Gamberetti e chitosano

Impiego di chitosano per la salvaguardia della freschezza di gamberetti freschi
Anna Reale1, Nicolaia Iaffaldano3, Maria Pina Rosato3, Patrizio Tremonte1,
Mariantonietta Succi1, Connie Goglia1, Valeria Capilongo1, Massimo Iorizzo1, Raffaele
Coppola12, Elena Sorrentino12
1
Dipartimento STAAM, Università del Molise, Via De Sanctis, 86100 Campobasso
2
COVADIRAM, c/da Colle Piano, 82030 Torrecuso (BN)
3
Dipartimento SAVA, Università del Molise, Via De Sanctis, 86100 Campobasso
Introduzione
La necessità di garantire qualità e salubrità degli alimenti, rispondendo alle richieste del
consumatore di abolire o quantomeno ridurre gli additivi alimentari chimici e di
impiegare tecniche di processo poco invasive, ha spinto l’industria e la ricerca verso lo
studio di tecniche di conservazione alternative.
Tra i differenti approcci investigati è emerso un forte interesse allo studio e alla ricerca
di composti antimicrobici naturali tra i quali il chitosano, sostanza particolarmente
abbondante in natura in quanto è la componente principale dell’esoscheletro di
crostacei e molluschi.
Il chitosano è stato impiegato recentemente in ambito alimentare (Ji et al., 2003; Dong
et al., 2004; Kim et al., 2004; Caner, 2005; No et al., 2005; Hernández-Muñoz et al.,
2006; Choi et al., 2006; No et al., 2007), farmaceutico, cosmetico, tessile e ambientale
(Gagnè, 1993; No & Meyers, 1989; Holland & Shahbaz, 1985; Bautista-Baños, 2006).
In considerazione delle documentate funzioni antimicrobiche del chitosano (Sudarshan
et al., 1992; No et al., 2002), è stata ipotizzata una sua applicazione nella conservazione
di prodotti freschi altamente deperibili, in particolare dei prodotti ittici, il cui consumo
ha fatto registrare, nell’ultimo decennio, un considerevole aumento.
In tale contesto si inserisce questo studio, svolto nell’ambito del progetto
“Valorizzazione di prodotti da acquacoltura in Campania” finanziato dalla Regione
Campania, che ha inteso valutare la possibilità di prolungare la shelf-life di gamberetti
freschi mediante l’uso di chitosano.
Avendo individuato in uno studio precedente, svolto sempre nell’ambito di questo
progetto, la forma e la concentrazione di chitosano più attive nei confronti di
microrganismi alteranti, sono stati realizzati esperimenti volti a studiare l’effetto in vivo
del chitosano a differenti concentrazioni sulle caratteristiche microbiologiche e
qualitative di gamberetti freschi durante la frigoconservazione.
Materiali e metodi
Chitosano e gamberetti
Il chitosano utilizzato nella prova di conservazione di gamberetti è stato acquistato
dalla Sigma-ALDRICH LOGISTIK GmbH. Il chitosano aveva le caratteristiche
riportate in Tab. 1.
Tab.1 – Proprietà chimiche e fisiche del chitosano
Low Molecular Weight
Peso Molecolare
Grado di deacetilazione
Viscosità
Solubilità a pH<6.5
50 KDa
75-85%
200-800 cp
1% in 1% di HAc
25
I gamberetti oggetto dello studio sono stati reperiti presso un mercato ittico di
Campobasso e trasportati in ghiaccio in laboratorio. I gamberetti, pescati da non più di
24 h, si presentavano freschi e con ottime caratteristiche qualitative.
In laboratorio i gamberetti sono stati sgusciati, immersi per circa 5 minuti in una
soluzione di Sodium Acetate buffer (0,1 N) contente chitosano all’1%, sgocciolati,
confezionati in vaschette munite di coperchio e refrigerati a 4°C.
Sono stati, inoltre, realizzati 2 campioni di controllo: uno (controllo A) contenente
gamberetti tal quali, l’altro (controllo B) contenente gamberetti trattati in una soluzione
di solo Sodium Acetate buffer (0,1N). Sui campioni sono state realizzate analisi
chimico-fisiche, microbiologiche e sensoriali a tempo zero e dopo 7, 12 e 15 giorni di
conservazione.
pH Il pH è stato determinato, alle differenti epoche di campionamento, sulla prima
diluizione decimale del campione con un pH-metro con elettrodo a vetro (Crison pHMeter Basic 20) inserito dell’omogeneizzato di 10 grammi di gamberetto + 90 mL di
H2O fiosiologica sterile.
Aw L’attività dell’acqua è stata determinata su ogni campione mediante Water Activity
Meter AQUALAB modello CR-2 (USA), seguendo le indicazioni fornite dalla casa
costruttrice. Il valore di aw è stato ottenuto dalla media di due determinazioni.
Colore Al fine di ottenere una valutazione oggettiva delle variazioni del colore dei
campioni durante la conservazione è stato utilizzato un colorimetro Minolta CR300b”
(Japan). Il colore è infatti un importante indice per valutare la shelf-life dei gamberetti.
Il colore è stato determinato sulla superficie del gamberetto sgusciato.
Analisi microbiologiche. I conteggi microbici sono stati eseguiti prelevando
asetticamente 10 grammi di gamberetto, che sono stati omogeneizzati in Stomacher 400
Lab-blender con 90 mL di fisiologica sterile. L’omogeneizzato è stato utilizzato per la
realizzazione di successive diluizioni decimali con le quali sono state inoculate le
piastre per i conteggi microbici. Ogni gruppo microbico è stato contato su un opportuno
substrato di crescita rispettando le appropriate condizioni di incubazione.
La carica microbica totale è stata determinata su PCA dopo incubazione a 28°C per 48
h.
I psicrotrofi sono stati determinati su PCA dopo incubazione a 7°C per 10 giorni.
La presenza di Pseudomonas è stata determinata su CFC Agar (OXOID) + supplemento
(Oxoid R0103F) dopo incubazione a 28°C per 2-3 giorni.
La presenza di Brochothrix thermosphacta è stata determinata su STAA (Oxoid
CM881) + supplemento (Oxoid SR0151E) dopo incubazione a 25°C per 2-3 giorni.
Il conteggio di Coliformi totali e fecali è stato effettuato su VRBLA (Oxoid) incubando
rispettivamente a 37 e 44°C per 2 giorni.
Le Enterobacteriaceae sono state contate su VRBGA (Oxoid) incubando a 37°C per 2
giorni.
Il conteggio degli Enterococchi è stato effettuato sul terreno nutritivo “Slanetz &
Bartley Medium” (SB) dopo incubazione a 37°C per 48 h.
I produttori di H2S sono stati contati su IRON Agar dopo incubazione a 25°C per 3
giorni.
26
Prodotti di ossidazione. Il livello di ossidazione lipidica è stato quantificato
determinando il livello di malondialdeide (MDA), un prodotto secondario
dell’ossidazione lipidica, tramite il test dei TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive
Substances). La metodica utilizzata è stata quella escritta da Lemon (1975), con le
modifiche apportate da Richards e Hultin (2001).
La produzione di MDA è stata espressa come µgMDA/g di gamberetto.
Analisi sensoriale. Per la valutazione sensoriale è stato allestito un panel test.
Ai panelisti, 5 comuni consumatori, è stata proposta una griglia di valutazione nella
quale i parametri considerati erano odore, colore, consistenza e aspetto generale. Ad
ogni parametro sensoriale poteva essere attribuito un valore compreso tra 1 e 5,
corrispondenti a cinque differenti descrizioni del grado di qualità: 5 = eccellente, 4 =
buono, 3 = accettabile, 2 = mediocre, 1 = inaccettabile ( Lee et al., 2002).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Analisi microbiologiche
In seguito sono riportati i risultati delle analisi microbiologiche realizzate durante la
frigoconservazione dei gamberetti.
In Fig. 1 è riportato l’andamento delle cariche di Pseudomonas spp. La contaminazione
iniziale dei campioni di gamberetti era pari a 2,8 log UFC/g. Dopo 7 giorni di
conservazione è stata registrata una drastica riduzione delle cariche di Pseudomonas
spp. nei campioni trattati con soluzione di chitosano all’1%. Tale risultato ha
confermato quanto osservato nelle prove in vitro realizzate nei confronti di due ceppi di
Pseudomonas spp. I due campioni di controllo, CA e CB, facevano, invece, registrare
dopo 7 giorni un aumento dello sviluppo microbico di Pseudomonas spp. che
raggiungeva rispettivamente per i due campioni cariche pari a 4, 0 log UFC/g e 5,2 log
UFC/g.
Pseudomonas spp.
log UFC/g
10,0
8,0
6,0
CA
4,0
CB
2,0
1%
0,0
Tempo
zero
7
12
15
tempo (gg)
Fig. 1 - Variazione delle cariche di Pseudomonas spp.
Nella Fig. 2 è riportata la variazione dello sviluppo di Brochothrix thermosphacta.
Anche in questo caso è stato possibile registrare degli ottimi risultati, infatti è evidente
dal grafico che i campioni trattati con l’1% di chitosano permettevano di contenere
fortemente lo sviluppo di tale specie microbica. Dopo sette giorni di conservazione
27
infatti è stata registrata una differenza di carica tra i campioni di controllo e quello
trattato con la soluzione di chitosano all’1% pari a circa 3,4 log UFC/g. L’azione del
chitosano risultava efficace anche dopo 12 e 15 giorni di conservazione. A fine
conservazione, infatti, i campioni di controllo risultavano fortemente contaminati
presentando una carica pari a circa 7,0 log UFC/g, mentre il campione trattato
presentava una carica pari a 4 log UFC/g.
log UFC/g
Brochothrix thermosphacta
10,0
8,0
CA
6,0
4,0
1%
CB
2,0
0,0
Tempo
zero
7
12
tempo (gg)
15
Fig. 2 – Variazione delle cariche di Brochothrix thermosphacta.
Nella Fig. 3 sono riportate le variazioni delle cariche di mesofili totali. E’ stato
possibile registrare un contenimento dello sviluppo dei mesofili totali nei campioni
trattati con chitosano. In particolare i mesofili totali a tempo zero erano pari a 4,3 log
UFC/g. Dopo 7 e 12 giorni si registrava una differenza di carica tra i campioni trattati
ed i campioni di controllo pari a circa 2 log UFC/g. A fine conservazione, tuttavia, le
cariche microbiche dei differenti campioni erano simili anche se si registrava una
leggera differenza tra il campione CA (gamberetti conservati tal quali) ed il campione
1% (gamberetti trattati con chitosano) e CB (gamberetti trattato semplicemente con la
soluzione di acetate buffer).
Conta mesofili totali
10,0
log UFC/g
8,0
CA
6,0
CB
4,0
1%
2,0
0,0
Tempo zero
7
12
tempo (gg)
Fig. 3 – Variazione delle cariche di mesofili totali.
28
15
La Fig. 4 mostra l’andamento delle cariche dei mesofili psicrotrofici. I campioni a
tempo zero presentavano una carica pari a circa 1 log UFC/g. Il trattamento con
chitosano ha permesso di contenere lo sviluppo dei mesofili psicrotrofici fino al 7°
giorno di conservazione quando i campioni di controllo presentavano una carica pari a
circa 5,3 log UFC/g mentre il campione trattato con chitosano una carica pari a 3,6 log
UFC/g. L’azione del chitosano diventava inefficace dopo il 7° giorno di conservazione;
infatti, sia al 12° sia al 15° giorno di conservazione non era possibile registrare una
differenza consistente di carica microbica tra il campione trattato e i campioni di
controllo. Dopo 15 giorni i campioni presentavano cariche estremamente elevate di
mesofili pscicrotrofici pari a circa 7,5 log UFC/g.
Mesofili psicrotrofici
log UFC/g
10,0
8,0
6,0
CA
4,0
CB
1%
2,0
0,0
Tempo
zero
7
12
15
tempo (gg)
Fig. 4 – Variazione delle cariche dei mesofili psicrotrofici.
L’andamento dello sviluppo dei microrganismi produttori di H2S è riportato in Fig. 5. A
tempo zero le cariche risultavano pressoché trascurabili. Dopo sette giorni di
conservazione, invece, si registrava in tutti i campioni un aumento dello sviluppo
microbico, tuttavia risaltano le differenze tra il campione trattato con chitosano (1%) ed
i campioni di controllo. Dopo sette giorni, infatti, il campione trattato presentava
cariche ridotte e pari a 2,3 log UFC/g, mentre i campioni CA e CB presentavano
cariche pari rispettivamente a 5,2 log UFC/g e 3,7 log UFC/g.
log UFC/g
Produttori di idrogeno solforato
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
CA
CB
1%
Tempo
zero
7
12
15
tempo (gg)
Fig. 5 – Variazione delle cariche dei microrganismi produttori di idrogeno
solforato.
29
Le cariche di Enterobacteriaceae, Coliformi totali e fecali e di enterococchi risultavano
inconsistenti a tempo zero e restavano pressoché irrilevanti anche durante la
conservazione in tutti i campioni considerati.
Colore
Dall’analisi dei risultati si evince che per i campioni di controllo CA (gamberetti
conservati tal quali) si verificava una riduzione della lucentezza durante la
conservazione (data not shown). Il valore L, infatti, diminuiva da 53,95 a tempo zero a
42,39 dopo 15 giorni di conservazione. I campioni CB gamberetti trattati in soluzione
di acetato buffer) e 1% (gamberetti trattati in soluzione di chitosano all’1%), invece,
facevano registrare un valore di lucentezza pressoché costante durante l’intero periodo
di conservazione.
Il colore dei campioni 1% e CB dopo 7 giorni di conservazione restava pressoché
stabile, infatti i valori di a e b a tempo zero risultavano pressoché simili valori di a e b
dopo 7 giorni di conservazione. Il campione controllo, invece, evidenziava un
cambiamento di colore che si manifestava con un marcato imbrunimento della polpa
del gamberetto. A fine conservazione i campioni che mostravano il minor viraggio del
colore erano i campioni CB e 1%.
La foto A riporta le immagini dei gamberetti dopo 7 giorni di conservazione. E’
evidente che il campione controllo presentava la maggior variazione del colore, tradotta
in un marcato imbrunimento del prodotto. I campioni 1% e CB, invece, presentavano
una gradevole apparenza ed il colore, in particolar modo risultava pressoché simile a
quello dei campioni a tempo zero.
FOTO A – Stato dei gamberetti dopo 7 giorni di conservazione.
Prodotti di ossidazione. I risultati dei livelli di malondialdeide sono riportati in Fig. 6.
Il livello di MDA è aumentato durante il tempo di conservazione, ma in maniera
differente a seconda del trattamento, con valori marcatamente più elevati nel controllo
rispetto al campione trattato con chitosano che ha riportato un aumento contenuto dei
livelli di MDA, passando da 0,45 µg MDA/g del tempo 0 a 0,70 µg MDA/g dopo 15
30
giorni di conservazione, laddove il controllo CA presentava dei livelli di MDA
quadruplicati rispetto al tempo iniziale.
L’MDA rappresenta un indice molto importante per la valutazione dello stato di
freschezza del prodotto in quanto i lipidi dei crostacei sono costituiti principalmente da
acidi grassi polinsaturi, i quali vanno facilmente incontro ad ossidazione lipidica,
dovuta in particolare all’azione alterativa di microrganismi. I bassi contenuti di MDA
ritrovati nei campioni trattati con chitosano dimostrano che questo, rallentando i
processi di alterazione microbica, è efficace anche nel contenere i processi ossidativi a
carico dei lipidi.
µg MDA/g
2
1,5
CA
CB
1
1%
0,5
0
0
7
12
15
Giorni di conservazione
Fig. 6 – Variazione dei valori di MDA (malondialdeide).
Analisi sensoriale. Le caratteristiche sensoriali sono chiaramente visibili al
consumatore fornendo
nell’immediato informazioni sullo stato di freschezza del prodotto. Dall’analisi
sensoriale è stato possibile evidenziare che il chitosano ha avuto un effetto positivo
sulle caratteristiche qualitative dei gamberetti. A tempo 0 tutti i campioni presentavano
delle caratteristiche sensoriali di estrema freschezza in merito all’odore, al colore, alla
consistenza e all’aspetto, riportando il massimo punteggio nella scala edonistica.
Dopo 7 giorni di conservazione, tuttavia, i gamberetti del controllo hanno fatto
registrare punteggi inferiori rispetto ai gamberetti trattati con chitosano, e queste
differenze si sono accentuate al 12° giorno, dove il controllo sfiorava valori di
preferenza al limite dell’accettabilità, ed è stato dichiarato inedibile al 15° giorno di
conservazione, mentre i gamberetti trattati con chitosano, in particolare il trattamento
all’1%, hanno mantenuto ancora livelli di accettabilità.
Conclusioni
Con tale ricerca si è inteso individuare un’applicazione pratica del chitosano al fine di
sfruttare le caratteristiche antimicrobiche di tale sostanza naturale per il prolungamento
della shelf-life di gamberetti freschi.
Tale ricerca ha dimostrato che il trattamento con chitosano può in maniera efficace
salvaguardare le caratteristiche qualitative di gamberetti freschi durante la shelf-life.
Le prove microbiologiche, sensoriali, chimiche e chimico-fisiche hanno, infatti, messo
in evidenza che il trattamento con chitosano garantiva una salvaguardia delle
caratteristiche qualitative dei gamberetti durante la conservazione.
L’azione inibente veniva riscontrata principalmente nei confronti di Pseudomonas spp.,
Brochothrix thermosphacta e, anche se in minor misura, nei confronti dei
microrganismi produttori di idrogeno solforato e nei confronti dei mesofili psicrotrofici.
31
L’inibizione dei suddetti microrganismi nei campioni trattati con chitosano ha
consentito di rallentare i processi di degradazione e putrefazione permettendo di
garantire la conservazione delle caratteristiche qualitative per un tempo maggiore. Fino
a 12 giorni, infatti, i campioni trattati con chitosano risultavano di gradevole aspetto,
non presentavano sgradevoli odori e presentavano le più basse cariche microbiche.
L’attività inibente del chitosano nei confronti di differenti microrganismi lo rende un
potenziale conservante naturale per egli alimenti. Inoltre il chitosano, in virtù delle sue
caratteristiche strutturali, quali proprietà coesive e di barriera, può essere considerato
una potenziale materia prima per la realizzazione di film edibili.
In prospettiva di una prosecuzione di tale ricerca nasce l’idea di realizzare un film
attivo edibile a lento rilascio di chitosano che possa essere impiegato in campo
alimentare al fine di salvaguardare le caratteristiche qualitative degli alimenti senza
ricorrere all’utilizzo di conservanti chimici.
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33

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