Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) RNA-polimerasi Tutti i tipi di RNA vengono sintetizzati nel nucleo. A sintetizzarli è un enzima, detto RNA-polimerasi che, copiando su particolari tratti del DNA (geni), ne esegue una copia complementare di quelle sequenze. RNA-polimerasi nei procarioti I procarioti hanno un'unica RNA-polimerasi che sintetizza tutte le forme di RNA (rRNA, tRNA, mRNA). Il processo di trascrizione si svolge in 3 fasi: inizio allungamento fine Inizio Per cominciare la trascrizione, l’RNA-polimerasi deve riconoscere e legare saldamente l'inizio di un gene. Per individuare il gene la molecola di RNA-polimerasi scivola (guidata da alcune proteine) lungo la doppia elica sino a quando incontra la regione del promoter, cioè una sequenza di nucleotidi che indica il punto d'inizio della trascrizione. Il riconoscimento ed il legame col promotore è favorito da un fattore proteico dell’RNA-polimerasi, chiamato fattore σ (sigma). Raggiunto il promotore, l’RNA-polimerasi si lega ad esso in maniera orientata, cioè nella direzione della lettura (il legame in senso opposto è impossibile). Il legame al DNA produce un cambiamento di forma della RNA-polimerasi (da un complesso chiuso ad un complesso aperto). Tale cambiamento comporta la separazione dei filamenti di DNA (ad opera di una subunità interna detta rudder = timone) e lo srotolamento di circa 13 bp (si forma la bolla di trascrizione). All’interno della bolla avviene la lettura del DNA. Davanti alla RNA-polimerasi il DNA si svolge, mentre i filamenti che la polimerasi stessa si lascia dietro, si riavvolgono (ad opera di un’altra subunità interna detta zipper = cerniera). Il legame col promotore è importante per svariati motivi: consente di individuare il sito di inizio del gene da leggere; permette di stabilire il legame iniziale col DNA; consente di modulare la velocità lettura dell’RNA-polimerasi stessa. Ci sono alcune sequenze altamente specifiche e critiche sul promotore tali da determinare non solo la specificità del legame tra DNA e RNA-polimerasi, ma anche influire sulla velocità di lettura di quest’ultima. Infatti, se queste sequenze critiche assomigliano molto al tratto di DNA (e alla catena senso, più precisamente) da codificare, esse impongono alla RNA-polimerasi una velocità di trascrizione notevole; mentre, se sono molto diverse, la velocità di trascrizione è lenta. Nel primo caso i promotori si dicono “forti”, nel secondo caso “deboli”. In realtà, anche altre proteine regolatrici influenzano la velocità di trascrizione. Allungamento Tale fase comporta l’ulteriore aggiunta di ribonucleotidi. Dopo la sintesi dei primi 9 nucleotidi, l’RNApolimerasi si stacca dal promotore (altrimenti non potrebbe procedere nella lettura del DNA) e va avanti con la trascrizione, leggendo e sintetizzando il gene in questione, dall’inizio alla fine, senza staccarsi. Il tutto procede ad una velocità media di 50 nucleotidi al secondo (inferiore rispetto a quella di duplicazione del DNA che è 800 nucleotidi al secondo). La direzione di trascrizione è sempre 5’ 3’ (riferita all’RNA e non al DNA!). Fine Quando finisce la lettura del gene, l’RNA-polimerasi si stacca dal DNA. Questa operazione è imposta da elementi di controllo detti terminatori. I terminatori possono essere di due tipi, Rho-indipendenti e Rhodipendenti: i terminatori Rho-indipendenti sono formati da due sequenze consecutive, la prima ricca di basi C e G, la seconda una poli-A. A causa della prima sequenza si viene a formare una forcina che rallenta la corsa della RNA-polimerasi; a causa della seconda sequenza, invece, l’RNA si stacca dal DNA, in quanto il legame A-U è molto debole. Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 1 i terminatori Rho-dipendenti, diversamente dai precedenti, reclutano una specifica proteina, detta Rho (una ATPasi ad anello), la quale effettua la separazione dell’RNA neosintetizzato dal DNA; questa proteina viene a sua volta attivata da una sequenza ricca di basi G sul tratto di DNA letto. RNA-polimerasi negli eucarioti Negli eucarioti il processo di trascrizione è molto più complesso per diversi motivi: 1. l’RNA-polimerasi non è una, ma triplice (RNA-polimerasi I, RNA-polimerasi II e RNA-polimerasi III). 2. L’RNA-polimerasi per legarsi al promotore ha bisogno di più fattori (e non di uno solo, come il fattore σ nel caso dei procarioti), detti fattori generali di trascrizione; 3. altri fattori (attivatori e repressori), direttamente o tramite il complesso mediatore, esercitano un’influenza sul processo della trascrizione; 4. il promotore non è unico ma multiplo; 5. diversi altri elementi, detti elementi regolatori prossimali e distali, intervengono per modulare l’attività di trascrizione. Analizziamo, adesso, nei particolari i cinque punti sopra esposti. Tipi di RNA-polimerasi A differenza dei procarioti (dove esiste un solo tipo di RNA-polimerasi), negli eucarioti ci sono molti tipi di RNA-polimerasi. Le varie RNA-polimerasi non sono solo chimicamente diverse tra loro, ma sono anche situate in posti diversi (le polimerasi II e III nel nucleo, la polimerasi I nel nucleolo) e riconoscono promotori diversi. Tipo di RNA-polimerasi Geni letti e sintetizzati RNA-polimerasi I RNA-ribosomiale 28S, 18S e 5.8S RNA-polimerasi II RNA-messaggero (mRNA), snRNA, snoRNA, miRNA e l’RNA delle telomerasi RNA-polimerasi III tRNA, RNA ribosomiale 5S, scRNA e alcuni snRNA RNA-polimerasi IV e V Sintetizzano i siRNA nelle piante. RNA-polimerasi mitocondriale Simile a quella dei procarioti (… poiché entrambe sono state trasferite, dai procarioti agli eucarioti durante il processo di endosimbiosi). RNA-polimerasi cloroplastica Fattori di Trascrizione Generali (GTF=General Transcription Factors, o anche TF=Transcription Factors) Si tratta di un gruppo di 6 proteine (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH) che hanno il compito di riconoscere il promotore e svolgere il DNA. La nomenclatura TFII sta per Trasnscription Factor of RNA-polymerase II. Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 2 Senza di loro, la RNApolimerasi II non può iniziare la trascrizione. Infatti, si parla di complesso di trascrizione iniziale (o macchinario di trascrizione) per indicare l’insieme dell’RNA-polimerasi II e dei TF. Il primo fattore di trascrizione ad entrare in azione durante la trascrizione è il TFIID. Si tratta di un grosso complesso proteico formato da 12 subunità; tra queste particolarmente importante è la subunità TBP (TATA binding protein), che si lega a livello del TATA-box. La TFIID piega di circa 80° la sequenza TATA e questo espone alcune regioni di essa al contatto con i fattori TFIIA e TFIIB, le quali si legano e stabilizzano il legame del TFIID. Successivamente, si lega l’RNA-polimarasi II assieme alla TFIIF. Gli ultimi a legarsi sono il TFIIE, TFIIJ (che è una subunità del TFIIA) ed il TFIIH (che ha la funzione di elicasi, cioè di srotolare ed aprire la doppia elica del DNA). Durante la fase di allungamento la RNA-polimerasi II si stacca da quasi tutti i fattori di trascrizione (TF). Gli unici TF a rimanere attaccati alla RNA-polimerasi sono il TFIID (che stabilizza il legame tra l’RNA-polimerasi ed il DNA) e il TFIIH (che ha il compito di svolgere ed aprire la doppia elica del DNA). Attivatori, repressori, co-attivatori, co-repressori e complesso mediatore Gli attivatori e repressori sono una serie di proteine che interagiscono con particolari sequenze del DNA, dette elementi regolatori prossimali e distali (vedi dopo), ed esercitano una funzione stimolante o inibente sul processo di trascrizione. Essi non agiscono mai direttamente sul macchinario della trascrizione ma si servono del complesso mediatore (che fa da mediatore, appunto, tra loro e vari TF) o di altre proteine, dette co-attivatori e co-repressori. Promotore (promoter) L’apparato promoter varia a seconda della RNA-polimerasi considerata. 1. La RNA-polimerasi I, che trascrive i geni dell’rRNA 28S-18S-5.8S, ha un apparato promotore formato da: un nucleo promotore (core) ricco in GC, che si estende da -45 a +20. A questo sito vi si lega un complesso formato da 4 subunità, la TBP (TATA binding protein) + 3 TAF (TBP-activating factor 1, 2, 3). Elemento a monte del promotore (UCE = upstream control element), ricco in GC, che si estende da -180 a -107. Ad esso si lega la proteina UBF (upstream binding factor), responsabile del ripiegamento del DNA e necessaria a portare l’UCE a contatto col gruppo promotore, al fine di attivare la RNA-polimerasi I. 2. La RNA-polimerasi II, che trascrive i geni degli mRNA, snRNA, snoRNA e miRNA ha un apparato promoter formato da: Nucleo promotore (core promoter), rappresentato da solo 2 o 3 dei seguenti 5 elementi: BRE, una sequenza situata a -35 dal punto di inizio; rappresenta l’elemento riconosciuto dal TFIID. TATA box, una sequenza posta a -25 dal punto di inizio. Elemento iniziatore (Inr), una sequenza situata a ridosso del sito d’inizio della trascrizione, tra le posizioni –3 e +5. Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 3 DPE (downstream promotor element), una sequenza che si trova a valle del sito d’inizio, a+30. MTE (motif ten element) situato tra +18 e +27. Esso interagisce con l’Inr per l’attivazione del TFIID. Elementi regolatori prossimali, sono posti tra -50 e -200 dal sito di inizio della trascrizione. Questi elementi vengono riconosciuti e legati dagli attivatori (vedi dopo) ed hanno la funzione di stabilizzare l’apparato di inizio della trascrizione e di modulare la reazione di inizio. Quelli più noti sono: la CCAAT-box (generalmente localizzata a -80/-100), la GC-box (GGGCGG, generalmente a -40/-70), la CRE. Elementi regolatori distali (long-range regulatory elements), sono posti ad oltre -100.000 dal sito di inizio della trascrizione. Nonostante la loro notevole distanza dal gene da trascrivere, questi elementi, quando vengono attivati, si portano sempre in prossimità del gene, grazie all’attività dei TF (Transcription Factors). Gli elementi più noti sono: Esaltatori e silenziatori (enhancers e silencers), sono sequenze grandi (circa 500 bp) che attivano o reprimono il promotore, mediante l’interazione dei TF (Transcription Factors). Solitamente sono dislocati a notevole distanza dal promotore (a monte o a valle di esso); talvolta, però, gli enhancers e i silencer possono anche situarsi all’interno del gene da trascrivere. Isolatori (insulators), sono sequenze molto grandi di DNA (da 300 a 2000 bp) che hanno la funzione di “confinare ed isolare” le varie regioni dell’eucromatina per evitare che il DNA di una regione vada a “mischiarsi” col DNA di altre regioni; impedire eventuali cross-reazioni attivanti da parte di geni vicini (mediante il blocco dei silencers e degli enhancers). Locus di controllo delle regioni (LCR = Locus control regions), è un sito regolatore situato molto lontano dal promotore ed indipendente dagli enanchers. La sua funzione è quella di rendere attivo un promotore ed il meccanismo consiste nell’aprire i nucleosomi del promotore, in modo che i TF possano legarsi ad esso (e quindi attivare il promotore stesso). Spesso gli LCR sono tessuto-specifici cioè, pur essendo presenti in tutte le cellule, funzionano solo in quelle di un determinato tessuto grazie all’intervento di proteine attivatrici, presenti solo in quel tessuto. Regioni di attacco alla matrice (MAR = Matrix attachment regions), sono sequenze di DNA alle quali si lega la matrice nucleare (una fitta rete proteica che fa parte del nucleo scheletro e che regola la disposizione della cromatina all'interno del nucleo). I MAR servono per organizzare la cromatina in domini (regioni) e giocano un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica. I geni attivi sono associati alle MAR nelle cellule dove sono espressi, mentre non sono associati alle MAR nelle cellule dove non sono espressi. 3. Per la RNA-polimerasi III l’apparato promotore può essere di 4 tipi: Tipo 1 (promotore interno): è formato da 2 elementi di controllo a valle del punto d'inizio della trascrizione, detti boxA e boxC (sequenze di circa 10 basi); si trova nei geni per l'rRNA5S. Tipo 2 (promotore interno): è formato da 2 elementi di controllo a valle del punto d'inizio, detti boxA e boxB; è presente nei geni per il tRNA. Tipo 3 (promotore a monte): è formato da 3 elementi (conservati) a monte del punto di inizio, detti Oct, PSE e TATA; è presente nei geni per gli snRNA. Tipo 4 (promotore interno + a monte): è formato da due promotori interni simili a quelli del tipo 2 (boxA e boxB) e 2 promotori a monte (TF e TATA).; è presente nei geni che trascrivono l’RNA-7SL, uno degli RNA più piccoli presenti nelle cellule (nota 1). Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 4 In generale, i promotori si suddividono in due categorie, quelli contenenti e quelli non-contenenti le isole CpG (C=citosina, p=fosfato, G=guanina: sequenze nucleotidiche, da 20-50 bp, ricche di coppie C-G). I promotori con isole GpG sono frequenti nei geni “housekeeping”, cioè quei geni che gestiscono le funzioni basilari di tutte le cellule (ad esempio costruire membrane cellulari, le proteine del citoscheletro, etc). I promotori senza isole CpG, invece, sono frequenti nei geni altamente regolati (cioè che subiscono l’influenza di molti regolatori). Questi geni, di solito, gestiscono funzioni molto complesse (come la difesa immunitaria e i processi digestivi). Un numero elevato di geni (40-50% RNA polimerasi nell’uomo) è provvisto di promoter alternativi. Si tratta di geni dotati di Introduzione negli eucarioti nei procarioti promoter “opzionali” coi quali possono dare origine a proteine con caratteristiche a) Solo 1 tipo di RNA-polimerasi Differenze coi procarioti a) Tipi di RNA-polimerasi biochimiche diverse, pur partendo dallo b) Bolla di trascrizione I, II, III (IV, V, mitocondriale, cloroplatica) stesso gene. Questo meccanismo è c) Promotore b) Fattori di trascrizione generali coinvolto nella specificità di tessuto (cioè, d) Fattore sigma c) Attivatori, repressori, co-attivatori, corepressori e complesso mediatore. uno stesso gene, in cellule appartenenti a e) Fasi della trascrizone d) Promotori -Inizio tessuti diversi, può produrre più o meno -allungamento • per l’RNA-polimerasi I -fine core + UCE la proteina codificata perché influenzato • per l’RNA-polimerasi II da diversi promoter). nucleo promotore I promoter alternativi sono molto attivi BRE +TATA-box + Elemento iniziatore + DPE + MTE durante la vita embrionale. Difetti nel elementi regolatori prossimali funzionamento dei promotori alternativi, CCAAT-box + GC-box +CRE possono essere causa di gravi malattie elementi regolatori distali Enhancers + silencers + insulators genetiche. Un esempio significativo è la + LCR + MAR “distrofia muscolare di Duchenne”, • per l’RNA-polimerasi III dovuta alla mutazione del gene distrofina, - Tipo 1 (int.): boxA, boxC - Tipo 2 (int.): boxA, boxB che governa la produzione della omonima - Tipo 3 (est.): TATA, Oct, PSE - Tipo 4 (misto): TATA, TF, boxA, boxB proteina, componente fondamentale e) Elementi regolatori prossimali e distali della struttura delle fibre muscolari …solo per la RNA-polimerasi II scheletriche e cardiache. Elementi regolatori prossimali e distali Vedi paragrafo sulla RNA polimerasi II Traduzione In questa fase, l’informazione portata dall’mRNA viene tradotta dai ribosomi. Il processo si svolge in 5 tappe: 1. Attivazione dei tRNA 2. Inizio 3. Allungamento 4. Termine e rilascio 5. Modifiche post-traduzionali Attivazione dei tRNA Per l’attivazione dei tRNA, vedi lezione 12. Inizio (Initiation Factors IF) Il tRNA di inizio (tRNAiMet)1, assieme all’IF2 (legato ad un GTP) e alla IF5B (anch’esso legato ad un GTP) si lega alla subunità 40S del ribosoma. Quest’ultimo si era già legato all’IF3 (che ne impedisce l’accoppiamento con la sub-unità maggiore) e all’IF2 (che servirà per legare la sub-unità minore all’mRNA). L’insieme IF3-IF1ribosoma40S + IF5B-IF2- tRNAiMet forma il complesso di pre-inizio. Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 5 Nel frattempo, e indipendentemente, l’mRNA si lega all’IF4, un fattore di inizio formato da diverse subunità, di cui una, l’IF4E (cap binding protein= proteina che lega il cap) si lega e riconosce il cappuccio dell’mRNA, mentre l’altra, la IF4A, riconosce la coda poli-A. Il ruolo dell’IF4 è quello di verificare che entrambe le estremità dell’mRNA siano presenti ed intatte e, quindi, che l’mRNA sia idoneo. In seguito, l’IF4-mRNA si unisce al complesso di pre-inizio e forma il complesso di inizio. Alla formazione del complesso di inizio fa seguito il processo di scansione. In questa fase, il complesso di inizio, partendo dall’estremità 5’ dell’mRNA, scorre lungo il filamento fino ad arrivare alla tripletta AUG, che rappresenta il segnale di inizio traduzione. Il codone di inizio AUG è contenuto all’interno di una breve sequenza nucleotidica, detta sequenza di Kozak che viene riconosciuta dal complesso di inizio (e che corrisponde alla sequenza pre-inizio di Shine-Dalgarno dei procarioti). A questo punto, la subunità maggiore (60S) del ribosoma si libera dell’IF6 che lo teneva bloccato e gli impediva di legarsi alla subunità minore e si va ad unire alla subunità 40S, la quale, nel contempo, si libera di tutti i fattori di inizio (compreso l’IF1 che gli impediva di aggregarsi alla 60S). Allungamento (Elongation Factors EF) Dopo l’unione delle due sub-unità ribosomiali, un secondo tRNA (quello con l'anticodone corrispondente al codone successivo a quello di inizio AUG) si lega al sito A, assieme all’EF1-GPT (elongation factor +GTP = fattore di allungamento unito ad un GTP). EF1 unisce il tRNA al sito A e all’mRNA (sfruttando il GTP in suo possesso) ed effettua un controllo di qualità della corrispondenza codone-anticodone. Una volta riconosciuto il corretto appaiamento, l’EF1 si stacca dal tRNA. A questo punto, sul ribosoma ci sono due tRNA adiacenti (uno sul sito A e l’altro sul sito P) uniti ciascuno al proprio codone sull'mRNA. Tra i due aminoacidi contigui si forma un legame peptidico. A realizzare il legame è l’rRNA28S. L’energia necessaria per effettuare il legame peptidico è fornita dall’aminoacido attivato (a sua volta ricevuta al momento dell’attivazione da parte dell’aminoacil tRNA-sintetetasi). In seguito al legame peptidico, la metionina si trasferisce dal sito (P) del primo tRNA a quello (A) del secondo tRNA. Successivamente, il ribosoma avanza di una tripletta sull’mRNA. Nel fare ciò, sposta il primo tRNA nel sito E ed il secondo nel sito P, liberando, quindi, il sito A. Il fenomeno dell’allungamento è consentito da un altro fattore di allungamento (EF2-GTP ) e l’energia necessaria è fornita dall’idrolisi del secondo GTP in GDP. Quindi, un terzo tRNA unito all’EF1-GTP si porta nel sito A… si forma il legame peptidico tra il nuovo aminoacido ed il secondo … il ribosoma avanza di una tripletta … e il primo tRNA (che era collocato nel sito E) viene espulso dal ribosoma e va nel citosol mentre, il terzo tRNA passa dal sito P quello E … ed un nuovo tRNA-EF1-GTT approda nel sito A. L’intero processo prosegue fino a quando non è stata completata la lettura dell’mRNA. Termine e rilascio (Releasing Factors RF) La sintesi si arresta quando uno o più segnali consecutivi di stop (UGA, UAG, UAA) compaiono nel sito A. A questo punto subentra un fattore di rilascio (releasing factor) che ha affinità con i segnali di stop e che stacca la catena peptidica dal ribosoma. Il releasing factor non è altro che un tRNA che non lega alcun aminoacido e che induce l’rRNA28S (attraverso la la sua attività aminoacil-transferasi) a legare una molecola di acqua sul gruppo carbossilico dell’ultimo aminoacido della catena proteica. Il primo aminoacido (metionina) incorporato nella catena proteica non compare nella proteina finale perché esso viene asportato da un enzima subito dopo l’inizio della sintesi proteica. Dopo il distacco dell’mRNA, il ribosoma si dissocia nelle sue due unità costituenti (40S e 60S). Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 6 Una stessa molecola di mRNA viene solitamente letta da più ribosomi contemporaneamente, con conseguente produzione in serie di più catene proteiche. Il complesso mRNA e ribosomi si chiama polisoma. Modifiche post-traduzionali Dopo essere state sintetizzate, le proteine devono subire delle modifiche per diventare proteine mature in grado di svolgere le proprie funzioni. Le modifiche post-traduzionali possono essere: Chimiche avvengono nel RER. Le modifiche più importanti sono la N-glicosilazione, l’aggiunta di lipidi, la formazione di ponti disolfuro, la fosforilazione e il taglio proteico. Quest’ultimo è importante per rendere attive molte proteine. Infatti, di solito le proteine vengono prodotte in una forma inattiva. Un esempio di questo tipo è l’insulina che viene prodotta come pro-insulina e, poi, in seguito due successivi tagli proteolitici, si trasforma in insulina attiva. Conformazionali ( folding) Il processo di ripiegamento delle proteine porta alla formazione di strutture tridimensionali. Il ripiegamento può avvenire sia contemporaneamente alla traduzione (della sintesi proteica) che alla fine di questa. Soltanto una volta terminato il ripiegamento le proteine possono svolgere la loro funzione fisiologica. La funzione di una proteina (sia essa un enzima, un trasportatore, un recettore o una proteina strutturale) è resa possibile dalla sua struttura tridimensionale. Questo è il motivo per il quale il ripiegamento proteico ha una notevole importanza. Un cattivo ripiegamento delle proteine gioca un ruolo importante in svariate malattie quali l'encefalopatia spongiforme bovina, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, alcune varianti di fibrosi cistica (dove la perdita di un aminoacido porta ad un cattivo ripiegamento di una proteina-pompa del cloro e ad un suo cattivo funzionamento). La forma tridimensionale delle proteine non è casuale (vedi paradosso di Levinthal) ma dipende, in parte, dagli aminoacidi che la compongono (e, quindi, dai legami che si stabiliscono tra essi) e, in parte, da particolari proteine chiamate foldasi (dal termine inglese fold=piega) e chaperon molecolari. 1) Le foldasi comprendono essenzialmente due gruppi: le disolfuro-isomerasi (che crea i ponti disolfuro) e le peptidil prolil-isomerasi (che converte tutti i legami della prolina cis in trans). 2) I chaperon (o chaperones o Heat Schock Proteins - HSP) furono, in origine, descritte come proteine da shock termico (vedi esperimento della Drosofila e Hsp70). In realtà, vengono prodotte non solo in risposta a shock termico ma anche ad altri fattori ambientali (presenza di metalli pesanti, chemioterapici), stati patologici (infezioni, febbre, neoplasie) e fattori cellulari (per es. fattori di crescita). Tutti i chaperon hanno una struttura in comune, caratterizzata da una sequenza N-terminale di 450 aminoacidi, detta dominio ATPasico (col quale legano l’ATP che serve a fornire l’energia necessaria per ripiegare le proteine), ed una sequenza C-terminale di 200 aminoacidi, detta dominio di riconoscimento (col quale riconoscono e si legano alla proteina da ripiegare). I chaperon si legano ai siti idrofobi delle proteine per evitare che questi, per sfuggire all’acqua, si aggreghino tra loro o con siti idrofobi di altre proteine (provocando, in entrambi i casi, un non corretto ripiegamento della proteina). Ci sono due tipi di chaperon molecolari: Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 7 i chaperoni veri e propri (di piccole dimensioni – 200 KDa): si legano alla catena proteica non appena questa esce dal ribosoma. Le principali classi di chaperoni sono la Hsp70 e le Hsp90 (Hot schock proteins … 70 e 90 sta ad indicare il peso molecolare) e la clanexina. Gli chaperoni molecolari possono agire sia nel RER (per le proteine destinate alla via secretoria) che nel citoplasma (per le proteine destinate alla via citoplasmatica. le chaperonine (di grandi dimensioni 800 KDa), che si legano a proteine già completamente formate ma che hanno perso la propria struttura tridimensionale a causa di agenti denaturanti. Destino delle proteine La destinazione delle proteine viene decisa da segnali di indirizzamento, primari e secondari. Il segnale di indirizzamento primario viene espresso non appena la proteina inizia ad essere prodotta ed è letto da una ribonucleoproteina (composta da RNA-7SL e 6 proteine) detta particella di riconoscimento del segnale (SRP= signal recognize particle) che si lega in corrispondenza dell’uscita del tunnel ribosomiale. Il segnale di indirizzamento primario è costituito da: una regione N-terminale a carica positiva, una regione centrale idrofobica una regione polare adiacente al punto dove viene effettuato il taglio della sequenza segnale, per liberare la proteina matura. Una proteina neo-sintetizzata può contenere oppure non contenere il segnale di indirizzamento primario. In base a questo, la proteina seguirà due vie: 1. Via secretoria Se la proteina nascente ha il segnale di indirizzamento primario viene riconosciuta dall’SRP, la quale arresta temporaneamente la traduzione (per evitare che la proteina venga erroneamente rilasciata nel citosol e/o si ripieghi prima di essere trasferita nel reticolo endoplasmatico) e trascina il ribosoma sul RER, dove lo lega al traslocone; quindi il ribosoma porta a termine la traduzione. Il traslocone è un complesso proteico composto da parecchie componenti. In particolare: - un recettore SRP, che lega la molecola di SRP; - un recettore per il ribosoma, che serve per ancorare l'organulo al reticolo; - una proteina del poro che forma un canale idrofilico tramite cui la proteina in allungamento può entrare nel lume del reticolo; - un enzima peptidasi che taglia la sequenza segnale (che serviva solo per il riconoscimento e trasporto al reticolo endoplasmatico). Dal RER le proteine vengono, poi, veicolate verso l’apparato di Golgi e da qui verso le altre destinazioni (esterno, membrana citoplasmatica, lisosomi). Il tipo di destinazione viene deciso da segnali di indirizzamento secondario. Alcuni di questi segnali sono stati parzialmente identificati. Per Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 8 esempio, per inviare le proteine verso i lisosomi viene legato loro uno zucchero particolare (il mannosio 6-fosfato). 2. Via citoplasmatica Se la proteina nascente non ha il segnale non viene riconosciuta dalla SRP. Pertanto, la sintesi continua sui ribosomi liberi (cioè, non legati al RER) e la proteina risultante viene, poi, rilasciata nel citoplasma. Qui, in base ad altri segnali, verrà destinata nei vari siti (nucleo, mitocondri, perossisomi o citoplasma). Anche in questo caso sono stati individuati alcuni segnali di indirizzamento secondario. In particolare: - sequenze di aminoacidi basici, intervallate da brevi tratti di aminoacidi non basici,destinano le proteine verso il nucleo; - sequenze di aminoacidi basici (treonina e serina), non intervallate da altri aminoacidi, destinano le proteine verso i mitocondri. Distruzione delle proteine La vita media delle proteine varia da pochi minuti a parecchi giorni (ad esempio l’emoglobina ha una vita media di 120 giorni) … a tutta la vita dell’individuo (per esempio le proteine del cristallino dei vertebrati). Tutte le proteine vengono distrutte per 3 motivi: - evitare l’accumulo di quelle anormali - evitare l’accumulo di quelle normali ma divenute inutili - favorire il riciclo degli aminoacidi Le proteine possono essere distrutte in due modi: - distruzione lisosomiale… formazione di un autofagolisosoma e degradazione della proteina. - distruzione ubiquitina-dipendente: le proteine da distruggere vengono legate dalle ubiquitine (una piccola proteina formata da 70-80 aminoacidi) e, per questo, riconosciute dal proteosoma (un complesso enzimatico che individua la proteina legata dalle ubiquitine), il quale le distrugge. Tale processo è stato individuato, per la prima volta, nei reticolociti (precursori dei globuli rossi), che non contengono lisosomi. Codice genetico Il codice genetico è essenziale per il passaggio di informazioni da DNA all’RNA. Esso ha alcune caratteristiche molto importanti. 1. Il codice è a triplette: ogni tripletta di basi corrisponde ad un aminoacido. 2. Il codice non ha punteggiatura; i codoni sono letti consecutivamente. 3. Il codice non ha sovrapposizione: le basi sull’mRNA vengono lette per gruppi di 3 e in successione (es. AUGAAGUUGCGG può essere letto solo come AUG-AAG-UUG-CGG e non AU-GAA-GUU-GC-GG). 4. Il codice ha segnali di inizio e di fine che ne definiscono il quadro di lettura. Il segnale di inizio è quasi sempre rappresentato dalla tripletta AUG, raramente può essere utilizzata la tripletta GUG. Il segnale di fine è rappresentato da 3 codoni UAG, UGA, UAA. Questi ultimi sono detti codoni non-senso perché non codificano per alcun aminoacido (mentre, quelli codificanti sono detti codoni senso). 5. Il codice è quasi universale. Con poche eccezioni, tutti gli organismi condividono lo stesso linguaggio genetico. Alcune variazioni sono state trovate nei batteri, in alcuni protozoi, nelle alghe e nei mitocondri. Per esempio la tripletta UAG che nell’uomo rappresenta un segnale di stop, in alcuni protozoi ciliati essa codifica per l’aminoacido glutammina. 6. Il codice è degenerato (ridondante). Tranne due eccezioni, AUG (metionina) e UGG (triptofano), per ogni aminoacido è presente più di un codone. Questa molteplicità del codice è detta degenerazione del codice. Infatti, se due codoni hanno le prime due basi uguali e la terza è diversa, l’aminoacido codificato può sempre lo stesso. Un esempio è dato da CUU, CUC, CUA e CUG, tutti per leucina. La ridondanza rende il codice genetico meno vulnerabile alle mutazioni. 7. L’anticodone vacilla. Il vacillamento (o tentennamento o wobble) dell’anticodone consiste nella variabilità di appaiamento tra la 3a base del codone e la corrispondente 1a base dell’anticodone. I primi due appaiamenti (posizioni 1 e 2 sul codone) sono fissi e rispettano la regola della complementarietà (CG U-A), il terzo, invece, è oscillante cioè, può non rispettare la regola della complementarietà (per cui alla C può corrispondere anche la A o la U). Questo fenomeno è dovuto alla conformazione curva dell’anticodone che, in quanto tale, non consente il perfetto appaiamento di tutte e tre le basi. Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 9 In virtù del vacillamento, le cellule degli eucarioti non contengono 61 (64-3 segnali di stop=61) tRNA diversi ma solo 45-51. 8. Nella posizione 3 del codone si ritrovano spesso nucleotidi insoliti, come l’inosina (… e diversi altri). 9. Il codice genetico, per convenzione, è scritto nella forma in cui appare nell’mRNA. Biologia 13 – RNA, trascrizione e traduzione (parte 2) 10
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