07/04/14 16. La Trascrizione contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale dogma centrale della biologia molecolare flusso dell'informazione genetica è monodirezionale L’informazione “scorre” dal DNA al RNA e da esse alle proteine, ma non in senso contrario (Francis Crick) Ossia I geni (genotipo) codificano per messaggeri che vengono tradotti in proteine, gli effettori, che costituiscono il fenotipo 1 07/04/14 eccezione alla regola I retrovirus non ubbidiscono al “dogma centrale” in quanto il loro RNA codifica per il DNA – trascrizione inversa («reverse transcription») Usando il suo enzima trascriptasi inversa e i materiali dell’ospite (nucleotidi, zuccheri, ecc.) il virione dell’HIV trascrive il suo RNA in DNA. NB: retrotrascrizione è utilizzata in biologia molecolare in esperimenti di ingegneria genetica: mRNA purificato porta a sintesi di DNA complementare (cDNA), normalmente privo di introni, da usare per clonaggio e manipolazione del gene corrispondente. Nei procarioti trascrizione e traduzione sono contemporanee 2 07/04/14 Negli eucarioti il messaggio viene così espresso trascrizione le informazioni contenute nel DNA vengono trascri5e enzima6camente in una molecola complementare di RNA. sequenze di coppie di basi che vengono trascri4e prendono il nome di geni, per cui il processo di trascrizione viene anche de4o espressione genica. 3 07/04/14 I geni possono essere trascritti e tradotti con efficienza diversa RNA vs DNA 4 07/04/14 L uracile fa da base complementare all adenina Interazioni non classiche (A-‐G) 5 07/04/14 Tipi di RNA RNA Messaggero mRNA codifica proteine RNA Ribosomiale rRNA -‐ parte dei ribosomi -‐ utilizzato per tradurre mRNA in proteine RNA Transfer tRNA accoppia la regione che lega il codone dell mRNA ed il suo aa corrispondente Coinvolti nello splicing, regolazione fattori di trascrizione, mantenimento telomeri 6 07/04/14 La trascrizione produce RNA complementare a uno dei filamen: di DNA Sequenza codificante = sequenza di DNA 5 -‐ 3 catena senso (+) Sequenza stampo = sequenza complementare di DNA in direzione 3 -‐ 5 catena antisenso (-‐) La direzione di lettura dello stampo è 3 – 5 La direzione di sintesi è 5 -‐ 3 7 07/04/14 Il filamento codificante porta la stessa sequenza dell mRNA Il filamento stampo è trascritto ad mRNA TRASCRIZIONE vs REPLICAZIONE Analogie: Apertura breve tratto doppia elica di DNA Ribonucleotidi aggiunti uno alla volta Appaiamento complementare sullo stampo Differenze: Filamento RNA si distacca dallo stampo RNA è quindi a singolo filamento Filamenti RNA molto più corti 8 07/04/14 L RNA polimerasi trascrive il DNA sintetizza RNA in direzione 5 -‐ 3 Non necessita di un innesco Utilizza ribonucleosidi 5 -‐trifosfato (ATP, GTP, UTP e CTP) e richiede Mg++ Ogni nucleotide è selezionato in base alle regole della complementarietà A:U e G:C e alla geometria della coppia di basi V di 50 nt/sec Il 3 OH agisce da nucleofilo sul gruppo fosfato del ribonucleoside trifosfato entrante e si ha liberazione di PPi (NMP)n + NTP è (NMP)n+1 + Ppi Il PPi viene scisso in 2Pi dalla pirofosfatasi inorganica. La chimica di sintesi dell RNA è identica a quella del DNA. L RNA polimerasi trascrive il DNA 9 07/04/14 DNA polimerasi vs RNA polimerasi RNA polimerasi catalizza legame tra ribonucleotidi DNA polimerasi catalizza legame tra deossiribonucleotidi RNA polimerasi NON ha bisogno di un innesco DNA polimerasi ha bisogno di un innesco RNA polimerasi commette un errore ogni 104 nucleotidi copiati DNA polimerasi commette un errore ogni 107 nucleotidi copiati RNA polimerasi batterica Un unico enzima responsabile della sintesi di rRNA, tRNA e mRNA Nucleo dell enzima (core) α2ββ α = 40 kDa β = 155 kDa β = 160 kDa + Subunità σ = 32-‐90 kDa diversi tipi di σ conferiscono specificità per gruppi diversi di promotori 10 07/04/14 La TRASCRIZIONE avviene nelle seguenti fasi: 1. Riconoscimento dello stampo 2. Inizio 3. Allungamento 4. Termine 1. Riconoscimento dello stampo comincia con il legame della RNA polimerasi al DNA a doppio filamento, con formazione di un complesso chiuso poi i filamenti di DNA vengono separati, formando un complesso aperto la bolla di trascrizione è creata grazie ad uno srotolamento locale che comincia nel sito legato dalla RNA polimerasi. 11 07/04/14 2. INIZIO L RNA polimerasi deve legarsi al DNA da trascrivere su appropriate sequenze di inizio della trascrizione: promotori PROMOTORE: sequenza di DNA necessaria per il legame della polimerasi allo stampo e per l effettuazione della reazione di inizio dopo sintesi 10 nt fase di inizio è resa più lunga dal succedersi di even> abor>vi: enzima sinte>zza brevi trascri@ (<9 basi) , li rilascia e ricomincia la sintesi. La fase di inizio termina quando l enzima riesce ad estendere la catena e lascia il promotore • Tutte le molecole di RNA polimerasi si trovano già legate al DNA. • I nuclei dell'enzima si trovano legati al DNA (chiuso) in complessi deboli. In che modo l'RNA polimerasi riconosce i promotori? • Una RNA polimerasi libera si lega al DNA e resta in contatto con esso, passando da una sequenza all'altra fino a quando raggiunge un promotore. • A questo punto può avere inizio la trascrizione. Com’è fatto un promotore ? La funzione di un promotore non è di essere trascritta e tradotta, ma di farsi riconoscere dalle proteine. • L'informazione per la funzione del promotore sta direttamente nella sua sequenza, che costituisce il segnale. • La sequenza di un promotore non deve necessariamente essere contigua e lo spazio tra due elementi distaccati può essere parte stessa del segnale 12 07/04/14 Per studiare i promotori è necessario confrontarli tra loro • Le sequenze essenziali sono presenti in tutti i promotori e sono sequenze conservate. • E' comunque ammesso un certo grado di variazione. • I possibili segnali sul DNA vengono definiti sulla base di sequenze idealizzate, dette sequenze consenso, nelle quali ogni posizione è rappresentata dalla base che vi compare con maggiore frequenza. • Un promotore è dunque definito dalla presenza di brevi sequenze consenso in posizioni specifiche. • I singoli promotori in genere differiscono dal consenso in una o più posizione • Relativamente al sito di inizio della trascrizione, le sequenze consenso a -‐35 e a -‐10 contengono gran parte dei punti di contatto tra RNA polimerasi e promotore. • A -‐10 si trova la sequenza consenso TATAAT • A -‐35 si trova la sequenza consenso TTGACA La RNA polimerasi riconosce il promotore stabilendo contatti specifici con le regioni delle basi che si trovano esposte all esterno dell elica Promotore lega enzima solo in una direzione: trascrive solo in direzione 5 3 13 07/04/14 3. Allungamento -‐ enzima si muove lungo il DNA, estende la catena di RNA e srotola la doppia elica esponendo una nuova porzione dello stampo a singolo filamento. -‐ nucleotidi vengono aggiunti all estremità 3 della catena nascente di RNA, formando un ibrido DNA-‐RNA nella regione srotolata. -‐ Alle spalle della regione srotolata, il filamento stampo si riappaia con il filamento codificante, riformando la doppia elica e spiazzando la catena di RNA. 4. Termine -‐ riconoscimento di un punto nel quale l enzima cessa di aggiungere nucleotidi alla catena di RNA in crescita -‐ dopo l aggiunta dell ultima base, l ibrido DNA-‐RNA si dissocia, la bolla di trascrizione collassa riformando la doppia elica, l enzima e l RNA si dissociano dal DNA -‐ La sequenza di DNA che innesca questa reazioni è chiamata terminatore. Si distinguono due tipi di terminatori: -‐ terminatori intrinseci o rho-‐indipendenti può terminare senza l ausilio di altri fattori -‐ terminatori rho-‐dipendenti necessità del fattore rho (ρ) per terminare la trascrizione. 14 07/04/14 Struttura dei terminatori intrinseci: -‐ struttura secondaria a forcina (contiene una regione ricca in G-‐C alla base) -‐ serie di residui U (circa 6) a valle della forcina La polimerasi rallenta o si ferma (circa 60 secondi) quando ha trascritto la sequenza che forma la forcina La serie di U è necessaria per la dissociazione della RNA polimerasi durante l arresto alla forcina (se si accorcia le serie di U, la polimerasi si ferma, ma non termina la trascrizione) sequenze ricche in AT sono importanti sia nell’inizio che nella terminazione rho-‐indipendente della trascrizione Terminazione rho-‐dipendente Rho è una proteina essenziale di E. coli, che funziona solamente nella reazione di terminazione; agisce come un esamero di 6 subunità identiche lega la catena di RNA in elongazione o all estremità 5 o su alcune specifiche sequenze esposte si muove lungo la catena di RNA e raggiunge la RNA polimerasi srotola l ibrido DNA-‐ RNA nella bolla di trascrizione (attività di elicasi 5 -‐3 ) oppure rho potrebbe interagire con la RNA polimerasi causando indirettamente il rilascio della catena di RNA 15 07/04/14 La trascrizione negli eucarioti è un processo complesso 3 RNA polimerasi RNA polimerasi I RNA polimerasi II RNA polimerasi III rRNA mRNA tRNA,snRNA RNA polimerasi per avviare la trascrizione richiedono l intervento di FATTORI di TRASCRIZIONE che -‐ Sono i responsabili del riconoscimento del promotore -‐ devono aggregarsi alla polimerasi in corrispondenza del promotore Negli eucarioti i geni sono sparsi nel DNA intervallati da sequenze molto lunghe non trascritte (nei procarioti sono molto vicini) FATTORI di TRASCRIZIONE Formano aggregato sul promotore riconosciuto dalla RNA pol II Legame di TFIIB induce distorsione del DNA Si legano altri fattori e RNA pol II COMPLESSO D INIZIO TFIIH aggiunge gruppi P alla coda dell RNA pII RNA pol II si sgancia dai fattori di trasc 16 07/04/14 Maturazione mRNA eucariotici pre-‐mRNA eucariotici sono processati (modificati) nel nucleo prima di essere trasportati nel citoplasma dove avviene la traduzione. Serie di reazioni chimiche che avvengono durante la trascrizione Enzimi responsabili della maturazione seguono a ruota la coda della polimerasi mentre trascrive il DNA Solo ai trascritti destinati a diventare mRNA vengono aggiunti Cappuccio e Coda mRNA eucariotico è modificato ad entrambe le estremità 17 07/04/14 1. Apposizione del cappuccio all RNA (capping) Estremità 5 incappucciata con un nucleotide atipico prima della trascrizione del gene (dopo che sono stati trascritti 25 nucleotidi) 7-metilguanosina legato al residuo 5’-terminale dell’RNA, attraverso un inconsueto legame 5’, 5-trifosfato 2. poliadenilazione Lunga qualche centinaia di nucleotidi Queste modificazioni aumentano la stabilità della molecola e ne facilitano l esportazione dal nucleo al citoplasma 18 07/04/14 Diversi tipi di cappuccio: Cap 0 Posizione 7 della G terminale Cap 1 Posizione 2’-‐O penultima base e/o in N6 se base è A Cap 2 Posizione 2’-‐O terza base La poliadenilazione 19 07/04/14 CPSF riconosce seq. AAUAAA CstF lega GU, stimola CFI, CFII endonucleasi PAP Poli(A) Polimerasi PABP Poly(A) Binding Protein Splicing processo con cui sono escissi dall'RNA gli introni, mentre gli esoni vengono uniti tra loro a formare una molecola continua di mRNA 20 07/04/14 geni batterici consistono di un tratto unico di sequenza nucleotidica ininterrotta geni eucariotici sono interrotti da lunghe sequenze: INTRONI Le sequenze espresse (ESONI) sono molto più corte La parte codificante di un gene è spesso una frazione modesta della sua lunghezza totale 21 07/04/14 Splicing Dopo l apposizione del cappuccio si ha la rimozione di tutte le sequenze introniche e ricucitura di tutti gli esoni Solo dopo si aggiunge la coda di poli A Le snRNA (small nuclear RNA) individuano il confine tra introni ed esoni partecipano al taglio e saldatura (sono parte dello SPLICEOSOMA) Durante lo splicing l introne forma una struttura ad ansa e poi a cappio 22 07/04/14 Attacco del 2 OH al 5 splicing site con formazione del cappio Attacco del 3 OH libero al 3 splicing site: Liberazione del cappio I trascritti primari di molti geni possono essere elaborati in vari modi e dar luogo a mRNA diversi che codificano proteine diverse SPLICING ALTERNATIVO: dallo stesso gene proteine diverse Spiega perché negli organismi superiori non ci sia un rapporto lineare tra numero di geni e complessità dell organismo (= numero di proteine): dipende anche dalla capacità di utilizzare il meccanismo dello splicing alternativo 23 07/04/14 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 degradazione dell’mRNA batterico 1. ENDONUCLEASI forma diverse estremità 3’ all’interno dell’mRNA (direzione 5’-‐3’) 2. ESONUCLEASI degradazione in nucleotidi dei frammenti di mRNA (direzione 3’-‐5’) Degradosoma: complesso multienzimatico Rnasi E è la endonucleasi Elicasi svolge RNA per renderlo accessibile a PNPasi (esonucleasi) 24 07/04/14 Stabilità mRNA eucariotico è determinata dalla struttura e dalla sequenza Localizzazione più comune degli elemen1 destabilizzan1 25 07/04/14 mRNA instabili per presenza di sequenze ARE (AU Rich Elements) in 3-‐UTR deadenilazione Degradazione endonucleolitica Gli mRNA maturi vengono esportati selettivamente dal nucleo Il complesso del poro nucleare riconosce e trasporta solo RNA completi Proteine apposite si legano all RNA marcando selettivamente i messaggeri maturi 26 07/04/14 27
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