Cover Page The handle http://hdl.handle.net/25202 holds

Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/25202 holds various files of this Leiden University
dissertation
Author: Pan, Qifang
Title: Metabolomic characteristics of Catharanthus roseus plants in time and space
Issue Date: 2014-04-16
Samenvatting
Samenvatting
173
Samenvatting
Catharanthus roseus is de afgelopen 40 jaar uitgebreid onderzocht van het
niveau van de genen tot aan dat van de metabolieten. Als de natuurlijke bron
van meer dan 130 verschillende terpenoidindolalkaloiden (TIA), waaronder de
de antitumor bisindolalkaloiden vinblastine en vincristine, is C. roseus van
groot farmaceutisch belang met een grote commerciële waarde. De biosynthese
van de TIA bestaat uit meerdere stappen die verspreid zijn over verschillende
typen van cellen en verschillende cellulaire compartimenten. De biosynthese is
strikt gereguleerd door endogene, ontwikkelings en omgevings factoren. In de
afgelopen jaren zijn verschillende omics technieken ontwikkeld zoals genomics,
transcriptomics, proteomics, en metabolomics, die gebruikt worden in systeem
biologische studies met als doel de biochemie van levende systemen te
ontrafelen en te beschrijven. Metabolomics omvat de methodes die het fenotype
zelf beschrijven, en van waaruit de link naar het genoom gemaakt kan worden
met behulp van proteomics en transcriptomics. Dus analyse methodes die alle
metabolieten kunnen meten kunnen ons helpen om meer inzicht te krijgen in
complexe biochemische systemen.
In dit proefschrift wordt eerst een overzicht gegeven van de beschikbare
kennis van de TIA biosynthese in C. roseus. Dit overzicht beschrijft de
biosyntheseweg en de individuele stappen; de lokalisatie van intermediairen en
enzymen; de genen; de rol van transport; transcriptiefactoren; strategieën voor
“metabolic engineering”; en de toepassing van NMR-gebaseerde metabolomics.
Onlangs zijn de laatste genen en enzymen in de MEP-secoiridoid biosynthese
geidentificeerd en daarmee is de architectuur van het eerste deel van de TIA
biosyntheseweg volledig in kaart gebracht. Vier cell types (epidermis, interne
floëem geassocieerde parenchymcellen, laticifers en idioblasten) en zes
verschillende intracellulaire celcompartimenten (plastide, chloroplast, vacuole,
nucleus, ER en cytosol) blijken betrokken te zijn in de TIA biosynthese.
Sommige TIA accumuleren alleen in bepaalde organen. Verschillende types van
transcriptiefactoren zijn betrokken bij de de regulatie van de TIA biosynthese,
zoals de inducers (b.v. ORCAs) en repressoren (zoals ZCTs en GBFs). De
klonering van de coderende genen en karakterisering van de biosynthetische
enzymen, transcriptiefactoren en transport eiwitten hebben de weg geopend
voor metabolic engineering van de TIA biosynthese, met als doel de productie
van TIA in verschillende systemen (celcultures, hairy roots en planten) te
verhogen. Echter genetische modificatie van de TIA biosynthese resulteerde
niet alleen in veranderingen in de accumulatie van TIA maar ook in complexe
veranderingen in het totale metabolisme. Om inzicht te krijgen in deze niet
voorziene veranderingen, werden verschillende experimenten uitgevoerd en met
metabolic profiling en metabolic fingerprinting verkregen data die werden
geanalyseerd met multivariate analyse werden deze in kaart gebracht. Verder
werd door middel van 13C-gelabelde precursors metabole flux analyse gemaakt.
Experimenten met C. roseus planten werden uitgevoerd om de stress response
en geanalyseerd met de omics technologieën om de crosstalk tussen
biosynthesewegen en het kanaliseren van metabole fluxen in kaart te brengen en
174
Samenvatting
daarmee de TIA biosynthese verder op te helderen en inzicht te krijgen in de
regulatie en de functie in de plant door deze systemische benadering.
Om de regulatie van de accumulatie van TIA in C. roseus in de 4
dimensies van ruimte en tijd beter te kunnen analyseren werd een HPLC
methode ontwikkeld en gevalideerd voor de simultane bepaling van acht TIA en
three precursors (Hoofdstuk 3). Deze methode is geschikt om het TIA profiel in
verschillende organen van de C. roseus plant te bepalen in verschillende stadia
van de ontwikkeling van de plant. Bladeren kunnen meer verschillende TIA
accumuleren dan andere delen van de plant, bovendien in een hogere
concentraties, met uitzondering van ajmalicine en serpentine, die vooral in de
wortels geaccumuleerd worden. Vinblastine kon alleen in de de bladeren
aangetoond worden, ook vindoline kon niet in de wortels aangetoond worden.
Het bisindolalkaloid anhydrovinblastine werd aangetoond in zowel de bloemen
als de bladeren, maar niet in de stengel of de wortels. De leeftijd van een blad is
ook een belangrijke factor voor de biosynthese en accumulatie van de TIA,
omdat de activiteit van verschillende enzymen gerelateerd is aan de leeftijd van
een blad (Murata et al. 2008). Wij vonden dat met het ouder worden van de
bladeren het gehalte aan mono-indolalkaloiden afneemt, terwijl het gehalte van
hun precursors tryptophan en loganin toeneemt. Het hoogste gehalte van
bisindolalkaloiden werd gevonden in de middelste groep van bladeren. De
gehaltes van de verschillende TIA hangt ook samen met het groeistadium van
de C. roseus plant. De gehaltes van vindoline, catharanthine en ajmalicine
nemen toe voor de bloei, maar nemen af gedurende de bloei, terwijl
anhydrovinblastine en vinblastine vooral accumuleren gedurende de bloei. De
bloei heeft geen effect op de gehaltes van serpentine en vindolinine.
Catharanthus roseus is niet alleen een belangrijke medicinale plant, maar
het is ook een zeer gewaardeerde sierplant vanwege zijn lange bloeiperiode en
de diversiteit van bloemkleuren. Voor de plantenveredeling is het interessant om
te onderzoeken of de metabole profielen van de verschillende organen (blad,
stengel, wortel) correleren met de metabolieten die verantwoordelijk zijn voor
de bloemkleur, om daarmee in een vroeg stadium voor de bloei al de
bloemkleur van nieuwe kruisingen te kunnen voorspellen. Bovendien kan een
vergelijking van de profielen van de metabolieten in de verschillende organen
informatie geven over mogelijke metabolische interacties tussen deze organen,
inclusief interacties van de TIA biosyntheseweg met andere biosynthesewegen.
1
HNMR spectroscopie gebaseerde profilering van metabolieten en multivariate
data analyse werden toegepast om de profielen in bladeren, stengels, wortels en
bloemen te meten en de metabolieten te identificeren in vier cultivars met
verschillende bloemkleuren (oranje, rose, paars en rood) (Hoofdstuk 4). Iedere
bloemkleur liet een specifiek profiel van metabolieten zien, waarin, onder
anderen, anthocyanen, flavonoiden, organische zuren en suikers geidentificeerd
werden. De verschillende organen laten ook andere profielen zien dan de
bloemen. Echter in de metabolomen van de bladeren, stengels en wortels
konden markers geidentificeerd worden die correleren met de bloemkleur. De
175
Samenvatting
metabolieten die betrokken zijn bij bepaalde bloemkleuren hangen mogelijk
samen met metabole interacties tussen de organen. Dit betekent voor de
plantenveredeling dat een specifieke kleur mogelijk al voorspelt kan worden
lang voor de bloei.
Jasmonate (JA) veroorzaakt majeure veranderingen in het metabolisme van
een plant, zoals bijvoorbeeld de TIA biosynthese in C. roseus plantencelcultures.
Het effect van de behandeling met JA op het metabolisme in verschillende
organen in verschillende fases van de groei van de C. roseus plant werd
onderzocht. Daarbij was met name de focus op de TIA biosynthese (Hoofdstuk
5). In C.roseus planten wordt voor de bloei het gehalte van TIA meer verhoogd
door JA, dan in bloeiende planten. Alhoewel sommige van de waargenomen
trends statistisch niet relevant zijn, werden vergelijkbare resultaten gevonden in
de tweede set van experimenten. De TIA biosynthese in bloemen, bladeren en
wortels vertoonde verschillende reacties op de elicitatie met JA. Het gehalte aan
JA in de plant was veel hoger voor de bloei. Geen verschillen werden gevonden
voor JA en MeJA elicitatie, wat erop wijst dat deze twee vormen van JA in de
plant dezelfde reactie oproepen. De resultaten zijn mogelijk van belang voor de
commerciele alkaloid productie in het veld, omdat jongere bladeren de hoogste
gehaltes hebben van de precursors voor de synthese van de dimere alkaloiden.
Metabolic engineering van C. roseus celcultures en hairy-root cultures
heeft niet geleid tot een productie van de bisindolalkaloiden. Deze alkaloiden
worden evenals een van de precursors, vindoline, alleen in de bladeren
geproduceerd en opgeslagen. Dus genetische modificatie van de hele plant is
noodzakelijk om mogelijk tot verhoogde bisindolalkaloid productie te komen.
In Hoofdstuk 6 wordt de NMR-spectroscopie gebaseerde metabolomics
beschreven van transgene C. roseus planten waarin of het regulatore eiwit
ORCA3 alleen (OR lijnen) of in combinatie met het TIA biosynthetische
enzyme geraniol 10-hydroxylase (G10H)(GO lijnen) tot overexpressie is
gebracht. ORCA3 overexpressie leidt tot een verhoogde niveaus van de
transcripten van anthranilate synthase (Asa), tryprophan decarboxylase (Tdc),
strictosidine synthase (Str) en desacetoxyvindoline-4-hydroxylase (D4h), maar
er werd geen effect gezien op de transcript niveaus van G10h en Myc2. Uit de
NMR metabolomics bleek dat ORCA3 and G10H overexpressie resulteerde in
verhoogde gehaltes van strictosidine, vindoline, catharanthine en ajmalicine,
maar weinig effect had op de gehaltes van anhydrovinblastine en vinblastine.
Verder bleek uit de multivariate analyse van de NMR-spectra dat in vergelijking
met de controles in zowel GO als OR lijnen er metabolome veranderingen
waren wat betreft aminozuren, organische zuren, suikers en fenylpropanoiden.
De verhoogde TIA biosynthese lijkt dus ook andere delen van het metabolisme
te beinvloeden in de transgene C. roseus planten, en met name de
fenylpropanoiden biosynthese.
In Hoofdstuk 7 wordt de analyse van de metabole fluxen in C. roseus
planten beschreven door middel van het voeden van [1- 13C]-gelabelde glucose.
De gelabelde suiker wordt efficient opgenomen door de wortels van de plant en
176
Samenvatting
wordt vandaar verspreid over de hele plant. De plant bereikt een soort “steady
state” isotopische staat in deze labeling experimenten. Deze methode is dus
bruikbaar om de flux in de biosynthese van verschillende eindproducten in een
meer systemische benadering te bestuderen. In combinatie met elicitatie lijkt de
13
C metabole flux analyse een goed model om de crosstalk tussen de complexe
biosynthesewegen in het metabole netwerk van een plant te bestuderen.
Perspectieven
De TIA biosynthese op zich is complex, maar is ook nog deel van een veel
groter en complexer metabool netwerk in de plant. Kloneren en karakteriseren
van structurele biosynthetische genen, de regulatie van de biosynthese door
transcriptie factoren, localisatie van de verschillende stapen in de biosynthese,
intra- en intercellulair transport van intermediairen, en controle van metabole
fluxen bij vertakkingen in biosynthesewege vragen nog veel studie om
uiteindelijk tot rationele genetische modificaties te komen die leiden tot
verhoogde productie van de gewenste TIA. Een combinatie van de omics
gereedschappen, biochemie, fytochemie en plantenfysiologie is noodzakelijk
om genoemde aspecten te onderzoeken. Metabolic profiling/fingerprinting
alleen zijn niet voldoende, ook de flux analyse is noodzakelijk om de
architectuur en regulatie van de TIA biosynthese volledig in kaart te brengen.
Om de TIA biosynthese beter te begrijpen is een systeem biologische
benadering noodzakelijk, dat wil zeggen studies op het niveau van de levende
cel, orgaan en plant. Om het systeem te begrijpen moeten we alle struturele
genen kennen, maar ook processen zoals:
Transport, wat inhoudt fysisch transport door diffusie in waterige
oplossing en door membranen; actief en selectief transport door
(sub)cellulaire membranen via transporter eiwitten in twee richtingen;
en transport via de vaten van de bladeren naar de wortels en
omgekeerd.
De beschikbaarheid van co-factoren and energie (ATP) op de plaats
van de biosynthese.
Met andere woorden we moeten de logistiek van de cel als fabriek
begrijpen, wat meer is dan de betrokken genen kennen. Biosynthese vereist dat
alles in de noodzakelijke hoeveelheid op het juiste ogenblik op de juiste plaats
aanwezig is. Systeem biologie moet de inzichten verschaffen voor synthetische
biologie die, zo mogelijk, een strategie ontwikkelt om de celfabriek te
verbouwen tot een nog efficienter productiesysteem.
177
Samenvatting
178

Download Report