I m - Radboud Repository

PDF hosted at the Radboud Repository of the Radboud University
Nijmegen
The following full text is a publisher's version.
For additional information about this publication click this link.
http://hdl.handle.net/2066/23810
Please be advised that this information was generated on 2015-01-24 and may be subject to
change.
Oxidiuivu phosphmvkuinn en/.vmes in platelets and cel) lines
Hermann S c h a f e r 1
Herman Bondage*
Wim Ruitenheek"
Kathy Pfeiffer1
Stefan Rotter1
C'hrlstof Rother1
Andrea Bottcher-Purkl1
Kdgar I.odemann1
Electrophoretic separation of multiprotein complexes
from blood platelets and cell lines: Technique for the
analysis of diseases with defects in oxidative
phosphorylation
C entrum der Biologisehen ('hemic,
I 'niv ersitatsklinikum Frankfurt,
(iermany
d e p a r tm e n t of Pediatries,
University Hospital Nijmegen,
The Netherlands
V
A two-dimensional electrophoretic technique combining blue native polyacry
lamide gel electrophoresis (BN-PAGE) with Tricine sodium dodecyl sulfate
(S D v S )-P A (îH was previously used for the localization of oxidative phosphoryl
ation (OXPHOS) delects in hum an diseases starting from biopsy or autopsy
tissues (Schagger, IL, Electrophoresis 1995, 16, 763—770). In the present work
the technique was extended for the resolution of OXPHOS enzymes from
platelets and tissue-cultured cells. Silver staining is required to detect the pro
tein subunits o f OXPHOS complexes in two-dimensional gels. However, the
use of cultured cells has major implications for patients with mitochondrial
encephalomyopathies since it will reduce the num ber o f invasive muscle biop
sies. The ease of isolating the platelet m em brane glycoprotein complex from a
few milliliters o f blood makes it possible to analyze this complex and its pro
tein subunits in bleeding disorders like G lanzm ann’s throm basthenia.
1 Introduction
In the present work a special type o f two-dimensional
electrophoresis, com bining blue native polyacrylamide
gel electrophoresis (BN-PAGH) in the first dimension
with Trieine%Sl)S-PAtiP. in the second dimension, was
used. Major principles of BN-PAtJH are as follows:
M em brane proteins are solubilized from biological m em
branes by neutral detergents. Coomassie blue dye is
added to the cathode buffer and to the protein solution
before it is applied to an aerylamide gradient gel buff
ered at pH 7. Negatively charged Coomassie dye binds to
hydrophobic protein surfaces, keeps m em brane proteins
soluble in the detergent-free gel, drags proteins to the
anode, and makes native proteins visible during the run.
Protein migration stops when a limiting pore si/e o f the
gradient get is reached. Therefore, a separation of pro
teins according to their molecular masses is achieved.
Trieine-SD S-PA G P, used in the second dimension, then
resolves the subunits o f protein complexes.
This two-dim ensional (2-D) technique has been used for
the
quantification
of
oxidative
phosphorylation
(O X PH O S) complexes in Parkinson's disease [1], in
mitochondrial encephalom yopathies (2j, and for the
detection o f specific complex V deficiencies in
A l/h e im e r’s disease (3|. All these studies used tissue
specimens from biopsies (skeletal muscle) and autopsies
(brain, liver, heart). Any technique that allows the use o f
patient cell lines,
skin fibroblasts and lymphoblasts,
or the use of the platelet fraction from blood would be
of great benefit lor patients and researchers because less
muscle biopsies would be required, and sufficient
sample would be available for the analysis o f the molect »rrtspundertci4; 1*1 > Mr.
11. Schiigger, / c n i r u m
d e r Biuiogisdicn
Utmvt'ttf'it'iMmiKum ï't.mMmi. rueoilor-Siern-Kai 7, Havis
M i,
i t a a k l u f l a m M um , t î e r n w n v (Pax:
taium
Direct application o f the electrophoretic technique devel
oped for skeletal muscle to cultured celts or blood plate
lets is problematic because these cells have an approxi
mately tenfold lower mitochondrial content compared to
skeletal muscle. This would lead to overloading o f gels
and smearing of protein bands. On the other hand, a p re
ceding preparation o f mitochondria from cells is also
problematic beeausc the yields of mitochondria obtained
by conventional homogenization-ecntrifugation proce
dures can vary considerably* Variations in protein q u a n ti
ties would then lead to variations in detergent/protein
ratios used for m em brane protein extraction, and to co n
siderable variations in the performance o f 2-D gels. The
major problem to be solved therefore was the develop
m ent of a protocol for the preparation o f m itochondria
from cells with reproducible yield.
2 Materials and Methods
2.1 Cell lines
Murine L-929 fibroblasts, hum an FL am nion cells, H eL a
cervix carcinoma epithelial cells and primary fibroblasts
from healthy individuals and from one patient with
cytochrome oxidase deficiency were grown in Eagle’s
minimal essential medium in the presence of fetal calf
serum and penicillin/streptomycin. M urine N IH /3 T 3
fibroblasts and human MoIt-4 T-cell lymphoblasts were
grown in RPMI 1640 m edium with fetal calf serum and
penicillin/streptomycin.
2,2 Two-dimensional electrophoresis
2.2.1 Preparation of a platelet fraction from blood
Keywords: (Mue imiivc e le c t ro p h o re s is / (nicgrins / Mitochondrial
c m c p h . ï l u m v M j u ü u / Pc.»^»m s y n d r o m e / IMatclci m e m b r a n e ylyeoprotein c u » ! | t t c \
mMH,
ular basis of the defect. The enzymatic analysis of
OXPHOS enzymes in fibroblast cell lines and in plate
lets from patients with encephalomyopathy, Parkinson’s
or A lzheim er’s disease, showed already that OXPHOS
defects are also often detectable in fibroblasts [4, 5] and
platelets [6, 7],
(>*) 6301 6l)7l))
Nonstandard ttbhrciUttons: UN-PACîK, Mue native PAC H-.; O X PH O S,
W U
709
W«mhciiu, 1
NaVEDTA (1 mg/mL) or NaVcitrate (3.8 mg/mL) was
added to fresh hum an blood from tenfold concentrated
0l73'(m35/%/(U(M-0:Ul) SUU10+.25/0
tp f-
%
I %
■:f
%%I
-'I-
I
f
.' '
%
U.
-;i,
iW'3*
i
I
&
1 1
-I
7j;
,4 ;
~k
'A ,<>>,
y ; ,<-/
A'
Í&.
i I:
4
I
••■£:
1^:
':-i;:
--Äif/
' í ¡::
I;
f%
«
&M
m
'f
"É
:5!
'h
v . y jj
•i*'
% I
:•?;■;
>:;
m:
I # i!
'i<-
•*
é
ÌJ
!#
.# p : .# %
t §
vfr.
r íá ä
't e
M
ifJÍ
# €
€ i
yi:
f mm
•>%•
V
:^l
•#
i f
I
%:
:| i i ;
'f t.
I
I
•*1
I
I II
% v .#
\:l:.
%
Vi
fe
I
1
I
'4,1: I
M
•.N!¡.
$
•V/èì . w
I
#■
c .
• P-
I
%
'1
ill
;»
>/
'É :
%
I
«
>
I
i
■t% 1
%
#
I
I S
:vii:
!
K '/ h
%
t
W
f l;
i) 3
#
%
É
¡ I
S
11
*I■
'
!»
s
' % i¿ ;
•m
m
4
#
.ft!
■S'
I
t
'5?.
/.-•
I
#
r/
§
I :
% M í -1
I
%
m
Ti.
ass
■&■
k(o
i
I
n - » %
', 1
‘
%i.
•U
$
1
£
#
I
I
'S*
%
Hi
',C‘
V.■V>;: v?>
%
■*v
1
| f
%
%
f
m-
■ä■c''- 'ty,\
é
., - A I
.
W >
É
%
11
I
ti<:
I
?;i
í
warn
m
wi'
-'O.
t
:->it
:# Y%
if!;; •Ä
'/,v7:
C<:
0
->/
I
:è>/
:%k-
w
w
1
f
%
f
i
I
• !! •':ri*'.
‘ ‘Í/
:^ f|!
I
'.'VI
I
á
%
1 ISvf:
w y---'■ é -% .
%K iS Ì i. #
:T>J
%
f
I
% i
4
V%
»•
1
%
fÍ
i
»
■<il
^ íü ,
¿ fe
%
» #
:I
li
.%': x-V
*
:.\-<
^ r;
i f'
^r,
%
v-,!r
% , : i,
f
ll
1
«
4%
a
■it-
.
$:■
■-•-I’:
•5>v-
:S:
%
%
•y.* •
%
n>
i* 1
v’rT-
•Jif; .-Oj
I
k
Éf
I
%
I
m
S5Ä
I
r/-
IÜ ;
';k
m m
1
I
4
>&/
IÍ!
%
Vf/
i nft ,
%
m
.'s i
4 f#
%
iyi-.r.
'%■
m
i
C'í:
»
i
M
1 ft
•I
:fe
W ? k
1
#
w
f
§
isfc
#
I
s
'm
t
%
% ..
a
1
:,' t
•^fe:
'/
I
É
ijf
:///
I
'Si-
I
-Í1
■:
>/.
■i
■ fk .
t
W
i^:
j
::S;
■A
:;!ƒ
f
III
%
:Í
%
i
¿Sì
'm
V /í ::
%
! '
#
'A/.
f
I:
1
!i ^ i ;
iiv'
i!
:
I
f
ib
;w
-tór-.
1
1
((fe.
€ , : i:
»I
•#
»:•
I ,1
*
«
:ñ
m
%
■ih .vj:
!
4
Vy.
I
m
M
•$ I I 1-:wm É "1
: : il
i
>’ i
■.',•;■'-ac-
I
•$
i??
: -v! : - . \ c >
Xi
>íí.
f-%
1 $1
I1;
i
íW é -
.Vi
Y%
i
■
Mm -
1.
f
1 1
ii: v; x
I
m
&
I%#
I % ii% I
f ,
%.
''I
11■
'/;
.■M;
:r<-.
mI
^
■Yi:
m
1
%
i M
n
V /-
'1
%
■% í Í
:0
,v4%
.
S'
'M fj
4
$
%>/
<%
-r¿- ••£ v - %
■*
■YU
.&>
//.
■ * »
ni?
I
%
%
f
.... I,„
% (/
%
%
I
a
,1!
J &
?§
II
I
%
m
i
f
'./j
f
t
&
%
%
m
f
0-.
é fe
» I
I
m
i
%
■s,
#
'■¿\
•ÌH
%
...o
%
%
f
a;
1
I
f
m
m
•V;-
«•
1
•t
i '
È
i': ; / '
%
f
%
■%
'■ ft
Í!
%
i. ; : .
I
íríj
'4
;¡¡¿
i
1
I
l , .i v
%
:f
■
^ f%
m r
m
f
W Ä
|i
c
#
%
Í f * 1 1 1,1 I: I
'
©
| Ä
% 1 4 '- .-V.
'M
S
m
i
%
r........S f::i :t %
:
y :;
i
0
%#■
Ä:
■it
#
'If;
:l |
#
%:%. É
f
i
f
%
> i
#
%
f
%
%
M
I
#
?
é
$!
H
%, l
i
I
$
I
% : |:|'>'i-
:i
:fe -# r
'f
-vi.::.
■«j
-4 'h<
" |v |; : ; |
1' , I
« 1 % ! .11 1
#
yji
1 %
%
I f
i
:í¡
t
%
'M
'-'A.
d
"
VMM?;. - W0 M
%
.■'s
m
•»,'
1
I
I
I I
4. /fe
I
i
•%*i #
r%
%IT
Í
.
m
%
M
J v.'rV
■W ;
%
1 1 %
1 1 1
f « i
% €®
1 1
w % 4 #
i
I
I
i
f f
% I
'• %
%
f w%
% 1 wvu
r.\ ^ : •‘Kj
-■j:;
T/i’..
M
%
1
v-
%f;
vXfc
m
vjil:
■y¿.
I
I
%
I!
mi
?Z-
-k
IT I
H
I
$>.
?
è
*v «
.
:&: -m
<?;
%:
y . '1
1 1
%
)';■
I1%m
f :M
,Si
II
M
t;
I %: I 1
# .. . 0 4 .&
“
;p . . .
'f . 1
W■ j %
i V ÍS
: . i1’-: I I i Ä
1
I .f
1
W i i %>
f
m
« I
m%
..,
I t
;I
■%
A ;,
I"*** w
% V:
4,
yM.<.
1,1
.....
¥
li 1 1
i
.'%
'% 'ö
*
w
$
-
■
0 h
% M
1.
1
•>
ü
:
i!
i
/rt/
f; ^
m
f f f P %Pé í !
•W
!#:
*
i
f
«
Ä
!# ’
1
m
Ill
Í? %%
'I f ;
:P<i;
it% iif' II
-p■.•it:
i
i
I
''V:
l?á
ái
á
»
m¡®
f. i f m
f
;.V^
•^l!
^S! •$;
■H
m
¡#:
m m
■'m
'fef
l P
r # ti
'|k'. 'v’.í
■i ^
i-:;.-
1, p
if i
l
I
,
é m
É
á!” 4 i
I
m
.#
® 1
'r / ;
I
- fe ;
% Sif if
-I
B
■ m
i
l
m,
:W
■A
l
;>í
M
i)A
#
»
,-N
/ÍJ
. ,.';/ífÍ
i f:''f
:llÄ:
m m
irn
:'/{>]
F?:=l
i
I
:W
::C¿'
..
i #m'1
•
vi i
mm<ú- '^
M m
4
»á
•«í;.
!< J
■W
•I
•-•
íí% *
'% M ’
(è
É %I
f
:r&
•/Sfc':
y
"%È I
I I
Ií i
t
?:•
im m
I
f%
i',1-:'S í-
%J§’
§§ß^
■fe
I i
WM
• V i!
Í$M::^,y M
i
*«%á
'iífiWfa
%
I ß ß wí m :
m
í'M ■
I.'*# i P m
‘m .
■
# 1
i i
t.- l
y \x < o ;;,¿
È’
W %?4 f!
-üí!
%, #:w .#i
I
vr-!
*
i i
.*.'.::
iß
i
■'
;'Xy.
M.
W % m
»
I
&
, i
:0 .
é i € f l >%•
J
I Ä
PÀ ‘■Str.
I
m
..
f u
fe
m %4■ ^ '■ «IA ' I I■■ ' ■y<"B
• '*
•HSÜ.
#
W % W %
f l
'$ C -
'íí < :
1 1
á ' i ; ’: '-}
I
IM *
M
W W
tftf.r y .
II
t
%
I
í
11
i,
I# t4 f »i: f :!^: ii %, i
Si:
»
I
:^i
ill
% 1 1 »
* È É
»
'Sé É il %
fe#
'®v, ..
7;
•á
ii
i
■ « v ^ .
m
I
.#• /#%•
I
f || I
• W .:%
f
1 1
■%ii; ifc: . /É
- '¿ f e
%
w
#
'■*
■y.r
■'-¡J
%
&Ì
;-y.'
■•ítí!
I
%
1 .1
fé l
■%S
7^
i
■'$.
%
l
l
«
«
#
I V
'■ k
! ,!
Í f ::” « '
i■¡ti
® M' -■
i
^i i i I
É l
>Vj
il l
;Sív
■stf-:
&
:/4 :i¡%
1 3« I
1 1 »
f
*
«
íf
A'fáy1.!
I
I
%
§
ll
'.íiií'
y%
■
$
vé M1 | f
VÀ
%
■,'f>
%
à
V# % l i I t i
I III
I I l i l 'Ü1 á1 ,
■i¿í|I
ll:
¿VÁ'
ft
v;r
i.*
.'ci'
'6-'^i:
1
:€
m - M
9}
i n i i» n
I
¿sí y/v.
á
1 .1
w h IÍ%
|
:
%'M
nm
■;W¡
}0!%
If. éI. w
'% í
4 ß i
i.
i: ;
!<■■
Ä
:
m
W m
%
:jb--
J«í!
iÄI
;
M M %■$ m
.....
"é
>¿.
'/<■,
it
Íí
M
%
» ! i i i>wí
v
•X ''- •''•i.
»
i f
$& ■
W
W%. i
v;
t i '
# 4.
^v:^' ''á
% iív % W
I
:É È
f %: Í i! ,íi
i’; ;- vI I%, t
p
i
»
%;
m
it
....
‘k
■%
§ i :r
I
rii ii i %
Vyvvv.'
'Jj:
If
'«i
t :
m
I i
v:fi : é % #
•
«
%
4 f.
XÍ)
I
1 %
;ii;
1' I w é
i
:'i: IMi
1!
È
:f ¡! i
Ifa.
W:
f N
i .i i k
■’j<-
■v;:
vV.
f
i f If fm
1 ft li I p i % f i
é %• i J
!É#i
.f;
Vili
vVfi;
V5;
m
f!
•'•y'
v^r-
I
■■m
..
i
■If
.VÜ-
I I » % i l W%
i
ll"
%£i
i$ x t
M
>Y/i-
I
•r^;
•fíí yp:. •1•':••%
y:fí I:;s
,fl
.Í6!
W i::I l ü
i
t
^
1Ä
, %
ft'
É ii i
;l!% 7
€ É § .
■
;:W:
&¡á I
.................
t!M
W f% I f
1:
i
%
■í*
%
ié
A
f 111
■
■:■
^’<(’■
■■’■-.<
•'-r
W ’-’
'/k .
I
i#
íiífiiK !
€.#
f'f%
I #
é; á i í I I
1
■a:
;Ä
•if 1
Ite
'f i
II M
!m
■■%
■%
# iri I
I I I 4 «#
%
■Ss
$
É
7ÌV.VJÌ
■w
y-
m
■W.
&%%
« 1
% '%k
1
m
■/k
i j P
i>; Ä1
. Ä ;
f I
ti
m:; i^:
' ':,.J:V!''
■;:4V '
■ f/#
-a i .■
m :m
¥%
Í I
#
•Irii;V-';;//:•
:7r
I «i #
f
...
fi 'Mr.
%: 4
■';/
%>
%
i4
,a<
\r| I
Ill
I
4
':'#
i
;É&-
m
i
■/.
l %
A/’'.
;|
V
r ww i*'/
I :|
I
*"**■ :í- % é
lili
-1
i
W;
J
m
illlu r
'. f e :
*
é .%
I!
1
i
1 ,1
■r ■%
’Kn . , . . . :'''•
.4 '
M
i
%
I l I ^ ^%
$
% # • :S * A
%
1
> .
f l l %é l t-Mi m
■¿fi- %
l í ^ - ^ íím
é
«y' '^í
I
f
I f t % %
i
•%!:Ä
•V¿¡
I Iv^'I s
I ;i i f 1* 1
’.Ä
^4
1V
I
m
• :: %
"
' ' ü
Ì& %
%
m m ® €
V;fi
ó ir :
y¡’,'::
'•
r
i
M
..
% #
I f e J :i|!
I
I zM
®
# ^f e í -- I-%’
m
W §M«
»
• íN ¡!
■ m
. 'í ? :
..,
#%
4
.,
Ä i f f I: :|ll
t" ##% f H
% # 'É
il
à
|: $. I I
■I I
i f
I
I
I
f
r
w
I i.
# a
’% # É " É ' i
# ;
w
i; p
i , , » *1
P
% •$
■&
i a
'•{}
m
■■:■
• ;í,
í-ifj
y,-
^ 1
=íg! ’Si
feS '
I
: ^ ! ?,'
%%.W:
'Wfo aS!.
t
%p %:g S 1 f {# :f
!
^r^m 1 1
f
m
I i
SÄ
ÍÍ! iáli •#
i
I v n
I II
y *
I
S ;.
III
%%
1
ty / -
&
•'j:i‘
• í:
'•
.a
I
|f W
1 f
% .#
1
.i
1
:í>il
%.
I I I
i
fe i
vij”i;
J
Ä M I
1 1
w
!í>
y
I «
M
% '.■
%®
S: ■
». Ü
«
'Kjj'- ;# ? > %
'jij;
:i i i r t
f
-:4
r
iiNi
' vM <%
(è %ííi
• íí
^ ■ »'
i
f
s
X l ’.
»
1 (1
1
&
Ii
•'A
r
»
f
r *
i
i
•!í;: :'í
:®
im
w
i4'% ú;
!
i
I;
•^K:M
fAi l-ii-i
w
:P
M
*
}}í\
..........
%
* 1 1
M
I
•.v¿
I i|
I , Í ■«(■
^ Ú ^
i
%
■M;
• íy
.¿m w ^ m m
'"■■
k'W « ; : í . iiíÉ &
'1
■'■ñ
% I
6
.'Í V
íA
;#
l
' f i
m
É MIM Mm MM '%¡
1,0.i:%CS# ú
.i;:
iftIL# i
#' %
Ä :
,;grf Vi)' /tó
:' Ä | % :'i' ®
:%|
Is. f
Ä
-' t e
•£ ■:#%
i
l
1
.
■'&'■
i
■édi i
■f^i
'^:í
H i.it,
'- '
ä
Ó V i’. ' J -'::r¿ :.
•
7^: * 1 8
l
i
l
a *
ß
■M
I
i
,i
i
4
%
U
í:
W
.....
.>■
Ai
IF!I ÌÌII..Ì
ii Ä
^11i
1
i
m
t
i
W -W " f l
r
è$í-B % í l ;
m
m
■?ä
|
rnM.
:
i i
■ ■ 'W
' S :i i S i J -
-
;t .
|
4
f
f
i
l
i
»
.
% á
I
f
5 i
y í W \ ¡i®
1
1
1
n
* 'ífei
I
»
1
m
V - : ; .: ; V :V
# J í f t . »t Ü ¡ %
m
%r
[,,f
i i
til
7, : '
%
V
ÍÉ:. iSM É 4
*
fife
Iflf 3
.Ü j>
tir
¡i M
i
% r:
l
i
l
l
f
i
i
i
l-íf"
V'í!.
:5-j
i i % »% #%
i
f
.
$ i
IM &
'/■A
;&
f »
:íj: :Í v#
«f
Í.M
•!ÍÍí
4¡1
%
'
p
iiir.
1 .
.iÄ .Ä i:
i i 1®
1
W;
f
S f
á 'i .
t
a
i
■W'0
; |||
írff.
I :1Ii^r.
l í E
I
u ;
■ 'r ii
I l i 1
1 P
« É
W% 1 1 f
% s i a , i
iV .
l . i l i l l f
i. 1 .
I'
f
« . % J¿¡¡
W M
* I
'<f&'■#
# 'É í
1
1
f 1Ä
# %
, .
- Ä
. .. .. ..
,
1
.
™
1 Siili
0
^
W I
i *
:
■•
■■'■
■
® "';P ; Ä
■'■■
■■■'■
&
:?: 'h té M m
i . ' it e
^iÄ!
l f t l
1
1
É¡ W¡ %
,.
•írl
^i
i'% I
I ¡ P
% # É .f
l
:>¿¡i
■&
Vìi
:?'>/
.w
I
ví
i ¡ 11%
1
Ä s
íSÉi#
I
I
m
•i:í'
:#
'-V;
I II
>«•
'1
m
•
I
! 1 : &
W
I
il%
Y A
'S
# %
l í sl %
1
'
• f 'r v .
, : r
f
i .i I
t
yyy&
mm
i
i
i
Ä h
%i..
iÄ
;áíS
,, "$■ /;
í¡®!': #
i
;*■
É
rirV í
y,
I
;Í%
I:
if
m
W:
n
Ii
ii
f
i
i
»
f
i
f
i
■
i
#
1 1 v..f..li
f iA-:
M
-É
■i
,
I f'M
f
%
■ itti
l
i|
:Ä ; :Ä : i t i l iW -É i
'Ä % . # Ä
Ul:
&!
l i ! %: ;| É
Íí#
■i
% I
% $%
'I
■!:■.'Ì.':Ì S
m
1 J ll;
'S
i I %# i II 11Ü
1
A fh
: ‘?a
%
II«
m
é
M
I fl
i^Ü
. '^ f t v - Ä W
- í f t
■■■&
f
I
i
■.#: if'
Wá
• .':ML
^
Mi
AAi'.Ùi
/ / a - :.y ,
'■%; '
?!§: y-l-f :/y*.
'%A ■■■:>. ■
W M : íé^M-MÉ ¡á
;•#■
i
W
■.%< y /'
vW
t
I «iifci
ii
9
*%1 #
'MMíít W íí-?Ä
* .n ^ íí.
f.
1
% À
•■ tò !
I
!i
f % m
!# % !■
^
:I
i
I
t
. 1 ./ ■ íf/y ■< &
v;.^:
;:^
•y.V:.
# !'
• ij;
>^p:" ' 1 :
á
f w
I
%
A:
•fa-
:::,:•;: f/‘!¿
Ií
-rfe
»
%
f
f
!li
I
Ä
yy :!&.
» I
*y É
Ivliìi
l i
¡a s
• ;s > ;
■f
^
*'>!
, 'V '
f ó :
fri
m0
W
i A
:
■lii
w
■tyym
Zk
.
W
M-M
A r'
#
fcíísti
:0
4
%
f V
i^
r>
li
M .
W•\iy.'
M
c
•:.ri
.- .
'Í & . . .
Vi': i#i::
v
ll
m
1
.
#
• O ì? ::
m
I f
f
:':i
m
'r%. :Ä;'
m
m
#í I
li I
II
m
m
i
ài:
li
flj
t
l
sif
Ä
t■/^;
ill I
f 5f '% ' I t l
'1 | : i i i | È
^';V#
I: Äil
■v„
■f" '1 , 1
% M '4 È %
f
■:W
;% v
■ f à
>^r
I f II.
• ;^ ,C :
f t -
'STV.'
[■:■■ Í J s
4 1
M
I
J
i
Íí
W
■Ér%>Z 1 :í¡íÍ
H
I l rS§ %
ì
V |V
»
B
yi
a
?íf
a
fe : Vt:V;^y.
r n .
I
v fi
" '1
:4M
i
ii
If
''■&;■
^4 l
WW'
fi
#
Wj
ii
% 1
ifm
.
;
f
■
i
W
1 $
if
%
1
•''y.
:% i € .11
%I
:H 0 ' sò
i# %
■■i.&
I I ii# ^f ■■*
0
1
//'
I Ä
fr* Ì
i
I
/? r r .
V AH
I
i,,il
B'i
M
Í1S;
A ¿ if:
I
I
^!lr
I
il
a
w
?ìf
•#
1
i i p
I
8
i
li
:-<S.
II
kl
ü %•A
‘. :${ i:$ri ■?&
:',y.
IV^!' I t » w n
y^h1
.•Iti-
-¿i
I ;si
I'ví i%
'I
■S>S
-1
f% I
I
iw
fl
%
I « 1
I 4
% I È
M
M v|i.
% ;#
m
fW
?>?
ii^ i
$ lii
■m
■yy.:
m
n
ll
• i r '. ',
í í ü
■?Á
I I /A/y.
. ■’Ai
f-Üi . ;.
v.i; •••$:. -fii;
. I; r
■ ƒ /¡ ,-
y '; : r
f
y 4 % :W %
Ñ M # M i
:
4 . % i#0 m '
%
1
: 'J > ;
’^ J y -
':■’ / ,
: .
m
íí
■
■
■
0
%
:v-y- ■•’ií
!l/i:
7¿
I
■ i-';í:
m
.....
% yy,
w ih,:è
V rV .
%
,
[íí'
vK
■>'&
I. I
Is? ;
•'fei?.
■I
f f
f
.^1
Mr- :;.,,iä
0
’/ / I :
. ?m #m
.;i Ä %>
ppj
>;}y y.
<
■ xkr '4
I
i/:ír
:M
:§
w
v i ; ':
• f^ í:
:v ¡<
< \!V :
’¿ V
% ■
ym
íí: .«• i^:
:-'
á I Í :I J Í % J llf e V
*r
■%
è^1
li
m .
I
’M
’. 1
All
il I
}
b
. . . v%,vl'
..............
:É
I
i«?
p mm M
« i
1
» fl
i
>3f e » M É.
fi
'í í '
f
f
1
•Nil
WS; :^íi
m
I1 ,f
r # |¡
-V .V S !
y'j
iV
>
Y//,'
: !: % ¡
w
W
M
Ä
M F
m
: * :
W&
¡
(h j:-
H í-
fe*
w
«
»
t i
yy0 % % i
m .i l
7
i
1
t
M
^ is ..
í
S 'í¿ .
V '
t
y
1y
v ijfc
• o } :* -
,,,|
i
■W'w
í
>
#
i; ^
Sk<
á te
f Wm íM M
# %
€
ili :.f
.§:
ii 'i .i
I 'M
r’
y ,
I I
í
,:
'1
i
1
.S i>
«
üi
i é ^
?i. m M
®
rV
1
;í'í:
»; f h p t
-È: ;V|||
«
r í.
ii
•a!
i # % í % : :| : i # % Ä
%
i
V
f•% y//-• ^
& M ’
y$ é y$ :É tym :é wI r
wi
:Í 4 ' i '# i . #• %'#■
% # f l §
5®
mi
'íIí^í
■'yj;\
Ilíf! v /r.
:g
| i n
»
: < >
gl ig
¡t
m
*;<;
.'./
I :Mm$*
••!•'
V:V-
'if ífeí:t #;í.#;'áí%
m
yy.
0
ili , l i i i i
; k
ll
: í;.v
•%
y ) / y y f g -
'yy
Ii
W :
S; | » : ■i*; Wßfe
f 1 i
¡;¡f %
:á'
k-.i# % ■mm:m W'
rí
5
-iftíi
X í-
A/;\\
M i :Ai'
1#
ÍÍ
%
V jíj
.,- y
- ;V ;J '
§ # «
■■C-i'i:'
■>y.
■
1
ir^í íj■
f
:ñií
'Vtóii•i#
i
1 1
: '; f
~:<y
Y-.
i
y
s - i 'i
í'■'/'■l
. m
■
•:&.
■fiéf:
f ■W
%-
rié.r
.|f;i i iii €
•‘ I
.
I
}fü.yy)JA-
/y ^ y y ^
::y,
y - :'
w yfc/'&Yfy •%- yy& w # w ';é ty yp
í , i
W
y
m
M
i
M
m
■ ' A ; - , .
r,<--ir. i v
- j 'i
1
»
M í il
1
m
% .
'i f
'M
.
•'.:'.S':::.: • M Sy,
w
»I
'i-.f:
M '
1 :# ' *
É r |
i
|% r
II
IÄ
i
YMi it
W ’
wm
■1
)<!' Ar.v.
'%■■
f
f / %
M
#
1
%
:V /y .
il
■V(i
I
I
l | f .
fe
• ;W ;
•V M |
r^
"A/A
..
&I. :C^;. •■
sh ;
'
iy ::
'm
?#
f
l
ft
.i i É 'M!%Yí'-ír
Si i
É%
il
%
■5í
•/,
.v/y
%
f
Ii
iy.'A'YÁiA
!U :
AA;-
/ir
&ank's # #
m
'W Í
%>;.y
;;1 v
w
í5': 'U:M
y . '. v -
m
■M. ■'/}) í§»■.■^1’■' &
Ai
'
:
m
l l
'■ f/yi'y;.
i!;
I
yy-A.
■m:
■ f i
•¿¿ite:yy
t e
■■y
7.
W I I I
M■% %
m
1 1
V;
rs ;:
■.v-
■■'a'a0Á
Ü^i :íií
Tt
ti-V
I .#■■%
%%:ig
%
m
'•'y.
:í;: ¡i I,w, | f f l ?
Vi!
W ■■^: M
V :;;
-'A-
■%
%á
■:Í
I
W
i#
■<ií'
:Í#■
Í !M % %■,
Y#?:
W
'$J
•I:
%
:ii/ 'ií'.
■<:;■
M ■"Xí
w *
i r
•:Y?i
M
•'* Í!
I
■:0Á.
w
w
■i{'ii|: W%
i-',;--
"’P--
I
ffl.
>/>
■y.'
'f t :
m
M:
m.
.y :
-y - :
•'■V, :
i;:i
* «
'i '
f l
f
: : '! : ■ '/
f
, m: í:'ív^ .li
* « 4
I 1 : I MYÀW;
i
;v .í;
'M
%. íiímM '-!l"Hk
íí
:<
lii 1
m.
1
1
.
i;1.'-V
y/äo
--
i
/í; Ò
:v-
ty¡u- '4 /;V
m ? %.
i§ ,
Ä
'V ':
■Í í í !
ih f i í
0
i
í&y
l! i®
' M -M
m
i:
Ili
M
'é
Ííí"^
b
:Ä .
ife.
"Virr
t:
0
í:
V f:
■:r¡”
:^Ví
f if í
: i i;
I
-< Y /
:l f
'$
é] z y/¿. $
'■ty&i
We-
lír:- r¿:
•í %ßíí
1 .^:
M
tv
■ :*>
íí/. >
vV
'V
-
t il
í ' - l 'S ? í f - ®
:^
:v ;
I
■:■<■:
I I
■■.V',
.'■>: %
■SÉ
Mm
%.
/.ii.
1 il
/i;:i,.
;í:
,^ ;á '
w
if: W
^ 9 &
'
■
‘
Ía.
':'m
■■'A
m
m
{0.ii ;xr
1
.</y.
1 1 !
'&M1%
'A.\>
v!': ii:^'%.
:V*
Üi'i1
■ ■ m i
:% 0
¥M
M
Wh
:; >V.
1
■'rii
.:, f y
I
i
■STMÁ
íííi
%
■■'^>
Mí':'
:1 I |:
i
V, / / ,
t
S J
I i
&. w m % x<
&XW. ':■>}•
w
%
o '- A A
■N''
■Íííi
Á'y<-
;^ ¡
f
:> !í:
aA/xa
■■y
Ii ■
'.(■
isV
f
■•'l >'■'
'1
•/í
'■í!
l'i
.i ' r
1
aÍa'
Í
:%
Í/:VÍ!S
;S'.
Wm
f>>. Z'¡-
t
■m*
I f f !
'i
'a :
N :::
;Ííí;
-Y/a .
n
y\
%
AA\ -P.y
Oí:■:
•'!>:■Ví,
I
f
im
-;V>
■H' i; I 1
; \ í :'
'■ 'í!'.r
ri'V'i■■:■<■■
■Ma
.
y./AAA'
üií M
ííí!;:
II
yf f c i
m
.
>ji¡:¡
ffi«
i : i;
1
■m
1.
l l t
#
■s|]
■VX\
'ív :
■
■■®r"&
:
■■í'Vr.'
w
■
.1 1
■:^vi^
v/íi
■
I• V
i':
I «
■■’Ai:
5Í
: ! '.
• í> '
W :
I ■:
' ' í ; 1. .'.-f
r i : - : .'.M :
:iV
M
ste
¡ti
1
';>'■>■
w.
'yy
L
I"*
V A a .a
''/Á}<¿
O'Á
;:-iií:
fe §
Íí!® í
Ä
■/
:Ä
fc
>'A?$
M W
‘■wy%
Ä
'»À '|}¡
%'i
ti® !
ríí-r-
*
■:X:V/:
yy
■■>'t\
•S:
■
>eA
■■yy ■■>>-■■.
,-.u
^■'^i
':í i [iA
:V- /.I l i
Al\
yy
I H
:#■■* I 1 1
y>&.
m. él m -rs
W ¡ M
m
M
U
I
wA I
í^í-i
Tí/;
v^i
I I P1
j
•;fríí!
V f ;
■ií!'
Í ; I
■>'-Áí;
■ m
fe .
•f; ái
■■■4 «
«
■AA-í/y.
a
;A\¡\
■•!fí
A/i
:AA-é I
!
hi-
:.i|| Í 0 l]i f t f
; i I■//.:
ilife
',A.vyA/ 'A‘.\:
^ij:
y .'Á Y : á
w
" '• '
#
'■m
lili
¡V,
I
•*ái
■ /ílr
. '/ i
mm
aí¡ fa:
* 3?!
,í?ü
"y$
li
I
WjtfM ■•'V:1
»
i
I if:
'■ f t
ar' ?A
1 %
w
f" li
Ä Í5ÍÍ
.
z<< if
0: %
I 1
■
f
i
j
;
s
w %
•: .\ /
m m
iW i y i f c ,
: '*t< y . y r ^ / '.
1
%
■fr.
■a a 'i ',
I
;rV
.
I
Í .- /Í
I i# ■i «
’S'";
'/■/.
I
I
i f
'$■ #
'f i #
'• § .
'V . '
i
%
*
I
/•
''i f : :
-,
v &
,1
1
!'!■' .'V.,
'ig=:
|f
Ífíi
m
m
1
.(S'.
w
I
$1
/<<: % 3 '
ú
■V ,
M .
‘
'4 ;:-I
'Ii Ä
ÍI:
:c c :
Äi:
#
■% V
: yi-f
:,m .
s V . 'V , > r ; .
¥%
<rA
M
'Í
y-:
y Y ::
i
y
Í % . , i4
;é. -#í
if
■ ,
ii
i'íii.'
S 'l^ /
/if ö - f .
Í í 'i i
%.%
:
|i
i
V'fe
/¡í Í?tí ;>S.
i^Jh • é t
m é
'4
,-,
■yMviHifc
rt;
■■/f;
• f t
¿i i P l iÍ/S
1
%r- v;
1
M
/■fy-
u
75?!
m
m
t l'$■
?/. '
m%
If
:^=
Y&y.
■;.i/.-
i
i^
II i
i.
>|!
1 ft
:;••• '"Í5> '
i:m?
% . .
If
'ft 7Yi
#;•
%•
I
M
fl
ií
M
1
M
■
■■A'A
V
>
f
■ \ V Á i A :
yy$& w
,‘y /iY jA
i 'i:,
Ii f
-iiä
■:<¿
f “
1? ä
I ^
I
• ...- .
-:»=■==
, IV
■IÍ
a
Y'j YY rí-A
■0:Y
á 'aY,
W 'A - i:
m
I
-è
..
W
. f , ^
i
«
.i
i
I
I
: 'i í - v
Ú
M0 ;.
I
A / y
■’•■J.
%
M
%
p : " i ,#■ % I
m.
■1
:w
.
I
y
É: .#SSt
/Íí. ' i
è
'fi
%
f
ii
m
%W&:
® ! ,# %
$v0 ■#
i
S ir «
a
m
:Í. m
•% 1 1 1
w
I
t J - f c
t i
%
• 'i i - .
:
w
f l g
MM %
l-J.
w
1
■%
m
m
M
% #
i
m
l '/ í i i ':
OC-
M
1-
■Tí .'/
'.'•>
•
t
%
m §
i
I
Mi
m
t
'•v%
■■yj,
h’ ^i
f/.
I
.1
■ÍÍ!
!
¡íf;
■^¡ì
m
y/
'■
■&
iíf>
í¿
:<s
%
%>, 1
ym
'#!
/>■.
Íí
'''
1
Ír
m
S
I
I
m
■!*/
'•>.V.
'■'Ay:
/v .
:y y
:íry.
:
0 %,
.:, g
1.
i # í|ór
i
y y ' ’ -i:■'#■
I
1
vg
i^ii
if
%
%
<: i
.
Ä % ; iÌ% :
% M -W
' A A.
i^i i f
1
' # ,
i ...
l mf %
$
yy %á Sf
I
4
|: t f
AiO:>>.
Ji:
’
■ ? #
'-'.f.
¥'%iÚ ^ m ' M
I
■
' t :'"
n
f
1
w
MM. Ì 9 a # t
W
È
ig:
«
#
■W
I
§
»
.7
l
'Ä
i li 1 r
í*
:
%¡i i
y
1
«
1
•ifi-; v!t.
is te
■i%
1 1 ? lili
'■■¿yß
:,•
;
: V) : :
■ ;W
,'.■
'.AyJ:.
#V -yy'-^y '1
•
:«
¡
v
.
%
1
y;..,.,
i 1:|ri¿i
|f,:'
■ m .
*
i l
' n ■.
M
:M
’ u- S.
i
M
m
m
i
■ «I
» y " - '
Ite
l l %
j
U
Ili
II
!%0
7
vs.-
1
è
m
1 ,,#
.■ / i ß
1
r iß - :
I M
É ti®
m
» I
1
1:§ Iil
w
fUjy
!p
■
<;!
r.< : : :
';..y .
'/<a
‘Y/YJüÄ ■■Mi
' -.V .V
'fy
I . . .
V í,
I
m
m
1
4„ .S5Í
vp;r. ....
fy/y%^ ñ - • I
%
yy
? /;v i
'• ^ : '
M
m
■0 %
•í-¡;
«
i
f!
e
'Ay
m
f
' Í ¿| : Í Í !
^ .% M W'-y
% ll # % #
'fe iñ
. 'í ? ;
i!)■
’
'
■■•í}
"tíi
w m % i i
y¡:äte M
a ® # íé
: i .
I
f c % i:t
i #
y.
r ,\
i-i1!
É
p .
S
í> .
.i
fa il
.v ii;
....I ■ :1
*
IÉ
V rii
■%'
!■?
V ^ .
I
- ■ ■ m .
i
yy
m,
I
f
i
'h
Ä ii
i
!iW%
■í?i
i;
8%
'/ ■ ? :
m %
1
rn %
'¿.Ki
te,..
Wm %
w
é
4
■é
•
m#
V# #
a
1
'ñ
II
ÍV iv .
§
•A
i:.
$ÚA0 9 Ü
'Wí
W i
■il
•;rS
:'
•./•/í:
■f
yí/y
% m
0 é,
%
Si!-;:i ■
' ’
%y-'’.
!ii:
•''.'S %
'% , fl Ì
É ÍÍ m •§yM,
«
%
r - '-
iA
■ 'A s i :
■’y,i.
.-:■.
i
M
;-)&■.
:#í fy-m
$&(
;
fel
'YiCÁ/A:
m-i
■
,v
.'
■
p
yyv
fife
:'ííf ■
%&
m m ■m
;¡k :%/o «
.■■Ili ;'Tsr '■':í.
'• f e .
f
m
■ /í : :
4
.
^
■Ä
'5
l l s™l
•'^v
I %-•'
m
t % i | Ä ■^!
1 É I '
%M%d>
■M
*
:: t f
■’/Ai t
Al';:
w4 l
%
É% % M M I k W
é, 1 fm 1
■m.-.
•^fi
W®
m :ím
1
■&
fr1
/
■■’O .
ylSO y
W M
'J.V • ’• ’•
il
1 * # %
■//:■
% é
1
• M
■$j -|i
*
i
m
m^k
m m
ik f
f f ! # íif!c'.-!:V
/
%á SÄ
■y.
1W,%■
>■
i:,
■
>
%
■
>
:
a
,
f
A
%
m
iii;
*
^;
'ti;
w
iy §
:|Í lf c
i%i^í:/
fe
»
M
é? ■■>7}
- ih
A i
>w¡ i
ilfe.
4
y$f: ÈSi
I lililili
yyyyí
'€
é i t i |:
•;#x
m
0\
% i¡
a
'■y.
w
%
i/y
Ä
M r
B
?
t,,,,
im # #
W'%üi
ñ m M,J.
P
I
■'Vi.
*
\<:
'iil
% #
•M
é
M
ii
M: i
i i 0:
i%#
m
m
m
é
m
^
r
n
vii
^ m ■m M
te ;
fe ,
Jl
%
t i
lì::
iVÍr- *;
|¡ # %
I
I
1
S
f,V
m- ñ
i
li
• :N '
É l
:SÉ :,v:#
I
p
#
$0 $yS¡i
1«
I
i
.íiJiv-ií
'I Ä
i®
•'A:: //j):
.ifí'i
Üiji
. ......
■ % . : ,
i& y
I
frá
• v i 'í r
i;íí/'
| Ä
■•ífc #i |‘¡È:
í
»
fci
Ya a
'á
;i|
•ii»;
:^ j::
!'■.'A..r7.;.
. N Í 'i
l i^;
É ^ l f íí ® # i p
i:^ |
YríÉi
• Ä te
%MM'%y0ñM%£
V' •■-£
■# ^
'•í
5á?'
I
- . w - ' J i j
w
fl
ii
W > \
:
Í0 0 % Ak
■Ayi
:ss
i¡®: i ' 1
iiv r-i
l i iM.
yy.
í^i
■AA.A.AS>:- ':/í-
■: > Ä
S il
.- ..v .^
>j.'.
i '&■■ :ii:í-;
.
.;ííü
11
y&
•ñ
■iSY-y.-,
w r
*
I
i®
■Ay,'
Ü %
8 ? # ilr "
Ú/£a i# ’ó1!^
« ll
i
■■■'■
'
■
’
/iV‘,1
ái
:I ®
O
Tr
'y
»t-!%
' 4*
1 %
)<
:f;
I
è>Yfí
■#
1'
w.
■■(A:
%
%
A 'J,
ll
•J'(
'YfY'
'y Y-
A ''y ¿ y y
■
0 }
'i
i
|:
'W y
- i í
m
•ä'
-•/
Ä
ìk %
íjí"
:)
»
m
i
l l « . Ii#
-x/>
v5/
<: '¡i ASAy;.
*?) :ifc
,’j^i ; '/rf; W ¡
;í|í: M i
v'.v.; '/yy. M
1m
-y : ■ I %
'.y.1
rf.
1ílj:
M.
'#
'%M
•% :
|i . •1
,f
I
W . .
#
» I
' fmM
•?^ r í
•U ;
:.f
i t
"Wm
fÍÍ:
ví'. ■/j,
:.#ó
m
m
tí; §%
Affi
M "tyVsW. ¿
¡&
■■
Ni'
Pt'
M
fl»
f?:
- i 1: ; '
ú m Mm
1
I
fe
%/: ■'luyy
.
%
í:
'W
■M
è
■¡fi
(A
Im m
yñh
ÈI
i 4%|íi «
'/:■;•;. • -/Vv:•'.*••.
Yfy
. !-/¿r
w
I
"Sfe
' ••
m.i i i
ií-;
r;-
m
#i■0a
ill
íX¿
•t .
VitìfTr
■-S'
"7/7
sf m
ÍV--
Á'iy;
-.’r.:
i;;j;j
:iÉÍ:
:|
I
ó%:
Mi
I *m
ilséí
f^iII =Ü#•:*'
I
I
&
!<¿
^¡
I
W
i
'i i »
r/í:.
v'¿'
I
y.iY
i:
1 i, f
-
/íy;
'■..Vr.r-ir'
í#
1 if
%/V?
■>v,
vr.
fí:
M
A/y-
M
mm
V
;. /íf
••.•ií:
f:
*:.C:
:■.*•
.-•y:
'(V
-
1
yM
■
>
;í|
% - m » 1'■^i:
1 § '% M $. ll %ili
'1
Pl
v.:.
i-ÍR
í
■*Y
'Sf-:
,; l '
•Íí W:%
»
i
É
m
■m m
wi. ii
í:ilii..
Wm
■m
yyt ;.
m
)&.
;p ■
::.‘f::
»m
ii
:
y
y
%
m
m
Yy.,.
'•'Ae-,
m
;íV,■;•:':•'.'••-:
'A' '
ta
i
¡«Y
i;- V,
fitti
I
ill
!: ii
li:!
V r im :.
■Jy
■ ..... :
/
y<?Y.
r r - .V ; .
P¡:
i
w.
ife
M
i •fll
*;,Í
%lí:
m#
1
m
Yf/y
'
0'
•%
y,
I*/,:.
v'xír.
;v..
•í&•í'íV
Ir
*
'%i:
fim¡ ^ii
m-
f '" t
>&: :í^
#11
31;:
f
«•#:§
i-:ríi
>‘y ,'
<r&. I r
II »
1
r/Á
■
ii?
1 i
1- Sxa
'I.&
:A.w%
w
•;?y
w%
I f 1 Ü :
A
m
#
Y/a Y
■/ó
;i i É
m,
f ;í l
-Èa YYÌìY
li
M
M
;
i I1¡AA
m
M
;%.
A
,11 Iy:,wm i ;';y5>iA' m vk -*í
» r;
/.¡i
:' Ä
• í : > íi
!(■
-A--
■■■“
'''
w>m
I W:
m
Iiísill i . i »
:
<
•
.
mé
11 I I
Y&w
■■■m
§ m
!#
v
i
i
fííiii
..¡^I- M
ys/A
•
<K\
'r
v
;
.^
■iv';A-,
(0 ;
■YjfYyy.^tA'Á yßy&
"y['Y. 'iMy
I i
IJi
y y . :-
M
a
iftWYA&y&í:■}-\-$r:m$y% M
'y?Y
yy.
V:
y?l 0P&W :
y¿ít m
im
íi‘. #•-•■ >&ù
m?>-
0®túii 11 I I
,,/:Í
i#" lii
r«i*
vlji; :'(i iv;?;
•aaA
.,-Vv :->:rr r;«:
■:*•
%■
yy
'^ A y : ;
r/:;
v...'•':■:;••'■ '.’o;//
■¿•'i;
ÌM
'*$;
;
Mv
v-w^
:
'P
i
?
i
;
. '"‘i
,
:
Ä
' !,i
;
$
';
j
;
<i
1
^
'i
r
í
:
a¡í»¿
.Ii
%
'í
i
i
f
f
^;My%. !0
■’}'"ik
lJ:i|Í:r* i|
|i I
1%; 1
«■W% f
i 1 :4
%: ;
^1
i '#;fc:i
c
i'^r' ;^ :
f|i¡!£ % I ;f :HM %iM
a ¡:
1ír/i I% I .s I
«K
*lá
A.i&i.
■ w
'y y
Wy%
i ;..: 11"ff 11
11^
>ííi:'
• ! .-■• *•
f
fe-
m
II
iyyy,
■f
•m :# i%
>x<s Éi tí?
Wi
i.V/':':
'-.r,<;
m
'r^.;
■
;.í '
:m
0 Mi. ¡••írjx
'Aiy '
i.V.1: m
%M- m'/Y
#fclÉ!
ii•Si
*iíhi• M
»
V>i;r»'/
I»
I
f.
i»
"if-'
VV/.'
4\
4 ^i :|
$)}■
:WS
íf¿
:
W
íi f if» %1§
f illw m W
m
m.
f
1É
.«
>r:.-.
....Vri /y.
;%N. V:?:-.
•;S¡|: >:Yy'ii':
' i
Víír'.
:/0
'Ü^ivirliv-
' -}y
•'S'
y/-•,;-•.•
m
y
!
'
|vii"|i.
%.
: -T ic -'
:■>ƒ/■
Ü
#■%
•IM
mmt
m
m-M
a
■:Y ¿ Y
,;v iftv ,
'.w:
-:>
J
-rV:
vy^
i#
y y :ß
il
M ;«i:
4
',y'A'.
i
I)irI Ä # f f■|s
'rvii
I
%
IPIÄ
#iir
m m
11i?':rvS&: f; fffj
•:!ti¡ M
0
% %
ÍS Ifrít
iY-'yYy-.
i-j>
v^j
W
m
rf
.#•
W MVv.
V .r .
•%
:'H
¡|i
.
r
y
Y,■'•y¡':
Y<&.
'NV
Y 'k
1yy
ili:
m
%
■yYYy
» ,§ .
l l INr i I fi f#;#
'M
r'
x
>W?
■y.i ¡
;J .
?y
■m-yy
i#
-:/íí:
.^■:
y.r.
y ff
ás va
■rv;.
fW%
:>i: í¡n
ií
*
Mi
M
?
í^>?
;w<
ifS
m
*
Y',h\.<é
9M
>;• s:^.
viv1-
áiSiriP
ll
3A
i - Ä ':
m
mk
. . ; . j r.-: : i v ;
:¿y,
-AAy’
y
i■' -0Ili0
i
í:%
If
-:'/V
■r/;'r'
£•
1
'.¿fi-
vZr1, :Í^V
a I m %li'
f{^1^: mÈ % * €1
%
•I
'■/■•'■■
:$íi
••#
ñr^::
ft
i
%
1 ;i* »
1 É
l¿ 1 1
'.í -
1 1
vV'iife
%
r#;
■'■yfr.
■'fl;
0
y?y
$
\ Y$k
:’/:: ':í;.'
wy.y
'Y/¡:
I
'•.Íí'
p %
&
l l %éf!:
i m •:iffi %£;'•'
^írV
m
■■•/<i:
i
:l<: /.sii
II
1
%
#m *:■
4v
'iil- r?í
•V
:-if; 'Jíf ?v
$$$,§■
m m
¡y
W:
f
y
v '/ y ;
«
i-'!*
:YÍ0 i.
#
0*q%y» , I M I» ^
:#ii#
*
m m
'lii: É iftli #:
■‘‘.y
''.AA.:
t
iv-i
i ffcfe
%Hí/r #■SÁ :l
I
wm
í /1
Ì&
é
M
1¿
t*Y
P':
Jíi.
1'i 1
yil
ZfiÀ'
:.'/ü-
WÍ i p i l #| | l "r:| =lí :!i? m
i||i|i
I'
iM #
• 'í - r
v i;>.
f
ti:f i
•rr>É
íl
1
rÍl?:rfV
f
r^¿
?y<-
■1 if% m
Sftl 'vliíiÉ;
* I l,f c
¿r
■ÍL:
i l , , ,
l # f
f
r^:
0y$ñ¡á
ÍÍ!, í|
Éii; :^i .íiSv!í . ^ » &
W % -$é- S n i
1
íl |P#
-ir« .
• ií»
•>:A. ’
y :-t;
> A y
fl
:|í;
'/ / ? ; i
1 :i i t
• ^ r '
i'■
%
% 1
W'-
y f c ' A :
i‘
/A.
v iv .
i s M . y f y .
Ys,-
y■
?
.'
:h
!${yy
~-yi-
i
y,tiy.
%
%>
f: ^f
l :;# Í^.;ir i
yyé
%YYik
v
W m
'■'■'■
.f.
'■•.Sí'
ií.
ti.® i
1
fsV'<1
'ÍÍk ■Ík-M
É l:
■r
,;íj
m
yy
iii j f l &
#
V - /Í -
•'áí' 1
■:&$>.
tr tf*í¡-r.#• "'i'
■
|i% í l
i|é ,#
Mi
É
:s}. I
yfyy/Yy''
ÍÍ
¡iéíi m ■
::ip & » « á H
•te
%
• • • # '■
$ É Ir
f0m
M
/^^v.
™:
1m m1 1m M'íte:
l# % t ?r;
M.
'
*
•:>i-ii
1 1 8i^v
m
%
C %
I » V ii # «
i i ili
f ili v ili mI
M
W"‘%
r i f . s ' - '.
r »
V
míp l | : Í
w %
I
l á
'A'.l
.V; ^ .r,r:.. r , r¡-
r-fp.
-äSl
ft
% M S %
«
1
ä
:
>V
i# »
■
W ! # 1l; ü iiil
■3¿
:$y ? W %
P%
Ä
ifl
W##é %
i?;Í; Éf%:l/'l; 'f
m i:W$i I ^
l
¡&
•í: m;|':;^
;jV
.:i#
-^iv
i®
«■
':ié
# %'¡YYi
■
I
"4
«g
i
11 Ä
11
:®'Íl yM
'#
'Ä
'
§V¿
w t n
............................... ' "
i
A r/í
t
f
e
ii|Í
llf
V«>.v,
ví:
:§
- ir-W
• í-i:-
, j
i!ii|i#i-€
•irj Y¿
:.$/ :í¡|
:% Ä I I * V*. I íaA.
mi
,
7.! :
^S:
A i «
M
1 ¡liíÉ: A 4 f
V‘ | V .
i# # %
... ..
;
i
l
!
l ^i
'à
i
iil * m :fáí
%
%>í
11i 1'HP
i UV:
l í í F 'i f l i i
15:.v"
I 'l
..
l!
: N J'
r-v j
:i?J-
%
¡ f e
M
r
#
l i
I
1
1
■ y í:
■ify
i
'%■
I I
■r
$?.-
f
>;'K
i *
W
V v l ';
.# i l %
ÌÌIII
% M |i
:íi
Áyj.
■ÍA>.
. S » 's ; A
yy;.,
f.ti
« r ía
■■y<-
f - 'í . - . í ’F í
■jyí-Új W %
mmé: ñ. ■:vr? i 4
?#mw
1
í?i?.':
-
Ä
♦ o./ 1
% i$f f
IÍ'
. i
íü:
%
i%f l,,... 1 iA tMi %1
i % M Í
>\
m
■Mk
\y A $ m
m
¿ ÍL
•VI*/
% .||: H % 0
* -.*
Iff
§
•i|:
^
y¡
è-
f
-'ss.
f i> ;:
.-y.
•. 1:: *.jl
. 'i - i '
' .■'■
•JS'/
I Í
■■
;i;C r
;V r
-:AA
*
Á i'yyf i.
: : I i'
®VÍÍ^
■' '
;.;,v .: :
M i: i . á
# . :#
•1
é
■iY*. ■&
érp %
■% r t i i
m m ’
;« l ¡
% ;f
%
I.
ií.S.1 7/i: :■/'.;
% i'vfe. i#i :&
ü
■í ; ;
F l #
•;.b'¡ - . 1 ; i '
M:
Vii! =>sa<ij
:ife i
■
;>YA
■m
v í:¡? .
.y ;
'•Jffi:- y%
im• Wf;
tskl
r-fe
M i
1 %
• li li ;
% f
i 1
'fe
1
1
j y
: i : >¡.
*•“ '■ * “
*
f
% . /#
i
■¡ > ;
M\
■
P.
if
m
■.•.•; "¿/'-i
r
w
i &
i ir\¡ú:- :://>>'/
i l l
.
y/■
jA
fái-:■
-■ki’ •i.J•1A
Í0
Ñ
■
:Y>
y-'Í;:Y!iíft
:■
••$r?s*!.i•;Ä
8 ■
ffi\4 %.0
<
0': ■
i^}
i
■’/ y . ; . • ! : "
».
i;
■v / '
t
■ fei
-Íír
Vs»:
Ifl
5?^iN
r ■ ¿Ä »# #
... ■■" :!»í-
m
i). U- m
*
1
m
m
#
m
1
V #
■'fM iìifè-
§M. l?li Si
WM
!W¡
■fyy.
I
Í'íf’i 'J!?í:
; r> U / A .
Í.ÍW.
y?//.
%%::|
:Ü.Í
■■'Ií:
:'.'..í : í
w &
jM í
m.
; {V:
&
'¿i ■■-■ i:" í?:. $:■¥
:
■W PM-
n
m
■■
•■■ '
4r
'» '.■ ■ ■ / X ;
.............. ■■^
,
': w .
m
m
!
VA
: |l i i »
■?&
s
m
$*#%f f %
I
■7a
m-:m
i ;ii
Ü
rir-.-. !fe';
:«r
-
1 1
f.¡i;i; r $ ? %
&mrx
% # :
.§¡ r%$í}y m ® * ‘
■?é
y V .v ,
. í ^ .*
<•>:
Y/y.
. i;
I I
Ifl
■ ftlf v.:;.' >-
v / ''
m
1
•'íí*
a$.-B
... ...................
I! ?/
•
r
&
"W
f !í!i Í 5t :
??! .#
m
mm
M
"'0MÍ
-}
A&
w
'i
•#
m
i
fl fl
'm$y! > # i w #
l A ¡ í ; :I i f t :'® i
'A
ffi m<k
tM.
íi;Vjy.'sÓ
*
%
........
i.
. 't ó
ft:
.-r
■;y - / s i
' *
'<! ' ' ®
l# t
: 'W ;
1 %
.'>■■
.1 i i i l f
'
'. I :
wm
i
#
1
. /
! ^ j.
4 :# «
i^.i
ii
Éi
...
I
f
::'>
íi.
:UW;'
■
1
y¿.
■■■>/'.
'Ay,
¡¿y.
ifiij
^ :'
A'.y. •.:':iV
lili
^£,
I
W'.M
••ü V
;s * :
%
1%
'
ií
/•V
?'t.
y y. y k
m i
m
4/ ¡ 0:¡ f f í ^ '
■
i t i
v
::•'.•:•••• r : !
j> ^ / i
M 'M#.
■
W- mM
| Í ^ % lá
I
•í í ' ^
íí! :?«' 'l i
-0 él
I %
I
■*>i a
. 'í í :
i: I
# íí
II
ííf/i
7
•4
%
&
| |
1
#
;-rí
m
i
}
k
m m mí- m% ■§ «
r&
i
m W
w
í i |!
m
i I
■i 1 ,
:{ij¡
#
f l
m im
'1
V</
f
m
•fÉ m
il 4
/V fi'
=11 :íf
ír
1
I
% ,í
# %
Í/:
(#}
■'/Al
#
I
i...-:.
f ll
''í''
K%:
: 'N
-*véfí%\
0
:%
M:
r
<y i | | , |
P’
I %
m
J
•v r .
•irí:
i'V:
• :} ¡ i:
,1
# k m * m
I
I X
á Js
$
L
Ä
■tí ¿a
>5. ..>,k'
• .< « ! ;
l 'p .
'Í5i
pH''
f% j¡
li./. ,-" V
m
1
’/.■
■31
í
, . .
i'^i^:
W - -
li È %
•\ V .
• :? .!
r ’J J :
I !•t #! ■f/5?'
è ü
$■,
;I' ’
fc -0 .
è.
;V..;
:N '
:-i* 9Á
-
Ì
$ WW %
v .r , '
W%
É
m M‘
i?!1
.'Ií;
Ü
W
Ií
Í : á
1
•■>>
I
%
<.
?sffc.
?X'
W"'
y>
M
%
f
I
i'.!
| '. |
f:^í % f
4 •#
v® .
T
■■■&y'M.
■■■■■/
M
f>.
0
-ih :
fll
l i
M
•)^ isH
iSfi m ^yy
® ¿ i f
• / ¡ ;:
'r i '
.% •
Ä
•/Jí*
I
#
'}&
H H m í l|ii
%Íi m
íl
¿fi
:ái
t
w ^ ti i Ä
1
r y j •
•■^!
«
M1i f
f i i i i
g i
y':>
i.rè
/ ^ '■ *
I
: 'í í ¡ :
f 1 Í l
M -m I I I "»
í,^i :fá-.íki y{¿ 'up} .ili '-/¿
% s,:#
il- B % i ä
1
i■ f
m
; # vi
!$,y
«
% W
•^i ;'$r
•Tßi 4
ii l i
• '• M i
i » *
am>i yjp
'<'■# 1
•!$ »
f !f i
■ñ,S &
i
0
, i l?& .#
I I
(r- m I é l
Ä
i :!!:%
^ ili1
-S
M àÌs.
%Yf
f ’% S li »
è
l lä ! '
,1 »
,V : >
.-,X v
: í«
Hi,# i
i
?!
'S í
Mf M1
Í % %/í
ii
% 'M
’# ■
7/Ò:
:¡’>'
a
M
:!V /
m :m -ty"/&
•^¡iííí
¿ilfe «
I Í
I I
w/
> fe
':1
m
l i
Vi.
;|W h w
i
%
i
I! M
m
:' í í , . . i é f j
'Vii)^ i f e f
%
■ & .
á
íl 4
» H
*(>èi
W íft #
Ai'
. . .
i#
i l
I
l f%
■¿i |:
1 .
P
- .r iS .-
u.
•p
i l ií§ ' t e
: r.
£
f %. y
%
i
f
1
I Ite #
1!
• íjí:
íl*
•;^i
•A1?:
>J£.
iSlf $ j;
m
ír .- iy N
|CO>f ■•>.&; Ii-irí ^
t\f}
W.
A
$>
??%f$
•
JsJ
M
v riii
l
% SM
à
ì>.' Iá¡. il
1 1 %
ii.
^ : 'i
/x y
%
■tiI MH
%
• w ;
..
9
:l l
0
li
/*s: 1m\
•vv<
vjìLir
;S!
ííj. .
f 11
? ;iii
I
m #T: .-ií!
yujj-.
•«4fí gi#: W
^i
I■*■./ , * l i #
I
ié.
■m
M m [ñ:
-
i l
f
/ ; |< i
Ä
1 1
f: : i #
ffll
'V i
I
Y#
■
Ü
Sí 1 'I 1-!c'í¡ » WA■i:
w
1
•#■
— 'ÍÍ 1
! Y ß
A\
IÍ
i
■:>S
ti:
Í l
•Íí: .■//.
7í !
v
;<*.0í*
Ii
È % .à %■ ’
É%
W :i
l l
m
11
i'/y
m w '
&<■# -ry
%
• • • .'? <
b. m
Ä-
• .^*i
:r'í'l
l^ i
■ M &r
m
;•>.
V
■$>%
mm
f:
'■)
'v
$ i.
:■;(<
vM
.!#!
i
i ' ilI *
'I ,
fei#
ííf
I:.|! i l «
í
.-Í M .
>;■:■: ; > l ; i ' l > v
§$i-M $.
#
Ä
v*. dá^iífA
1
m w é >: 1
jSri
■■f
a
‘^:
■M-.■yI, b r f 1i
I
',> y/ Affi',
■''ƒ?/
Jl
• ¡ g f e '.
i
•í!
»
¡i»;.
i#
( j '^ i
i
..'.•.y. *•':%
¡•'ií:
. j
..../
%
: r? r -
1 1 1
■
ét
y
f:: M l i ^ i é
If l
.,..
7
%
M
rS ;
I4
íi! :-:^#§
I f
I4 M
i
%
w
il
v >
• ;
iM li
I
^ 'S
%
''ife
%■>i;:é
0 *I %
li
i 1 -t i ' ri;
f"Ú:
! 'W
Ä . € i , i l :% , f 1 %
i
■■Vs.
:ii : S %
# § # !
É
i
SI
' p
i - ■ti
; S Í > '! Ñ y j:
:•«
M%
m m
M
%%
. '.i;
v5sil ii>v.
A ' f y
:^ È
È. Ì % » := ì
;4 ■':?! vii: * 1
'%%i' :ài à É m %m
«
ufr',
:* :
i
ya ;
:
// / : \ • : - ; í i
: ’•
•s?»
•Ä?
1
•■■??.
•'M' •v;"% i
È . M 's.
I ,t!
f § V ;l i i í l : ® J l
Í Í I .Ä | i :
í N 1/
0W% iil
%yy
È
m
t.
4
w
:r^:
i!M
á
'/).<YÀ
•>; ;.l
ií
ä f
:
$ú.W
w¡
. 'i r ; .
v i-
0
M ■<
■
% :í
■■'/
»
I
<i
■■■<í<:
I.
%
¡%.
M a^
i®
■■'rti!
i
í
:ty
•
)?$
Ja %
r&: Í síÜ ; f e%.
:'
»
nM' ' •riir.’yi-' # i 'i # :É
I
Ä
■
)Ä;’
I
*
;I
é
m
.■yy
fy -
'
%m ?
0$\%'A •
é■fÁm
é M é % é
f
I. á
i « : Í |'. : é i %
i
•$'
I
i
f %
i
*
t
'4
mg^k J í I J ' •* ,
■yj,
'■Y'.-
.y
§ 4
:; ^ l
It
;f m
I? f !
w. íüií * : Í : |
íl: :
’
éiA%i$
^ ' .0 ,
J. •
r|. Í0
>|i. á Mi 'fi M
ü
;>É
%
%
■m
<á
Ayj/
,\
: ¡ íí ! i
m
y
)
iij'y
.............................................................................
;-;j;
■ fe.
v ¿
r /.
.i.
...
i i
■ '•'
# %
:f I '% # M f .1
•rii£ iv
iii;.
n
I: i &
f
:!p:^
M
Í Í W% mm
'Viiü Í'í.
ii&.
■my-
Wy
iy # '
m
.¿i ;yk::
.í;•: m
¡w
Íí
•#:j!| %
i*} #=
fe1 :|i f 1II
,
- r; f
■iÄ fi i I %-¿
:ÍÍÍ
■f^iv
V.v.
■VÓ’V
yy.■
♦ p%
i... 4 |
• I iil
íyj; i^^: ^Í:
là
¡t)
!W
í-SlSi.
$
iá á . l
t '
&■
I
Y¿\
't !
.i
im i *
f]
# :v
iI Ä
1
w
il
í*:
¥>,r M
f % t
iP
m
= :M ®
!%
V
:■% V% vrtr
V>;
I
■■t
# :É
1
*
• rfc i
‘ •‘.iV
.•íírO!':*.: i**.*: •*
>1'
.;ii: '1
i
m
■;>j
%
f
fl
i % ám
■ ;lñ
:Í •
# % !!
€ ■k
I»
S. -k i l J
#W % :
i
I
t r t i '# $
ii "4 #
# i;
Jl
m # '- -
^l¡ ^Vj ;
.1 ' «?
ií
w
W ^y-
ff; :■%
W 1
M
m
ii
Im
é
¡-^'rii.oü'
%
mm
''fayi ij.V^:
'1^ '-íi '•
'Wk
'tk:.
'S titt.
#
*#
I
#
%
%%\
# I
■ ■ '■ ■ ■ •■ •■ ■
l^ á
*
& l 1!
i
1I
m
Ì,
•■i*,
II:
I
r;i .
# 1
.i i; f
È
&
w -
% fi fi ; l'ì. A¡-: f p i
m %;ú %
:‘
á.
P % :.:4 I Ä
'Ä
I
■?.r¡
%í%
w'fe. :4 !
1
,.,v
•I
1 ?¿
M
v
I%
fVí
Ä
rm .
fi
i
•i&..
4f/ :.v¡D
r? í:
W.'É
• J j) ,
p
i
:? K -
íjí-
¡ß m
l
■■Zf-.
m
i
lili®
ri®
I i
/
m
'r*:
iS
• íl- - :
11
m
V v - Í 'v ;
iif l.
11 vvv
ifíií
■ii/
MM M
'(<
y.'yy-
•A :
Hi
%
m
I
m
'Mi:M
• I fi
'/ . v f :
i
■m
1 1 -
■:i: .-;H""'*:
■Íís.
'^y..
i l i
’■y.-: ? / / } ■ ■ ■ :
áV ,
m
»
!» f f
1
I
m v?/;
í t -1
:.
m
wíí
W.È :Ei#:
3gf:
i v . '. ^ i '. . '; : #
Í^jjjí^ .'j^j í^;. .yí'f í^-.
" t i » t i
f%
I
}
Sm
m
• . '> / • :
M
m
ÍW
i
v . ' . v ; , ’ ' ■'
IW
I I I f
%
á
9
1
$4,
*X>:j á«ü;
;á¿ -Mi
p i i i ®
ÍÍÉ
1
Stilb
N’ í ’ f i
Wm
w
:.!a A Á .
^ i ' -I P l f
Í3k:#
fife
w-
" ' -
SÉ Í l
IÉ IáPí !:É
«
¡.i
m $%'!$'■
4
>>
:* I ’ f/ÍS-;!Í
lili
-/fi
. :'.' '• - i r ? :
.,12:!
»
•/:
m
•I ^ .,ií
■%>
íjíj.í
m
II
%
.{/sí
*
Hh M
■M®
i
%
:V,Ñfj
l i f
a i . -
;-*¡l: íl? :
>i
M m :f¡!
% ..%
a
:ÍÍ 1 I .
%i¡
%i
w
i
• .'A 1/ :
MS
i ) :t #
6
III
i
.•« ;
m
ir,!r^s l l .
i
:.¡K;:
%
E i M
.1
Al
#•
i
i I, ..
pi 1 II i I
1
fi
:f
1
|
% - y -í Z -
I
i
v iri
v u í.
i
f
%
0
HA
I•••á ill
íf%
# S
.......... m
m. m *?>• •#
/&
% I! W :W
I
h Mv}m 1 S i t i
1
1J;■:
m
f
pv. 1r f
t
W
% m
m rt
* ; -f
;,.
\tjtj
■
yj'r
.<
r:¡:
:•••*::'•’•
■% #•?/•:?
ü
p: :#
f! *
•
:>
^ í^j - é
lí
x!):' rM
lili■ y// :■;.!%
:/://■'■:'>•■
:
W %
:5r
# fi
.
1 If: M
'¿h.
ái
* > *
i
f
t
%
f
! 'f e
0
a *
S#
Ì
a
fjV ,
W
1 ?
l i i i
1 ll H
■JW
V W -:
M
%ii:'
L # 1' ^ . 1 , 1 : È
I
1
,1
.íi;
i;
m
i
1 .1
i
■11
1
Ü
^ r fI;
. 'V ,;
$
■f
m w w ^ m í
w
€%
ri
r
'1
M
ll
%.kÍT'
M
l kß
<1
á
1
I § t ..
% -#' 'fev'
fift:
%
.
A ?r-
I
I
%
%¡
if
■i'fc,
f
m §
W ? /J
I
4v
,3 ^
;í.í:.
i$ ;
%
i
: i~í/
;; í; ä? I I I
l-é
...
| í ..........
m
J.V,:
'•Sí
..
5
■ ¡ - .r r % :
yJ/Á
M
•É!
■
■>YAr.V'
%¡
% | | :
M l\
m
i4 »
m
■
’(
o
.'.■
..■
P%. :.p á
I4^:. :f'yh'-tÍY
«il
&i
'»nifi'
É
mM
É
W6
%
é'
íi:
■1±-
i:
m
m M
"0%
i#i
....
'A'y
|W|
% &'&£:■ i I
'*■ ••:?!:•: ^
7í ;:
V
■ß
yt
-t
Úy
i
m
i » fi.i
il
Ite II il Ì::Ì
w .
Ili
•■.■i•
■■'ai
«
'•'ƒ/;
1%,
H i I ì %ii'i^i,>
%w I|k
1%
* 11%
iir
W:- •i/ii =&
V--,
Äi;
•;<¿
^
f # '®i %
fi
■:ìì |;
• t, V
M B
ì
•.
vi::
. rví.r:
É.Í 1
#'
,ríiS
M
1:‘§g:
i^m■M
w
$
<(¡A
W
•;/;/: i^í>r
i^;
'sri:
v#
m ||
M¿. M ■"&■:-W>
Y ‘-'Ay/y
0
yM
yy % 0
m
■m #m"
y
■
t lM !i:-:r¿=Yf/y M
■■
'& $: w
M
M
fell
.■Ay.
r,¡/;;.
*>'í/;:
'W:
ySYAYYA
*» 1
■M yyy§ M. Mm
m.
■yy
Ai-yí!-
ii rl;>m
'i#:
11
Mí:
Mm
m
%:
i
ni:
.
é:*
iff:
Ai:.- v ,y -
-Vr-
:V/;Í
■:m
§m
■'S. M-v
' yj é% fe
mm
■A>í
■
’ #.
-yy.
m.%
'••:•. y.
Isi
i
llió#
fe i#i
<fi-
■Xfíí
■
’//y'-'- i-
&y %Y:
Y'-
P
A&í•••■
'^»ííí .•■¿•'
,-Ä ^ :V¿
Ä
■
yy' il£i «
y
li
y
m
■
8 1
-,1/ . -■
•••/.>?
1 :#
%p-W1
#1: » f »
ryy A y y y
YAA
Y'Yy- /¿y.i
'.y-Ay:
/Vj^íi
.',<./•
■y.<y.
•|f &
■y<•'j
■»:
//,'vr
i^fe:
V,
>A,
r*í;
•r/‘í !
víJ:
■ éi
w%.
YaYaY}
• í '/ i !
-Y-X i
YYif(.
yy
Y/
Y
È
: i í- -VY.
I'l
f
*YA ! 1
ifei
*W Sí;
yy; ■(fj
A/A
Mi" •'I
■'/y,Y:
1
■•iv
&
Yi-üi
i
Wy
m.
li.
iyy,
• v., r
vjiry;
É.
■#
^ ri
I
.y.'Ay.'-,',
yy-'i-Y-
•i »
ií'
:;P
:«i
m
../r-v'r,:
■/ƒ/.'.
'A tít
9
mm II
•■y/y
i^ :
%;
r'-;:
.^ i
y.<
1.
faÄ
. I
l ;%.£
ll
%# ;%
/í
^#11
/¿■f/;
w
%%
yyy; ■■•
'i/ty
fíí'/
w&
'yy.
I
'i
á 4'
'Ííy
t
i
í'¿ lí- y
i
.
ìy V /y
’i>,
J:'1
fr : % .
•V
•>!■
'ti.
.
$?•
í^ í.
i«
É'
/ili
1
$
'•
(ib
f% # | l
%ífv■« i
■^k ■;•' ":!
J
1
f
íf í;#;%
;:f .
’
■Mi
• '# Í7.v.::í^i.
ffa f'»■
i i|f
4
■X<í-
' ííl
I * » *
'-./¿'A
•>;.
-ií.
%W
1
i 'li
:ÄVi
I*.
te iJli
•XbJjf.
%#
r
•y>
»1*1
lí I
J;
. . . . . .
.0 M
3 íW -
í* í
&
'
#:ífe&
:
f lu p
§ li
y d v
i
y ¿ i:
wf f
i i
®P#kif# *%
Í ij'í-
%§#¿É
*
• : # %
'
J i«#ti»
t
I¡fc:
%±l
: A’
#>:■
Mf
f?%
;
fcH lili
w ¿&
i&I I
&
Ím
#ri
v¿;
M
m
:fe
'# :
: W /'W ,
I#
■ i* U l I I H J J I
Ü
8
'
V£:
•#
!#
M :; ’■%■ .fe ' % ■ ■$:
f:
.^ :-
lp^ #%1
« :1 M« ÉL Jl
II
m
u i
m
%:
s w í t i í í lis :!%
*
W
<í í í
V
^y,-.-
'••V;
11 %
■
1/1
->k-
% ,
j0 ¡
C ll
%# n
fj Él t í f
y ;■■'.■
:^ '
'
?
••-&ym
tí#
11
V//-
&
S /, 'f c
%
!'
y;.-
& < $K
li
U
%w^;!$
w%
M i 'M
h$
W
B
:
í
|
'1#
^
t
It I
i
J
4:
Ál
w
§0 %0 %
«i
'J<:-í7,
m
^K?%
mmmB-
% 0 $:
W
f
í':
f;jfet
ytI
■ fy v 0 M
'4:4
$
P
tU
^
Í
É
f&
ü
/
IJI ^
'
e-- i§. ';...:^'-®
'IfW
1
'
Ii
Ii
I
■
;i«::
m
¡jfc :
yA
im
É
'íl. 1
f¡:,
\
1» I I 14 * 1 1
S /l
,
4
PKfc
ill
|#;|§ Éf
i#%#l
#ÉilÉ
u '? /
m
m
#%
1«
m
te
$ %
^
. . 4
#
II
f # ^ i# in p f m
il
: # % . : W : '. # % v
¿w .
.
á L :É 1|
W
W
,0
VV.::ÍíV.;
:í? ;
K -píí','
| !ü l l 5!
0:%
w
W %M §
■j W
:•
*/ ' “•
-^
fif
í’ :
'ÍJií.
#^ i # !l §^i % M:A
„
m
’M
« . ..
#
%
§# I
%;• :í4
i i i í
M
'
fS
m
%
m
Wl'Á
i |
J -
p
í^
11!##11
m
..
■
méim
é
t e á w
,; ..
i1
I t?
lM; .¡&V
| :
%
#
#:
#v
#
I i 111
í 4
W
|l
í^#' 1:.?#
%A
f
€
%
f
|
u * l l . , #,#11*
*
i,w § #
|
»
f
' t®é■!w 1i 1f■4|
^
"■"'
*f»
f él l%É
l
u"*"'f Ü ®
1
mi «lisiií-U
f S. ■! :1;% #■#
ú m ñ i«:á1 t J
| | | :I fm|t %!%«
iif t
íif e
I
I I I I A iTli'1
$ t'-'
% :IS ;
f
•i?
W
v | ; . f 1?: ' ■ %
#
I
% é i..
% 0 ¡#%;II 0 % ¡®
#
:
"mHII
i
í : #
; f
i:
# % = ;%
;5í
,W
'•I®'
%
i.-#’«
ií(f■ fi
ir-
m
# ;:
•/
f/.
.
•rlM
.
^
:®,:
W;%M!í: III
!í^,
W :'
•/#
- t e
:
m
é: ¡i # i i |
ftf
I
P"l| 1
*>.
;'JÍ:
, ¿ !V ::'^;¿
IV
é; ;#^ éf
1I I
'%,
■ % m
•^í;;f
V *
I f:
Ií;i i;É
■ ti
'>1
!lí
;¿ ^ .r fc
^
,.
t
?%if.f i'li'l
iií?
1; i® 1:(í<:" %
■
•fe :
iS^: .'/.ó
:%■
%
# ■
' I
%-'■
i ;
í
y
>
:>
J;')
®
!\>A
J.C--
W \
;:::í;;s
■&Vrjy m < &
•i'.í;;
1 %
*
i
* W ' *■
-fc
1,4 fc 4
m
i W|
‘jyrr
%
M Pm
Lm i
g /w .
■ W
' ^ I
A f |f
g -;
?
w%
-r,y
Y
éH;WI 4S
w W t-
W
;JJ,
:g:
:w A
&
>□;/
\ 0
ijj
'A t:
% £■
¡ # .
%
v| %|v#1#%%
.,J%
|
;0Í:
#
v ||..
É-
-!>
'jípi [•/
5.0';
-ffotW .:
m p-
'M
%
^ {r'
•!N-.^ÍV/'.:Í
:^ ' K :
'&>T'
I llfm0
I* * «
=!5?f
.,>;íííi
■■tf&k!
t
#%
•.^
¡íi:
I
i# « !'# « «
' ^
líi
IIti
^
&
mmñm
11‘ÍI! *:
1«!
■&,■ !i¡ '■.yfyil- -írM
í m
.
-VJ:.
W l#i
f :
? r '^ #
% : '" '
|f
w%
ff :
fct %
11
%
:r/^
I:
¡.í-v
í
::>.'•■•• ^:í.
'•Í7-
f.-
■ ^ .-r
4
I 'i' É
/.-J.
#
:% j C #
j
0 $ & {W ¡^ I ¿W WW: f
#■*#H: w I
W
í- W .
#
■m
'4 /
. \í'
;)[’ ;.í¿’ ::t
0*'V
#
,'í1/
fíl
W %#
mié-ifPW
jy
•...
■M
W
í
.%•'
.¡í
0 '
?/¡
!•
:^ i? 4 ÍS v :
a
■'■■■■'/■•r''//,Y/.h''y,':c.
V.V'-'
ém\
%éí!F' %k±é
« % .
;40$Í
•?r.
.<if. É v ^ i í -
W;
iiU.
w m .
M&
.: • •••:.;
mmw. t p t i f
%
Wá
v>V'..-
€ : .^
éi
É
¿v:;v
*m
^ I f l* IM1
U ltll
'IV.''
® '
x/í/:'/:;
^ í# i^
" i'l
íá # !# :
I
I
1I
v 'y M í
' '&■
\(j:.
¡•i/!
.'¡fj;
!IAi W íi,| « lliílw 11 l i l i
1 '
# t y i y :y iw
M
M
^ M ’k 4
é .
$000É0 ^§3$Í§$Í
10 11 II11t|i
W
I '
i■h'
i
‘‘.‘^N
/; ‘i .^.
V.-:
h:
I;
I
1
:. &
'í:-;
. #
■y Jí-v^í:.
W‘i-%Í: til
11®;«: 1
,ifc.
%
r¿,: i f '
'í'c
#
%
? %
'
M-
ap
:í
....... ......... ••:,.
á[&
f IfV lí
#1,
•::í ^
Jií; C
I-;.:».-
■M k
i-«-;
.....
CJ'11%r;"'
# %
. : # #
%
v.
^
á
%
»
1
1
«
$
4 |#'%# «8
IIIIIK IIJ
..
ilili
f}pfá$\
....
;b
/?¿
# fK -
m
ItttlflS -J tA llf
&
:
f f I tl:;f f 1 . f
0 :m
<1 \'I,V
*3®
^ . :? ¡ É
flPII
ilIlIlK illi
V 0 Í
!p
i1Í;f':í^:t
€■
J (é
..V .................... .
# ' # '
m
M
i f / M
á;i:-:é.^M:
flS®!*!
■ m k %
f
;\<s. ‘.p^.í.^: *yy
I
:<jví
l i # :
&
k-
#
:| :S ;4 I"'!® Íl.f l' l
■ f i l i
,i í
'•
iI»KM®
ilá ll
%
tw i#
L
11
«
•
,,
ir ^ j;
i#
.'. V
,
•;',V.
&!
w.\
M
rvui:
'¥1
V¿i\
¡fli Cll i l l l i l
.\
l^ :
¥9W^á% i#
%
¡»ilAlllll
><í; :¿¿/íjk-
f
t #■ i
m
6 § l i l i l í o i i i i IiiíJ s i m
f:
'siixar"
fe
,§:>i
« » j t ic l 10 IIC
1
1
* ,!'
1
1
n¡os
1 1 , 1
n
%
|
I
*
!t
U W IC iJC l
í^ U í;
Wi;.
^ í í ’’
.^'
r?¡4¡iv>/>;
EP MSf i J f i . f
¡<
%';v>
?! {jif 4 :..# ?;
I
i-:#
¡■^:
É
I
P
ú
ír
i?
Y0Wí>¿k
t e
^
r'
i ; éf f 'mfél
%
>
$
f c
W '^ W -
<:
I i p i l 11*11
^ f #'
1
.
fí : *
•;#
ffi/
m ^§% M %?**%
r f
% , . -jp’
;;.á' ; í :
W
:f e v í * >
#
t'líll
IJ:|
É |||í
i --
■Oí;
••• J ; : i !f$
•: M
l i
-.
lí: ’«i® I
%##% • • 11 f 1
|Í !§ '|Jí?
.'-f1 ?^ :J;
i «11 * * # á
M
If l|fl 11
t e í
V;V
t: '% .
íí;
I I .
íí:
áv:
#'%
%# f
M I Í
'fe
é ..AI % I
i# i * 1 «1* m
"I§
if^ I I É J t A 4A I#
Ijm,»
liFIllIíj
%¡¡4¡¡
t f lJ il!
ii itii
IÉ «: 1 # Ii
f f!•% #%,|
1%#■# 11 %lfe*
f e :
Í¿
*
1
ÍS-.' ¡;¿V
é
# . v .
'* í ;
V',;
-T% i-
í|s i: ¡ |
ili
fl
w
É '':';,lk
:ft$
f
•«
t
^
i
iíí.
fiX-
&
V
W r : 'i
®l i
ttf'iíftí lii fe
I % Í SW f« W ' ..
É
.
■
J
%#%ff ffc#'
t f%
l#íf%
f#
Wr"
% i!ií
/ /» ''« t J l
'iW fc ■■$!>
m
Í14Í
fli
fe 1 §¡1
4y
• f t f:§1|f
%#%#
t
I :P%f
I ;1Í IJ
II
!#r
t #
ft
f
lá l
.
:>¡.'"
■
•3 % ;,
l' e
. .
Él
:
I
■ H fr.
®:IS1
’h m
«
Í:
#%4S:f:f
I# ti li II
a S$
te
u
%
'
I«ap
flA f f
'WfáiW/Xl;
1 1 1#% 1
aí': '1# | fi# M jlli | %M#1
p?:íí;'';.
:'::í':'-''v • # ; ' :: % í ■'“#
K P;
m
€ ir
€
/p.
:%
p%n$
Í: ............. áfe
¡n^4i *1'
. . . . . # %
:ii
I
' #
;
« ii* # 4 « if’"
ñ
U :;:*slJyi
Ü
w .
v .
:W
w a t«
AiSf i-
11»
I
|
,
u
.
#
,íP É
W - fó
.......... . j ® .
'
*■
M
m
#
:
I l i l i i l I I llJ s il
■ i'.- .
' / / :::Í V - :. ;:
: < y /X
M
feI;##¡É®
m
.
:
%
, «
W
1 '.
f&
f
P
m
m w
I .
is
mm'.
&"'
■'mm.
Wi®
mmvwm»
■tmm\ amm,'
mam> mum
flllt
%
lV■
:'Mfi
ml.
!M>j.
if
’W
'#}■
'W*m ’m m
mmmm
■’■•■ • ! •
WiW
•••.•!.•;••'•,<•••;.' •.••••••••.•••.-.
wmm.
•v; ■'•:i
ummtMmmmm
■
K
>
?% 4i
:0%
•!VJi":rv5|
r^
f '% U
$
t>
In
% % #
I
:-yj
i | : '4
* W ]U'^-
1 1ffij 1
■y-,'7-
i 1
l ;i
^,v::;
<&*
/I 1 ' I
& :l $
c#11
i 1%f
f^
f ,#fe
%) I
vjj,
okStj-t
■'■■■*■•«*.<? *
*
v
*
C
X
&
%
*S*»
a n #
iijif'fe
ll
riS
i»
} r o b I t s is
•I
%
IIj
^Tr1.
■
a
m I4
i: •^. ■*
Ip
M $
f1 "1
%
u
.;•;$ I i:/
4.
,j *■%*%.M
:?
&■
®Im
.^V:
'.'rife
if% f % ;<
I
0'f i I:<-.
% l % f
■
/% :%! #'
'■?)
:vV^ ■*
'<*■'
m.
.■
.\
i
,>i
t W% i
'I i li# ■.!
I ■:*>r5: ''*
i
f
'
1
|
|
f
0%
f’
%
f
i
i*:1
.
^ || | ■« -■s‘i.- '■ ■■
!«
?; - * » «-
f % a 11 # )W I
:|,f ■
m :i S ,fW $ i| i|
/:?
I
■
'ifA
',!■
■ft ■
■>
.< '■;'i
■
jrj:■% f| i
jf
.I :
i
#
■I ■
«!
m
(I
il! <~
?j'r
ivl
\k 4 %
%%
■Ml
^I
t.
^
I| l|4
#|:$f 1
% I%
<■:-3
-3
,||
:.v:' iVf Vk'■
•.i; ■
■'A
#%
;
r
^
m
$
I I
|.
fyj/xsy
ft
•#
I •
*.
# %
•I ■%
#%ifi ip'Ci J
jl 111
1
.f
%
f
1
y iiu ii
V
a
1Sit=/8 'i
n
4 1
O I
SI * :iU
% .:# li'
■/c
&
■
■
ft '¡T
y% W'%. .'ij.
I k ■«: '* '.ft ■■£: j:: % ,
v...'3
111.1. # i
§
IX
'!% sV
f'i! »
i i
I I |
fei'
■
flj
f
f\
:x-'W
if
W :>k '1
I
iij:.'••'
* It
.i %,
\ 1 1 V I1
-W;1
:$ M&h
h. I i'f I
i 4 %f
fin
I ill*
7i
•'M
k
■&
■
>
‘X
■W%
%!
.,
M%il I i '4^ -y§
%
I
i l l%wli?
1 1 #1^ V **
.
n
f
:#;• i
-7>
4%
If f
:
»
iWI
J
j
v
I
I
;
S
j
'•^:i#'
jttH#
h
■
ist #
ifi €
.ƒ//• i
.'fr: i■
&
M
;il
M
%}J
^¿?
%
.fe
t
|
■"%?
4 /
•1
$,
V
N
-
f
'A
w
1
%
'C
!> vu
*■J /C4 I I %J
&
Yf
I
!s
: I
:
S
I
A
1'v?
m i •1; rfc 1
>
\
\ ft. :% ■
■
$ :n & '!/.
■V'
I I I | ,# I %
¥?■ k: m 1
ii A
''fj
#i$t0
% S' ';t|
!i
I
■
&
C
ill
f%
I
C*
C
"»<;*
f
ife
W;
%sri^
/iit
!-i\,
1» li
7
W
&rA
fV-m :{
I %J
f ,i| 0 * # |
V I l<6r▼
II
•
ii
iu
IJ
••si!
Ik I#1
iii '.r^i
I .*'4
S i n g
'Jl?
f%
*
jP
I%
Sfi-' Vix^
•i
b.
I
t ..! I
#
ji.: %W#
y ."0 s$! .#
!&; ri
%
I I 'V
'•¿=^
i
1 I
f%
i
l i 1 1 1 1 1 ; l i,; i : S
.•.jH»i
ffi' 9
A
'
■%sij M
V
l
,<r/'
it
f
M l
■
■
^ |%
:,s. |■
V
ii
f t # ;»
1' ' i m .
» !* % r; A
:i'»i
:i^;,:^'
1|4 If
im
In
1 ...
*
l i t !
%■ §(:
Ji# ^
«
fe .
•45i?'v':'-
.
if
f% n i*i f t «»
1J
b,
%
■
#
» w
,. ....
%'0
# : :^i li .;§ ■'■$
*
1 .11
^ I I
*J
J
,'iF -i ||, ^1:
li'
l
«
# .% •%
W %':!!
f
I »
% j % %>ivv
%4 f
$
iV:
}fr
V
|
1
1
III
I
*■*1.1
'4^1
■
/i
:0
'/£
\i<fr-"\$
!I
%0\% Ui;/f/
r^..-^
::^1
i
«t;| | f %.
|,i' I 1 1 4 '%m>
iii •■
iii
t j 111 J4S iit%
,
j | 1lX iI!%i\ \i%'.
1
f?
sl f!V"'^ f
'1
i
li%
i
■
i.
V%
0k
k '% 'i- '
%
,
v
; li ■
^
•■
•;
-
^ ,v' -4
•' "4i
%
1 f i l l
1 1 f13. "ITj(j #
;* H1
j-
%:
c i i % / #■^ t ;i
I f i %n%
I I 4,i I I I
V
':'%
y
^
1
& Ij
&5l
i Q
I f%
i* * U
1 f ' III
I
:r,i
/:>;
I«
#4 j
V>. a
%<?$Q
S#
"
%
'* %, I
8 '1
W
iX
:
i
f
. |
-55
lili
:,J
,,- |
.:f& ifS! %
%
%
%
%
%
%
I
I
:4 ■
■
& ■i.
f \ % S f 0m %,,
% ,i
$
f % €. . -.¡•¿I
k W
■'$. %
' i >?i
#11 %
%
•4
1#.
I..
^ ^ i£%
\■S %,#
^ I % %h
■M
0M
Q9
t
1
If i ?
i
;
'^
i.¡h 1
,«w I
'ifc *
/v;•
$
y$\
P%
?I I % I '%
'!(<
'^i|i|l„•
1^ |*l
f>
-i'- 7*'
Ji
•i
V!: %
.¡fe
I If I I f :
l11
v>I ;ps« I:
« 1 1t s
i
t
w
■
y .■
*
I :i i|sii :l I 5| #
■.ii--■^1
I I
I%?*"$i ,.#I if tI %i i %4>]i 1 '
t
11
i
■/^*
:'Ii. r:i!; p'^%
»
% 6!
% 1 | I 1 ^ f1 |
u#I
J fei 1 ,# Mi I I ■
!1 1
I f I t il#* f 1
'ftm
W^i
’■
ij
^ffe.
1
•rJ&, .<
# % '&w- ■*.3
i # %
I %■% '% | i
II):#
%m % '4
> S 1I
| P% 0 k f % f %0
M
‘
-M ••!>&'
■$ ■■$ i!ij 'A r|
I
,
#
l
i
I
■
^
/
I
%
I I 8# %
...
% J %4 | I %:ij*
:=i
f t 'i f* f | i f-ii ifr;
% w*
;i'
f
t
II .#"'
^
%%cii
IS# .^
[|
■f
<%
//ivrrifri
•=&
i.
I | 1|
%ji^'
.•>}!
jli '6 Sj
ifjrA
li.
■r
4 ,,;^
.ui
I
#%
»%
0
' ' .;|i
^"•,r/
il
%y|:;'
%0 % fa
4
|
%i
<
ft;.
lilfel
T! IISSC S
ij'! !C:
%m
#4
c
%■.
n i
* I%
%
*><<*' ,
t I
il V^i
C l w%
C i I I %s
?i!
=fli
m
i# I
M.S.'
:,£,fmy
I
f% f
I
II il i
W #%.
I
Cl I
1i
■
:^j :|i ''%:y .:&'..'2
%:
#■
■
■
'&
>4 »
I f1
5%:4 J-
#
Jl 'fr'f<^
J
f .#
%
4.
infj'
•in’.
W.'.
A'i5
0 h .#
/)c ' "
i 4 %#
'1 %
;^ l^fpk •«jHI
fei#'
'§
nJ
^
;;m
k‘
.m u
1
:;i 'fej/ ^ 4
'.i/i i/
I
.'.K'
*4 11 r
%.A$
•c-.f 'W;' '%
■
s>
■
'?k ■?
ni
vX-iH
^
•;k
W^5 Sft
i:
...//.'Vi*,
■
I %;
I
c s
/r / '%
•2f
'
ii/j--'/
'iJjb-
14 %
i i^r1111
i ^ i0th.
i n%$ t"i
ff t
I II
%v:i?
:Si
I
f
c.
flfi 1*11 #*
:'^
»# i
%
I
...
:»iss
..'i*
—
I*
r-■% ^ -1
*
1
1
4
1
*sfs
is
m
t
'*%
€ I r i I 11 F I # 1 C l
i v3| %, # '4^ 4 li 8
I*
;0£
€
v.
# I I ,,
^ ff1
!
•>':
w^m%
.#%.
.y/'^ kf (4
I
w
li :i :
'#| I '?
/
'' to
M '-i:
:^r
t-
iyb:} I-
•/
r% w %
MI li i n
^
|li .\ ^
%
*i.^ '1
1 1® i t
lif f
•^,
4
I 11
%b#;
1 T\
1
*'i'.
--V
f:
¡AK:<
,iI?
-1
jpv:#
fife« .4
%
i •:!
4
4%
4% f,^f'
t 'n5r; :;^ p |®# '
-iji?
"%i#
,.,
'
üieciroptïiiï'i'à/.v ivvu, v
/uv—
*/14
with the molecular mass of 265 kDa determined by ana
lytical ultracentrifugation [11] and confirms the m ono
meric structure o f the glycoprotein complex by an inde
pendent m ethod.
3.2.2 Analysis of O X PH O S proteins from cell lines
Figure 3 shows the protein patterns in 2-D gels from
Molt-4 lymphoblasts. The patterns from human cell
lines, such as FL am nion cells and HeLa cells, look very
similar (not shown). Complex I could rarely be identified
in silver-stained 2-D gels from hum an cells, although it
could be easily identified in murine cells (not shown).
Complex II comprises four different protein subunits in
mammals with molecular masses of 70, 27, 13 and 9.0
kDa, although five protein bands can be detected, as
indicated by the arrows (Fig. 3). Amino-terminal protein
sequencing revealed that the additional 9.3 kDa 'com
ponent is the preprotein to the 9.0 kDa protein that is
not yet processed to the mature 9.0 kDa form (ScMgger,
Hm unpublished). Complex IV is present in two forms,
the major m onom eric form with the normal apparent
molecular masses of 200 kDa and a minor IV’-form with
an apparent mass of about 150 kDa. Several protein sub
units, e.g. the 9.5 kDa subunit Via and the 7.0 kDa sub
unit, are missing in the IV’-form. This can be caused by
dissociation from the holo-complex at the high deter
gent/protein ratio required for solubilization. Complex
V-monomer and complex Ill-dim er with apparent molec
ular masses of 600 kDa and 500 kDa in the first-dimen
sional BN-PAGE (not shown) seem to be less sensitive
to high detergent, and only one form each with the
normal polypeptide composition [1—3] is observed in the
second-dimensional SDS-PAGE.
3.2.3 Deviations from normal OX PH O S protein patterns
in fibroblasts
A normal OXPHOS protein pattern from primary skin
fibroblasts o f a healthy individual is shown in Fig. 4A.
Complex I again is the only complex that is usually not
detected in Coomassie and silver-stained 2-D gels. A 2-D
gel of a patient with mitochondrial encephalomyopathy
is shown in Fig. 4B. Complex IV was hardly detectable
in the patient’s fibroblasts. This is in agreement with the
low complex IV catalytic acitivity, measured in fibro
blasts and muscle of the patient. The most prominent
alteration, however, concerned complex V. The largest
subunits of complex V, the alpha and beta subunits,
were detected at two different locations, at the normal
position of complex V, also called FjF 0 ATP-synthase
(600 kDa), and at the position of the free Fj subcomplex
(400 kDa). Since BN-PAGE separates proteins according
to their molecular masses [21] the Fx subcomplex will be
found in the vicinity of complex III, which has an
apparent molecular mass o f 480 kDa [22]. This complex
V abnormality, characterized by the presence of a consi
derable portion of an Fj sub comp lex was detected nei
ther in skeletal muscle samples nor in fibroblasts from
control individuals. It was also absent in muscle samples
from patients with deletions or individual defects of
either complex I or complex IV [2]. However, it was
Oxidative phosphorylation enzym es in platelets and cell lines
713
found recently in m uscle o f patients with Leigh's disease
with normal complex IV, and a point m utation (T -+G at
position 8933) in the m itochondrial ATP 6 gene [23]. The
single amino acid exchange in a protein subunit of com
plex V seem ed to selectively influence th e structural sta
bility or assembly o f this complex. In the present case a
point m utation in any gene o f a com plex V subunit is
unlikely, since additionally the am ount o f assembled
complex IV was reduced by 80%. We therefore suspect
that a novel point m utation in either one of the m ito
chondrial tRNAs could be responsible for the sim ulta
neous expression o f the com plex V abnorm ality and the
complex IV deficiency,
4 Concluding remarks
OXPHOS deficiencies present in skeletal muscle can
also be expressed in skin fibroblasts in som e forms of
mitochondrial encephalom yopathies [24]. If OXPHOS
deficiencies are not detectable in fibroblasts of patients
with mitochondrial encephalom yopathy, a needle or sur
gical biopsy o f skeletal m uscle will still be required* The
possibility to use cell lines from control individuals and
from patients offers th e chance for studies o f OXPHOS
complexes under varying conditions, i.e., there is m ore
flexibility in probing the influence o f inhibitors, hor
mones, and transcription factors. It seems possible to
study the biogenesis, assembly, and turnover of
OXPHOS complexes in cell cultures, and the influence
of thyroid horm ones, steriod horm ones, and cytokines
on the OXPHOS system.
OXPHOS analysis in blood o f patients certainly may
have the same or even stronger restrictions as the anal
ysis of cell lines. The percentage o f the MELAS point
m utation in m itochondrial D N A , for example, was found
to be 90% in muscle, b u t only 25% in blood [5]. Sim
ilarly, the chronic progressive external ophthalmoplegia
(CPEO) and Kears Sayre syndrom e (KSS) forms o f m ito
chondrial encephalom yopathies are characterized by
deletions in muscle m itochondrial DNA, b u t these dele
tions are hardly detectable in blood cells. Therefore, the
2-D electrophoretic approach will n o t detect OXPHOS
alterations in these cases (c f references in [25]). In
Pearson marrow-pancreas syndrom e, however, the gene
ralized cytopenia correlates with a high percentage of
mtDNA deletions in peripheral blood [26], and enzy
matic analyses revealed a com plex IV deficiency in fibro
blasts and lymphoblastoid cell lines [27]. F uture experi
ments will show if these genetic and enzymatic defects
are also expressed by reduced am ounts o f assembled
complexes or by altered ratios o f complexes in platelets.
We would like to stress th e potential use o f the 2-D elec
trophoretic technique for the analysis o f G lanzm ann’s
throm basthenia [13] or other diseases with defects in the
platelet glycoprotein com plex, e.g. neonatal alio im m une
throm bocytopenia [12].
These investigations were supported by a grant o f the
Deutsche Forschungsgemeinschaft to H erm ann Schägger:
Received Novem ber 23, 1995
4
A
I
l n
n
,
U W l l
I
5 References
[1 Schägger, H .}
1» n ( ; » r r ’ * '
*’ » ■ '
# ' ■ • > » *
*
' »
I VI 7 ” ' * /
|
tTf
Electrophoresis 1995, 16, 763—770,
[2 Bentlage, H., de Coo, R., ter Laak, H., Sengers, R,, Trijbels, F.,
R uitenbeek, W., Schlote, W., PfeifTer, K., Gencic, S,, von Jagow,
G., Schägger, H „ Eur. J, B iochem . 1995, 227 , 909-915.
13 Schägger, H „ O hm , T. G ., Eur. J. B iochem . 1995, 227 , 916-921.
[4 R obinson, B. H ., G lerum , D. M., Chow, W., Petrova-Benedict, R.,
Lightowlers, R., Capaldi, R., Pedriatr . R e s . 1990, 28 , 549-555.
[5 De Vries, D. D., de Wijs, I,, Ruitenbeek, W., Begeer, J., Smit, P.,
Bentlage, H., van Oost, B, A ., J. NeuroL Sei . 1994, 124 , 77-82,
[6 Benecke» R., Strüm per, P., Weiss, H., B rain 1993, 7/6, 1451—1463.
[7 Parker, W. D., Filley, C. M., Parks, J* K., Neurology 1990,4 0 , 1302—
1303.
[8 H elenius, A., Simons, K., J, Biol, Chem. 1972, 247 , 3656—3661.
[9 Hawiger, J., T im m ons, S., M ethods E nzym ol. 1992, 2 /J , 228—243,
[10 Schiigger, H., von Jagow, G ., A nal, Biochem . 1991, J99y 223-231.
[11 Phillips, D. R., Fitzgerald, L., Parise, L., Steiner, B., M ethods
E nzym of, 1992, 215 , 244-263,
[12 Kuijpers, R. W., Simsek, S., Faber, N. M.» Goldschmeding, R., van
W erm erkerken, von dem Borne, A. E., B lood 1993, 81, 70-76.
[13 Ruggeri, 2 . M ., Bader, R., D eM arco, L., Proc. N atl. A ca d , S e i USA
1983, 79, 6038-6041.
[14 Walker, J. E., Quart. Rev. B io p h ys , 1992, 25, 253—324.
[15 Schägger, H., M ethods E nzym ol, 1995, 2 6 0 , 190-202,
[16] Schägger, H., Unk» Th. A., Engel, W. D., von Jagow, Ci.,
2jw:rymfl/. 1986, 126, 224—237.
[17] Kadenbach, 13., Merle, P., FICBS U w . (1981), /.f.\ 1’ 11.
[18] Collinson, J. R., Runswick, M. J., Buchanan, S. K., Fearnley, 1. M„
Skehel, J. M., Raaij, M. J., GrilTith, D. F.. Walker, J. U.,
mistry 1994, j j \ 7971-7978,
[19] Calvete, J. J., Menschen, A., Gon/akv.-RiuIriii«c/, J.. Biochem. J.
1989, 26/, 561-568.
[20] Fitzgerald, L. A., Steiner, N., Rail, S. C.. I o, S. S.. Phillips, I). R.,
J. BioL Chem. 1995, 262, 3936^3939.
[21] Schiigger, H., Cm me r, W, A,» von J agtnv, Ci., A n ui. Bi m it cm . 1994,
217 , 220-230.
[22 ] Schägger, H., Brandt, U„ Cienctc, S., u m Jagow, G., Methads
Enzymol. 1995, 26(K 82—96.
[23] Houstek, J., Klement, P.^ Hermanska, J., Houstkovu, H., Hansikova, H., Van den Bogert, C., Zeman, J., B tm h tm . ßm phys, Acta
1995, 1271, 349—357,
[24] Sperl, W., Ruitenbeek, W., Trijbels, J.
K. Ktuenkc> G, C., Sengers, R. C. A., J. Inherited Metalh Dts 199p, /,*„ 359 362.
[25] Lestienne, P.* Biochimie 1992,
123 130.
[26] De Vries, D. D., Buzing, C J,
Ruitenheek, W., van der Wo uw,
M. P. M. E., Sperl, W., Sengers, R. C. A., Trijhcls* J, M F., van
Oost, B. A., Neuromusc. Dixord, 1992, J, 185 195.
[27] Bourgeron* TM Chretien, D., Rötig, A., Munnich, A.. Rustin, P.,
J. Biol. Chem. 1993, 2<Wi, 19369..19376,

Download Report