20/03/2014 Neospora caninum è un parassita intracellulare obbligato a prevalente Neospora caninum è un protozoo che fino al 1988 è stato identificato erroneamente come Toxoplasma gondii. localizzazione intracitoplasmatica, correlato morfologicamente e antigenicamente con Toxoplasma gondii TASSONOMIA Regno: Protista Phylum: Apicomplexa Classe: Sporozoa Sottoclasse: Coccidia Ordine: Eucoccidiorida Sottordine: Eimeriorina Famiglia: Sarcocystiidae Genere: Neospora Specie: Caninum La prima descrizione di Neospora caninum risale al 1984, in Norvegia, dove Bjerkås et al. (1991) isolarono un parassita strutturalmente assimilabile a Toxoplasma gondii, dal cervello e dal tessuto muscolare di cani affetti da una forma clinica di encefalopatia, senza però che gli animali avessero anticorpi controT.gondii. Nel 1988, in USA, si isolò un parassita di caratteristiche simili in 10 cani che soffrivano di alterazioni neurologiche, dimostrando, con l'utilizzo di tecniche sierologiche e immunoistochimiche, che si trattava di un parassita differente da Toxoplasma gondii, e per questo venne dato il nome di Neospora caninum (Dubey et al., 1988). N.caninum ha un ampio range di ospiti. Sebbene gli anticorpi anti-Neospora caninum sono stati determinati nell’uomo, il parassita non è stato rilevato nei tessuti umani. Così, il potenziale zoonosico è incerto. Attraverso studi biologici e molecolari è stata confermata l’esistenza di un’ulteriore specie di Neospora, isolata esclusivamente negli equini, agente eziologico di turbe a carattere neurologico (mieloencefalite equina; EPM). Marsh et al. (1999) proposero il nome di Neospora hughesi, parassita molto simile strutturalmente a N. caninum. E’ molto simile nella struttura e nel ciclo biologico a T.gondii, ma presenta due differenze: la neosporosi è primariamente una malattia dei bovini e dei cani e i canidi sono ospiti definitivi, mentre la toxoplasmosi è primariamente una malattia dell’uomo, delle pecore, delle capre. I felidi sono gli ospiti definitivi Gli Apicomplexa costituiscono un Phylum di protozoi che include alcune migliaia di specie, caratterizzate dall’assenza di organi di movimento (ciglia o flagelli). Il ciclo di riproduzione di questi parassiti è costituito dall’alternanza di una fase asessuata (schizogonia) e una fase sessuata (gametogonia) che porta alla formazione di forme infettanti dette sporozoiti. Sono aploidi durante tutto il ciclo vitale, salvo che nella fase di zigote, che comunque è di brevissima durata. Rappresentazione schematica di tachizoiti di N. caninum all’interno di una cellula ospite 1 20/03/2014 N. caninum si presenta in vari stadi evolutivi: I tachizoiti di N. caninum sono stati rinvenuti in molte cellule tra le quali: 1. stadio di tachizoita; 2. stadio di bradizoita; neuroni, macrofagi, miociti, epatociti, fibroblasti, fibrocellule muscolari, nelle cellule degli endoteli vasali e nell’epitelio tubulare renale (Dubey e Lindsay, 1999); inoltre hanno la capacità di attraversare la barriera placentare ed essere così un’importante causa di infezione del prodotto del concepimento. 3. stadio di oocista. Vacuoli parassitofori (freccia) con tachizoiti di Tutti e tre gli stadi di sviluppo di N.caninum (tachizoiti, bradizoiti e oocisti) sono coinvolti nella trasmissione del parassita • STADIO DI TACHIZOITA I tachizoiti sono di forma allungata o a semiluna, di dimensioni variabili dai 3 ai 7 μm per 1-5 μm In questo stadio evolutivo di tipo asessuato il parassita è nettamente infettante, si moltiplica rapidamente e quindi invade molti distretti e tessuti dell’organismo dell’ospite intermedio. N.caninum. Il parassita può essere libero nel citoplasma o all’interno di vacuoli parassitofori che possono essere anche più di uno in una cellula STADIO DI BRADIZOITA Una cellula può contenere anche fino a 100 tachizoiti e la penetrazione del tachizoita nella cellula avviene in tempi molto ristretti Nel processo di invasione della cellula ospite, svolge un ruolo fondamentale il complesso apicale, un insieme di strutture citoscheletriche e vescicolari presente in tutti gli stadi invasivi degli Apicomplexa. Cisti tissutali contenenti bradizoiti Sono la forma latente del parassita e ne permette la notevole e durevole resistenza nell’ospite intermedio. Si localizzano all’interno di cisti tissutali, le quali si rinvengono soprattutto a livello di sistema nervoso centrale (cervello, midollo spinale, nervi periferici) e di retina Le cisti tissutali di N. caninum possono raggiungere un diametro di 107 μm e possono essere di forma ovale o rotonda e contenere dai 20 ai 100 bradizoiti; I bradizoiti si formano a partire dai tachizoiti stessi i quali, nel momento in cui si attiva la risposta immunitaria dell’ospite, reagiscono incistandosi. In questo modo il parassita riesce a sottrarsi all’azione del sistema immunitario e può quindi resistere anche degli anni all’interno dell’organismo STADIO DI OOCISTA I bradizoiti hanno dimensioni variabili: 5,2 (±0,6) x 1,6 (±0,3) μm 2 20/03/2014 oocisti sporulate, forma infettante, possono essere ingerite dall’ospite definitivo od intermedio OOCISTI -eliminate nelle feci da ospiti definitivi -devono sporulare nell’ambiente -infezione orale ospite definitivo/intermedio Le oocisti, che rappresentano lo stadio di resistenza ambientale, sono escrete nelle feci dei cani e dei coyote in forma non sporulata. Le oocisti maturano all’esterno in poche ore, 24, non è nota qual è la capacità di resistenza delle oocisti nell’ambiente esterno Si suppone che la resistenza ambientale sia simile a quella di Toxoplasma gondii Ogni oocisti contiene due sporocisti, che a loro volta contengono quattro sporozoiti. Le oocisti hanno forma ovoidale o sferica, sono costituite da una doppia parete e le dimensioni variano da 11,3 a 11,7 μm Oocisti di Neospora caninum sono state identificate solo in pochi cani nel mondo. Le oocisti sono la chiave dell’epidemiologia della neosporosi, ma poco si conosce sulla biologia delle oocisti di N.caninum. N. caninum è simile a Hammondia heydorni. E’ epidemiologicamente importante identificare correttamente le oocisti di N.caninum. Poche sono le informazioni inerenti sull’eliminazione di oocisti da cani infettati naturalmente I cani eliminano le oocisti per 5 giorni o più dopo l’ingestione di tessuti infetti in animali infettati sperimentalmente o naturalmente. La durata dell’eliminazione delle oocisti dopo la primaria infezione varia da 1 a diversi giorni. Il totale del numero delle oocisti eliminate, il periodo di prepatenza e la durata dell’eliminazione delle oocisti varia tremendamente. Vie di trasmissione N.caninum può essere trasmesso per via orizzontale per ingestione di tessuti infetti con i tachizoiti o da cisti o dall’ingestione di acqua o alimenti contaminati con le oocisti o può essere trasmesso per via verticale da un animale infetto al suo feto durante la gravidanza Trasmissione verticale esogena: infezione del feto in seguito all’infezione primaria della madre Trasmissione verticale endogena: infezione del feto in seguito alla riattivazione dell’infezione durante la gravidanza Le cisti tissutali e i bradizoiti possono sopravvivere più di 2 settimane a 4°C ma sono uccise dal congelamento 3 20/03/2014 L’ospite definitivo, può inoltre infettarsi attraverso l’ingestione di tessuti contenenti cisti parassitarie di N. caninum . Quando le oocisti sporulate sono ingerite dall’ospite intermedio (bovino, cavallo, ovi-caprini...), i trofozoiti, dopo essersi liberati della parete cistica, vengono rilasciati nel lume intestinale e divengono tachizoiti. A seguito della risposta immunitaria dell’animale, i tachizoiti si “rifugiano” all’interno di una cisti, trasformandosi in bradizoiti Le cisti tissutali sono circondate da una parete cistica molto spessa e resistente, e sono reperibili principalmente nei tessuti neuronali (cervello, midollo spinale). I tessuti cistici inducono una reazione infiammatoria minima e possono persistere per lunghi periodi di tempo senza manifestazioni cliniche. I tachizoiti si dividono rapidamente e diffondono in tutto l’organismo, di numerosi organi (fegato, reni, cuore, polmoni, muscoli, derma e SNC) nelle quali avviene la moltiplicazione asessuata (scissione binaria): lo stadio di tachizoite è associato ad infiammazione e necrosi nel sito d’invasione. OSPITE INTERMEDIO Si presume che, in corso di una gravidanza, i bradizoiti latenti in queste cisti vengano attivati, e si differenzino nello stadio di tachizoite, infettivo e mobile, che raggiunge, attraverso i tessuti, il sangue e/o sistema linfatico, la placenta e il feto ed essere così causa di aborto L’ospite intermedio, comprende il bovino, la capra, la pecora, il suino, il cavallo, il cervo, la volpe, i roditori (topi, ratti...) e volatili da cortile. In questi animali ha luogo il ciclo asessuato del parassita, che comprende lo stadio di tachizoita e lo stadio di bradizoita (endodiogenesi) Come risultato di questa "riattivazione" dei parassiti, ripetute infezioni fetali possono verificarsi nella stessa madre infetta, nelle gravidanze successive Tra gli ospiti intermedi, sono da aggiungere la lontra di mare che vive in Alaska ( Enhydra lutris) e il delfino (Tursiops truncatas), nei quali sono stati messi in evidenza anticorpi antiNeospora. Inoltre il DNA del protozoo è stato isolato nel lama (Lama glama) e nell’alpaca (Vicugna pacos) da un’equipe ispano-cilena. La sieroprevalenza in questi due camelidi è importante, varia dal 30 al 40% In un recente studio epidemiologico, anche l’esposizione a volpi rosse ( Vulpes vulpes) e volpi grigie (Urocyon cinereoargenteus) è stata identificata come un fattore di rischio per l’infezione da N. caninum per i bovini al pascolo, ma non è ancora chiaro come, essendo canidi, riescano ad eliminare nell’ambiente esterno le oocisti: per questo motivo sono da considerare ancora come ospiti intermedi 4 20/03/2014 Negli ultimi anni è stata riscontrata una significativa sieroprevalenza da N. caninum anche nel lupo grigio ( Canis lupus), nell’orso bruno (Ursus arctos) e nel tasso (Meles meles) oltre che in diversi ruminanti selvatici come il cervo a coda bianca ( Odocoileus virginianus), il cervo rosso (Cervus elaphus), il capriolo ( Capreolus capreolus) e l’alce (Alces alces Probabilmente l’infezione da N. caninum nell’uomo è potenzialmente possibile, soprattutto in quei pazienti più sensibili perché ad esempio immunodepressi. Quello che si deve continuare a fare, è ricercare sicuramente un più valido ed attendibile test per la diagnosi indiretta di N. caninum nell’uomo. Tra questi certamente si annovera la PCR e l’immunoistochimica, effettuate su biopsie od eventualmente su tessuti prelevati in corso di autopsie di feti abortiti. Non è ancora del tutto esclusa la possibilità di trasmissione di N. caninum all’uomo. OSPITE DEFINITIVO Nell’ospite definitivo si ha il completamento del ciclo vitale di Neospora caninum, attraverso le fasi della riproduzione sessuata, che porta alla produzione di oocisti non sporulate, che solo nell’ambiente esterno, in adatte condizioni di temperatura ed umidità, sporulano e divengono così infettanti. Ancora prima della completa conoscenza del ciclo vitale di Neospora, ci si è resi conto che la presenza di cani in allevamento aumentava il rischio di aborto nelle bovine Patogenesi e sintomatologia Il cane ( Canis familiaris), il dingo ( Canis dingos) ed il coyote ( Canis latrans) eliminano le oocisti nelle feci dopo essersi alimentati con tessuti di bovini o topi infetti da N. caninum; essi sono da considerare quindi come ospiti definitivi di N. caninum Sino ad ora sono stati riportati tre casi di cani che eliminano naturalmente oocisti di N. caninum. Il danno è causato dalla distruzione delle cellule in cui si sviluppano i vari stadi del parassita. La localizzazione dei bradizoiti a livello delle cellule nervose porta a paralisi, debolezza muscolare e incoordinazione. Quadri nervosi sono comuni nel cane, per cui in caso di manifestazione neurologica si deve sempre considerare N.caninum nella diagnosi differenziale. 5 20/03/2014 Nel bovino e nei piccoli ruminanti il sintomo principale è rappresentato dall’aborto. Nel bovino l’aborto interessa soggetti di tutte le età e occorre a partire dal 3 mese fino a fine gravidanza. I feti morti in utero possono venire riassorbiti o subire un processo di mummificazione Nei cani le forme più gravi si manifestano nei cuccioli, i quali presentano sintomi nervosi Nei soggetti adulti l’infezione passa generalmente inosservata, ma si possono comunque rilevare forme cutanee o segni clinici relativi alla sfera riproduttiva, come la natimortalità In alcuni casi i soggetti nati possono presentare natimortalità o segni clinici nervosi fin dalla nascita, oppure ancora apparire clinicamente sani, ma essere infetti. L’occorrenza degli aborti non presenta una particolare stagionalità. Tutte le razze (Labrador..) TECNICHE DIAGNOSTICHE DIAGNOSI DIRETTA ETA’: fondamentalmente è una malattia neurologica del cucciolo, la maggior parte dei casi si verificano tra quarta e decima settimana di vita 2gg-15 anni (>70%<di 6 anni) Questo suggerisce che l’infezione è trasmessa nella fase finale della gestazione o con il latte La diagnosi diretta di infezione da N. caninum si effettua attraverso metodiche diverse che comprendono l’esame istologico ed immunoistochimico, la cultura cellulare e l’inoculo in animali da laboratorio e l’applicazione di metodiche molecolari, quale la PCR Nessuna predisposizione sesso Uno o più cuccioli della stessa cucciolata Possibilità di infezione nelle cucciolate successive DIAGNOSI INDIRETTA TEST SIEROLOGICI Per la diagnosi indiretta della Neosporosi, il sangue o altri liquidi corporei (liquor, versamenti cavitari, latte) degli animali infetti vengono esaminati per ricercarvi anticorpi specifici verso N. caninum. I principali test utilizzati sono: IFAT: indirect-fluorescent antibody test; ELISA: enzyme-linked immunoassay; Avidity test; Immunocromatografia (ICT). 6 20/03/2014 Principali criteri di diagnosi differenziale di Neospora caninum N.caninum T.gondii Sarcocystis spp. Struttura generale Aspetto identico al microscopio ottico Aspetto identico al microscopio ottico Aspetto identico al microscopio ottico Struttura cisti Spessore parete 1-4 micron Cisti senza setti Parete più sottile 0,5 micron Parete spessa Cisti con setti Localizzazione cisti Tessuto nervoso (encefalo, midollo spinale,retina) Numerosi tessuti Muscolo scheletrico e cardiaco, SNC raramente Ulastruttura tachizoiti Rhoptrie numerose Rhoptrie poco numerose Assenza di rhoptrie replicazione endodiogenia endodiogenia endodiogenia PROFILASSI Inf.acquisita Occorre, dunque, in definitiva orientarsi a interventi di profilassi diretta quali: a) impedire ogni possibile contatto tra animali esterni o interni all’allevamento e feti abortiti, invogli fetali o neonati morti; b) smaltimento controllato di feti abortiti e invogli fetali; c) divieto di accesso dei cani stessi e a tutti gli altri animali estranei (volpi, lupi, volatili, roditori...) alle aree adibite al deposito degli alimenti, per evitarne la contaminazione; PROFILASSI Inf. Congenita: sierosorveglianza delle femmine destinate alla riproduzione; Inf.acquisita: definire meglio ciclo vitale del parassita (seguire stesso percorso per T.gondii??) Inf.congenita Il principale modo di trasmissione di N. caninum nell’allevamento è attraverso l'infezione dei feti in madri cronicamente infette (trasmissione verticale). Questi animali cronicamente infetti possono essere identificati sulla base dei loro titoli sierologici o per una storia precedente di aborto da N. caninum o d’infezione congenita (Moen, Wouda, Mul et al., 1998). Sulla base di queste conoscenze, il controllo dell'infezione potrebbe concentrarsi sulla riduzione del numero di animali infetti nell’allevamento e sulla limitazione dell’introduzione di animali da rimonta infette nell’allevamento. La decisione di riformare anticipatamente animali che hanno avuto una diagnosi certa di aborto da N. caninum può essere presa sulla base del dato che c'è un rischio più elevato di aborto ripetuto in questi animali PROFILASSI cane NeoGuard, un vaccino di Neospora caninum approvato dalla USA prodotto da Intevet Inc., si è stato dimostrato in grado di ridurre gli aborti in manze gravide sane, infettate con N.caninum Non esiste nessuna misura che possa assicurare in assoluto la profilassi della neosporosi nel cane. Nel caso che una cagna abbia partorito cuccioli infetti, può essere consigliabile escludere l’animale dalla riproduzione o, più semplicemente identificare i cuccioli infetti delle cucciolate successive qualche giorno dopo il parto. Oppure trattare la cagna prima dell’accoppiamento e durante la Tuttavia, sono scarsi i dati sulla vera efficacia di questo vaccino. gestazione. 7 20/03/2014 PROFILASSI Inf. Congenita: sierosorveglianza delle femmine destinate alla riproduzione; Inf.acquisita: definire meglio ciclo vitale del parassita (seguire stesso percorso per T.gondii??) 8
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