = fase mitotica
G1
Si forma il fuso mitotico
L’inizio della replicazione è ritardato nella cellula figlia
poiché è necessario un tempo per l’accrescimento della
cellula (ac); per questo, a S. cerevisiae non possono
essere applicate le formule prima descritte per i batteri
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
21
I cromosomi in diversi organismi
I procarioti possiedono nella maggior parte dei casi (ma non in tutti) un unico cromosoma
circolare, mentre gli eucarioti presentano un numero molto vario di cromosomi lineari
Organismo
Numero di
Numero
coppie
Tipo
di cromosomi
di cromosomi
Dimensione
(Mbp = milioni
di paia di basi)
Mycoplasma genitalium
1
1
circolare
0,58
Escherichia coli
1
1
circolare
4,6
Agrobacterium tumefaciens
4
1
3 circolari
1 lineare
5,67
Sinorhizobium meliloti (batterio
azotofissatore Gram negativo)
3
1
circolare
6,7
Saccharomyces cerevisiae
16
1o2
lineare
12,1
Schizosaccharomyces pombe
3
1o2
lineare
12,5
Caenorhabditis elegans
6
2
lineare
97
Drosophila melanogaster
4
2
lineare
180
Fugu rubripes (pesce palla)
Mus musculus (topo)
Homo sapiens
22
19+X+Y
22+(X o Y)
2
2
2
lineare
lineare
lineare
365
2500
2900
22

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