Academiejaar 2013-2014
DRUGSCREENING IN ZEBRAVISMODELLEN: EEN OVERZICHT
ZEBRAVISMODELLEN TOEGEPAST OP DE BINDWEEFSELAANDOENINGEN
Julie SMET
Promotor: Dr. Andy Willaert
Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
DRUGSCREENING IN ZEBRAVISMODELLEN: EEN OVERZICHT
ZEBRAVISMODELLEN TOEGEPAST OP DE BINDWEEFSELAANDOENINGEN
Julie SMET
Promotor: Dr. Andy Willaert
Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
Voorwoord
Nu deze thesis na veel bloed, zweet en vooral tranen af is, wil ik graag van de
gelegenheid gebruik maken om een aantal mensen te bedanken. Om te beginnen mijn
promotor, Dr. Andy Willaert, zonder wie dit werk er nooit gekomen zou zijn. Bedankt voor
de aanwijzingen, het herlezen, de aangereikte informatie en de vriendelijke antwoorden op
mijn paniekerige vragen.
Verder wil ik graag mijn ouders en gezin bedanken en me verontschuldigen bij mijn
kotgenoten. Ik heb het jullie niet gemakkelijk gemaakt de voorbije maanden, toen de deadline
meer in zicht kwam. Bedankt voor het luisteren naar mijn zoveelste to do-lijstje en al mijn
kleine grote problemen.
Bedankt ook aan Sam Brondeel, Lissa De Potter, en Sofie Colman, die de taak op zich
namen om stukken van mijn thesis of zelfs de hele boel door te lezen en aan Dorien Cooman,
Elias Impens en Emilie Janssens, die zorgden voor afleiding en ontspanning toen dat nodig
was.
Tenslotte, voor een combinatie van al het voorgaande, wil ik vooral ook Sasha
Libbrecht bedanken, die meer dan enig ander mijn thesismonologen heeft moeten aanhoren en
dat bijna altijd zonder morren onderging. Dankjewel.
Inhoudstafel
1.
Abstract ............................................................................................................................... 1
2.
Inleiding / Vraagstelling ..................................................................................................... 2
3.
Methodologie ...................................................................................................................... 3
4.
Resultaten ............................................................................................................................ 5
4.1
Algemeen ..................................................................................................................... 5
4.1.1
Compound screening ............................................................................................ 5
4.1.2
Diermodellen in high-throughput screening ........................................................ 6
4.1.3
Een vergelijking tussen de zebravis en andere diermodellen. .............................. 7
4.1.4
Toepassingen van de zebravis in drugscreening ................................................ 11
4.1.5
Zebravismodellen voor erfelijke afwijkingen. ................................................... 13
4.1.5.1 Forward genetics............................................................................................. 13
4.1.5.2 Reverse genetics ............................................................................................. 14
4.1.5.3 Beschikbare modellen..................................................................................... 16
4.1.6
Praktisch: de zebravis in HTS ............................................................................ 18
4.1.7
Read-out parameters voor compound screening in zebravissen ........................ 21
4.2
Compound screening voor cardiovasculaire toepassingen ........................................ 23
4.2.1
Gelijkenissen en verschillen van het cardiovasculaire stelsel van mens en vis . 23
4.2.2
Het waarom van de zebravis in cardiovasculair onderzoek ............................... 24
4.2.3
De zebravis in cardiovasculaire compound screening ....................................... 26
4.3
Compound screening voor botaandoeningen ............................................................ 28
4.3.1
Gelijkenissen en verschillen van het skelet van mens en vis ............................. 28
4.3.2
De zebravis in botgerelateerde compound screening ......................................... 28
4.4
Compound screening voor huidaandoeningen .......................................................... 30
4.4.1
Gelijkenissen en verschillen tussen de huid van mens en vis ............................ 30
4.4.2
De zebravis in huidgerelateerde compound screening ....................................... 32
5.
Discussie ........................................................................................................................... 33
6.
Referentielijst .................................................................................................................... 33
1.
Abstract
In de zoektocht naar nieuwe farmaca worden sinds lang proefdieren gebruikt als model
voor menselijke ziekten. De kleine diermodellen Drosophila Melanogaster, Caenorhabditis
Elegans en Danio Rerio maken hier relatief recent hun opmars. In tegenstelling tot de grotere
zoogdiermodellen zoals muis en rat zijn ze bijzonder geschikt voor high-throughput screening
(HTS), het principe waarbij men door het automatiseren van screeningstechnieken snellere
resultaten wil behalen bij meer proefdieren. Dit omdat ze klein, goedkoop, snel te kweken en
in hun vroege ontwikkelingsstadia transparant zijn. Danio rerio, de zebravis, is van deze drie
de enige gewervelde, met dus een sterkere gelijkenis tussen zijn orgaansystemen en die van
de mens en genen die voor 70% homoloog zijn aan de menselijke. Zebravissen kunnen
gebruikt worden voor verschillende toepassingen. Wild-type vissen kunnen van pas komen in
toxiciteitsstudies en mutante vissen, die erfelijke menselijke afwijkingen simuleren, kunnen
gebruikt worden voor enerzijds de ontrafeling van de bijhorende pathogene mechanismen
maar anderzijds ook voor het ontdekken van nieuwe therapeutische moleculen, het
onderzoeken van het werkingsmechanisme van de geneesmiddelen en voor het nagaan van
structuur-activiteitsrelaties. Mutaties kunnen gecreëerd worden via willekeurige mutagenese
maar er zijn ook technieken beschikbaar die meer gericht specifieke genen aan- of
uitschakelen. In deze thesis wordt verder gefocust op de praktische uitwerking van een
drugscreening met zebravissen en de mogelijke parameters die in zo’n studie belangrijk zijn.
De focus ligt in deze thesis op drugscreening bij erfelijke bindweefselaandoeningen, waarbij
drie
verschillende
orgaansystemen
worden
besproken:
cardiovasculaire-,
bot-
en
huidaandoeningen. Het cardiovasculaire stelsel van mens en zebravis vertoont vele
gelijkenissen. Verschillende studies tonen aan dat gekende geneesmiddelen met cardiaal
effect vergelijkbare effecten vertonen in zebravissen, waaronder de QT-verlengende farmaca.
Daarnaast werden in een studie met een model voor aorta coarctatio, gridlock, twee moleculen
ontdekt met een therapeutisch effect op de afwijking. Voor de botafwijkingen is de zebravis
best beschreven als mogelijk model voor osteoporosestudies. Onder meer toediening van
corticosteroïden en een overmaat aan ijzer veroorzaken osteoporose in de zebravis, wat
overeenkomt met wat we weten voor de mens. Voor dit laatste werd gevonden dat
behandeling met deferoxamine effect had op de osteoporotische zebravis en dus een
mogelijke behandelingspiste is in de mens. Onderzoek toont verder aan dat de zebravismutant
chihuahua fenotypisch en genotypisch een model is voor osteogenesis imperfecta en dus
1
mogelijk ook als model kan dienen voor drugscreening. Voor huidaandoeningen is het meeste
onderzoek gebeurd naar hypopigmenterende geneesmiddelen. Gekende farmaca blijken hier
ook een effect te hebben op de zebravis. Uit deze onderzoeken kan geconcludeerd worden dat
de zebravis een waardevol model is voor drugscreening. Het is vermoedelijk dan ook maar
een kwestie van tijd voor er meer studies zullen uitgevoerd worden met deze dieren en nieuwe
geneesmiddelen zullen ontdekt worden door gebruik van de zebravis.
2.
Inleiding / Vraagstelling
De wereld van het farmaceutisch onderzoek is er één die continu in beweging is. Er
wordt voortdurend gezocht naar nieuwe geneesmiddelen en therapieën, maar ook naar betere
methodes voor het ontdekken hiervan. Nieuwe moleculen en farmaca worden uitvoerig getest
voor ze aan de mens toegediend worden. Dit kan zowel in vivo als in vitro gebeuren. Voor in
vitro screening gebruikt men vaak celculturen. Het nadeel hiervan is dat de structuren waarop
het geneesmiddel moet inwerken, de targets, op voorhand gekend moeten zijn. Targets
kunnen zowel moleculen (ook ‘doelmolecule’ genoemd), genen of processen zijn. Een
voorbeeld hiervan is sclerostine, een eiwit dat in de mens geassocieerd wordt met een lagere
botdensiteit en een hoger risico op breuken. Geneesmiddelen die zich richten op de inhibitie
van dit proteïne, dus sclerostine als target gebruiken, kunnen dan ook mogelijk gebruikt
worden in de behandeling van osteoporose en andere skeletziekten.(1) Hiernaast werken de
cellen en weefsels in een levend organisme nauw samen, een situatie die niet na te bootsen is
in celculturen. Veel van de potentiële geneesmiddelen blijken daardoor in een later, in vivo,
teststadium niet te werken.(2–4)
Een oplossing voor dit probleem is het testen op volledige levende dieren. De
klassieke zoogdiermodellen zijn rat en muis, omwille van hun vele gelijkenissen met de mens.
Het grote probleem is hier echter de moeilijke automatisering en de grote hoeveelheid tijd en
energie die in één generatie proefdieren moet gestoken worden. Het duurt namelijk lang voor
een jong knaagdier voldoende ontwikkeld is om er onderzoeken op uit te voeren en in de
tussentijd moeten deze dieren wel onderhouden worden.(2) Als goedkoper alternatief, en
zeker sinds de ontwikkeling van nieuwere robotica en geautomatiseerde beeldvorming sneller
onderzoek toelaat, is een nieuwe groep proefdieren op de voorgrond getreden, de kleine
diermodellen. We herkennen hier twee ongewervelde dieren, de fruitvlieg Drosophila
melanogaster en de rondworm Caenorhabditis Elegans en één gewervelde, de zebravis,
2
Danio rerio. Deze laatste springt er uit omwille van een aantal redenen, waaronder zijn
grotere overeenkomsten met de mens.
Zebravissen zijn kleine, tropische vissen, onderdeel van de infraklasse beenvissen, die
gemakkelijk te kweken en te houden zijn (figuur 1). Ze zijn daarom populair bij zowel
aquariumhouders als onderzoekers. Zijn orgaansystemen vertonen veel gelijkenissen met die
van de mens. Samen met onder andere de transparantie in zijn vroegste ontwikkelingsstadia
maakt dit van de zebravis een veelbelovend model voor het bestuderen van menselijke
afwijkingen. De initiële interesse in de zebravis beperkte zich voornamelijk tot de
ontwikkelingsbiologie. Sinds een aantal jaar is er ook meer en meer interesse voor het gebruik
van zebravissen als modelorganisme, inclusief het uitvoeren van drugscreenings.
Het doel van deze masterproef bestaat erin door vergelijking en beschrijving van
verschillende studies, de mogelijkheden en beperkingen van deze tropische vis nader te
bekijken, een beter beeld te krijgen van wat er in recente drugscreenings bij zebravissen
bereikt is en waarmee rekening gehouden moet worden indien men een dergelijke studie wil
uitvoeren.
Figuur 1. Representatieve beelden van de zebravis. Links: Volwassen zebravis en embryo’s in 1-cellig stadium
(onderaan links), 24 uur na de bevruchting (onderaan midden) en 3 dagen na de bevruchting (onderaan rechts)
Rechts: 5-dagen oude embryo’s verdeeld over een microtiterplaat.(5)
3.
Methodologie
Voor het schrijven van deze thesis zijn verschillende artikels gebruikt. Deze werden
opgezocht in drie online databases: PubMed, Google Scholar en Web of Knowledge. Deze
thesis wil zich vooral richten op drugscreening bij zebravismodellen voor erfelijke
bindweefselaandoeningen. Daarom werd opzoekingswerk verricht binnen drie subdomeinen
3
hiervan: de cardiovasculaire studies, de botstudies en die studies die zich toespitsen op de
huidaandoeningen.
De zoekopdracht ‘zebrafish’ AND ‘drugscreening’ leverde 597 artikels op in PubMed.
Bij het doorlezen van deze titels en abstracten viel een eerste artikel vrijwel meteen op. ‘Kari
G, Rodeck U, Dicker AP. Zebrafish: An Emerging Model System for Human Disease and
Drug Discovery. Clin Pharmacol Ther. 2007 May 9;82(1):70–80.’ Het doorlezen van dit
artikel gaf een eerste beeld van de materie. Uit de MeSH-termen werden zoektermen gehaald.
Deze (‘Zebrafish’, ‘Drug Discovery’, ‘Drug Evaluation, Preclinical’, ‘Drug Design’) werden
opnieuw in PubMed ingevoerd, wat 292 artikels opleverde, waarvan 20 met deze termen in de
titel. Na het doorlezen van de abstracts hiervan werden er acht van weerhouden, wat een totaal
geeft van negen publicaties.
Voor het vinden van cardiovasculair gerichte publicaties werden in PubMed volgende
zoektermen ingegeven: ‘Drug screen*’, ‘Chemical screen’, ‘Compound’, ‘Drug evaluation’,
‘Drug design’, Zebrafish, ‘Heart, ‘Aorta’, ‘Aortic’, ‘Cardiovasc*’ en ‘vascul*’. Deze
zoekopdracht leverde 165 publicaties op. Na doorlezen van de abstracts werden hieruit 44
artikels weerhouden. Voor de meer botgerichte artikels werden dezelfde zoektermen
ingegeven, met vervanging van de vijf laatste door de termen ‘bone’ en ‘skelet*’. Dit leverde
85 artikels op, waar er na doorlezen van het abstract nog 13 van overbleven. Twee verdere
zoekopdrachten met ‘zebrafish bone compound’ en ‘zebrafish osteoporosis’ leverden
respectievelijk 13 en 20 artikels op. Hier werden er na doorlezen van de artikels 7 relevante
van weerhouden. Voor de huidgerichte publicaties werd gezocht met de termen ‘Drug
screen*’, ‘Chemical screen’, ‘Compound’, ‘Drug evaluation’, ‘Drug design’, ‘Zebrafish’,
‘Skin’ en ‘Melanocyt*’. Dit leverde 24 artikels op, waarvan er 6 weerhouden zijn.
Na het vinden van gerelateerde citaties in PubMed en interessante artikels in de
referenties van verschillende gebruikte artikels of aangereikt door de promotor van de dit
werk, Dr. Andy Willaert, werden de titels hiervan ook ingegeven in PubMed of zfin.org. Deze
werden ook toegevoegd aan de bibliografie en gebruikt bij het schrijven van deze thesis. Ook
het invoeren in PubMed van termen waar meer informatie over nodig was (bijvoorbeeld,
“morpholino antisense oligodeoxynucleotides”, “role of M2 receptor heart”) leverde nieuwe
publicaties op. De artikels werden telkens geselecteerd op basis van de inhoud van hun
abstract en de beschikbaarheid van een volledig artikel. Er werd gepoogd om zowel algemene
publicaties te selecteren als artikels die handelden over praktisch uitgewerkte studies. Voor de
gebruikte figuren en tabellen werd toestemming aangevraagd en verkregen.
4
Niet alle gevonden publicaties werden gebruikt in deze masterproef. Er werd
geopteerd om de minder relevante artikels in tweede tijd te laten vallen en voornamelijk te
focussen op die publicaties die niet onderling inwisselbaar waren, om herhaling te vermijden,
maar eerder nieuwe informatie aanbrachten. 116 artikels haalden uiteindelijk de selectie.
4.
Resultaten
4.1
Algemeen
4.1.1 Compound screening
Het onderzoek naar nieuwe geneesmiddelen, de drugscreening, verloopt in
verschillende stappen.(6,7) De eerste hiervan is een complex proces waarbij op biochemisch
niveau en celniveau verschillende moleculen (of compounds) getest worden op hun mogelijke
therapeutische werking. Deze moleculen worden onder andere uit natuurlijke bronnen, zoals
planten verkregen. Voorbeelden hiervan zijn taxol, een krachtig geneesmiddel tegen kanker,
verkregen uit taxus, en colchicine, tegen jicht, ook van plantaardige oorsprong. Verschillende
van deze moleculen worden verzameld in wat men small molecule libraries noemt, een
collectie van compounds die losgelaten kunnen worden op celkweken of proefdieren in de
hoop dat ze een positief effect hebben. Het nagaan van de effecten van deze compounds op de
celkweken of proefdieren noemt men small molecule screen of compound screen. Eens van
een bepaalde molecule de werkzaamheid is aangetoond wordt er geëxperimenteerd met de
chemische structuur en de toedieningsvorm en het is pas na uitgebreid (her)testen dat een
geneesmiddel op de markt komt.(8) De traagste stap in dit proces is het ontdekken welke
moleculen een effect hebben. Een belangrijk principe om dit proces te versnellen is dat van de
high-throughput screening.
High-throughput screening of HTS is een wetenschappelijke methode die door het
gebruik van robotica, dataverwerking, controlesoftware en gevoelige detectoren, onderzoekers
in staat stelt om snel en accuraat miljoenen moleculaire, genetische en farmacologische tests
te doen.(9) De huidige HTS-methoden zijn afhankelijk van vooraf gekende targets, de
moleculen, genen of processen waar het geneesmiddel zijn effect moet op hebben. Deze
worden vaak gevonden door in vitro onderzoek op celculturen. Echter, niet alle ziekten of
effecten van producten die we willen onderzoeken richten zich op één specifiek target. Het
vinden van een target is moeilijk en tijdrovend werk. Cellen en weefsels werken nauw samen
in het levende organisme en deze samenwerking beïnvloedt in belangrijke mate het effect van
5
afzonderlijke moleculen en processen op het al dan niet voorkomen van een ziekte. Als
gevolg hiervan blijken veel van deze targets na verder onderzoek in diermodellen irrelevant te
zijn. Een nieuwe tendens om deze tekortkomingen weg te werken is het gebruiken van highthroughput screening in levende diermodellen, in vivo.(2,10,11) Een enorm voordeel hiervan
is dat het mogelijk is om modulerende stoffen te vinden voor een bepaalde pathway zonder
dat alle stappen hiervan gekend moeten zijn.(12,13) Naast het nagaan van de werkzaamheid
van de compound is er ook de mogelijkheid om andere parameters te meten, zoals algemene
fenotypische effecten en toxiciteit. (10,13,14)
4.1.2 Diermodellen in high-throughput screening
De vraag moet eerst gesteld worden of diermodellen wel geschikt zijn voor HTSstudies, of chemische screening in het algemeen. Het is uiteraard veel moeilijker om de
screening te automatiseren dan bij in vitro technieken. De grootte van de dieren is dikwijls
niet compatibel met traditioneel HTS-materiaal. Nieuwe technieken worden ontwikkeld om
dit probleem op te lossen. Kweken in kleine volumes in multititerplaten en de ontwikkeling
van nieuwe robotica maakt het mogelijk om kleine dieren waaronder zebravisembryo’s en –
larven te gebruiken in HTS.(2,12,15)
Giacomotto en Segalat (2010) halen in hun review een ander belangrijk probleem aan,
namelijk dat van de concentratie van geteste compounds. Het is moeilijk om de doses te
bepalen die getest dienen te worden bij volledige diermodellen, in tegenstelling tot bij assays
gebaseerd op celkweken. Compounds worden in de kleine diermodellen (cf. infra)
opgenomen door zowel vertering als diffusie door de epidermis, waardoor de concentratie die
het proefdier werkelijk toegediend krijgt moeilijk te voorspellen is en afhankelijk is van de
chemische eigenschappen van de stof. Het is hierdoor zeer moeilijk om na te gaan of een
negatief resultaat het gevolg is van een slechte opname van de stof of van de biologische
activiteit in het model. Om vals negatieven te vermijden, kan er worden geprobeerd om
compounds in verschillende concentraties te testen. Door te starten met de test aan hoge
concentratie en stap voor stap deze concentratie te verminderen kan dit probleem gedeeltelijk
verholpen worden. Vóór de effectieve therapeutische dosis in de mens kan bepaald worden
blijft het voorlopig essentieel om resultaten te valideren in zoogdiermodellen (cf. infra).(2,16)
Nog een belangrijk bezwaar is het beoordelen van de effecten. Een machine is niet in
staat om het onverwachte te ontdekken, waardoor volledige diermodellen vaak afhankelijk
zijn van tijdrovende observatie door kleine teams van sterk getraind personeel. Deze
resultaten zijn ook vaak kwantitatief noch eenduidig. Er is nood aan de ontwikkeling van
6
snellere en meer consistente methodes voor de evaluatie van de bekomen fenotypes.(2,17)
Een voorbeeld van een stap in de goede richting is de studie van Gerhard GS, waarin
fluorescerende probes gebruikt werden om oxidatie van specifieke eiwitten in de zebravis aan
te tonen op een kwantitatieve manier.(18) Ook werden technieken ontwikkeld om beweging
te monitoren, wat van pas komt bij het bestuderen van onder andere neurodegeneratieve en
neuromusculaire stoornissen.(2)
4.1.3 Een vergelijking tussen de zebravis en andere diermodellen.
Voor medische doeleinden en het uitvoeren van drugscreening is de muis, Mus
Musculus¸ lange tijd het organisme bij uitstek geweest, gezien zijn raakvlakken met de mens
op genetisch, anatomisch en fysiologisch vlak. De grootste tekortkoming van de muis als
diermodel in HTS is echter de kostprijs, en de relatief trage reproductie. Daarnaast
ontwikkelen de muisembryo’s in utero, waardoor ze in hun vroegste ontwikkelingsstadia
moeilijker te bestuderen zijn, en worden per paring minder nakomelingen geboren dan dit bij
de kleinere diermodellen het geval is.(2,8) Om deze redenen wordt recent meer en meer op
deze laatste gefocust. Bruikbare en veel gebruikte proefdieren zijn de rondworm
Caenorhabditis Elegans, de fruitvlieg Drosophila Melanogaster en de zebravis Danio Rerio.
Deze modellen hebben het voordeel dat ze goedkoop zijn, genetisch relevant zijn voor
drugscreening gericht op menselijke ziekten en bovendien kunnen gekweekt worden op een
manier die HTS toelaat. Bovendien zijn het lichaam van C. Elegans, de D. Melanogaster
embryo’s en de larven van D. rerio transparant, wat visuele beoordeling van de
orgaansystemen vergemakkelijkt. Een bijkomend voordeel van het gebruik van deze modellen
is dat ze in vivo screening toelaten. Dit brengt ook met zich mee dat het hier niet noodzakelijk
is om vooraf targets te bepalen. Een effect kan immers ook gezien worden zonder dat alle
stappen uit het pathologieproces gekend zijn. Daarnaast kunnen ook alternatieve
werkingsmechanismen ontdekt worden. De in vivo technieken werken namelijk met een
volledig, levend organisme, dat bijvoorbeeld een verandering in hartritme kan vertonen
zonder dat de mechanismen op celniveau hiervan moeten gekend zijn. Dit in tegenstelling tot
de in vitro technieken, die zich baseren op celculturen. Aangezien cellen niet kunnen
contraheren zoals een volledig functioneel hart dat kan, moet men hier wel op voorhand weten
waar men een effect verwacht om dit te kunnen bestuderen (figuur 2).(2,8,11)
7
Figuur 2. Het proces van drugontdekking en -screening in diermodellen. (1, zwarte lijn) toont een schematisch
overzicht van de verschillende stadia nodig voor een screening gebaseerd op traditionele HTS. Indien geen
doelmolecule gevonden werd of bij screening in complexe organismen is het moeilijk om een screening op te
zetten. (2, blauwe lijn) Een alternatief is het gebruik van fenotypische chemische screenings met kleine
diermodellen zoals C. elegans, D. melanogaster en D. rerio. (3, rode lijn) Identificatie van hits in deze modellen
kan mogelijks nieuwe moleculaire mechanismen en targets onthullen. Deze targets zouden verder gebruikt
kunnen worden in traditionele HTS. (4) C. elegans, D. melanogaster en D. rerio kunnen de kloof tussen
traditionele high-throughput screening en validatie in zoogdiermodellen helpen dichten.(2)
Van de drie meest gebruikte kleine diermodellen is de zebravis de enige
gewervelde.(2,10) Dit geeft een voordeel dat de andere modellen niet hebben, met name hun
grotere gelijkenis met de mens op het gebied van moleculaire mechanismen betreffende
ontwikkeling en celfysiologie. Zebravissen hebben in se dezelfde lichaamsopbouw als alle
gewervelden inclusief de mens en de belangrijkste organen vertonen duidelijke
gelijkenissen.(8,10) Bovendien is het ook zo dat de epidermis van de zebravislarven, in
tegenstelling tot de harde huid van C. Elegans en Drosophila, erg permeabel is voor small
molecules als die aan hun aquariumwater toegevoegd worden, waardoor kleinere
hoeveelheden compound gebruikt kunnen worden. Zelfs voor hydrofobe moleculen wordt het
frequent gebruikte oplosmiddel DMSO (Dimethylsulfoxide) goed verdragen.(7,10,12,15,19–
21) Ter vergelijking leven de Drosophila larven in vaste media, terwijl de volwassen dieren
vooral in de atmosfeer leven, wat gecontroleerde toediening van moleculen bemoeilijkt.(8,10)
Nog een voordeel van het gebruik van zebravissen is het feit dat hun genoom volledig in kaart
gebracht is en gemakkelijk te raadplegen is via het UCSC (http://genome-euro.ucsc.edu/) De
zebravisgenen zijn gemiddeld 70% identiek aan hun menselijke homologen. Bovendien is
deze overeenkomst vaak sterker in de functionele domeinen, zoals de substraatbindende
regio’s (de typische bindingsplaatsen voor geneesmiddelen) waar de homologie bijna 100%
is.(7,10) Ter vergelijking, het genoom van C. Elegans en D. Melanogaster vertoont
8
respectievelijk 50% en 60% homologie met dat van de mens.(2,22–25) Een kanttekening die
hierbij gemaakt kan worden is het feit dat de zebravissen twee kopieën van veel
zoogdiergenen bezitten.(11) (5,15,26)
De vroege ontwikkelingsstadia van zebravissen hebben een aantal opmerkelijke
voordelen als het over drugscreening gaat. Bevruchting van de zebraviseitjes gebeurt buiten
het lichaam, waardoor de vroege ontwikkeling veel gemakkelijker te observeren is dan bij de
zoogdieren. Elke zeven à veertien dagen kan van het zelfde paartje een nieuw broedsel
verzameld worden.(5,7,10,27) Deze broedsels variëren in grootte van 100 tot 300 nieuwe
embryo’s.(5) Als we dit vergelijken met de muis zien we dat na een in utero zwangerschap
van 19-21 dagen slechts vier tot twaalf jonge muizen geboren worden.(28) Zebravissen
ontwikkelen zich ook snel. Al vanaf 24 uur na de bevruchting (hours post fertilisation, hpf) is
een eenvoudige lichaamsbouw bereikt (figuur 3). Op dit moment beginnen de tot dan toe
transparante embryo’s wat pigment te vertonen, al kan door het gebruik van 1-fenyl-2thiourea (PTU), een tyrosinase inhibitor, dit
proces eenvoudig worden tegengehouden en
bestaan
er
ook
albinovarianten
van
de
zebravis.(7,29,30) Deze optische transparantie
biedt een groot voordeel, onder andere door de
mogelijkheid om ontwikkelingsafwijkingen te
bestuderen zonder invasief onderzoek. Via
transgenese (cf. infra) kunnen ook relatief
eenvoudig
nieuwe
genconstructen
in
de
zebravis ingebracht worden. Wanneer we
bijvoorbeeld een flurorescerende probe
Figuur 3. Organen van larve (A) en volwassen vis (B).(31)
kunnen koppelen aan een gen(promotor), is
het dankzij de transparantie nog gemakkelijker om het eiwit of proces waarvoor dit codeert in
vivo te volgen. Verschillende van deze transgene lijnen zijn beschikbaar.(7,10,32,33) Na 48
hpf zijn de meeste grote organen, inclusief de maagdarmtractus en de vasculatuur, ter plaatse
en bevrijdt het embryo zich uit het chorion. Na 72 hpf is de embryogenese voltooid en
spreken we over larven. Zebravissen worden volwassen na ongeveer 90 dagen (days post
fertilisation, dpf) en kunnen zich al na ongeveer 3 maanden voortplanten, vergelijkbaar met 68 weken voor de muis.(5,7,11,34) Volwassen zebravissen worden 4 cm groot en leven
gemiddeld 5 jaar.(35) Er kunnen bovendien vijf volwassen vissen per liter water gehouden
9
worden, waardoor duizenden dieren op een relatief kleine ruimte in een standaard
laboratorium kunnen gehouden worden.(7)
Deze eigenschappen zorgden er in de jaren 90 voor dat in meer en meer grote
genetische studies over gewervelde orgaanvorming, de zebravis een eerste keuze organisme
werd. Recenter blijkt hetzelfde waar voor de drugscreening.(11,32) Een vergelijking van de
eigenschappen bij veelgebruikte diermodellen (de muis, zebravis en fruitvlieg) wordt gemaakt
in tabel 1.
Tabel 1 - Eigenschappen van enkele modelorganismen voor menselijke aandoeningen (13)
Eigenschap diermodel
Model organisme
Vlieg
Zebravis
Muis
Infrastructuur
$
$
$$$
Kost per dier per jaar
$
$
$$$
Anatomische gelijkenis
-
+
++
Moleculaire of genetische gelijkenis
+
++
+++
Gekarakteriseerde inteeltlijnen
+
-
++++
Lijnen met grote allelische variatie
+
+++
++
Pathologische gelijkenis
-
++
+++
Bewaarmogelijkheden, bijvoorbeeld invriezen van sperma
Nee
Ja
Ja
Transgenese
++
++
++
Gerichte genmodificatie
+
-
++++
Transiënte in vivo assays
++
++++
+
Uitvoerbaarheid van screening op grote schaal
++++
+++
++
Betaalbaarheid van screening op grote schaal
++++
+++
+
Vooruitgang in sequencing
+++
++
+++
Cellijnen en weefselkweken
++
+
++++
Antilichaam reagentia
++
+
++++
Praktisch
Moleculaire biologie tools
Celbiologie tools
-, +, ++ en +++ staan voor de relatieve kracht van het model in vergelijking met de andere, ++++ staat voor
uitzonderlijke kracht van het model
10
4.1.4 Toepassingen van de zebravis in drugscreening
Zijn snelle ontwikkeling en reproductie, gemak in onderhoud, transparantie in de
vroege ontwikkeling en het grote aantal nakomelingen op korte tijd, maken van de zebravis
een interessant proefdier, specifiek voor het uitvoeren van drugscreens. Hierdoor kan de
zebravis in aanmerking komen voor een waaier aan mogelijke toepassingen.
Ten eerste is de reactie op toxische stoffen goed bewaard tussen mens en vis. Een
groot deel aan fase I en fase II oxidatie-enzymen (onder andere de cytochroom P-450 familie
of CYP) en andere eiwitten die met drugresistentie en drugmetabolisme worden geassocieerd
zijn aangetroffen in zebravissen. Onder andere het CYP1A-gen is goed omschreven in de
zebravis en kan in veel weefsels van het embryo geïnduceerd worden. Ook het CYP3A-gen
vinden we terug. Hierbij dient wel vermeld te worden dat deze enzymen nog niet volledig
gekarakteriseerd zijn en dat hun relevantie met betrekking tot het menselijke
drugmetabolisme nog niet voldoende begrepen wordt.(11,36) De effecten van schadelijke
stoffen op groei en ontwikkeling kunnen ook bepaald worden door het bestuderen van de
lengte en vorm van het lichaam van zebravis, de grootte en morfologie van de interne
organen.(5) Verschillende stoffen waarvan bekend is dat ze bij de mens toxische effecten
hebben vertonen bovendien gelijkaardige effecten in Danio rerio. Dit maakt de zebravis nuttig
voor toxicologische studies en nagaan van de veiligheid van farmaca, en dit op een meer
kosteneffectieve manier en veel sneller dan bij andere diermodellen.(5,7,12,15)
Een tweede belangrijke toepassing van zebravissen in drugscreening is uiteraard de
ontdekking van nieuwe kleine moleculen met een therapeutisch of biologisch effect. Vele
geneesmiddelen blijken immers gelijkaardige activiteit te vertonen bij mens en vis. Dit is
onder meer onderzocht van steroïden, statines, moleculen met effect op het hartritme (cf.
infra) en die met effect op de angiogenese. De gelijkenis doet vermoeden dat compounds die
ontdekt worden bij zebravissen ook en gelijkaardig effect zullen hebben bij de mens.(11,37–
43) Voor drugscreening zijn zebravissen bijzonder waardevol in de vroegere onderzoek
stadia, aangezien ze in vivo de doeltreffendheid van een nieuwe behandeling al kunnen
aantonen vooraleer zoogdiermodellen gebruikt worden. De gegevens die men bekomt met
deze studies leiden ook tot verfijning van de zoogdierstudies en een verminderde nood aan
een grote hoeveelheid van deze duurdere studies.(7,44)
Het is niet alleen mogelijk om therapeutische eigenschappen van stoffen te testen op
gezonde vissen, maar er worden ook meer en meer zebravismodellen ontwikkeld die
afwijkingen vertonen gelijkaardig aan deze die we aantreffen bij menselijke ziektes (cf. infra).
De combinatie van bijvoorbeeld monogenetische mutanten met fluorescente biomarkers biedt
11
interessante mogelijkheden. Paquet et al. (2009 ) beschrijven ter illustratie een zebravismodel
van tauopathie. Het mutante Tau-proteïne veroorzaakt fronto-temporale dementie in mensen
en lokt in zebravissen neuronale dood uit, samen met andere pathologische veranderingen die
typisch zijn voor de ziekte. Een fluorescent proteïne dat in diezelfde neuronen voorkomt,
werd gebruikt als marker, om evaluatie van de zebravismutant te vergemakkelijken. De
onderzoekers testten vervolgens verschillende compounds gericht tegen het glycogeen
synthase kinase 3-β, een proteïne betrokken bij neuronale celontwikkeling. Ze konden hier
aantonen dat verschillende compounds die actief waren in vitro, in vivo geen effect hadden,
wat de toegevoegde waarde van in vivo screening onderstreept.(8,11,45)
Waar het relatief onbekende compounds betreft kan de zebravis bovendien gebruikt
worden voor het begrijpen van het werkmechanisme van deze laatste. Het is ook mogelijk om
de werking van een geneesmiddel te achterhalen door onderzoek met zebravissen. Dit werd
gedemonstreerd door Ito et al. (2010), die konden bepalen dat het teratogene product
thalidomide, gebruikt in de behandeling van multipel myeloom, in vivo inwerkt op het in vitro
gevonden doeleiwit Cereblon. Zij bonden verschillende menselijke celfragmenten aan
gemagnetiseerde nanopartikels en verdeelden hier thalidomide over. Na wegwassen van het
product bleef het thalidomide zitten op twee aan de partikels gebonden polypeptiden. Dit
suggereert dat deze eiwitten specifiek interageren met thalidomide. Studies zoals deze kunnen
toegepast worden voor het vinden van de verantwoordelijke werkingsmechanismen van
geneesmiddelen en toxische stoffen.(11,46)
Het vinden van nieuwe moleculen wordt typisch gevolgd door studies die de relatie
tussen structuur en activiteit trachten te bepalen. Nieuwe zijketens en andere moleculaire
wijzigingen worden hier uitgetest om de effectiviteit van het compound te trachten vergroten.
Deze gemodificeerde moleculen kunnen uitgetest worden op zebravissen om hun effect en
toxiciteit in vivo te bestuderen.(11)
Niet elke menselijke ziekte of afwijking kan gesimuleerd worden in zebravissen. Een
aantal zoogdierorganen, zoals longen, prostaat, huid en melkklieren ontbreken in de zebravis
en ondanks hun genetische overeenkomsten kunnen de fenotypische eigenschappen van
ziekten veroorzaakt door overeenkomstige genen wel heel verschillend zijn. Het risico bestaat
hierdoor dat een deel van de gevonden actieve moleculen in zebravissen geen resultaat zullen
opleveren in zoogdieren, al moet er rekening gehouden worden met het feit dat geen enkel
model van bij het begin kan garanderen dat gevonden hits ook het gewenste effect zullen
hebben bij de mens.(5,7,12,13) Bovendien betekenen de verschillen tussen de weefsels of
organen niet noodzakelijk dat de drugs die hierop inwerken niet via zebravissen kunnen
12
ontdekt worden. Van rosuvastatine, gebruikt in de behandeling van hypercholesterolemie
werd in een chemische screening met zebravissen bijvoorbeeld ontdekt dat het antiangiogene
eigenschappen had. Deze blijken zich te vertalen naar een verminderd risico op het optreden
en metastaseren van prostaatkanker bij de mens. Ook al hebben de zebravissen geen prostaat,
dragen ze dus toch bij in de behandeling ervan. (11,47,48)
De bedenking moet gemaakt worden dat zebravisembryo’s of -larven mogelijks niet
voorspellend zijn voor behandelingen die gericht zijn op een oudere of zieke menselijke
populatie.(7) Tot op heden gebeurt slechts de minderheid van de screenings met volwassen
vissen. Er zijn verschillende toepassingen te bedenken waarvoor een dit wel nodig zou
kunnen
zijn,
onder
andere
chemotherapeutische
toepassing
en
screening
naar
ouderdomsaandoeningen. Oppedal en Goldsmith (2010) gebruikten volwassen zebravissen
voor hun onderzoek naar inhibitoren van staartvinregeneratie. Zij ontdekten twee compounds
die dit met succes blokkeerden, budesonide en AGN192403, waarvan de laatste inwerkte op
een pathway die nooit eerder met regeneratie geassocieerd werd. Zij besloten dan ook dat
chemische screening in volwassen zebravissen een haalbaar concept is.(49) Blackburn et al.
(2011), die een LED fluorescentiemacroscoop gebruikten om tot 30 volwassen zebravissen
tegelijk te controleren op tumoraanwezigheid, en Bang et al. (2002), die met behulp van onder
meer een CCD videocamera de respons op auditieve stimuli nagingen, kwamen tot dezelfde
conclusie.(50,51) Door de nood aan een veel grotere dosis compound en daardoor ook meer
chemisch afval, gecombineerd met grote beperkingen wat betreft throughput en ruimte nodig
voor de dieren, blijven de screenings met volwassen zebravissen tot nog toe echter
ondervertegenwoordigd.(11,12)
4.1.5 Zebravismodellen voor erfelijke afwijkingen.
Bij het uitvoeren van drugscreening voor erfelijke humane aandoeningen is het nuttig
om overeenkomstige zebravismutanten te hebben. Deze mutante zebravissen kunnen enerzijds
gebruikt worden om de moleculaire basis van menselijke ziekten te achterhalen, zelfs als de
mutante genen in mens en zebravis niet 100% homoloog zijn, anderzijds kunnen ze gebruikt
worden in drugscreening, op zoek naar een geneesmiddel.
4.1.5.1 Forward genetics
De meest klassieke aanpak voor mutagenese, het uitlokken van nieuwe mutaties, is die
van de forward genetics, waar men van vissen met afwijkende fenotypes het
verantwoordelijke genotype probeert te achterhalen.
13
De grote meerderheid van de reeds ontdekte mutanten werd gecreëerd door het
toedienen van N-ethyl-N-nitroso-ureum of ENU. ENU is een sterk mutageen product,
waardoor een grote verscheidenheid aan willekeurige mutaties kan worden verkregen. Op een
gelijkaardige manier kunnen willekeurige mutaties bekomen worden door gebruik van
radiatie. De op deze manier verkregen embryo’s worden vervolgens gescreend volgens hun
ontwikkelingsfenotype. Van de afwijkende fenotypes probeert men dan de verantwoordelijke
mutatie op te sporen via koppelingsanalyse met behulp van polymorfe merkers. Een derde
techniek maakt gebruik van een gemodificeerd pseudo-type retrovirus, afgeleid van het
murine leukemie virus (MLV). Lin et al. toonden in 1994 aan dat dit retrovirus in staat was
om zebravisembryo’s te infecteren en zijn DNA efficiënt in te planten in het
zebravisgenoom.(52,53) De voorkeursplaats voor integratie in het zebravisgenoom is dicht bij
de ‘start’plaatsen van transcriptie net zoals dat in menselijke cellen het geval is, waardoor het
deze kan verstoren en afwijkende fenotypes kan veroorzaken.(53–55) Na de identificatie van
een interessant fenotype kan bij deze mutanten de genoomsequentie rond de insertieplaats van
het virus gemakkelijk geïdentificeerd worden door middel van inverse PCR. Deze drie
technieken zijn een voorbeeld van forward genetics.(7,8,31,35,56,57) Het nadeel hiervan is
dat er weinig controle is over welke mutaties uit de screening naar voor zullen komen. Het is
ook erg tijdrovend, zonder garantie dat het verantwoordelijke gemuteerde gen gevonden zal
worden. Huang et al. (2012) halen daarom aan dat het mogelijk interessanter is eerst de
gewenste genen te identificeren, vervolgens hun mutaties te bekomen en nadien het
fenotypische effect van deze mutaties na te gaan. Dit laatste valt onder het vakgebied van de
reverse genetics.
4.1.5.2 Reverse genetics
Reverse genetics houdt in dat men eerst het genotype wijzigt en daarna het effect op
het fenotype bestudeert. Geselecteerde genen kunnen op verschillende wijzen gemanipuleerd
worden.
Om te beginnen is het mogelijk om de expressie van specifieke eiwitten te
onderdrukken
(knock-down)
door
de
injectie
van
morpholino
antisense
oligodeoxynucleotides.(7,58) Morpholino oligodeoxynucleotiden zijn niet-ionische DNAanalogen, die te verkrijgen zijn bij Gene Tools LLC. Ze hebben een andere
ruggengraatstructuur dan RNA of DNA, waardoor ze stabieler zijn, maar binden desondanks
op complementaire nucleïnezuursequenties volgens het principe van de Watson-Crick
baseparing. Deze verbindingen worden geïnjecteerd in het 1 à 2-cellig ontwikkelingsstadium
en maken het mogelijk om genexpressie te blokkeren via binding op de translatiestartpositie
14
of splice sites van het overeenkomstige mRNA. De morpholino’s blijven slechts 6 tot 7 dagen
actief. Aangezien de meeste organen gevormd en functioneel zijn rond 5 dpf is dit echter lang
genoeg om fenotypische effecten te produceren. (31,53,59) Dit laat toe om de rol van deze
eiwitten in ontwikkeling en/of therapeutisch antwoord te monitoren. (7,6)
Een reverse genetics methodiek om stabiel mutaties te bekomen in het gen van
interesse (knock-out) is verder het uitvoeren van random mutagenese (via ENU of radiatie) en
een hieropvolgende screening naar mutaties bij het gen van interesse. Verschillend groepen
houden zich op dergelijke manier bezig met het bestuderen en creëren van nieuwe mutaties.
Eén
hiervan
is
het
Zebrafish
Mutation
Project
van
het
Sanger
Institute.
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/zmp/). Dit project is gericht op het identificeren,
fenotyperen en verdelen van een groot aantal mutante zebravislijnen, met als uiteindelijke
doel het creëren van een knock-out allel voor elk eiwitmakend gen in het zebravisgenoom.
Mutaties worden geïdentificeerd uit populaties van chemische gemuteerde dieren door middel
van exoomsequencing. Geïdentificeerde knock-out vissen worden vervolgens beperkt
gefenotypeerd voor identificatie van morfologische afwijkingen en worden ter beschikking
gesteld van de gemeenschap. Voor heel wat genen in het zebravisgenoom bestaat momenteel
al
een
knock-out
variant
en
deze
mutanten
zijn
terug
te
vinden
op
http://zfin.org/action/fish/search.(31,60)
Sinds kort is het ook mogelijk om gerichter specifieke genen te inactiveren.(7,61,62)
De eerste methode die hiervoor beschikbaar werd was het gebruik van Zinc-finger nucleases
(ZFNs), een familie van transcriptiefactoren, besproken door Huang et al. (2012). Door
specifieke DNA-sequenties te herkennen en hierop te binden zijn ze in staat om zowel
inserties, deleties als puntmutaties te veroorzaken.(53,63) Een andere toepassing is de inductie
van grote genomische deleties, wanneer twee paar ZFNs in dezelfde cel of organisme worden
geïntroduceerd, en de twee dubbelstrengige breuken met elkaar verbonden worden.(53,64)
ZFNs bieden de mogelijkheid om eender welk zebravisgen te inactiveren.(53) Ook het
gebruik van TALE-proteïnen is een optie. TALE-proteïnen hebben een DNA-bindende regio
die bestaat uit verschillende short tandem repeats, waarmee ze op sequentiespecifieke wijze
het zebravis-DNA ‘herkennen’.(53,65,66) Ze binden op het zebravisgenoom op een manier
die veel simpeler en voorspelbaarder is dan ZFNs en werken op een gelijkaardige manier. Ze
kunnen inserties en deleties veroorzaken en doen dat meestal efficiënter dan de ZFNs.(53,67–
69)
15
4.1.5.3 Beschikbare modellen
De voorgaande technieken hebben al heel wat interessante mutaties opgeleverd.
Santoriello en Zon (2010) vermelden een aantal modellen gebruikt voor cardiovasculaire
toepassingen. Er zijn mutanten ontdekt met hartafwijkingen die lijken op de menselijke
gedilateerde cardiomyopathieën (DCMs), gekenmerkt door vergroting van het ventrikel,
atrium, of beide; en door verminderde contractie van het myocard. Voorbeelden hiervan zijn
silent heart en pickwick.(31,70) Er bestaan daarnaast modellen voor zowel het short-QTsyndroom als het long-QT-syndroom (cf. infra), respectievelijk reggae en breakdance
genoemd.(31,71) Ook myocardinfarct is recent gesimuleerd in zebravissen door middel van
het aanbrengen van bevriezingsschade, wat leidt tot massieve celdood.(31,72) Een mutant die
gelijkenissen vertoont met aorta coarctatio, gridlock, is ook beschreven.(73) Deze modellen
kunnen gebruikt worden in drugscreening, in de hoop therapeutische moleculen te ontdekken.
Voor de botaandoeningen zijn eveneens mutanten met verschillende fenotypes
beschikbaar. Er zijn mutanten met minder of geen bot (i), met ectopische botvorming (ii),
meer perichondraal bot maar normaal membraneus bot (iii) en minder perichondraal bot maar
normaal membraneus bot (iv). In de eerste groep is het vaak zo dat bot wel gevormd wordt,
maar niet gemineraliseerd. Tot de tweede groep behoren de vissen die botvorming vertonen
op plaatsen waar dat in wild-type vissen niet het geval is. Onder meer de mutant chihuahua,
een model voor de dominante vorm van osteogenesis imperfecta, behoort tot deze groep. De
laatste
twee
groepen
worden
mogelijk
veroorzaakt
door
veranderingen
in
het
differentiatiepotentieel of de functie van chondrocyten of osteoblasten.(74,75)
De mutanten voor huidaandoeningen zijn voornamelijk vissen waarbij de pigmentatie
afwijkend is. Een voorbeeld is nacre, model voor het syndroom van Waardenburg type IIa,
dat gekenmerkt wordt pigmentstoornissen en gehoorverlies. Sandy is dan weer een model
voor oculocutaan albinisme type I, dat gebrek aan pigmentatie in haar, lichaam en ogen
veroorzaakt. Verder zijn er verschillende transparante mutanten, waarbij genen gemuteerd
zijn die niet overeenkomen met die aangetroffen in menselijke ziekten, zoals Casper, Roy
Orbison en albino. Deze zijn bijzonder nuttig voor het bestuderen van inwendige
organen.(8,11,43,76,77)
Tabel 2 geeft een overzicht van mutanten voor cardiovasculaire, bot- en huidziekten,
waarvan het gemuteerde gen overeenkomt met dat in menselijke ziekten.
16
Tabel 2. Overzicht van mutante zebravissen waarvan het verantwoordelijke gen overeenkomt met dat van een
gekende humane afwijking.(57)
Naam
mutant
heartstrings
violet
beauregarde
breakdance
cardiofunk
island beat
Fenotype mutant
Cardiale dysfunctie
en geen pectorale
vinnen
Gebrekkig circulatoir
system
Onregelmatige
hartslag
Incorrecte vorming
septum intermedium
Gebrekkige
hartfunctie
pickwick
Gebrekkige
hartfunctie
silent heart
Hart klopt niet
weak atrium
Groot en slecht
kloppend atrium
beamter
Slechte somietformatie
Kraakbeendefecten
jellyfish
b4galt7
dackel
nacre
sparse
sox10
sandy
Naam menselijke
afwijking
Syndroom van HoltOram
Fenotype menselijke afwijking
Atriaal septumdefect en
duimanomalie
Teleangiëctasieën,
Arterioveneuze malformaties
erfelijk
hemorragisch, type 2
Long-QT- syndroom Ventriculaire tachyaritmie
Cardiomyopathie
Cardiomypathie
Syndroom van
Timothy
Dodelijke aritmieën, congenitale
hartziekte, webbing van vingers en
tenen, immuundeficiëntie,
cognitieve abnormaliteiten,
hypoglycemie
Hart- en skeletspierpathologie
Cardiomyopathie;
dystrofie spieren
tibia
Cardiomyopathie,
familiaal, hypertroof
Cardiomyopathie;
atriaal septumdefect
Cardiomyopathie
Cardiomyopathie, atriaal
septumdefect
Spondylocostale
dysostose
Campomele
dysplasie
Kraakbeendefecten
Progeroïde type van
EhlersDanlossyndroom
Abnormale vin,
Exostosen,
retinotectale projectie, multipele, type II
kaak, hoofd, oor
Wervelafwijkingen
Lichaam bezit geen
melanoforen
Minder en kleinere
melanoforen
Waardenburg
syndroom, type 2a
Piebaldisme
Pigmentstoornissen en gehoorverlies
Gebrek aan pigment
cellen, abnormaal oor
Geen
melaninepigment in
lichaam of ogen
Waardenburg-Shah
syndroom
Oculocutaneus
albinisme type I
Skeletafwijkingen
Bindweefselafwijkingen, osteopenie
van alle botten, losse maar elastische
huid en hypermobiele gewrichten
Multipele exostosen, gewoonlijk
vooral afkomstige van de lange
botten
Geen pigmentatie van het mediale
deel van haar, voorhoofd,
wenkbrauwen en kin en van de
ventrale borstkas, abdomen en
extremiteiten
Pigmentonregemaltigheden en
gehoorverlies
Geen pigment in haar, lichaam en
ogen
17
4.1.6 Praktisch: de zebravis in HTS
Voor het opstellen van een HTS-studie met zebravissen zijn een aantal dingen
essentieel. Om te beginnen zijn grote hoeveelheden embryo’s of larven nodig. Aangezien
deze snel ontwikkelen, en specifieke levensstadia nodig zijn voor het onderzoek wordt de
voorkeur gegeven aan het ter plaatse kweken boven het importeren van embryo’s.
Zebravissen zijn over het algemeen gemakkelijk in onderhoud en richtlijnen voor het houden
zijn onder meer terug te vinden in The Zebrafish Book, door M. Westerfield. (8,77)
Delvecchio et al. (2010) halen aan dat er vier belangrijke methodologische stappen zijn bij het
opstarten van een chemische screening met zebravissen: (i) volwassen paarvorming en
verzamelen van de embryo’s, (ii) sorteren van de embryo’s in multititerplaten, (iii- toediening
van de moleculen en (iv) data verzameling en analyse. Het ideale verloop van zo’n screening
in een HTS-setting wordt geïllustreerd in figuur 4, gebaseerd op een publicatie van Lessman
Zebraviskweek en –onderhoud 
et al (2011).(8)
Zebravissen zijn tropische vissen en hebben
geen duidelijke piekperiodes in hun voortplanting.
Volgens
Lessman
et
al.
zijn
de
gangbare
laboratoriumcondities (14 uur licht, 10 donker en een
omgevingstemperatuur van ongeveer 28.5°C) , voer en
zoet water van hoge kwaliteit over het algemeen
voldoende om de voortplantingscyclus het hele jaar
door te ondersteunen. Paarvorming gebeurt in de
Embryo’s of larven: wild-type,
mutant, of transgeen 
Sorteren door middel van robotica 
Multititerplaten 96, 384 of meer
wells 
Chemische compounds
Multipipettorrobot 
Screeningstoestel aangepast aan
grote hoeveelheden
Algoritmen voor objectdetectie 
valavond en vrouwtjes beginnen hun eitjes te leggen als
’s morgens de lichten aangaan. De onderzoekers stellen
verder dat vrouwtjes niet in staat zijn om elke dag een
Data-analyse algoritmen
Figuur 4. Verloop van een HTS met
zebravissen.
nieuw broedsel te leggen. Er wordt aangeraden om één bepaald vrouwtje niet meer dan één
keer per week te laten paren, om het opnieuw aanvullen van de oöcyten toe te laten. Meteen
na het verlaten van de ovaria begint activatie van het ei. Als deze voltooid is voor de
mannelijke gameten het ei bereiken vindt er geen bevruchting plaats. Het percentage
onbevruchte eitjes is normaal gezien minder dan 10% en deze worden best verwijderd. Een
overmaat aan mannetjes ten opzichte van de vrouwtjes of een hogere concentratie van paartjes
per tank helpt dit percentage te verminderen. Lessman et al. stellen dat, als voor een bepaalde
screen 10 multiterplaten van elk 384 wellsf nodig zouden zijn waarbij telkens 1 embryo
voorzien wordt per well, er dus nood is aan 3840 embryo’s.(78,79) Als er uitgegaan wordt
van een 100-tal embryo’s per paar en voorzichtig gesteld wordt dat 50% van de eitjes ook
18
effectief uitkomt, zijn er minstens 80 paartjes nodig om voldoende embryo’s te bekomen.
Indien er dagelijks, van maandag tot vrijdag, nood zou zijn aan deze hoeveelheid embryo’s
zouden er ongeveer 800 à 1000 volwassen vissen moeten gehouden worden. Dit is biedt geen
probleem voor de meeste, goed uitgeruste laboratoria. Wanneer we met mutante vissen
werken zijn er meer exemplaren nodig. Dit is omdat de meeste mutaties zich in de volwassen
vissen presenteren als heterozygote mutaties. Indien men wil testen op homozygote vissen
moet er dus rekening gehouden worden met de Mendeliaanse overerving uit heterozygote
ouders. Twee heterozygote ouders zullen namelijk maar één vierde homozygote jongen
produceren. Indien de afwijkingen overleefbaar zijn en de homozygote mutanten vruchtbaar
zijn, is dit grotere aantal niet nodig aangezien hier met homozygote ouderparen zou kunnen
gewerkt worden. De eitjes worden vervolgens verzameld en geïncubeerd bij 28,5°. Hoe lang
de incubatie duurt hangt af van de leeftijd die men wenst te onderzoeken. In dit stadium kan
men PTU toevoegen aan het water om de transparantie van de embryo’s te behouden. Een
alternatief hiervoor is het gebruik van transparante mutanten, zoals Casper, die gekruist kan
worden met eender welke andere mutant of transgene zebravis (cf. infra). (8,11,43,76,77)
Het sorteren van de embryo’s (100 à 300 per paring) gebeurt door de embryo’s
manueel in multititerplaten te pipetteren. Dit kan ook geautomatiseerd worden, onder andere
door middel van het COPAS XL systeem (Union Biometrica, Holliston, MA), dat zowel
embryo’s als larven kan selecteren op basis van lengte, optische densiteit en/of fluorescentie
en ze vervolgens over 96- en 384-well multititerplaten kan verdelen. Ook andere systemen
zijn commercieel beschikbaar, waaronder CellBot (Centre Suisse d’Electronique et de
Microtechnique) en Biosorter (Union Biometrica, Holliston, MA). Een mogelijke hindernis is
hier voorlopig nog de kostprijs. Eens de embryo’s verdeeld zijn, kunnen ze verder
ontwikkelen in de platen tot het gewenste moment van de drugtoediening. Vanaf 4-6 dpf
moeten ze gevoederd worden. Het dieet van de net uitgekomen embryo’s bestaat uit
pekelkreeftjes en pantoffeldiertjes. Rond 21 dpf kan dan overgeschakeld worden op gewoon
visvoer, verkrijgbaar in de dierenwinkel.(8,11,43)
De te testen compounds kunnen vervolgens manueel, met pipetten, of door middel van
robotica toegediend worden. De stoffen worden typisch opgelost in DMSO al kunnen ze ook
onder het eten van de vissen gemengd worden. Er kan geopteerd worden voor verschillende
concentraties van dezelfde compound, aangezien het moeilijk is te bepalen hoeveel de dieren
juist binnenkrijgen en zo de effectiviteits- en toxiciteitsgrenzen te bepalen (cf. supra). De
gebruikelijke concentratie van de compounds varieert tussen 1-10 µM. Indien de compounds
toegediend worden voor 2/3 dpf kan het zijn dat de embryo’s uit hun chorion gehaald moeten
19
worden, wat snel kan gebeuren door toevoeging van Pronase aan het water. Voor ongeveer
100 embryo’s is 1mg/ml Pronase nodig. Na 5-10 minuten voor 24 hpf oude embryo’s en 1020 minuten voor 9 dpf embryo’s, kunnen de embryo’s uit hun chorion gehaald worden met
behulp van een pasteurpipet. Na toediening van de compounds, worden de platen bewaard
voor de gewenste incubatietijd, op een temperatuur van 28°C.(11,12,43,77) Hoe lang de
compounds toegediend worden en op welke leeftijd hangt af van wat men wil onderzoeken.
Voor het testen van compounds met effect op repolarisatie van het hart kozen Milan et al.
(2003) voor dieren van 48 hpf oud, waarna ze onmiddellijk het effect nagingen. Voor
compounds waar een trager effect van verwacht wordt, zoals deze die onderzocht werden
door Choi et al. (2007) op hun vermogen om pigmentatie te verminderen laat men de
compounds langer inwerken. De onderzoekers dienden hier de moleculen toe aan embryo’s
van 9 hpf en wasten deze weer weg rond 72 hpf.(41,80)
Dataverzameling kan manueel en geautomatiseerd gebeuren. Elke well van een
multititerplaat kan manueel gescoord worden voor fenotype, waarna er foto’s worden
genomen en de resultaten opnieuw bevestigd worden in een secundaire screening. Het gebruik
van fluorescente transgene zebravislijnen, gezien bij Tran et al. (2007), in een screening voor
antioangiogene compounds, laat toe om dit met een veel hogere throughput te doen, door
middel van geautomatiseerde fluorescerende microscopen.(11,81) Ook processen zoals
hartritme ( Burns et al. (2005) cf. infra), bloedflow en zwembewegingen kunnen gemonitord
worden.(82) Tussen 2 en 4dpf liggen de uitgekomen larven van nature in een laterale positie,
wat beeldvorming vergemakkelijkt. Na 5dpf worden de zwemblazen opgeblazen en beginnen
ze te zwemmen. Vanaf dit moment worden ze beter geïmmobiliseerd. Onderzoekers kunnen
dan gebruik maken van een anestheticum, waarna de larven zullen drijven (larven van 5 dpf
of ouder) of naar de bodem zinken (rond de leeftijd van 12dpf) (43) Een andere optie is het
SCORE-systeem (Specimen in a Corrected Optical Rotational Enclosure), ontwikkeld door
Petzold et al. (2010), dat gecombineerd worden met klassieke beeldvorming. De larven
worden in hierbij een viskeus methylcellulose medium geplaatst in capillairen die gemaakt
zijn uit gefluoreerd ethyleenpropyleen. Ze kunnen hierin geïmmobiliseerd worden terwijl ze
in leven blijven, wat een hogere resolutie toelaat. Het materiaal van de capillairen heeft
dezelfde brekingsindex als water. Hierdoor wordt de vervorming van het beeld verminderd en
is het mogelijk om de larven te draaien om het nodige perspectief te krijgen.(83) Zowel het
sorteren van de embryo’s als de beeldvorming kan bovendien geautomatiseerd gebeuren door
middel van het VAST (Vertebrate automated screening technology) systeem. Het VAST
systeem (Pardo-Martin, 2010) kan larven overbrengen van wells of reservoirs naar capillaire
20
buisjes, gebruikt voor visualisering. Na de beeldvorming zijn verdere manipulaties mogelijk,
zoals laserchirurgie en fotoactivatie van reagentia. Nadien worden de larven automatisch
teruggebracht naar hun oorspronkelijke reservoir. Het hele proces van laden en beeldvorming
duurt slechts 19 seconden per larve, wat dit systeem erg compatibel maakt met HTS. Het
VAST systeem is verkrijgbaar bij Union Biometrica (Holliston, MA).(8,84) De meeste van de
onderzoekers gebruiken, ongeacht hun studiegebied, verschillende concentraties en
vergelijken zowel het effect van de verschillende componenten onderling, als het effect van
de variërende doses.
4.1.7 Read-out parameters voor compound screening in zebravissen
Het spreekt voor zich dat, afhankelijk van wat men wil onderzoeken, andere
parameters bestudeerd moeten worden. Waar het over de cardiovasculaire toepassingen gaat
zijn er veel potentiële veranderingen die kunnen bestudeerd worden. Kitambi et al. (2012)
bestudeerden in vaatvorming in de zebravisretina door zowel de nieuwvorming van vaten als
de circulatie in realtime te bekijken door middel van een microscoop.(85) Andere parameters
die visueel te volgen zijn onder meer de bloedvatdiameter, cardiac output (slagvolume x
hartritme) en erythrocyten-aantal. Fritsche et al. (2000) berekenden deze parameters door
middel van Digital Motion Analysis, een techniek die door het samenbrengen van de
verschuivende vectoren die de snelheid van de erytrocyten voorstellen, een volledig tracé kan
opstellen van de routes waarover de erytrocyten zich verplaatsen.(86,87) Een combinatie van
microscopie en video-opname werd ook gebruikt voor het bepalen van het hartritme in het
onderzoek gevoerd door Milan et al (2003).(41) Een techniek die voorgesteld werd door Lin
et al. (2014) bestaat uit het gebruiken van pseudodynamische 3D-beeldvorming, gebaseerd op
een publicatie van Liebling et al. (2005). Deze laatste ontwikkelden een algoritme dat in staat
is het dynamisch volume van een microscopisch object te berekenen dat periodiek beweegt en
gebruikten dit om de structurele en functionele ontwikkeling van het hart van
zebravisembryo’s in kaart te brengen.(88–90) Lin et al. maakten hier gebruik van en
beschreven eerst individuele parameters: eindsystolisch en –diastolisch volume van een
ventrikel, slagvolume, ejectiefractie, hartritme, ventriculaire massa en cardiac output. Ze
bekeken de systolische functie en maakten een curve op die de ventriculaire diastolische
vulling voorstelde, een functionele parameter die gevoelig is voor cardiale abnormaliteit.(87)
Voor de bot- en osteoporosestudies is het onder meer belangrijk om de
botmineralisatie te evalueren. Fleming et al. (2005) gebruikten hiervoor larven die behandeld
waren met alizarinerood, dat neergeslagen calcium rood kleurt, en nadien onder een SZX12
21
stereomicroscoop werden gelegd. Door het berekenen van de oppervlakte van de kleuring met
AnalySis software waren zij zo in staat om de botmineralisatie te kwantificeren. Deze
techniek werd ook gebruikt door Chen et al. (2014). Andere bruikbare parameters in het
bestuderen van het zebravisskelet omvatten onder meer het meten van de lichaamslengte en
het gewicht van de larven en het bepalen van de botdensiteit. Siccardi et al. (2010) gebruikten
voor deze laatste parameter een microCT-scanner, waarmee elk embryo afzonderlijk gescand
werd. (79,91,92)
Afhankelijk van wat men juist wil te weten komen variëren de gewenste parameters.
Toen Chen et al. het effect van deferoxamine op zebravissen met een overmaat aan ijzer
bestudeerden, gebruikten zij voor de bepaling van de hoeveelheid ijzer in een larve een
inductief gekoppeld plasma massaspectrometer of ICP-MS, een techniek die met zeer grote
gevoeligheid de bepaling van metalen en sommige niet-metalen mogelijk maakt en eerder al
werd beschreven door Weber et al (2006).(91,93,94) Als het aan de andere kant over
toxiciteitsstudies gaat, zijn mogelijke parameters bijvoorbeeld de maximale niet-lethale
concentratie (MNLC), de 10% lethale concentratie (LC10), zoals beschreven door Zhu et al.
(2014) (cf. infra) in hun studie over het effect van cardiotoxische geneesmiddelen op de
zebravis. Zij bestudeerden onder andere ook het optreden van pericardoedeem en het optreden
van trombose en bloedingen.(95)
Waar het gaat over het bestuderen van processen in de huid werkt men vaak met
visuele beoordelingsmethoden. Het fenotypisch vergelijken van pigmentatieprocessen is
mogelijk en door middel van het bijhouden van de foto’s kan één embryo door verschillende
onderzoekers bestudeerd worden. Studies waar ook naar de toxiciteit van de gebruikte
compounds gezocht wordt kunnen bijvoorbeeld de mortaliteit registreren, maar ook
morfologische malformaties, zoals een te klein hoofd, scheefgroeien van staarten en dunne
gebogen lijven kunnen opgemerkt worden. Daarnaast kunnen bijvoorbeeld stoornissen in het
hartritme, zowel wat frequentie als de verhouding van atriale tot ventriculaire contracties
betreft, zoals gedaan door Choi et al (2007).(80)
Een hulpmiddel bij de controle van veel van deze parameters is het gebruiken van
transgene zebravissen. Door de injectie van plasmides, mRNA of DNA transposons is het
mogelijk om te zorgen voor de (over)expressie van specifieke eiwitten of specifieke varianten
hiervan (bijvoorbeeld puntmutaties) in bepaalde weefsels of in het hele embryo. Dit noemt
men transgenese. Een veelgebruikte toepassing hiervan is het inbrengen van een fluorescerend
proteïne in het zebrasgenoom. Op deze manier is het mogelijk om bepaalde weefsels of
organen fluorescent te maken, wat hun visuele beoordeling vergemakkelijkt. (7,10,32,33)
22
4.2
Compound screening voor cardiovasculaire toepassingen
4.2.1 Gelijkenissen en verschillen van het cardiovasculaire stelsel van mens en vis
Zoals bij alle gewervelden is het hart het eerste functionerende orgaan in de zebravis.
Het hart van de zebravis heeft twee kamers en lijkt op dat van het 3 weken oude menselijke
embryo. De ontwikkeling ervan begint als cardiale precursorcellen een centraal gelegen
hartbuis vormen. Deze plooit op zichzelf en wordt geremodelleerd tot het atrium en ventrikel,
die bestaan uit endocard en myocard en van elkaar gescheiden worden door een
atrioventriculaire klep.(7,35,96–98) (figuur 5)
Figuur 5. Vergelijking van een menselijk hart op echo (links) en een zebravishart gezien door
fluorescentiemicroscoop (rechts)(99)
De genetische factoren die voor de vorming en plooiing van de hartbuis zorgen zijn
grotendeels gelijk bij zoogdieren en zebravissen, al wordt er bij deze laatste geen septum
gevormd en blijft het hart dus tweekamerig. Tijdens deze ontwikkeling wordt door
mesoblasten een primitieve vasculaire lus gevormd die later de aorta en vena cardinalis zullen
gaan vormen. Door uitstulping hiervan worden de latere bloedvaten gevormd.(35)
Na 22 hpf begint het hart samen te trekken, in het begin als een peristaltische golf en het is na
36 hpf dat we gecoördineerd samentrekken van atrium en ventrikel kunnen zien. Het
zebravishart vertoont een contractiepatroon dat gelijkaardig is aan dat van het menselijke hart,
met herkenbare systole en diastole (figuur 6).(87) Bloed wordt eerst van het hart naar de
kieuwen gestuurd, waar het later geöxygeneerd zal worden. Nadien gaat het door het hoofd
om verder te gaan naar rest van het lichaam door een ventraal en op de middellijn gelegen
aorta. Verschillende kleine subcardinale venen vormen samen de gemeenschappelijke
23
cardinale venen. Het bloed hieruit loopt samen in de sinus venosus voor het naar het hart
terugkeert.(7,10,100)
Figuur 6. 3D beelden van het zebravishart rond begin, midden en einde van de systolische fase.(87)
4.2.2 Het waarom van de zebravis in cardiovasculair onderzoek
Het gebruik van de zebravis als model voor het menselijke cardiovasculaire stelsel
stuit op een aantal bezwaren. Het hart van de zebravis heeft maar twee kamers en geen
pulmonaire circulatie. De voordelen echter, wegen zwaarder door. Dankzij hun kleine
omvang en het feit dat ze in het water leven kunnen zebravissen verschillende dagen
overleven met grote vasculaire defecten of zelfs zonder cardiac output omdat ze voldoende
zuurstof kunnen binnenkrijgen door diffusie. Hierdoor kunnen effecten op cardiovasculaire
ontwikkeling ontdekt worden die snel fataal zouden zijn in zoogdieren en daarom niet verder
onderzocht kunnen worden.(5,7,10,35,101)
De transparantie van de zebravis laat toe om de hartfuncties, waaronder het hartritme,
de frequentie, contractiliteit en circulatie in real time te monitoren zonder nood aan
gecompliceerde technieken.(5,15) In zebravislarven is het hierdoor mogelijk om de
circulerende bloedcellen te volgen met een microscoop.. Er zijn beeldtechnieken beschikbaar
die het mogelijk maken om de snelheid van de erytrocyten, de diameter van de bloedvaten en
distributie van het bloed te beoordelen, waardoor een systeem kan ontwikkeld worden dat het
effect van compounds op de contractiliteit van het hart kan evalueren.(15,35) De vroegste
elektrofysiologische processen zijn ook waarneembaar in de zebravis, het is zelfs mogelijk
24
om calcium- en voltagegradiënten te monitoren nog voor de primitieve harttube gevormd
is.(32)
Veel
processen,
waaronder
vroege
hematopoëtische
ontwikkelingen
en
cardiovasculaire processen zijn ook gelijkaardig binnen de gewervelden.(7,35) Bij het
bestuderen van trombose in zebravissen wordt bijvoorbeeld opgemerkt dat hun trombocyten
de plaatjes glycoproteïnen GPIIb/IIIa en GP1b dragen en zowel de extrinsieke als intrinsieke
pathways worden aangetroffen. Ook de M(2) muscarine acetylcholinereceptor van de zebravis
vertoont grote gelijkenissen met die van de mens. Deze receptor is in het menselijk hart de
meest voorkomende muscarinereceptor en stimualtie hiervan lokt negatieve chronotrope en
inotrope effecten uit. Ondanks de anatomische verschillen is het zelfs mogelijk om
cardiomyopathie te onderzoeken met zebravismodellen. In een studie van Hsieh en Liao
(2002) werd ontdekt dat bepaalde mutaties in de eiwitten laminin alpha 4 en integrin-linked
kinase hartfalen veroorzaken in zebravissen en gelijkaardige mutaties zijn in overmaat
aangetroffen bij patiënten met gedilateerde cardiomyopathie.(10,15,102) Daarnaast slaagden
Huang et al. (2013) er in twee zebravismodellen van hartfalen te ontwikkelen, enerzijds door
toediening van aristolochiazuur (AA) en anderzijds door toediening van doxorubicine,
waarvan de eerste methode de snellere en gemakkelijkere bleek. Verschillende nieuwe
compounds konden getest worden op deze twee modellen. Op het AA-model werden met
name NS398, MEK-I, C25 en A11, uitgetest. Deze moleculen toonden een opvallend grotere
werkzaamheid op het model dan de traditionele farmaca die momenteel gebruikt worden voor
hartfalen, wat erg hoopgevend is.(103) Lin et al. (2014) gebruikten eveneens een
cardiomyopathiemodel op basis van doxorubicine, en merkten een duidelijke verminderde
cardiac output en slagvolume op. Dit komt goed overeen met de verminderde contractiliteit,
ventriculaire massa en toegenomen hartritme dat we opmerken bij patiënte die in hun
kindertijd behandeld werden met doxorubicine in het kader van een maligniteit.(87)
Van veel geneesmiddelen, onder andere warfarine, een vitamine K-antagonist, is het
ook bewezen dat ze gelijkaardige effecten hebben bij beide soorten.(7,10) In een studie van
Lin et al. (2014), bestudeerden de onderzoekers zowel inotrope als chronotrope effecten van
farmaca op de hartfunctie van de zebravis. Zij bemerkten onder meer dat epinefrine, een
hormoon met positief inotrope en chronotrope effecten op het menselijke hart, deze zelfde
effecten vertoonde in het zebravishart. Wanneer zij echter esmolol, een bètablokker,
toedienden aan de embryo’s vertoonde deze zowel negatief intrope af chronotrope effecten op
het zebrahart. De onderzoekers concludeerden hieruit dat de hartfunctie van de zebravis
gelijkaardige farmacologische responsen vertoont als het menselijke hart.(87) Zhu et al.
25
(2014) kwamen tot diezelfde conclusie. Zij testten zeven gekende cardiotoxische
geneesmiddelen en twee geneesmiddelen zonder gekende cardiovasculaire toxiciteit. Alle
geteste middelen vertoonden respectievelijk negatieve effecten en geen effecten op het hart,
wat deze bewering ondersteunt.(95)
4.2.3 De zebravis in cardiovasculaire compound screening
In
cardiovasculaire
compound
screening
studies
zijn
verschillende
toepassingsmogelijkheden voor de zebravis. Enerzijds is er het gebruik van wild-type
zebravissen, die een gezonde populatie voorstellen, voor het nagaan van bijwerkingen van
verschillende geneesmiddelen in het kader van toxiciteitsstudies. Anderzijds is er het gebruik
van mutante zebravissen, die model staan voor een waaier aan menselijke afwijkingen en
dienen als testorganisme voor verschillende compounds.
Een erg belangrijk probleem dat zich stelt bij geneesmiddelonderzoek is dat van de
cardiotoxiciteit. Elk jaar worden er geneesmiddelen van de markt gehaald, niet omdat ze niet
effectief zijn, maar omwille van onvoorspelde bijwerkingen.(104,105) Hoe vroeger in het
ontwikkelingsproces deze bijwerkingen ontdekt worden, hoe minder tijd en geld verspild
moet worden aan de ontwikkeling van deze geneesmiddelen. Hier komt de zebravis handig
van pas. Verschillende bekende cardiotoxische stoffen blijken ook op de zebravis een effect te
hebben, wat mogelijkheden schept voor de toekomst.(5)
Een belangrijk neveneffect van verschillende geneesmiddelen die de cardiale
repolarisatie vertragen door het hERG-kanaal (human ether a-go-go-related) te inhiberen is
dat van een verlenging van het QT-interval op ECG. Deze verlenging kan, gecombineerd met
andere cardiale risicofactoren, leiden tot levensgevaarlijke aritmieën. Omwille van deze reden
zijn specifieke richtlijnen opgesteld door het ICH (International Conference on Harmonisation
of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use), die vereisen
dat elke kandidaatdrug zowel in vitro, voor zijn effect op hERG als in vivo, op eventuele QTverlenging moet gecontroleerd worden voor de toediening aan mensen. Het gebruik van
zebravis kan hier zeer nuttig blijken, in het bijzonder omwille van de grote gelijkenis tussen
hERG en zERG, het zebravisequivalent.(15) Zowel Park et al. (2013) als Langheinrich et al.
(2003) beschrijven bijvoorbeeld hoe QT-verlengende geneesmiddelen bij de zebravis zowel
bradycardie als aritmie veroorzaken bij zebravissen. Langheinrich et al. ontdekten dat de
Ca2+-blokkers nifedipine en nimodipine, die vaak gebruikt worden voor het behandelen van
patiënten met hoge bloeddruk in de zebravis leiden tot een sterke daling van de hartfrequentie,
contractiliteit en circulatie. Dit toont het bewaarde cardiovasculaire effect van farmaca op
26
onze beide soorten aan.(104,106) Gelijkaardige resultaten werden ontdekt door Milan et al.
(2003), die ontdekten dat de meeste farmaca die een QT-verlenging veroorzaken in de mens
leiden tot bradycardie en atrioventriculair blok in de zebravis, en door Fritsche et al. (2000),
die aantoonden dat verhoging en verlaging van NO-spiegels in zebravissen respectievelijk een
vasodilatatie en –constrictie veroorzaken.(7,10,41,86) Deze resultaten lijken goed nieuws te
brengen voor het vroegtijdig opsporen van bijwerkingen van farmaca.
Zebravissen bieden echter meer dan alleen toxicologische studieopties. Peal et al.
(2011) gebruikten in een functionele in vivo screening de mutant breakdance, een model voor
long-QT-syndroom. Zij ontdekten twee compounds, flurandrenolide en 2-MMB, die een QTverkorting induceerden en dus therapeutische mogelijkheden zouden kunnen bieden voor de
behandeling van Long-QT-syndroom.(31,43,107) In de toekomst wordt verwacht dat dit soort
screeningstudies gemakkelijker en sneller zal kunnen verlopen, onder andere dankzij de
ontwikkeling door Burns et al. (2005) van embryo’s met groen fluorescerend eiwit in hun
myocard. Door middel van een geautomatiseerde microscoop en software die de fluorescentie
detecteerde, slaagden zij erin om erg snel in 95% van de larven het hartritme te bepalen. Ze
konden ook succesvol bradycardie detecteren bij een aantal gekende QT-verlengende
geneesmiddelen. De combinatie van deze nieuwe technieken met de toenemende
beschikbaarheid van zebravisaritmiemodellen, zoals bijvoorbeeld de bradycardische mutant
slo mo, impliceert dat toekomstige screening op een meer high- throughput manier zullen
kunnen uitgevoerd worden.(32,35,82)
De mogelijkheden van de zebravis gaan verder dan het bestuderen van aritmieën.
Peterson et al. (2004) deden een chemische screening op de zebravis gridlock mutatie. Deze
vertoont een verstoorde bloedflow in zijn aorta en wordt gezien als een model is van
coarctatio aortae in de mens. Twee van de geteste moleculen, GS4012 en GS3999, waarvan
de eerste het krachtigste is, slaagden erin het mutante fenotype permanent te corrigeren.
Toedienen van deze gridlock-suppressors deed de VEGF-expressie (vascular endothelial
growth factor, een belangrijke component in de vorming van bloedvaten in de mens en
verschillende diersoorten) stijgen, wat de vermoedelijke basis is van hun werking. De
onderbroken bloedstroom naar de staart werd hersteld. Zelfs na stopzetten van de toediening
bleven de mutante vissen genezen en bereikten zonder problemen het volwassen stadium.
Deze moleculen bleken een zelfde positief resultaat te hebben op menselijke celculturen, wat
de kracht van de zebravis als model voor genetische aandoeningen onderstreept.(7,35,73)
27
4.3
Compound screening voor botaandoeningen
4.3.1 Gelijkenissen en verschillen van het skelet van mens en vis
Het skelet van de zebravis verschilt van mensen, door het gebrek aan lange beenderen,
cancelleus bot of beenmerg. Ze hebben geen hematopoëtisch beenmerg. Hun gewrichten zijn
ook niet synoviaal of gewichtsdragend. Ze hebben wél,
net als mensen, een complex
verbeend skelet bestaande uit kraakbeen en bot, met zowel intramembraneuze als
endochondrale botvorming in het craniofaciale skelet. Zebravisbotten hebben dezelfde
lamellaire structuur en dezelfde primaire kenmerken waar het het systeem van Havers
betreft.(13,15,92,108,109) Zebravisbotten zijn gevasculariseerd, geïnnerveerd en bevatten
holtes gevuld met vetweefsel. Zowel osteoblasten als osteoclasten worden aangetroffen in
zebravissen. Ook de karakteristieken van biomineralisatie en microstructuren van het
zebravisskelet gelijken op die van het menselijke bot en de craniofaciale botten ontwikkelen
op een gelijkaardige manier als bij de hogere gewervelden. (73,108)
4.3.2 De zebravis in botgerelateerde compound screening
In een poging om na te gaan of de botten van de zebravis een gelijkaardige functionele
plasticiteit hebben als bij de mens het geval is, en om dus verder de waarde van de zebravis
als botmodel te bewijzen deden Siccardi et al. (2010) onderzoek naar de effecten van
strontium in het dieet van de zebravis. Strontium werd aan het voedingsmengsel toegevoegd
in verschillende concentraties. Na scannen van de vissen met een microCTscanner werden de
totale botmineraaldensiteit en botvolume bepaald en werd de verhouding van botdensiteit tot
lengte, gewicht en botvolume berekend. De onderzoekers kwamen tot de conclusie dat
toevoeging van strontium aan het dieet op een dosisafhankelijke manier leidde tot een
toename in mineraaldensiteit zonder dat er effecten op de botstructuur merkbaar waren.
Gelijkaardige resultaten werden in andere studies gezien bij ratten, muizen en apen, wat de
waarde van de zebravis als botmodel onderstreept.(92)
De waarde van de zebravis als botmodel wordt in nog meer studies aangetoond.
Fleming et al. (2006) deden bijvoorbeeld een high-throughput in vivo screening naar
compounds die effect hebben op de densiteit van het bot. Vitamine D3 en zijn analogen en
intermittente toediening van parathormoon (PTH) veroorzaakten dosisdependente toename in
de vorming van gemineraliseerd bot. Continue blootstelling aan PTH veroorzaakte echter
netto verlies aan bot en verschillende statines veroorzaakten geen detecteerbare effecten. De
onderzoekers concludeerden dat deze effecten, die ook gezien waren in vorige studies met
28
andere diermodellen, aantoonden dat de zebravis een valabel model is voor het anabolisme
van zoogdierbotten.(79) Een ander voorbeeld van de gelijkenissen tussen mens en zebravis is
de studie van Barrett et al. (2006). Zij toonden in een gelijkaardige screening aan dat
toevoegen van prednisolone (25µM) aan het water waarin de larven zwemmen de
botmineralisatie met 50% deed afnemen, wat overeenkomt met wat we weten over het effect
van corticosteroïden op menselijk bot.(110) Deze positieve resultaten ondersteunen de
overtuiging dat zebravissen een veelbelovend model zijn voor het onderzoek naar antiosteoporotische therapieën. Een kanttekening die hierbij gemaakt dient te worden is het feit
dat er nog geen zebravismodel bestaat voor ouderdomsgerelateerde osteoporose.(92)
Ook het onderzoeken van therapeutische pistes voor botaandoeningen kan met
zebravissen gebeuren. Onlangs is gebleken dat overmatig ijzer een onafhankelijke risicofactor
is voor het optreden van osteoporose. IJzer stimuleert osteoclastdifferentiatie en botresorptie
door de productie van reactief zuurstof. Chen et al. (2014) deden een screening waarbij
zebravislarven eerst gedurende vier dagen blootgesteld werden aan ammoniumijzercitraat
(ferric ammonium citrate of FAC) en vervolgens behandeld werden met deferoxamine (DFO),
een krachtige ijzerchelator. De onderzoekers konden aantonen dat, hoewel FAC de
hoeveelheid gemineraliseerde botmatrix, gedetecteerd door aankleuren van calciumzouten
met alizarinerood, verminderde, dit effect succesvol tegen gegaan werd door DFO. Daarnaast
bleek DFO de downregulatie van osteoblast-specifieke genen door FAC ook tegen te gaan.
Deze data suggereren dat DFO een mogelijke piste is voor het behandelen van osteoporose
door ijzerovermaat.(91)
Een ander voorbeeld van de toepassing van het zebravismodel op menselijke
pathologie is dat van het onderzoek naar osteogenesis imperfecta. Osteogenesis imperfecta
(OI) is een ziekte van de collageenmatrix van het bot, die leidt tot misvormingen van het
skelet, broze botten met een groter fractuurrisico en, in de meeste gevallen, verminderde
botdensiteit. De meerderheid van de OI-gevallen worden veroorzaakt door autosomaal
dominante mutaties in genen die coderen voor collageen type I, maar er bestaan ook
recessieve vormen, onder meer veroorzaakt door recessieve mutaties in het enzym Bmp1. Een
forward genetics screening heeft geleid tot de identificatie van de zebravismutant chihuahua,
die zowel genetisch als fenotypisch lijkt op de dominante vorm van OI. Genetisch, want de
verantwoordelijke genen bij zebravis en mens zijn homoloog
en fenotypisch, want
heterozygote vissen vertonen een normale kraakbeenvorming maar abnormale botgroei,
gekenmerkt door ongelijke verdeling van de mineralisatie en frequente breuken.(108) Meer en
meer van deze mutanten zijn gekend en worden onder andere gebruikt om onderzoek te doen
29
naar de genetische basis van menselijke ziekten. Dat zebravissen in staat zijn om intacte
menselijke enzymen te produceren na injectie van menselijk mRNA geven de onderzoekers
aan als een duidelijk voordeel, en heeft onder andere tot nieuwe inzichten geleid in de
recessieve vorm van osteogenesis imperfecta. Om na te gaan of de mutatie die werd
aangetroffen in families met deze vorm van OI ook verantwoordelijk was voor de aandoening
werd mRNA met de mutatie in kwestie toegediend aan zebravissen met een vertraagde
ossificatie van de wervels, de mutant frilly fins, met een mutatie in het Bmp1a protease
domein. Injectie van wild-type mRNA leidde tot de overleving en dus ‘genezing’ van het
frilly fins fenotype, waar dit met het mutante mRNA niet het geval was.(108)
Deze mutanten en het gebruik ervan als model openen nieuwe deuren voor de
drugscreening. Hoe meer relevante mutanten gevonden worden, hoe groter de kans wordt dat
door grote screenings moleculen ontdekt worden die een therapeutisch effect kunnen hebben
bij de mens.
4.4
Compound screening voor huidaandoeningen
4.4.1 Gelijkenissen en verschillen tussen de huid van mens en vis
Net als bij de mens wordt de huid van de zebravis gevormd uit ectoderm en hun
patroon van pigmentatie wordt veroorzaakt door pigmentcellen, waaronder melanocyten,
afkomstig uit de crista neuralis. (13,80,111–113) Na 1 dpf vertonen de zebravisembryo’s
verschillende huidlagen, waar we een equivalent van onze dermis en epidermis in kunnen
herkennen. De basale membraanzone tussen dermis en epidermis is op dit moment nog niet
ontwikkeld. Tegen 6 dpf is de epidermis, bestaande uit twee cellagen, gemakkelijk te
onderscheiden en duidelijk gescheiden van het onderliggende weefsel door een basale
membraan. Op het oppervlak van het epiderm zijn dan heel kleine stekelachtige structuren te
zien die te vergelijken zijn met het microreliëf op menselijke epidermale cellen. Aan de
dermale zijde is er dan een goed ontwikkeld collageneus stroma zichtbaar, met aanliggende
fibroblastische cellen die een goed ontwikkeld ruw endoplasmatisch reticulum hebben. Bij
sterke vergroting vinden we ook hemidesmosomale structuren.(111,114,114) Onder de
elektronenmicroscoop vertoont de huid rond 1 dpf afgelijnde keratinocyten, die goed
georganiseerd zijn tegen 6 dpf en later de schubben zullen vormen (figuur 7). Deze opbouw
lijkt sterk op die van de mens. (111,115)
30
Figuur 7. Huid van de zich ontwikkelende zebravis. (a) toont de groei van de zebravis van embryo’s rond 1 dpf,
omringd door een transparant chorion (C) en met een duidelijke vruchtzak (YC), tot volwassen vissen. Rond 6
dpf wordt pigmentatie van de huid zichtbaar. (b) Transmissie elektronenmicroscoop toont op 1 en 6 dpf een
epidermis € die bestaat uit twee cellagen. Tegen 6 dpf is de epidermis gescheiden van het onderliggende
collageneus stroma (CS) en dermis (D) door een duidelijk zichtbare basale membraan (open pijltjes). Bij
volwassen vissen is er een meerlagige epidermis en een vergroting van de basale membraan zone toont de
aanwezigheid van hemidesmosomen (pijltjes op de vergroting). De stekelvormige uitlopers van het
huidoppervlak (pijltjes) komen overeen met microreliëf bij menselijke cellen. (c) Scanning
elektronenmicroscoop toont goed afgetekende keratinocyten met duidelijke cel-celgrenzen (kleine pijltjes). In
het midden van het oppervlak van de keratinocyten ontwikkelt er zich microreliëf, dat rond 6 dpf goed
georganiseerd is (pijlhoofden) In een volwassen vis is de epidermis bedekt met schubben.(111)
De structuur van de zebravishuid loopt dus erg gelijk met die van de mens, maar
verschillen zijn er ook. De vissen hebben structuren uniek voor hun leven in het water, zoals
hun schubben en muceuze cellen. De genen die voor de schubben coderen in de zebravis
komen overeen met deze die in de mens instaan voor haar en tanden. We kunnen hier dus niet
spreken van een extra huidlaag. De zebravissen missen verder structuren die zoogdieren wel
bezitten, zoals haarfollikels en talgklieren. Ook hebben ze twee extra pigmentceltypes die de
mens niet heeft, xantoforen, die een gele kleur hebben onder wit licht, en reflecterende
31
iridoforen. (13,80) Ondanks deze bezwaren geven Li et al. (2012) aan dat de zebravis een
valabel model is voor het bestuderen van huidziekten en bijgevolg ook voor het uitvoeren van
drugscreenings.(111)
4.4.2 De zebravis in huidgerelateerde compound screening
Een
voorbeeld
van
het
gebruik
van
zebravissen
in
studies
gericht
op
huidaandoeningen vinden we onder meer terug bij Choi et al. (2007). Zij gebruikten in hun
onderzoek naar hypopigmenterende stoffen zowel gekende melanogene inhibitoren, zoals
arbutine, kojinezuur, 2-mercaptobenzothiazol (MBT) en PTU, als nieuw ontwikkelde small
compounds (haginine, YT16i). Alle gekende melanogene inhibitoren vertoonden een variabel
effect op de pigmentatie. Om het nut van het zebravismodel voor dit soort studies aan te tonen
behandelden de onderzoekers ook een groep zebravissen, die vooraf behandeld waren met
PTU, met een melanogene stimulator, α-melanocyt stimulerend hormoon (α-MSH).
Verwijdering van het PTU in de controlegroep had maar een mild herstel van de pigmentatie
tot gevolg, in tegenstelling tot de groep behandeld met α-MSH, die een duidelijke toename in
pigmentatie vertoonden. De auteurs concludeerden dat de zebravis een waardevol alternatief
biedt voor het bestuderen van pigmentatieprocessen en de invloed van nieuwe moleculen
hierop.(80)
Een studie die deze bewering verder ondersteunt is deze gedaan door Lin et al (2011).
In een eerste in vitro studie op B16 melanoomcellen uit muizen ontdekten de onderzoekers
dat een methanol extract uit Trifolium pratense, rode klaver, een sterke inhibitie van de
melanogenese veroorzaakte. Na isolatie van de actieve compound, biochanine A, werd deze in
vitro onderzocht op gekweekte muis-B16 melanoomcellen en in vivo op zebravisembryo’s en
muizen, respectievelijk door toevoeging van de in 0.1% DMSO-opgeloste compound aan het
water van de larven, geïnspireerd op de aanpak van Choi et al (cf. supra), en applicatie van
2% biochanine A crème op de huid, tweemaal daags. In vitro werd een duidelijke preventie
van pigmentatie bemerkt, die dosisdependent was. In vivo vertoonden zebravissen die tussen 9
en 48 hpf behandeld waren, duidelijk minder pigmentatie. Ditzelfde effect werd opgemerkt bij
de behandelde muizen, wiens huid meer overeenkomsten vertoont met die van de mens. Deze
bevindingen bevestigen dus enerzijds dat biochanine A een effectieve melanogenese inhibitor
is en potentieel gebruikt kan worden als hypopigmenterende behandeling bij de mens en
anderzijds dat de zebravis een valabel modelsysteem is om dit te onderzoeken.(116)
32
5.
Discussie
De vele voordelen van het gebruik van zebravissen spreken voor zich. De zebravissen
bewijzen al jaren dat ze een valabel model zijn voor het bestuderen van gen- en andere
afwijkingen en lijken de overgang naar model voor drugscreening gemakkelijk te maken.
Desalniettemin zijn er in de literatuur nog relatief weinig voorbeelden van praktisch
uitgevoerde studies. Een aantal onderzoeksgebieden, onder andere het onderzoek naar
kankertherapeutica is sterk vertegenwoordigd, maar aan andere toepassingen, waaronder
zeker het onderzoek naar bot- en huidaandoeningen, is nog weinig aandacht besteed. Meer
studies in deze gebieden moeten nog gebeuren om het nut van de zebravis verder aan te tonen,
wat op zijn beurt de aanvaarding van de zebravis als model voor drugscreening ten goede zal
komen. Een belangrijk argument voor het gebruik van de zebravis als drugscreeningmodel is
de toenemende automatisering. De mogelijkheid om sneller en meer compounds te evalueren
zal een positief effect hebben op de huidige vertragende stap in het onderzoek naar nieuwe
geneesmiddelen. Aan de andere kant is een nadeel van het gebruik van zebravissen ten
opzichte van de klassieke diermodellen zoals rat en muis is dat de zebravis, ondanks zijn
gelijkenissen met de mens, geen zoogdier is. De zebravis staat evolutionair gezien verder van
de mens dan de knaagdieren die momenteel nog steeds de gouden standaard vormen als het
over drugscreening gaat. De zebravis is dus geen alternatief voor het gebruik van deze laatste,
eerder een aanvulling. Door de mogelijkheid om de screening met zebravissen te
automatiseren, met dank aan zijn kleine formaat en transparantie, kan namelijk al een eerste
selectie gemaakt worden van compounds die een in vivo resultaat hebben. Hierdoor worden
de hits die wel een in vitro, maar geen in vivo resultaat hebben al geëlimineerd. Dit zorgt
ervoor dat minder van de duurdere en meer tijdrovende studies met zoogdieren nodig zijn,
wat de efficiëntie verhoogt. Een kanttekening die bij deze conclusies moet gemaakt worden is
dat het aantal studies waar men echt praktisch op zoek gegaan is naar nieuwe compounds met
een effect op ziekteprocessen, in deze thesis jammer genoeg beperkt is. De huidige artikels
lijken zich nog meer te focussen op het bewijzen van de validiteit van de zebravis als model
dan op het echte onderzoek ermee. In de toekomst zal hier ongetwijfeld nog veel werk kunnen
verricht worden.
6.
Referentielijst
33
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
Lewiecki EM. Role of sclerostin in bone and cartilage and its potential as a therapeutic target in bone
diseases. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2014 Apr;6(2):48–57.
Giacomotto J, Segalat L. High-throughput screening and small animal models, where are we? Br J
Pharmacol. 2010 May;160(2):204–16.
Lindsay MA. Target discovery. Nat Rev Drug Discov. 2003 Oct;2(10):831–8.
Bleicher KH, Böhm H-J, Müller K, Alanine AI. Hit and lead generation: beyond high-throughput
screening. Nat Rev Drug Discov. 2003 May;2(5):369–78.
Kari G, Rodeck U, Dicker AP. Zebrafish: An Emerging Model System for Human Disease and Drug
Discovery. Clin Pharmacol Ther. 2007 May 9;82(1):70–80.
Zon LI, Peterson RT. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. 2005 Jan;4(1):35–44.
Rocke J, Lees J, Packham I, Chico T. The Zebrafish as a Novel Tool for Cardiovascular Drug Discovery.
Recent Patents Cardiovasc Drug Discov. 2009 Jan 1;4(1):1–5.
Lessman CA. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening
of chemical libraries. Birth Defects Res Part C Embryo Today Rev. 2011;93(3):268–80.
High-throughput screening [Internet]. Wikipedia, the free encyclopedia. 2013 [cited 2013 Nov 16].
Available from: http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=High-throughput_screening&oldid=571065678
Langheinrich U. Zebrafish: A new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 2003;25(9):904–12.
Delvecchio C, Tiefenbach J, Krause HM. The Zebrafish: A Powerful Platform for In Vivo , HTS Drug
Discovery. ASSAY Drug Dev Technol. 2011 Aug;9(4):354–61.
Murphey RD, Zon LI. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 2006 Jul;39(3):255–61.
Lieschke GJ, Currie PD. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet.
2007 May;8(5):353–67.
Tsang M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res Part C Embryo Today Rev.
2010;90(3):185–92.
Barros TP, Alderton WK, Reynolds HM, Roach AG, Berghmans S. Zebrafish: an emerging technology for
in vivo pharmacological assessment to identify potential safety liabilities in early drug discovery. Br J
Pharmacol. 2008;154(7):1400–13.
Kaletta T, Hengartner MO. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev
Drug Discov. 2006 May;5(5):387–98.
Evanko D. In praise of manual high-throughput screening. Nat Methods. 2006 Sep;3(9):662–3.
Gerhard GS. Small laboratory fish as models for aging research. Ageing Res Rev. 2007 May;6(1):64–72.
Rubinstein AL. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Curr Opin Drug Discov Devel. 2003
Mar;6(2):218–23.
Hallare AV, Köhler H-R, Triebskorn R. Developmental toxicity and stress protein responses in zebrafish
embryos after exposure to diclofenac and its solvent, DMSO. Chemosphere. 2004 Aug;56(7):659–66.
Lahnsteiner F. The effect of internal and external cryoprotectants on zebrafish (Danio rerio) embryos.
Theriogenology. 2008 Feb;69(3):384–96.
Harris TW, Chen N, Cunningham F, Tello-Ruiz M, Antoshechkin I, Bastiani C, et al. WormBase: a multispecies resource for nematode biology and genomics. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 1;32(Database
issue):D411–417.
Bier E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 2005
Jan;6(1):9–23.
Bernards A, Hariharan IK. Of flies and men--studying human disease in Drosophila. Curr Opin Genet
Dev. 2001 Jun;11(3):274–8.
Celniker SE, Rubin GM. The Drosophila melanogaster genome. Annu Rev Genomics Hum Genet.
2003;4:89–117.
Postlethwait JH, Woods IG, Ngo-Hazelett P, Yan Y-L, Kelly PD, Chu F, et al. Zebrafish Comparative
Genomics and the Origins of Vertebrate Chromosomes. Genome Res. 2000 Dec 1;10(12):1890–902.
Brand M, Granato M, Nüsslein-Volhard C. Zebrafish: practical approach. Oxford University Press; 2002.
p. 7–37.
Institutional animal care and use committee. Breeding guidelines for mice [Internet]. University of
Florida;
2012
[cited
2014
Apr
10].
Available
from:
http://iacuc.ufl.edu/policies/Changes%202012/ACS%20Mouse%20Breeding%20Guidelines%20for%20IA
CUC.pdf
Woo K, Shih J, Fraser S. Fate maps of the zebrafish embryo. Curr Opin Genet Dev. 1995;5(4):439–43.
Ni-Komatsu L, Orlow SJ. Identification of Novel Pigmentation Modulators by Chemical Genetic
Screening. J Invest Dermatol. 2007;127(7):1585–92.
Santoriello C, Zon LI. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 2012 Jul
2;122(7):2337–43.
34
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
Milan DJ, MacRae CA. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog Biophys Mol Biol. 2008;98(23):301–8.
Poon K-L, Liebling M, Kondrychyn I, Garcia-Lecea M, Korzh V. Zebrafish cardiac enhancer trap lines:
New tools for in vivo studies of cardiovascular development and disease. Dev Dyn. 2010;239(3):914–26.
Schilling T. Zebrafish: practical approach. Oxford University Press; 2002. p. 59–64.
Chico TJA, Ingham PW, Crossman DC. Modeling Cardiovascular Disease in the Zebrafish. Trends
Cardiovasc Med. 2008 May;18(4):150–5.
Wheeler GN, Brändli AW. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens:
Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 2009;238(6):1287–308.
Emelyanov A, Parinov S. Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in
transgenic zebrafish. Dev Biol. 2008 Aug 1;320(1):113–21.
Mathew LK, Sengupta S, Kawakami A, Andreasen EA, Löhr CV, Loynes CA, et al. Unraveling tissue
regeneration pathways using chemical genetics. J Biol Chem. 2007 Nov 30;282(48):35202–10.
Tong S-K, Mouriec K, Kuo M-W, Pellegrini E, Gueguen M-M, Brion F, et al. A cyp19a1b-gfp (aromatase
B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genes N Y N 2000. 2009
Feb;47(2):67–73.
Thorpe JL, Doitsidou M, Ho S-Y, Raz E, Farber SA. Germ cell migration in zebrafish is dependent on
HMGCoA reductase activity and prenylation. Dev Cell. 2004 Feb;6(2):295–302.
Milan DJ, Peterson TA, Ruskin JN, Peterson RT, MacRae CA. Drugs That Induce Repolarization
Abnormalities Cause Bradycardia in Zebrafish. Circulation. 2003 Mar 18;107(10):1355–8.
Chan J, Bayliss PE, Wood JM, Roberts TM. Dissection of angiogenic signaling in zebrafish using a
chemical genetic approach. Cancer Cell. 2002 Apr;1(3):257–67.
Mathias JR, Saxena MT, Mumm JS. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med
Chem. 2012 Sep;4(14):1811–22.
Redfern WS, Waldron G, Winter MJ, Butler P, Holbrook M, Wallis R, et al. Zebrafish assays as early
safety pharmacology screens: Paradigm shift or red herring? J Pharmacol Toxicol Methods. 2008
Sep;58(2):110–7.
Paquet D, Bhat R, Sydow A, Mandelkow E-M, Berg S, Hellberg S, et al. A zebrafish model of tauopathy
allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 2009 May;119(5):1382–
95.
Ito T, Ando H, Suzuki T, Ogura T, Hotta K, Imamura Y, et al. Identification of a Primary Target of
Thalidomide Teratogenicity. Science. 2010 Mar 12;327(5971):1345–50.
Wang C, Tao W, Wang Y, Bikow J, Lu B, Keating A, et al. Rosuvastatin, identified from a zebrafish
chemical genetic screen for antiangiogenic compounds, suppresses the growth of prostate cancer. Eur
Urol. 2010 Sep;58(3):418–26.
Lustman A, Nakar S, Cohen AD, Vinker S. Statin use and incident prostate cancer risk: does the statin
brand matter? A population-based cohort study. Prostate Cancer Prostatic Dis. 2014 Mar;17(1):6–9.
Oppedal D, Goldsmith MI. A Chemical Screen to Identify Novel Inhibitors of Fin Regeneration in
Zebrafish. Zebrafish. 2010 Mar;7(1):53–60.
Blackburn JS, Liu S, Raimondi AR, Ignatius MS, Salthouse CD, Langenau DM. High-throughput imaging
of adult fluorescent zebrafish with an LED fluorescence macroscope. Nat Protoc. 2011 Feb;6(2):229–41.
Bang PI, Yelick PC, Malicki JJ, Sewell WF. High-throughput behavioral screening method for detecting
auditory response defects in zebrafish. J Neurosci Methods. 2002 Aug 30;118(2):177–87.
Lin S, Gaiano N, Culp P, Burns JC, Friedmann T, Yee JK, et al. Integration and germ-line transmission of
a pseudotyped retroviral vector in zebrafish. Science. 1994 Jul 29;265(5172):666–9.
Huang P, Zhu Z, Lin S, Zhang B. Reverse Genetic Approaches in Zebrafish. J Genet Genomics. 2012 Sep
20;39(9):421–33.
Wu X, Li Y, Crise B, Burgess SM. Transcription start regions in the human genome are favored targets for
MLV integration. Science. 2003 Jun 13;300(5626):1749–51.
Wang D, Jao L-E, Zheng N, Dolan K, Ivey J, Zonies S, et al. Efficient genome-wide mutagenesis of
zebrafish genes by retroviral insertions. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 24;104(30):12428–33.
Dooley K, Zon LI. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 2000
Jun 1;10(3):252–6.
Amsterdam A, Hopkins N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in
development and disease. Trends Genet. 2006 Sep;22(9):473–8.
Nasevicius A, Ekker SC. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nat Genet. 2000
Oct;26(2):216–20.
Corey DR, Abrams JM. Morpholino antisense oligonucleotides: tools for investigating vertebrate
development. Genome Biol. 2001;2(5):reviews1015.1–reviews1015.3.
35
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
Zebrafish
Mutation
Project
[Internet].
[cited
2014
Apr
4].
Available
from:
http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/zmp/
Woods IG, Schier AF. Targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Biotechnol. 2008 Jun;26(6):650–1.
Meng X, Noyes MB, Zhu LJ, Lawson ND, Wolfe SA. Targeted gene inactivation in zebrafish using
engineered zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 2008 Jun;26(6):695–701.
Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD. Genome editing with engineered zinc finger
nucleases. Nat Rev Genet. 2010 Sep;11(9):636–46.
Lee HJ, Kim E, Kim J-S. Targeted chromosomal deletions in human cells using zinc finger nucleases.
Genome Res. 2010 Jan;20(1):81–9.
Moscou MJ, Bogdanove AJ. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 2009
Dec 11;326(5959):1501.
Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S, et al. Breaking the code of DNA binding
specificity of TAL-type III effectors. Science. 2009 Dec 11;326(5959):1509–12.
Hockemeyer D, Wang H, Kiani S, Lai CS, Gao Q, Cassady JP, et al. Genetic engineering of human
pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 2011 Aug;29(8):731–4.
Huang P, Xiao A, Zhou M, Zhu Z, Lin S, Zhang B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized
TALENs. Nat Biotechnol. 2011 Aug;29(8):699–700.
Li T, Huang S, Zhao X, Wright DA, Carpenter S, Spalding MH, et al. Modularly assembled designer TAL
effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic Acids Res.
2011 Aug;39(14):6315–25.
Stainier DY, Fouquet B, Chen JN, Warren KS, Weinstein BM, Meiler SE, et al. Mutations affecting the
formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 1996 Dec
1;123(1):285–92.
Milan DJ, Kim AM, Winterfield JR, Jones IL, Pfeufer A, Sanna S, et al. Drug-sensitized zebrafish screen
identifies multiple genes, including GINS3, as regulators of myocardial repolarization. Circulation. 2009
Aug 18;120(7):553–9.
Chablais F, Veit J, Rainer G, Jaźwińska A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced
myocardial infarction. BMC Dev Biol. 2011;11:21.
Peterson RT, Shaw SY, Peterson TA, Milan DJ, Zhong TP, Schreiber SL, et al. Chemical suppression of a
genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 2004 May;22(5):595–9.
Spoorendonk KM, Hammond CL, Huitema LFA, Vanoevelen J, Schulte-Merker S. Zebrafish as a unique
model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 2010 Apr
1;26(2):219–24.
Fisher S, Jagadeeswaran P, Halpern ME. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Dev Biol.
2003 Dec 1;264(1):64–76.
White RM, Sessa A, Burke C, Bowman T, LeBlanc J, Ceol C, et al. Transparent adult zebrafish as a tool
for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2008 Feb 7;2(2):183–9.
Westerfield M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) [Internet].
Eugene: Univ. of Oregon Press; Available from: http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html
Wang H-M, Chen C-Y, Wen Z-H. Identifying melanogenesis inhibitors from Cinnamomum subavenium
with in vitro and in vivo screening systems by targeting the human tyrosinase. Exp Dermatol.
2011;20(3):242–8.
Fleming A, Sato M, Goldsmith P. High-Throughput In Vivo Screening for Bone Anabolic Compounds
with Zebrafish. J Biomol Screen. 2005 Dec 1;10(8):823–31.
Choi T-Y, Kim J-H, Ko DH, Kim C-H, Hwang J-S, Ahn S, et al. Zebrafish as a new model for phenotypebased screening of melanogenic regulatory compounds. Pigment Cell Res. 2007;20(2):120–7.
Tran TC, Sneed B, Haider J, Blavo D, White A, Aiyejorun T, et al. Automated, quantitative screening
assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 2007 Dec 1;67(23):11386–
92.
Burns CG, Milan DJ, Grande EJ, Rottbauer W, MacRae CA, Fishman MC. High-throughput assay for
small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat Chem Biol. 2005 Oct;1(5):263–4.
Petzold AM, Bedell VM, Boczek NJ, Essner JJ, Balciunas D, Clark KJ, et al. SCORE Imaging: Specimen
in a Corrected Optical Rotational Enclosure. Zebrafish. 2010 Jun;7(2):149–54.
Pardo-Martin C, Chang T-Y, Koo BK, Gilleland CL, Wasserman SC, Yanik MF. High-throughput in vivo
vertebrate screening. Nat Methods. 2010 Aug;7(8):634–6.
Kitambi SS, McCulloch KJ, Peterson RT, Malicki JJ. Small molecule screen for compounds that affect
vascular development in the zebrafish retina. Mech Dev. 2009;126(5-6):464–77.
Fritsche R, Schwerte T, Pelster B. Nitric oxide and vascular reactivity in developing zebrafish,Danio rerio.
Am J Physiol - Regul Integr Comp Physiol. 2000 Dec 1;279(6):R2200–R2207.
36
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
Lin K-Y, Chang W-T, Lai Y-C, Liau I. Toward Functional Screening of Cardioactive and Cardiotoxic
Drugs with Zebrafish in Vivo Using Pseudodynamic Three-Dimensional Imaging. Anal Chem [Internet].
2014 Jan 23 [cited 2014 Feb 13]; Available from: http://dx.doi.org/10.1021/ac403877h
Liebling M, Forouhar AS, Gharib M, Fraser SE, Dickinson ME. Four-dimensional cardiac imaging in
living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. J Biomed Opt. 2005
Oct;10(5):054001.
Liebling M, Forouhar AS, Wolleschensky R, Zimmermann B, Ankerhold R, Fraser SE, et al. Rapid threedimensional imaging and analysis of the beating embryonic heart reveals functional changes during
development. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 2006 Nov;235(11):2940–8.
Forouhar AS, Liebling M, Hickerson A, Nasiraei-Moghaddam A, Tsai H-J, Hove JR, et al. The embryonic
vertebrate heart tube is a dynamic suction pump. Science. 2006 May 5;312(5774):751–3.
Chen B, Yan Y-L, Liu C, Bo L, Li G-F, Wang H, et al. Therapeutic Effect of Deferoxamine on Iron
Overload-Induced Inhibition of Osteogenesis in a Zebrafish Model. Calcif Tissue Int. 2014 Mar
1;94(3):353–60.
Siccardi AJ, Padgett-Vasquez S, Garris HW, Nagy TR, D’Abramo LR, Watts SA. Dietary Strontium
Increases Bone Mineral Density in Intact Zebrafish ( Danio rerio ): A Potential Model System for Bone
Research. Zebrafish. 2010 Sep;7(3):267–73.
Weber DN. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of
larval zebrafish Danio rerio. J Fish Biol. 2006 Jul 1;69(1):75–94.
Inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie [Internet]. Wikipedia. 2014 [cited 2014 Apr 2]. Available
from:
http://nl.wikipedia.org/w/index.php?title=Inductief_gekoppeld_plasma_massaspectrometrie&oldid=37356
701
Zhu J-J, Xu Y-Q, He J-H, Yu H-P, Huang C-J, Gao J-M, et al. Human cardiotoxic drugs delivered by
soaking and microinjection induce cardiovascular toxicity in zebrafish. J Appl Toxicol. 2014;34(2):139–
48.
Epstein FH, Epstein JA. A perspective on the value of aquatic models in biomedical research. Exp Biol
Med Maywood NJ. 2005 Jan;230(1):1–7.
Fishman MC, Chien KR. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Dev Camb Engl.
1997 Jun;124(11):2099–117.
Stainier DY. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2001 Jan;2(1):39–48.
The Exploratorium. Zebrafish: A model for heart development [Internet]. The museum of art, science and
human perception, Florida; [cited 2014 Apr 10]. Available from: www.exploratorium.edu
Isogai S, Horiguchi M, Weinstein BM. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of
embryonic and early larval development. Dev Biol. 2001 Feb 15;230(2):278–301.
Pelster B, Burggren WW. Disruption of hemoglobin oxygen transport does not impact oxygen-dependent
physiological processes in developing embryos of zebra fish (Danio rerio). Circ Res. 1996 Aug;79(2):358–
62.
Hsieh DJ-Y, Liao C-F. Zebrafish M2 muscarinic acetylcholine receptor: cloning, pharmacological
characterization, expression patterns and roles in embryonic bradycardia. Br J Pharmacol. 2002
Nov;137(6):782–92.
Huang C-C, Monte A, Cook JM, Kabir MS, Peterson KP. Zebrafish Heart Failure Models for the
Evaluation of Chemical Probes and Drugs. ASSAY Drug Dev Technol. 2013 Dec;11(9-10):561–72.
Park MJ, Lee K-R, Shin D-S, Chun H-S, Kim C-H, Ahn S-H, et al. Predicted drug-induced bradycardia
related cardio toxicity using a zebrafish in vivo model is highly correlated with results from in vitro tests.
Toxicol Lett. 2013 Jan 10;216(1):9–15.
Piccini JP, Whellan DJ, Berridge BR, Finkle JK, Pettit SD, Stockbridge N, et al. Current challenges in the
evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the Critical Path
Initiative. Am Heart J. 2009 Sep;158(3):317–26.
Langheinrich U, Vacun G, Wagner T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are
sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia☆. Toxicol Appl Pharmacol.
2003 Dec 15;193(3):370–82.
Peal DS, Mills RW, Lynch SN, Mosley JM, Lim E, Ellinor PT, et al. Novel Chemical Suppressors of Long
QT Syndrome Identified by an In Vivo Functional Screen. Circulation. 2011 Jan 4;123(1):23–30.
Mackay EW, Apschner A, Schulte-Merker S. A bone to pick with zebrafish. BoneKEy Rep [Internet].
2013
Nov
13
[cited
2014
Feb
24];2.
Available
from:
http://www.nature.com/bonekeyreports/2013/131113/bonekey2013179/full/bonekey2013179.html#referen
ces
37
109. Witten PE, Huysseune A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in
teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 2009
May;84(2):315–46.
110. Barrett R, Chappell C, Quick M, Fleming A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoidinduced osteoporosis. Biotechnol J. 2006;1(6):651–5.
111. Li Q, Frank M, Thisse C, Thisse B, Uitto J. Zebrafish: A Model System to Study Heritable Skin Diseases.
J Invest Dermatol. 2011 Mar;131(3):565–71.
112. O’Reilly-Pol T, Johnson SL. Melanocyte regeneration reveals mechanisms of adult stem cell regulation.
Semin Cell Dev Biol. 2009 Feb;20(1):117–24.
113. Lee Y, Nachtrab G, Klinsawat PW, Hami D, Poss KD. Ras controls melanocyte expansion during
zebrafish fin stripe regeneration. Dis Model Mech. 2010 Aug;3(7-8):496–503.
114. Le Guellec D, Morvan-Dubois G, Sire J-Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on
collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 2004;48(2-3):217–31.
115. Sire J-Y, Akimenko M-A. Scale development in fish: a review, with description of sonic hedgehog (shh)
expression in the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 2004;48(2-3):233–47.
116. Lin VC, Ding H-Y, Tsai P-C, Wu J-Y, Lu Y-H, Chang T-S. <I>In Vitro</I> and <I>in Vivo</I>
Melanogenesis Inhibition by Biochanin A from <I>Trifolium pratense</I>. Biosci Biotechnol Biochem.
2011;75(5):914–8.
38

Noonan and LEOPARD Syndrome in Zebrafish

Cover Page The handle http://hdl.handle.net/30138 holds

Organigram

2014 03 13 plug-INN studiedag - (758kb)

DOEL DOELGROEP BESCHRIJVING

Ik laat niet naar mijn borsten kijken (De Standaard 22.01.2014

Kankerpatiënte kan veel vaker vruchtbaarheid

Korte screening parkinsonproblemen

HAL-aanvraagformulier

CazisNieuws 7