VALUTAZIONE DELLA TOSSICITA’ DEI FARMACI SPERIMENTAZIONE PRECLINICA FARMACOCINETICA (Assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione) TOSSICITA’ ACUTA, SUBCRONICA E CRONICA STUDI TOSSICOLOGICI SULLA RIPRODUZIONE STUDI DI CANCEROGENESI STUDI DI MUTAGENESI TOSSICITA’ riduzione di funzioni o ciclo vitale di un organismo acuta altre tossicità subcronica cronica TOSSICITA’ ACUTA IT = DL50 ED50 IT maggiore sicurezza del farmaco gli effetti acuti non sono comunque limitati alla sola letalità tossicità - + è possibile determinare LD50 diverse per sostanze che sono assorbite attraverso vie diverse TOSSICITA’ ACUTA la curva dose-risposta può essere trasformata in una retta per estrapolare anche altri parametri di tossicità come la DL10 o la DL100. Tuttavia bisogna considerare i limiti connessi con le estrapolazioni matematiche la dose massima di sostanza deve mantenersi entro limiti regolamentati per evitare effetti aspecifici, e simulare il più possibile l’esposizione umana STUDI DI TOSSICITA’-PRINCIPI GENERALI Definire la dose minima che produce effetti tossici e la dose massima che non induce alcun effetto, diretto o indiretto regolamentazione europea Definire la relazione tra dose terapeutica e dose tossica rapporto quantitativo Individuare quale struttura cellulare, organo o sistema sia il bersaglio della tossicità differenziare tra diretta o indiretta Definire le caratteristiche dell’effetto tossico determinato dalla molecola o dai suoi metaboliti possibili meccanismi Stabilire la reversibilità o meno degli effetti tossici osservati a breve e/o lungo termine SPERIMENTAZIONE PRECLINICA PROVE DI TOSSICITA’ COSA DEVONO EVIDENZIARE soglia di tossicità alterazioni funzionali e/o anatomo-patologiche dovute al farmaco relazione tra effetti tossici e dosi COME SI ESEGUONO esame di mortalità, accrescimento e modificazioni del comportamento unito a valutazioni autoptiche e istologiche TOSSICITA’ ACUTA Somministrazione unica (acuta) del principio attivo su due o più specie di mammiferi (in genere scelte tra ratto, topo e coniglio) Almeno due diverse vie di somministrazione (nel caso dei roditori), una delle quali identica a quella proposta nell’uomo, mentre l’altra deve garantire l’assorbimento sistemico del farmaco TOSSICITA’ ACUTA periodo di osservazione adeguato a evidenziare danni ai tessuti e agli organi e/o il ritorno delle condizioni dell’animale alla norma. NON E’ MAI INFERIORE AI 7 GIORNI prove devono fornire dati il più possibile chiari sulla relazione dose/effetto e dose/mortalità per consentire il calcolo della DL50 esame anatomo-istopatologico deve essere effettuato al termine dell’osservazione (e/o sugli animali deceduti) STUDI DI TOSSICITA’ ACUTA ESEMPIO DI PROTOCOLLO • • • • • • • • • Animali adulti standardizzazione dei risultati Entrambi i sessi compensazione differenze ormonali Specie animali diverse metabolismo Numero minimo 5 animali variabile ma mai inferiore Dose pilota basata sulla DL50 deve dare effetti specifici Somministrazione mantenere un volume costante Scelta del solvente somministrato anche ai controlli 7 giorni osservazione variabile ma mai inferiore Studio autoptico degli animali deceduti prolungando il periodo di osservazione fino a circa 14 giorni si possono effettuare valutazioni di tossicità subacuta STUDI DI TOSSICITA’ ACUTA- SINTOMI COMUNI - respiratori (dispnea, apnea, cianosi, tachipnea, edema polmonare) - cardiovascolari (variazioni della frequenza, extrasistoli, variazioni dell’ECG, ipotensione, ipertensione, vasocostrizione o vasodilatazione cutanea) - nervosi (convulsioni, variazioni del tono muscolare, variazioni della motilità, sonno, analgesia, piloerezione, variazioni delle funzioni motorie superiori) - cutanei (eritema, edema, alterazioni del pelo) - gastroenterici intestinali) (vomito, diarrea, emorragie gastro- nel caso dei farmaci gli effetti tossici sono in genere correlati all’effetto terapeutico TOSSICITA’ SUBCRONICA integra gli studi di tossicità acuta e considera una frazione significativa del ciclo vitale dell’animale (in genere il 20%) almeno 3 dosi di farmaci, scelte sulla base degli studi di tossicità acuta almeno due specie di mammiferi, di cui una non appartenente ai roditori TOSSICITA’ SUBCRONICA elevata: deve essere associata a una mortalità non superiore al 10% degli animali DOSI intermedia: calcolata come media fra la dose elevata e la minore minore permette di fissare il margine di tolleranza attraverso la valutazione dell’effetto farmacologico questi studi permettono anche di calcolare le dosi minime e massime a cui si osservano effetti tossici TOSSICITA’ SUBCRONICA la somministrazione deve garantire uniformità della dose somministrata durante tutto il trattamento deve essere attentamente considerato il fenomeno della bioaccumulazione quando si stimano le dosi e si valutano gli effetti STUDI DI TOSSICITA’SUBCRONICA ESEMPIO DI PROTOCOLLO • • • • • • • Animali adulti standardizzazione dei risultati Entrambi i sessi compensazione differenze ormonali Specie animali diverse tassativamente un non-roditore Somministrazione intragastrica o negli alimenti Numero minimo 10 animali variabile ma mai inferiore 3 livelli di dose Valutazione del ruolo della bioaccumulazione STUDI DI TOSSICITA’ SUBCRONICA ESEMPIO DI ESAMI -Esame delle urine (chetonuria, porfirinuria, emoglobinuria, ematuria, glicosuria, pressione osmotica, cristalli, cellule di sfaldamento, pH). -Chimica clinica (livelli plasmatici di bilirubina, creatina e creatinina, colinesterasi, acidi grassi, colesterolo, LDLP e HDLP, glicemia, azotemia, elettroliti, acido urico, proteine totali e frazionate, immunoglobuline, marcatori enzimatici di funzioni di organo (creatinfosfochinasi, colinesterasi, lattico deidrogenasi, fosfatasi alcaline ed acide, transaminasi, amilasi). -Ematologia ematocrito, emoglobina, conte di GR e GB, con eventuale formula leucocitaria, piastrine, misure di coagulazione. L’interpretazione dei risultati ottenuti in questi studi è molto complessa e deve considerare tutte le variabili valutate e le loro interazioni TOSSICITA’ CRONICA copre la quasi totalità della vita dell’animale (sopra i 3 mesi nel roditore) la scelta del tipo di protocollo e della dose da impiegare devono tenere presente il peggioramento delle condizioni dell’animale durante il trattamento la scelta della dose si può avvalere del fattore di cronicità TOSSICITA’ CRONICA FATTORE DI CRONICITA’ giorno 0 giorno 90 valutazione quotidiana di DL50 se DL50 decresce sensibilmente progressivamente si è in presenza bioaccumulazione della sostanza da valutare e di TOSSICITA’ CRONICA elevata: calcolata in genere come dose associata ad una perdita di peso del 10% in 3 mesi. E’ detta anche MDT (Massima Dose Tollerata) DOSI intermedia: calcolata come media fra la dose elevata e la minore minore dose non associata a effetti tossici. Dovrebbe essere da 2 a 10 volte superiore a quella proposta per la terapia TOSSICITA’ CRONICA i protocolli sono simili a quelli utilizzati per la tossicità acuta e subcronica i parametri vitali devono essere controllati a intervalli regolari lungo tutto il corso dell’esperimento può essere applicata non solo ai principi attivi dei farmaci ma anche agli additivi; in questo caso la dose si calcola sulla base dell’esposizione presunta di esposizione giornaliera TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA riguarda i processi fisiologici pertinenti alla sfera riproduttiva • riduzione della fertilità • morte fetale • malformazioni di varia gravità TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA gli animali preferiti sono il topo e il ratto, ma si può usare anche il coniglio • Modifiche della fertilità o procreazione anormale dovuta a danni dei gameti maschili e/o femminili • Interferenza con le fasi di pre-impianto e impianto dell’embrione e del suo sviluppo • Effetti tossici di vario tipo sull’embrione • Effetti tossici di vario tipo sul feto TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA STUDI DI FERTILITA’ maschi accoppiamento con femmine sane e valutazione del tasso di natalità e delle caratteristiche del liquido seminale femmine accoppiamento con riproduttori sani e valutazione del tasso di natalità e delle caratteristiche delle nidiate TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA STUDI EMBRIONALI E PERINATALI FASE I pre-impianto. 14 giorni somministrazione (coprire ovulazione). Morte fetale e aborto. FASE II organogenesi. In genere i primi tre quarti della gravidanza. Malformazioni, effetti teratogeni FASE III embrionale e neonatale. Ultimo quarto della gravidanza e allattamento. Ritardo crescita, deficits funzionali TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA PROTOCOLLO •Pubertà •Inizia il trattamento che prosegue per 100 giorni •Accoppiamento e produzione della prima nidiata (F1) •Dopo 50 giorni inizia il trattamento degli F1 che prosegue per 120 giorni. Si accoppiano gli F1 producendo gli F2 •Svezzamento degli F2, conta, misura del peso, uccisione, necroscopia e istopatologia i protocolli specifici variano a seconda dell’ente regolatore, ma la durata delle procedure è in genere lunga STUDI DI CANCEROGENICITA’ manifestazione di tumori indotti o aumento di frequenza di tumori spontanei spesso combinati a cronici Due specie animali il ratto è tra gli animali preferiti Via di somministrazione analoga all’uomo, lontana dal sito Documentazione assorbimento Somministrazioni giornaliere trattamento prolungato Gruppi sperimentali devono essere numerosi Almeno tre dosaggi possono essere ottenuti da altri studi si basano sull’assunzione che tutte le sostanze cancerogene per gli animali lo siano anche per l’uomo STUDI DI CANCEROGENICITA’ massima: dovrebbe essere cancerogena ma non associata ad altre manifestazioni tossiche DOSI intermedia: calcolata come media fra la dose elevata e la minore minima: dose non associata a effetti cancerogeni. Dovrebbe essere da 2 a 10 volte superiore a quella proposta per la terapia STUDI DI CANCEROGENICITA’ RICHIESTI PER NUOVE MOLECOLE, IN PARTICOLARE PER: molecole di una classe nota per possedere effetti cancerogeni rilevanti anche per l’uomo; relazione struttura attività che suggerisce un rischio cancerogeno evidenza di lesioni neoplastiche negli studi di tossicità ripetuta ritenzione a lungo termine della molecola o suoi metaboliti, in determinati organi evidenze di positività nei test di mutagenesi STUDI DI CANCEROGENICITA’ Frequenza nei controlli (%) Frequenza nei trattati(%) 60 30 20 10 10 17 65 241 - 5 13 35 76 464 1 10 27 46 114 Dimensioni del campione sperimentale richieste per ottenere differenze significative con potenza statistica del 95%. Se l’incidenza spontanea dei tumori è del 5% e ci si attende un incremento del 10% serviranno 464 animali per dose è necessario utilizzare alte dosi di farmaco per cercare di ridurre al minimo necessario il numero di animali STUDI DI MUTAGENESI si effettuano in vitro e in vivo Induzione mutazioni geniche, danni cromosomici e/o genomici, danni primari al DNA. Completano studi di cancerogenesi e di teratogenesi STUDI DI MUTAGENESI almeno: Un test di mutazione genica sui batteri Un test di mutazione genica in un sistema eucariotico in presenza o meno di induttori del metabolismo Un test di aberrazioni cromosomiche in colture di cellule di mammifero Un test in vivo di danno genetico (i più convalidati sono quelli a livello cromosomico, come il Mouse Spot Test) STUDI SUPPLEMENTARI Studi di tollerabilità locale: sono richiesti prima della sperimentazione clinica se, la via di somministrazione topica è rilevante per l’impiego nell’uomo o se si ritiene che la via endovenosa possa determinare lesioni •Prove di immunogenicità: sono effettuate per valutare la capacità immunogenica e allergizzante di un farmaco, oltre alla sua eventuale interferenza con il sistema immunitario •Prove di pediatria: se si prevede utilizzo in bambini, può essere necessario eseguire studi in ratti neonati. Normalmente, si preferisce avviare studi pediatrici, solo se in possesso di consistenti risultati nell’adulto e in presenza dei test completi di tossicità della riproduzione, mutagenesi e tossicità ripetuta NORMATIVA VIGENTE IN EUROPA http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm
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