FACULTEIT GENEESKUNDE EN
GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2013 – 2014
DE ROL VAN METALLOTHIONEINS IN
CHRONISCHE MODELLEN VOOR INFLAMMATOIR
DARMLIJDEN.
Lisa CRAPÉ
Promotor: Debby Laukens, PhD
Co-promotor: Lindsey Devisscher
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
Voorwoord
Bij de keuze van mijn thesisonderwerp twee jaar geleden, viel mijn oog onmiddellijk op de
titel van deze studie. Ik ben altijd al nieuwsgierig geweest naar de wereld van het
wetenschappelijk onderzoek en de beschrijving van dit onderwerp sprak mij dan ook enorm
aan. De interesse is niet verminderd met de tijd.
Deze laatste twee jaar kreeg ik de kans om van dicht bij te zien hoe wetenschappelijk
onderzoek in zijn werk gaat. Zo leerde ik dat het nodig is om bij dergelijke onderzoeken over
veel achtergrondinformatie te beschikken. Deze informatie is immers noodzakelijk om goed
uit te dokteren wat en hoe men iets wilt onderzoeken. Planning en structuur zijn onmisbaar; er
moet maanden op voorhand beslist worden wanneer wordt gestart met het kweken van
muizen en wanneer de testen worden uitgevoerd. Ook kleuringen moeten zorgvuldig gepland
worden, aangezien deze soms meerdere dagen kunnen duren. Ik leerde tegenslag kennen
wanneer een kleuring niet was gelukt en op zo ’n moment is het dan belangrijk om door te
zetten en op te zoeken waar de fouten zijn gemaakt, om een protocol logisch te kunnen
aanpassen. Overleg met collega’s en experten zorgt voor betere planning en begrip. Ook
leerde ik hoe men de stalen zorgvuldig bewaart en hoe men zuinig kan omgaan met dure
materialen. Verschillende labotechnieken werden mij aangeleerd, zoals coupes snijden,
kleuringen uitvoeren, werken met DNA materiaal, qPCR en in vitro werk. Bij dit laatste
moesten
de
protocollen
over
de
hygiënische
voorschriften
toegepast
worden.
Als toekomstige arts is het nuttig om te weten hoeveel tijd, geld en materiaal sommige
onderzoeken vragen. Aangezien ik dit nu zelf heb ondervonden, kan ik deze kennis gebruiken
om later geen onnodige testen aan te vragen. Ik ben dan ook enorm blij met de kans die ik heb
gekregen om deze praktische ervaring op te doen.
Ik wil graag daarom al de mensen bedanken die mij geholpen hebben om dit werk tot een
goed einde te brengen. Eerst en vooral wil ik mijn promotor Dr. Debby Laukens bedanken,
voor de kans die ik kreeg om aan deze studie mee te werken en voor het nauwgezet opvolgen.
Ook wil ik graag mijn co-promotor Lindsey Devisscher bedanken, voor de leidende hand
gedurende heel het tijdsverloop van mijn studie. Je was altijd heel vlot te bereiken en altijd
paraat voor mij. Ik had altijd een goed beeld over mijn studie en de rol die ik zou spelen in het
overkoepelende werk. Bij elke stap kreeg ik een duidelijk uitleg en de nodige begeleiding.
Heel erg bedankt voor al je enthousiasme en inspanning.
Tot slot wil ik al de mensen in het laboratorium van de dienst Gastro-Enterologie (3K12) in
het UZ Gent bedanken. In het bijzonder de laborantes Hilde Devlies, Kim Olievier, Anja Van
den Bussche en Petra Van Wassenhove, voor de vriendelijke en geduldige uitleg bij elke stap
van het proces. Jullie leerden me veel bij in de - in het begin onbekende- wereld van het
wetenschappelijk onderzoek.
Door de leuke sfeer in het laboratorium had ik iedere keer opnieuw zin om naar het labo te
gaan en iets nieuws uit te proberen. Hoewel er wel theoretische lessen waren gegeven in kader
van mijn opleiding, had ik nog maar heel weinig praktijkervaring in een klinisch
laboratorium. Ik werd echter zo goed opgevangen, dat ik mij vlug nuttig kon voelen.
Heel erg bedankt allemaal. Ik zal de leuke middagpauzes nooit vergeten.
Dit onderzoek werd goedgekeurd door het Ethische Commissie Dierproeven. De toelating is
gearchiveerd als ECD 10/11.
Inhoudstafel
Abstract – English ..................................................................................................................... 1
Abstract – Nederlands ................................................................................................................ 2
Inleiding ..................................................................................................................................... 5
1.
Inflammatoir darmlijden ..................................................................................................... 5
1.2 Klinisch ............................................................................................................................. 6
1.2 Lokalisatie ........................................................................................................................ 7
1.3 Histologisch ...................................................................................................................... 7
1.4 Experimentele diermodellen voor IBD............................................................................. 8
1.4.1 Chemische modellen .................................................................................................. 9
a) DSS acuut en chronisch .............................................................................................. 9
b) 2,4,6-trinitrobenzeensulfaat (TNBS) acuut en chronisch ......................................... 10
c) Andere, minder gebruikte chemische modellen ........................................................ 11
1.4.2 Genetische modellen ................................................................................................ 11
1.4.3 Cel transfer ............................................................................................................... 12
1.4.4 Spontane of congenitale IBD ................................................................................... 13
2.
Metallothioneins (MTs) .................................................................................................... 13
2.1 MTs in IBD ..................................................................................................................... 14
3.
Macrofagen ....................................................................................................................... 16
Methodologie ........................................................................................................................... 19
1. Muismodellen ....................................................................................................................... 19
1.1 Chronische colitis ........................................................................................................... 19
1.1.1 H&E en histologische evaluatie ............................................................................... 19
1.1.2 Sirius Red kleuring .................................................................................................. 20
1.1.3 F4/80 kleuring .......................................................................................................... 20
1.2 TNFΔare ............................................................................................................................ 20
1.3 qPCR............................................................................................................................... 22
2. In vitro .................................................................................................................................. 22
2.1 Bone marrow derived macrophages (BMDM) – test ..................................................... 22
2.2 THP-1 test ....................................................................................................................... 23
3. Statistische verwerking ........................................................................................................ 24
Resultaten ................................................................................................................................. 25
1.Chronische DSS-model ......................................................................................................... 25
1.1 Epitheliale expressie van MT tijdens colitis. .................................................................. 25
1.2 Rol van MT in colitis ...................................................................................................... 26
1.2.1 Gewichtsevolutie...................................................................................................... 26
1.2.2 Colon lengte ............................................................................................................. 26
1.2.3 H&E kleuring: inflammatie score ............................................................................ 27
1.2.4 Sirius Red kleuring .................................................................................................. 29
1.2.5 F4/80 kleuring .......................................................................................................... 29
2. TNFΔare-model voor ileïtis .................................................................................................... 30
2.1 Expressie MTs tijdens ileïtis........................................................................................... 30
2.2 Rol van MT bij ileïtis...................................................................................................... 32
2.2.1 Gewichtsevolutie...................................................................................................... 32
3. Invloed van MTs op macrofaag polarisatie .......................................................................... 33
3.1 Inductie van MTs in BMDM .......................................................................................... 33
3.1.1 Validatie van het onderzoek..................................................................................... 33
3.1.2 MT opregulatie......................................................................................................... 35
3.2 MTs en macrofaagpolarisatie in THP-1 ......................................................................... 36
3.2.1 Validatie van het onderzoek..................................................................................... 36
3.2.2 Macrofaagpolarisatie................................................................................................ 37
Discussie................................................................................................................................... 39
Referentielijst ........................................................................................................................... 43
Abstract - English
Abstract – English
BACKGROUND
Inflammatory bowel disease (IBD) comprises different chronic
relapsing diseases, namely ulcerative colitis (UC) and Crohn’s Disease (CD). IBD has a
prevalence of 50-200 per 100 000, depending on region, age and subtype. Disease onset
mostly occurs in young adulthood. Metallothioneins (MTs) are acute phase proteins that act as
danger signals in mouse models for acute colitis, however, whether these proteins are also
upregulated during experimental chronic intestinal inflammation is unknown.
METHODS
The expression of MTs and their functional role was investigated in the chronic
dextran sulphate sodium (DSS) colitis model using wild type (Mt+/+) and MT knockout (Mt-/-)
mice and in TNFΔARE+/- mice which develop spontaneous ileitis at the age of 6 weeks. MT
expression was determined using quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). Clinical
and histological evaluation of intestinal disease was based on weight, colon length,
haematoxylin-eosin staining (histopathological scoring for inflammation, H&E staining),
Sirius Red staining (evaluation of fibrosis) and F4/80 staining (evaluation of macrophage
infiltration). Finally, bone marrow derived (BMD) macrophages from C57BL/6 mice and
THP-1 cells were used to test if MTs are able to polarize macrophages
RESULTS
MT expression tends to be lower in intestinal epithelial cells during chronic
colitis (p=0.06 for Mt1 and p=0.07 for Mt2) and ileitis (p=0,48 for Mt1 and p=0,90 for Mt2).
A clinical significant difference was found in weight and colon length, in the benefit of Mt-/mice in the DSS-induced colitis model. TNFΔARE+/- Mt+/- mice showed less difference in
weight loss compared to their littermate controls TNFΔARE+/+ Mt+/-. MTs are highly induced in
BMD-M and THP-1 cells upon LPS stimulation. However, we were unable to show an effect
of recombinant MT on macrophage polarization with the used dose.
CONCLUSION
MT expression tends to be lower in intestinal epithelium during chronic
inflammation in mice. MTs are induced in macrophages upon an inflammatory stimulus and
genetic deletion of MTs results in a clinical benefit during experimental chronic intestinal
inflammation.
1
Abstract - Nederlands
Abstract – Nederlands
ACHTERGROND
Inflammatoir darmlijden (inflammatory bowel disease, IBD) is een
verzamelnaam voor chronisch recidiverende inflammatoire darmziekten, waaronder colitis
ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD). De ziekte komt voor bij 50-200 per 100 000
mensen, afhankelijk van de regio, leeftijd en subtype. Meestal wordt de diagnose van IBD
gesteld bij jongvolwassenen. Metallothioneins (MTs) zijn acute fase eiwitten die tot expressie
komen in verschillende weefsels, oa. in de darm. Onderzoek heeft aangetoond dat er een
verhoogde expressie is van MTs in muismodellen voor acute colitis. Aangezien dit enkel werd
onderzocht bij acute modellen, was het doel van dit onderzoek om de expressie en rol van
MTs te bepalen in chronische muismodellen voor IBD.
METHODEN
Twee diermodellen voor IBD werden gebruikt; het chronische dextraan
sulfaat sodium (DSS) colitis model bij wild type (Mt+/+) en MT knockout (Mt-/-) muizen,
beide C57BL/6J-achtergrond en het TNFΔare+/- muismodel voor chronische ileïtis in TNFΔare+/Mt+/- en TNFΔare+/- Mt+/+ muizen. De expressie van MTs in het darmepitheel tijdens
chronische colitis en ileïtis werd bepaald met quantitative Polymerase Chain Reaction
(qPCR). Voor klinische en histologische evaluatie van de muizen werd gebruik gemaakt van
gewichtsverloop, colonlengte, haematoxyline-eosine kleuring (histopathologische score, H&E
kleuring), Sirius Red kleuring (fibrosekleuring) en F4/80 kleuring (macrofaagkleuring). Het
effect van MTs op de polarisatie van macrofagen werd nagegaan door gebruik te maken van
uit beenmerg (BM)-geïsoleerde monocyten (uit C57BL/6 muizen) die verder werden
gedifferentieerd tot macrofagen en THP-1 cellen.
RESULTATEN
Epitheliale MT expressie was verlaagd tijdens chronisch DSS-
geïnduceerde colitis en chronische ileïtis in TNFΔare+/- muizen, echter zonder significant
verschil tussen gezonde muizen. Bij het chronisch DSS model werd er klinisch een significant
verschil gevonden voor gewicht en colonlengte, in het voordeel van Mt-/-. TNFΔare+/- Mt+/muizen vertoonden minder gewichtsverschil tegenover TNFΔare+/+ Mt+/- muizen dan TNFΔare+/Mt+/+ muizen tegenover hun TNFΔare+/+ Mt+/+ littermates. MT expressie was significant
verhoogd in BM-gedifferentieerde macrofagen en in THP-1 cellen na LPS stimulatie. De
gebruikte dosis recombinant MT bleek geen invloed te hebben op de polarisatie van
macrofagen.
2
Abstract - Nederlands
CONCLUSIE
Chronische darminflammatie gaat gepaard met een daling in epitheliale
MT expressie. MTs worden opgereguleerd in macrofagen onder invloed van een
inflammatoire stimulus en een genetische deletie van MTs tijdens chronische colitis en ileïtis
verbetert duidelijk de klinische tekenen van inflammatie.
3
4
Inleiding
Inleiding
1. Inflammatoir darmlijden
Inflammatoir darmlijden (inflammatory bowel disease, IBD) is een verzamelnaam voor
chronische recidiverende darmziekten, gekenmerkt door opstoten van ontsteking en remissies.
IBD kent twee ziekte-entiteiten, namelijk colitis ulcerosa (UC), waarbij enkel het colon is
aangetast, en de ziekte van Crohn (Crohn’s disease, CD), welke het volledige gastrointestinale
kanaal
kan
aantasten.
De
diagnose
wordt
voornamelijk
gesteld
bij
jongvolwassenen, meer bepaald tussen 20 en 30 jaar, met een incidentie van 5-10 en 10-20
per 100 000 per jaar voor respectievelijk CD en UC. De aandoening komt meer voor in
ontwikkelde landen, met een prevalentie van 50-100 (CD) en 100-200 (UC) per 100 000. (1)
Echter, de incidentie is aan het stijgen in ontwikkelingslanden en IBD is momenteel een
wereldwijde ziekte.
Hoewel men de specifieke oorzaak nog niet heeft achterhaald, vermoedt men dat er een
overmatige reactie van het immuunsysteem op commensale kiemen in de darm optreedt bij
genetisch voorbestemde personen. Genoom-wijde associatiestudies toonden vroeger al
meerdere IBD-geassocieerde loci aan, waarvan het aantal recent op 163 staat. (2) Een bekend
voorbeeld hiervan is het NOD2/CARD15 gen, waarvan sommige varianten een verhoogde
kans geven op CD. (3) Een positieve familiale voorgeschiedenis is daarom één van de
risicofactoren van IBD (4) en dan voornamelijk bij CD. Zo hebben monozygote tweelingen
een concordantie van 30 tot 35% bij CD in vergelijking met de concordantie van 10 tot 15%
bij UC. (5) Er is echter geen volledige concordantie bij monozygote tweelingen waardoor
men kan aannemen dat ook microbiële en omgevingsfactoren een rol spelen in de
pathogenese. (4) Zo is de activiteit en compositie van de darmflora in mensen met IBD anders
dan bij gezonde mensen. Er worden namelijk minder humane commensale bacteriën
gevonden (zoals Clostridium IXa en IV groepen, bacteroides, bifidobacteriën) in tegenstelling
tot de stijging van het aantal pathogene vormen, zoals E.Coli. (6). Daarnaast is roken bij CD
een duidelijke risicofactor. Rokers hebben ook een hogere ziekteactiviteit dan niet-rokers,
waardoor rookstop sterk wordt aangeraden bij CD patiënten. Vreemd genoeg ziet men bij UC
patiënten een omgekeerd effect, met een betere controle van de ziekteactiviteit bij rokers en
5
Inleiding
een verhoogde incidentie bij ex-rokers. (7) Ook een appendectomie blijkt bij UC een
onderdrukkende rol te hebben. Doorgaans kan men zeggen dat er aanwijzingen bestaan
waaruit blijkt dat de “hygiëne hypothese” met IBD kan gelinkt worden. (8) Onderzoek
hieromtrent is echter moeilijk door het vaak retrospectieve karakter.
De diagnose wordt gesteld door een combinatie van anamnese en klinisch onderzoek,
biochemisch (p-ANCA, ASCA), endoscopisch, radiologisch, histologisch en/of nucleair
geneeskundig onderzoek. (9) De oorspronkelijke Vienna classificatie gebruikte drie
parameters om CD in verschillende subtypes op te delen. Deze waren beginleeftijd, locatie en
beloop van de ziekte. In de praktijk wordt deze classificatie niet vaak gebruikt, maar in de
onderzoekswereld kan de nieuwe versie van de Vienna Classificatie, de Montreal
Classificatie, wel eens gebruikt worden. De Montreal classificatie werkt nog altijd met de drie
hoofdparameters, maar met enkele modificaties. In tegenstelling tot de Vienna Classificatie,
wordt UC hier niet over het hoofd gezien. (10)
Hoewel UC en CD onder dezelfde koepelnaam worden geclassificeerd, zijn er toch grote
verschillen. Dit uit zich op klinische, histologisch en topografisch vlak.
1.2 Klinisch
IBD wordt gekenmerkt door opstoten van darmontsteking gevolgd door periodes van relatieve
stabiliteit. Symptomen kunnen variëren in ernst en kunnen zelfs helemaal verdwijnen tijdens
remissies. Opstoten zijn per definitie acuut maar kunnen door recidieven ook een chronische
uiting hebben. De symptomen moeten 4-6 weken aanwezig zijn alvorens men kan spreken
van een chronische inflammatie van de darm. (2, 11)
UC uit zich vaak acuut met frequente kleine hoeveelheden stoelgang per dag, vaak gemengd
met bloed en etter. Dit komt ook ’s nachts voor. Deze ‘urge’ kan zo erg zijn dat men in
sommige gevallen spreekt van incontinentie. Constipatie kan ook voorkomen maar dan
voornamelijk als enkel het rectum is aangetast (proctitis). Vaak ervaren patiënten
buikkrampen en pijn.
CD uit zich klinisch vaker als een chronische diarree met abdominale pijn, vermoeidheid,
koorts en gewichtsverlies. Ook nausea en braken kan voorkomen. (2, 9)
Er kunnen verschillende complicaties optreden bij een chronische IBD die niet goed onder
controle is te houden met medicatie. Zo komen hemorragieën soms voor, bij UC door
6
Inleiding
ulceraties in het colon; bij CD zijn ulceraties echter voornamelijk ileaal gelegen. Stricturen en
obstructies kunnen voorkomen door de acute inflammatie en oedeem, of door chronische
fibrose. Bij aantasting van het colon in CD zullen 75% van de patiënten in het verloop van de
ziekte perianale manifestaties ontwikkelen zoals fistels, intra-abdominale abcessen en
fissuren. (12) Klassiek komt dit niet voor bij UC. (9) Daarnaast zijn er nog andere
complicaties mogelijk zoals intestinale perforaties, toxische megacolon en tumorontaarding.
(9)
Vijfentwintig procent van IBD patiënten vertonen ook extra-intestinale manifestaties waarvan
arthritis de meest voorkomende is. Ook erythema nodosum, perifere synovitis, uveitis,
primaire scleroserende cholangitis en spondylitis ankylosans kunnen voorkomen. (9)
1.2 Lokalisatie
Ulceratieve colitis tast voornamelijk de oppervlakkige lagen aan van de intestinale mucosa
waarbij de overgang van aangetast naar gezond weefsel sterk afgelijnd is. (12) De ontsteking
is meestal gelokaliseerd in de gebieden die de grootste kolonisatie hebben van bacteriën,
namelijk het distale colon en rectum. De ontsteking verspreidt zich dan verder proximaal,
maar beperkt zich tot het colon. (6) Eventueel kan ook het distale deel van het ileum aangetast
zijn, wat backwash-ileïtis wordt genoemd. (5, 13)
De ziekte van Crohn kan zich, in tegenstelling tot UC, in elk deel van het gastro-intestinaal
stelsel voordoen en dit gebeurt op niet-continue wijze. De segmenten zijn minder scherp
afgelijnd en worden ook wel ‘cobble stones’ genoemd aangezien de ulcera en littekens
omgeven worden door oedemateuze mucosa. (12, 13) De voorkeursplaatsen bij de ziekte van
Crohn zijn het terminale ileum, het rechter colon en de perianale regio. Ulcera die voorkomen
kunnen oppervlakkig zijn, zoals bij UC, maar evengoed ook transmuraal (13) en zo fissuren,
fistels, abcessen en stricturen geven.
1.3 Histologisch
IBD is gekarakteriseerd door grote structurele beschadigingen van de intestinale mucosa.(14)
Histologisch wordt de diagnose van UC gesteld door gebruik te maken van verschillende
kenmerken waaronder de mucosale architectuur, lamina propria cellulariteit, neutrofiel
granulocyten infiltratie en epitheliale abnormaliteit als belangrijkste factor. (13) UC kent
voornamelijk oppervlakkige veranderingen van de mucosa en submucosa, zoals
7
Inleiding
cryptendistorsie,
atrofie,
mucine depletie,
cryptitis
en/of crypt
abcessen,
diffuse
lymfoplasmacellulaire infiltratie in de lamina propria en basale plasma cel infiltratie. (15) Dit
uit zich macroscopisch in oppervlakkige ulceraties met granulair uitzicht. In ernstige gevallen
kunnen deze ulceraties doorheen de muscularis mucosa dringen.(13)
Bij CD is de inflammatie meer discontinu en transmuraal met verdikte submucosa (4), focale
cryptendistorsie en epithelioide granulomas die niet gerelateerd zijn aan cryptebeschadiging.
Deze kenmerken hebben de hoogste diagnostische waarde. (13) Er zijn echter nog andere
tekenen, zoals ulcera en/of aftoide ulcers, pseudopylorische metaplasie, focale cryptitis, focale
lymfoplasmacellulaire infiltratie in de lamina propria, granuleuze inflammatie en geen mucine
depletie. (15) Musculaire hypertrofie is vaak aanwezig en is één van de oorzaken van
stricturen. (16)
Chronische inflammatie kenmerkt zich histologisch voornamelijk door cryptarchitectuur
veranderingen. Dit kan distorsie, vertakking, atrofie of een verminderde densiteit van crypten
zijn. (13) Deze kenmerken komen het duidelijkst voor bij chronische UC. Chronische
darminflammatie is gekenmerkt door fibrogenese, wat histologisch kan aangetoond worden
door een toename van collageen. (17, 18) In normale darmen zijn er drie majeure types van
collageen, namelijk type I, III en V met een verdeling van respectievelijk 70, 20 en 12
procent. Vooral stricturen zijn gekarakteriseerd door stijging van totaal collageen en relatief
ook de hoeveelheid van III en V. (19) Deze worden vaak gevonden in genezend weefsel en
type III is bekend voor contractie. (20)
1.4 Experimentele diermodellen voor IBD
In vitro en ex vivo onderzoek kunnen een eerste aanwijzing geven naar mogelijke factoren die
belangrijk zijn in de ethiopathogenese van IBD. Echter, om een multifactoriële en complexe
ziekte te onderzoeken is het vaak nodig om gebruik te maken van complexe modellen, zoals
proefdieren. De meest gebruikte proefdieren zijn knaagdieren en de verdere uiteenzetting
beperkt zich dan ook tot deze groep. Deze experimentele IBD diermodellen kunnen ruwweg
onderverdeeld worden in chemische modellen, genetische manipulatie, adoptieve cel transfer
en spontane congenitale modellen. (21)
De verschillende modellen worden meestal onderverdeeld naargelang de lokalisatie van de
ziekte. Zo lokken bijvoorbeeld Dextraan Sulphate Sodium (DSS) en oxazolone enkel colitis
8
Inleiding
uit, terwijl indomethacine en Tumor Necrosis Factor (TNF)Δare+/- muizen enkel ileïtis
ontwikkelen.
Fig. 1 Voorbeelden van verschillende diermodellen
Diermodellen voor IBD komen qua fysiologie en fenotype niet volledig overeen met de
humane IBD. De verschillen of gelijkenissen zijn afhankelijk van het model. Elk model bootst
een bepaald aspect van de ziekte na en afhankelijk van de focus van het onderzoek wordt zo
het beste model gekozen. Experimentele modellen voor CD en UC hebben bij voorkeur een
dominantie van respectievelijk T helper (Th)1/Th17 of Th2 immuunresponsen. (22) De
chemische diermodellen sluiten hier echter het minst bij aan. Dit is voornamelijk omdat ze
zeer acuut zijn, zelflimiterend en een niet-fysiologische oorzaak hebben door de chemische
aantasting. Echter door hun eenvoudig gebruik zijn het toch de meest gebruikte modellen.
(21)
1.4.1 Chemische modellen
a) DSS acuut en chronisch
DSS is een negatief geladen polymeer van glucose met sulfaatgroepen. Twee tot 5% DSS
wordt aan het drinkwater toegevoegd voor een korte periode (4-9 dagen) en lokt een acute
oppervlakkige ontsteking uit van het colon. Deze acute colitis kan het best vergeleken worden
met de recidiverende opstoten bij UC. Klinisch is er gewichtsverlies, diarree, bloed in de
stoelgang, anemie en zelfs dood. Histologisch weerspiegelt zich dit in het colon door mucine
depletie, epitheliale degeneratie, necrose, neutrofielen infiltratie, crypt abcessen, cryptitis en
9
Inleiding
erosies. (23, 24) Chronische colitis kan bekomen worden door cyclisch toedienen van DSS,
gevolgd door normaal drinkwater. De histologische veranderingen van deze chronische
inflammatie lijken het meest op UC en worden pas later duidelijk, meestal enkele weken na
de
toediening.
Deze
veranderingen
zijn
mononucleaire
leukocyten
infiltratie,
cryptenarchitectuur veranderingen, transmurale inflammatie, het vergroten van de afstand
tussen cryptbasis en muscularis mucosa en diepe mucosale lymfocytose. De transmurale
inflammatie lijkt zich echter niet altijd te manifesteren. (23)
Hoe DSS colitis uitlokt, is niet volledig gekend. Wel is geweten dat bacteriële flora een rol
speelt, aangezien antibiotica een doeltreffende behandeling is tijdens DSS-geïnduceerde
colitis in muizen. (25) Aangezien acute colitis zich ook voordoet bij severe combined
immunodeficiënte (SCID) muizen, wordt er aangenomen dat vooral het aangeboren
immuunsysteem een rol speelt in de initiatie van de ontsteking en niet het adaptieve
immuunsysteem. Lymfocytenactivatie door macrofaag-geproduceerde cytokines blijken
belangrijk te zijn in de herstelperiode van colitis aangezien het merendeel van SCID muizen
na chronische DSS toediening sterft door massieve bloeding in het intestinale lumen. (24, 26)
Er wordt gespeculeerd dat DSS geen intestinale inflammatie op zich veroorzaakt, maar
chemische ulceraties (27) door verbindingen te maken met MCFA’s (medium chain length
fatty acids) zoals dodecanoaat, in het lumen van de darm. DSS en MCFA’s vormen dan
samen vesikels (200 nm in diameter) die versmelten met de colonocyten, waardoor DSS in
het cytosol terecht komt. Hierdoor worden inflammatoire pathways geactiveerd en reverse
transcriptase en ribonuclease activiteit geïnhibeerd, wat leidt tot verstoring van de celfunctie
en afsterven van colonocyten. (23, 28) Aangezien de lamina propria en submucosa bloot
komen te liggen voor luminale antigenen die het immuunsysteem triggeren, leidt dit tot een
inflammatoire reactie (27) en een verhoogde infiltratie van macrofagen. (28)
b) 2,4,6-trinitrobenzeensulfaat (TNBS) acuut en chronisch
TNBS is een hapteen dat door gelijktijdig, intrarectaal toedienen met ethanol een ontsteking
uitlokt. Ethanol is nodig om de mucosa te vernietigen aangezien TNBS geen allergeengeïnduceerde inflammatie uitlokt bij een intacte barrière.
Histologisch ontstaan er granulomas en er is celinfiltratie doorheen de hele wand. Er worden
verhoogde hoeveelheden van interleukine (IL) 12, interferon γ (IFNγ) en IL2 teruggevonden,
waaruit men kan besluiten dat het Th1 antwoord hier dominant is. TNBS wordt dan ook het
meest gebruikt om CD colitis na te bootsen. (26, 29)
10
Inleiding
c) Andere, minder gebruikte chemische modellen
Oxazolone wordt, samen met ethanol, intrarectaal toegediend en veroorzaakt een Th2-type
immuunrespons in het colon. Hierdoor is er een stijging van IL-4 en IL-5 productie. Ook
Natural Killer (NK) T-cellen en hun geassocieerde cytokine, IL-13, spelen hierin een rol.
Klinisch uit zich dit in een acute colitis met gewichtsverlies, diarree en ulceraties. Aangezien
er oppervlakkige ulceraties ontstaan in het colon, is dit type model het meest geschikt als UC
model. (27) De villeuze architectuur van de darm blijft relatief bewaard, maar de inflammatie
is geassocieerd met wandoedeem en exsudaat. (29)
Ook indomethacine is een chemische component die darmontsteking induceert door depletie
van prostaglandines en cyclooxygenase 1 en 2 inhibitie, waardoor er een verhoogde activiteit
is van nitro-oxide synthetase. Indomethacine veroorzaakt dunne en dikke darm ulceraties, die
transmuraal zijn. De dunne darm laesies komen echter meestal voor in het middelste deel van
de darm, in tegenstelling tot CD waar ze meestal ileaal gelegen zijn. (26)
1.4.2 Genetische modellen
Genetische modellen omvatten de knock-out en de transgene modellen waar IBD ontstaat
door respectievelijk afwezigheid of overexpressie van specifieke genen.
Gen knockout (KO) wordt voornamelijk bij muizen uitgevoerd. Zo zijn er het T Cell
Receptor α chain KO model (TCRα-KO model) (22) en IL2 knockout (KO) model, waar de
chronische colitis het best passen bij UC.
TCRα-KO muizen ontwikkelen zestien weken na de geboorte chronische colitis op basis van
een Th2 respons, aangedreven door TCRββ T-cellen. (29) Klinisch hebben deze muizen
zachte stoelgang. (26, 27) De inflammatie is relatief oppervlakkig en toont een
gecombineerde infiltratie van neutrofielen en lymfocyten, misvormde crypten en soms
cryptabcessen. (27, 29) Er worden geen transmurale fissuren en granulomata gezien. (29)
IL2-KO muizen ontwikkelen een transmurale colitis door een Th1-respons. Van deze muizen
sterft 50% tussen vier en negen week oud aan een gegeneraliseerde autoimmuniteit met
lymfadenopathieën, splenomegalie, beenmerginfiltratie en hemolytische anemie. (26, 29) De
overblijvende muizen ontwikkelen vanaf 6 weken oud een chronische colitis. Histologisch
ontstaan er ulceraties, wandverdikking, cryptabcessen, mucine depletie en dysplasie van
epitheliale cellen. (26)
11
Inleiding
Als modellen voor CD worden IL10-KO muizen en TNFΔare muizen gebruikt, aangezien het
hele intestinum aangetast wordt. (26) Deze ontwikkelen een Th1 gemedieerde inflammatie die
gekenmerkt is door een overgang naar Th2 inflammatie. Het is mogelijk dat dit gebeurt door
accumulatie van cellen die via IL-4, IL-12 signalen onderdrukken. (29)
TNFΔare modellen zijn modellen waar er een excessieve effector celrespons ontstaat. Dit
gebeurt door een deletie van een segment in de 3’UTR regio, dat een adenine/uracil-rijk
element (ARE) is en bestaat door AUUUA-herhalingen. (26) Dit ARE segment staat in voor
de regulatie en afbraak van TNFα mRNA en dus deletie hiervan leidt tot een stijging van de
TNFα mRNA stabiliteit en dus de proteïneproductie. Substanties in intestinale microflora
(zoals LPS) zorgen voor een 3 tot 5 maal grotere stijging in TNF productie bij TNFΔare
muizen, in vergelijking met normale muizen. (30) Dit gebeurt voornamelijk onrechtstreeks,
door stimulatie van IL-12 waardoor er een verdere stijging ontstaat van TNFα in de mucosa.
(29) TNFΔare modellen zorgen voornamelijk voor chronische transmurale ileïtis en soms
proximale colitis met granuloomvorming, artritis en alopecia. Ze werken daarom zeer goed
om CD na te bootsten. (21, 29)
Transgene modellen worden bij ratten of muizen uitgevoerd. Het IL-7 transgene
muismodel is geschikt voor onderzoek naar UC. (26) Hoewel men hier ook de oorzaak niet
van kent, vermoedt men dat dit door een Th1 respons gebeurt nadat er een activatie ontstaat
van mucosale macrofagen door een defect in de epitheliale barrière. Klinisch ontwikkelen ze
acute colitis op de leeftijd van 1 à 3 weken oud. Wanneer ze 8 weken oud zijn, ontstaat er
proctoptosis met anale bloeding. (26) Histologisch is er een diffusie infiltratie van monocyten
met cryptabcessen en verlies van goblet cellen. (26, 29)
Het humaan leucocytenantigen (HLA)-B27 transgene ratmodel wordt gebruikt voor CD. (26)
Hierbij is er een overexpressie van HLA-B27, waardoor mucosale antigenen gemakkelijker
gepresenteerd worden aan mucosale T-cellen. Deze Th2-respons veroorzaakt inflammatie van
de gastro-intestinale tractus en de gewrichten. (29)
1.4.3 Cel transfer
Recent werd een nieuw chronisch model ontwikkeld, namelijk het T-cel transfer model. Men
transfereert hierbij lymfocyten in lymfopene muizen, zoals SCID muizen. Meestal worden
CD4+CD45RBhigh T-cellen getransfereerd naar SCID/Rag-1,2 muizen of athymische naakte
muizen. Hierbij ontstaat dan colitis, wat zich uit in chronische niet-bloedende diarree met
slijm en vermagering. (26, 31, 32) Dit ontwikkelt zich al enkele weken na de cel transfer. (26)
12
Inleiding
Histologisch ziet men cryptabcessen, mononucleaire infiltratie en ulceraties. Het is gebleken
dat dit gebeurt door een Th1-respons die ontstaat nadat de getransfereerde T-cellen in contact
zijn gekomen met de antigenen in het colon van de SCID muizen. (29)
1.4.4 Spontane of congenitale IBD
Spontane of congenitale IBD wordt verkregen door het kweken van muizen met een bepaalde
genetische achtergrond. Het ontstaansmechanisme en de specifieke genen zijn hierbij
onbekend. Enkele voorbeelden zijn C3H/HejBir muizen (voor UC, hoewel waarschijnlijk
veroorzaakt door een Th1 respons) en SAMP1/Yit muizen (ileïtis, dus voor CD). (26, 27)
Sommige van de C3H/HejBir muizen ontwikkelen op de leeftijd van 3 weken perianale
ulcera, ileocaecale laesies en colitis aan de rechterkant van het colon. Deze verschijnselen
verdwijnen rond de leeftijd van 10 weken. Histologisch ontstaan er ulcera, cryptabcessen en
regeneratie van het epitheel, maar er worden geen granuloma’s en verdikkingen van de wand
gezien. (26) Het is mogelijk dat SAMP1/Yit muizen ileïtis ontwikkelen door een mutatie die
lijkt op de NOD2 mutatie van CD; echter dit is nog niet bewezen. (29) Over de jaren heen
hebben de afstammelingen van deze SAMP1/Yit muizen nieuwe fenotypische kenmerken
ontwikkeld. Zo vertoont een subgroep perianale ziekte met ulceratie en fistels waardoor dit
het eerste muismodel is waarbij dit is gebeurd. (26)
2. Metallothioneins (MTs)
Metallothioneins zijn acute fase eiwitten met een laag moleculair gewicht (<7000 Da). (33)
Ze zijn sterk geconserveerd tijdens de evolutie en komen bij praktisch elk levend wezen voor.
(34) Bij de mens kan men het geassocieerde gen terugvinden op chromosoom 16 (16q13)
(35), bij de muis is dit gelokaliseerd op chromosoom 8. (33) Zoogdieren hebben MTs die
single-chain polypeptiden zijn van 61 tot 68 aminozuren residuen zonder aromatische
aminozuren of histidine.
In de mens zijn er tenminste 19 MT isovormen, waarvan elf functioneel (MT1A, MT1B,
MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1M, MT1X, MT2A, MT3 en MT4). (36) In de muis zijn er
vier isovormen (Mt1, Mt2, Mt3, Mt4). (33)
De synthese gebeurt voornamelijk in organen die belangrijk zijn voor absorptie en secretie.
De grootste concentratie wordt daarom ook gevonden in de lever, de nier, het intestinum en
13
Inleiding
de pancreas. MTs komen voor in het cytoplasma en nuclei. (33) Ze staan bekend als acute
fase eiwitten aangezien er bij stress en inflammatie een snelle en sterk verhoogde expressie is.
Dit gebeurt door pro-inflammatoire cytokines, zoals lipopolysaccharide (LPS), IL1, IL6 en
interferon. (37) Daarnaast zijn hypoxie en metalen ook sterke induceerders van MTs. (38, 39)
De meest gekende functies van MTs zijn het binden en neutraliseren van toxische metalen
(zoals Cd, Hg en Co), fysiologische metalen die in geïoniseerde vorm gevaarlijk kunnen zijn
zoals Zn, Cu en cytotoxische en inflammatoire agentia zoals radicalen. (36, 40) Er is ook een
bescherming tegen cel apoptose en promotie van celproliferatie en differentiatie aangetoond
met in vitro onderzoek. (40)
Reactive oxygen metabolites (ROM) omvatten oa. het superoxide ion, waterperoxide en
hypochloorzuur en zijn belangrijk in verschillende fysiologische en pathofysiologische acties.
Dit kan onafhankelijk gebeuren of in samenwerking met een familie van nitraatoxide
afgeleide componenten, reactieve nitrogeen metabolieten (RNM’s). ROM’s worden erkend
als potente immuno-regulatoire en weefsel destructieve moleculen die een rol spelen in
praktisch alle inflammatoire ziekten, waaronder ook UC en CD. Ze worden vrijgelaten door
massief infiltrerende polymorfo- en mononucleaire leukocyten. Om de schadelijke effecten te
neutraliseren van grote hoeveelheden ROM en RNM’s, is de intestinale mucosa uitgerust met
een netwerk van anti-oxidatieve enzymes. (41) Belangrijke enzymen hierin zijn oa.
superoxide dismutases, catalase en glutathion peroxidase. Ook laag moleculair gewicht
antioxidanten zoals gluthathion en zelfs metallothionein werden naar voor geschoven als
belangrijke factoren in het antioxidant defensiesysteem. (14)
2.1 MTs in IBD
Aangezien MTs worden gezien als acute fase eiwitten, een belangrijke anti-oxiderende
werking zouden hebben, een rol spelen in zink homeostase en immunomodulerende
extracellulaire effecten hebben, ontstond de interesse om de rol van MTs in IBD te
onderzoeken. Onderzoek naar de expressie van MTs in IBD patiënten gaf niet altijd
eenduidige resultaten. Recent werd aangetoond dat MTs voornamelijk epitheliaal voorkomen
in gezond darmweefsel, dat darminflammatie gekenmerkt wordt door een infiltratie van MT
positieve inflammatoire cellen en dat MTs afwezig zijn in sterk necrotische zones. (42) De rol
14
Inleiding
van MTs in IBD werd reeds onderzocht door gebruik te maken van acute modellen voor
darminflammatie in wild type en Mt-/- muizen (MT knockout) in verschillende studies.
Tran en collega’s vonden dat Mt-/- muizen een lagere disease acitvity index (DAI) hadden in
vergelijking met wild type muizen, bij toevoeging van 2%, 3% of 4% DSS in het water
gedurende zes dagen. Ze zagen in datzelfde onderzoek echter geen statistisch significant
verschil in histologische inflammatie score of colonlengte tussen wild type en Mt-/- muizen,
hoewel deze laatste relatief minder erg waren aangetast. (43) Tsuji en collega’s vonden echter
een verhoogde DAI bij de Mt-/- muizen en een verhoogde productie van inflammatoire
cytokines bij DSS toediening aan Mt-/- muizen in vergelijking met wild types. Zij besloten
aldus dat endogene MTs een protectieve rol hebben in de intestinale inflammatie. (44) Oz en
collega’s voerden een acuut DSS onderzoek uit bij Mt-/-, wild type en MT transgene muizen.
Klinisch en histologisch vonden ze geen verschil tussen de groepen. Er werd wel een vier
maal hogere totale colon MTs concentratie gevonden bij de DSS behandelde muizen, in
vergelijking met de controlegroep. (45) Echter, recent werd aangetoond dat dit verschil vooral
komt door een verhoogde invasie van MT positieve inflammatoire cellen in humane colitis en
niet door een verhoogde epitheelaanwezigheid; bij de controlegroep is MT namelijk ook
aanwezig in het epitheel. (42) Er zijn meerdere mogelijke verklaringen voor deze stijging. Zo
kan het zijn dat door de productie van scavenging proteïne in het inflammatoir proces en de
rol in celverdediging tegen hydroxyl-vrije radicalen, de MTs ter bescherming stijgen. Het is
ook mogelijk dat ze stijgen door hun functie als zink donor (zink is nodig voor DNA synthese
en herstel enzymen). (45) MTs worden ook vrijgelaten door necrotische epitheelcellen en
zouden zo leukocyten aantrekken. Ze zouden hier dan de functie hebben als danger signal en
meewerken in het inflammatoire proces. (42) Dit laatste werd onderzocht met een acuut DSS
onderzoek en toonde aan dat bij Mt-/- en antilichaam gemedieerde inhibitie van extracellulair
MT in muizen, de leukocyteninfiltratie en de inflammatie verminderde in vergelijking met
wildtypes.
MTs spelen een rol in de zink homeostase, aangezien ze zink binden en ook in staat zijn zink
uit te wisselen. Zo verhoogt bij stijgende toediening van zink, de zink plasmaconcentratie bij
Mt-/- muizen, terwijl dit bij de Mt+/+ muizen nagenoeg constant blijft. (40) Zink is essentieel in
celgroei, differentiatie en overleving en een tekort kan verscheidene gezondheidsproblemen
geven. De transcellulaire opname van zink gebeurt in het distale duodenum en proximale
jejunum. (33) Bij CD kan er echter een tekort ontstaan van zink. (36) Het is aangetoond bij
ratten dat zink deficiëntie villi dimensie reduceert en villi densiteit verhoogt in de dunne
15
Inleiding
darm. Als dan een periode zink wordt toegevoegd, worden de villeuze densiteit en de hoogte
van de individuele villi weer normaal. (40) Verder zag men ook dat Mt-/- muizen een
significant langer ileum hadden in vergelijking met Mt+/+ bij zink supplementatie, maar ook
significant kortere villi. Dit suggereert dat MTs een rol spelen in het behouden van optimale
intestinale groei als antwoord op zinktoediening. (40) Al-Gindan en collega’s onderzochten
het effect van zinktoediening op MT expressie bij ratten in een acuut DSS model.
Zinktoediening gaf geen verschil in histologie of kliniek, er was echter wel een stijgende MT
expressie in de crypten van het colon, aangetoond met immunohistochemische kleuring.
Ratten die zink en DSS kregen toegediend, toonden een hogere MT expressie in de crypten en
submucosa, dit in tegenstelling tot de zink deficiënte muizen met DSS, waar enkel een
zwakke immunohistochemische kleuring was in de submucosa. Bij deze ratten werd ook
gekeken naar de MT expressie in de dunne darm, hoewel dit niet door DSS wordt beïnvloed.
Er werd wel gevonden dat zink deficiënte ratten minder MT positieve cellen in het ileum
hebben in vergelijking met een controlegroep. Hiervoor werd gekeken naar de
cytoplasmatische en nucleaire lokalisatie van MTs in Paneth cellen, epitheel cellen, goblet
cellen en de lamina propria. (46)
De expressie van MTs en hun effect op het verloop van de darminflammatie in chronische
muismodellen werd echter nog niet onderzocht en is dan ook het onderwerp van dit
onderzoek.
3. Macrofagen
Macrofagen zijn fagocytaire cellen die een vitale functie hebben. Ze komen in praktisch alle
weefsels voor en staan in voor het opruimen van dagelijks 2x10^11 erythrocyten en cellulaire
afval. (47) Macrofagen zijn cellen die oorspronkelijk gedifferentieerd zijn uit CD34+
myeloïde progenitorcellen in het beenmerg. Na het matureren tot monocyten, verlaten de
cellen het beenmerg en nestelen ze zich in perifere weefsels, waar ze niet-actieve macrofagen
worden. (48) In de darm komen ze meestal subepitheliaal en in de lamina propria voor. (49)
CD14 is een glycoproteïne gelinkt aan glycosylphosphatidylinositol en fungeert als
membraanreceptor. CD14 receptoren kunnen worden aangetoond bij monocyten in het bloed
en weefsels en binden normaal met complexen van lipopolysaccharide (LPS)-bindend
proteïne en LPS, wat geproduceerd wordt door bacteriën. (50) De meeste voorkomende
16
Inleiding
macrofagen in de darm zijn echter CD14- macrofagen, in tegenstelling tot het bloed waarin
deze slechts voor 5% vertegenwoordigd zijn. (49) Deze CD14- macrofagen hebben een
regulatoire functie door hun verminderde cytokine productie als reactie op LPS in
vergelijking met CD14+ macrofagen, waardoor een inflammatoire reactie op commensale
bacteriën wordt voorkomen. (50) Bij CD blijken echter CD14+ macrofagen te domineren. (49)
Deze cellen reageren veel sterker op commensale bacteriën met pro-inflammatoire cytokines
(IL23 en TNFα), waardoor een Th1/Th17 respons in gang wordt gezet. (50, 51)
Als macrofagen worden geactiveerd, is er een verandering van oppervlakte eiwitten en de
productie van cytokines en pro-inflammatoire mediators wordt opgereguleerd. Dit alles
gebeurt onafhankelijk van het adaptieve immuunsysteem en is dus louter aangeboren.
Macrofagen
kunnen
in
twee
verschillende
richtingen
differentiëren.
De eerste groep zijn klassiek geactiveerde macrofagen (M1) die worden geactiveerd door
INFγ alleen of in combinatie met microbiële en/of pro-inflammatoire stimuli, zoals LPS, TNF
of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Dit resulteert in een
macrofaag populatie die een verhoogde microbiocide capaciteit heeft. Humane M1 cellen zijn
CD14hiCD16- (47) en hebben een hoge expressie van IL12 en IL23 gecombineerd met een
laag IL10. (48) Muis inflammatoire macrofagen vertonen een ander beeld dan de humane, met
een hoge expressie van CC-chemokine receptor 2 (CCR2+), chemokine CXC ligand 2
(CXCL2) en een lage van CX 3 C-chemokine receptor 1 (CX 3 CR1low). (47, 48) M1
macrofagen produceren verscheidene effectormolecules zoals reactieve zuurstof en nitrogeen
intermediatoren. Ze zijn ook verantwoordelijk voor verhoogde levels van pro-inflammatoire
cytokines (TNF, IL1β, IL6, IL8,...). (48) Deze aangeboren immuniteit staat in voor resistentie
tegen infecties. Echter, deze verhoogde reactiviteit kan ook schade toebrengen. Zo zijn IL1,
IL6 en IL23 geassocieerd met de ontwikkeling en expansie van de Th17 cellen. Deze
produceren IL17, een cytokine dat zorgt voor hoge levels van polymorfonucleaire leukocyten.
(47)
De tweede groep zijn de regulatoire macrofagen (M2), ook de alternatief geactiveerde
macrofagen genoemd, die gestimuleerd worden door het aangeboren en het adaptieve
immuunsysteem. (47) Ze worden geactiveerd door IL4, IL13, immuuncomplexen, IL10,
glucocorticoid (vrijgelaten door bijniercellen als antwoord op stress (47)) of vitamine D3
hormonen. (48) De meeste regulatoire macrofagen hebben twee stimuli nodig om hun antiinflammatoire activiteit te starten. Humane M2 macrofagen zijn CD14+CD16+, terwijl muis
M2 macrofagen gedefinieerd worden als CCR2-CX 3 CR1hi. Verder zijn muis M2 macrofagen
17
Inleiding
ook Arg1, Chi313 (Ym1 in humane M2) en Retnla positief. (47, 52) M2 macrofagen hebben
een laag IL12 en IL23 fenotype met een hoog IL10. (48) Hierdoor kan men oa. de ratio
IL10/IL12 gebruiken om het regulatoire aspect van een macrofaag na te gaan. IL10 kan de
productie en activiteit van pro-inflammatoire cytokines inhiberen en is dus een sterke
inhibitor van inflammatie. (47)
IBD wordt gekenmerkt door infiltratie van MT positieve inflammatoire cellen. MTs op zich
zijn in staat leukocyten aan te trekken en anti-MT behandeling tijdens experimentele colitis
leidt tot verbetering van de ziekte en een daling van infiltrerende macrofagen. (42) Echter, of
MTs een invloed hebben op de polarisatie van macrofagen is nog niet geweten en dit werd
onderzocht in het tweede luik van dit onderzoek.
18
Methodologie
Methodologie
1. Muismodellen
1.1 Chronische colitis
Chronische colitis werd uitgelokt in 16 wild-type (Mt+/+) en 16 Mt-/- muizen door 4% DSS
(MW 36000-50000; MP Biomedicals, CA, US) gedurende 5 dagen via het drinkwater toe te
dienen, gevolgd door 7 dagen gewoon drinkwater. Deze cyclus werd 3 maal herhaald. De
twee groepen, wild-types en Mt-/- (C57BL/6J) muizen van 12 weken oud, werden gekweekt
aan de University of Connecticut. Ze groeiden op en verbleven in de Universiteit van Gent,
volgens de richtlijnen betreffende de bescherming van proefdieren voor wetenschappelijk
onderzoek. Muizen van de verschillende groepen werden samen in kooien geplaatst, om een
zo goed mogelijke gehomogeniseerde onderzoekspopulatie te verkrijgen en beide groepen
kenden een gelijk startgewicht. De muizen werden klinisch opgevolgd op basis van hun
overleving en gewichtsverlies, waarbij de data statisch geanalyseerd werden. Op het einde van
de laatste cyclus werden de muizen gesacrificeerd door cervicale dislocatie. Het colon werd
onmiddellijk verwijderd, gemeten en ingebed in paraffine voor histologische evaluatie. Een
deel van het colon werd gebruikt voor isolatie van colonocyten op basis van MatriSperse (Cell
Recovery Solution, BD Biosciences) overnacht. De expressie van MTs werd bepaald in het
epitheel van wild type muizen op het einde van de proef.
1.1.1 H&E en histologische evaluatie
Paraffine ingebed weefsel werd gesneden in coupes van 4µm. Na het deparaffineren (3x8 min
Xyleen) van de coupes, werden ze gerehydrateerd (8 min. 99% ethanol, 8 min. 70% ethanol
en 8 min. 50% ethanol). Na 5 minuten spoelen met leidingwater met een constante toevoer,
werden ze 30 minuten in een haematoxyline vloeistof gezet en opnieuw gespoeld (5 min met
kraantjeswater en 5 min met gedestilleerd water). Na 5 minuten eosinevloeistof werden de
coupes opnieuw 5 minuten gespoeld met leidingwater. Daarna werden ze opnieuw
gedehydrateerd en gemonteerd met Neutral Mounting Medium (DpX; Klinipath).
De coupes werden histopathologisch onderzocht door twee onafhankelijke personen op
verlies van gobletcellen, cryptabcessen, verdikking van de submucosa, cellulair infiltraat in
het epitheel, elongatie van de mucosa en epitheel erosie.
19
Methodologie
1.1.2 Sirius Red kleuring
Om collageen aan te kleuren en zo fibrose aan te tonen werd gebruik gemaakt van Sirius Red
kleuring. De coupes werden, zoals bij de H&E kleuring, eerst gerehydrateerd, waarna ze 30
minuten in een bad met Sirius Red kleuring (0,1% sirius red in picrinezuur) werden geplaatst.
Na dehydrateren werden ze gemonteerd met Neutral Mounting Medium (DpX; Klinipath).
1.1.3 F4/80 kleuring
F4/80 is een oppervlakte merker voor macrofagen en kan immunohistochemisch worden
aangekleurd om macrofaaginfiltratie in weefsels na te gaan. Na rehydratie werden de coupes
20 minuten in antigen retrieval (Dako, Glostrup, Denmark) geplaatst op 98°C. Na 20 minuten
afkoelen en 5 minuten in TBS (buffer), werden de coupes 20 minuten in een bad geplaatst met
3% MeOH/H 2 O 2 , om endogene peroxidase activiteit te blokkeren. Na wassen met TBS
gedurende 3x5 minuten, werden de coupes in een bad geplaatst met rabbit serum (Dako) dat
werd aangelengd tot 1/5 met TNB, gedurende 45 minuten. Rabbit serum werd gebruikt om
niet-specifieke bindingsplaatsen voor primaire antilichaam te blokkeren. Daarna werd het
primaire antilichaam, Rat anti-F4/80 (serotec MCA 497 G, Dusseldorf, Germany) 1/300 in
TNB op de stalen aangebracht overnacht. Twee uur vóór het aanbrengen van het secundair
antilichaam, rabbit anti-rat antilichaam (Ra-Rat – B 1/300) in rabbit serum, werd dit
aangelengd tot 10% in TNB. De coupes werden met dit secundair antilichaam, dat gelabeld is
met biotine, gedurende 45 minuten geïncubeerd. Daarna volgde een reeks van 3x5 minuten
TNT (TBS + Tween; 0,1%), gevolgd door 45 minuten Vectastain Elite ABC Kit (Vector
Laboratories, Inc., Burlingame, USA) voor visualisatie. De coupes werden 3x5 minuten
gewassen met TBS gevolgd door 15 seconden chromogeen 3,3'-diaminobenzidine (DAB
staining) (Dako). Een haematoxyline counterstaining om de kernen aan te kleuren, werd
aangebracht (op dezelfde wijze als hierboven vermeld) en de coupes werden gedehydrateerd.
1.2 TNFΔare
Als model voor chronische ileïtis werd gebruik gemaakt van TNFΔare muizen. Dit zijn
genetisch gemanipuleerde muizen die TNF overproduceren. Heterozygote TNFΔare muizen
ontwikkelen ileïtis vanaf de leeftijd van 6 tot 8 weken oud. Aangezien homozygote muizen
ernstiger ziek zijn en overlijden tussen de 5 à 12 weken, wordt er gekweekt met TNFΔare+/+
(WT) en TNFΔare+/- muizen. (30) Een bijkomend voordeel hierbij, is dat er een controlegroep
gemaakt kan worden met littermates TNFΔare+/+.
20
Methodologie
Om de expressie van MTs te bepalen in het epitheel, werden twee groepen, TNFΔare+/- met
controlegroep TNFΔare+/+, gesacrificeerd toen ze 14 weken oud waren. Het ileum werd
gecollecteerd en de enterocyten geïsoleerd aan de hand van MatriSperse (Cell Recovery
Solution, BD Biosciences). De cellen werden in RLT (buffer RLT, Qiagen) geplaatst om de
cellen te lyseren en het RNA werd geïsoleerd.
Om het effect van MTs op het verloop van ileïtis na te gaan werden werden TNFΔare+/muizen gekruist met Mt-/- muizen. Bij deze koppels werden TNFΔare+/- Mt+/- en/of TNFΔare+/+
Mt+/-geboren. (Figuur 2)
De gewichten van deze muizen werden opgevolgd tot de leeftijd van 24 weken en vergeleken
met het verschil in gewicht tussen TNFΔare+/+ Mt+/+ en TNFΔare+/- Mt+/+ muizen. (Figuur 3)
Fig. 2 Kweekkoppel 1
Fig. 3 Kweekkoppel 2
21
Methodologie
1.3 qPCR
De expressie van MTs in het epitheel werd nagegaan aan de hand van een qPCR. RNA werd
geïsoleerd uit de epitheelcellen met behulp van een RNA isolatiekit (RNeasy mini kit,
Qiagen). Dit gebeurde door 600µl buffer RLT en β-mercapto-ethanol toe te voegen aan de
stalen. Buffer RLT lyseert namelijk de cellen en β-mercapto-ethanol (10µl/µl RLT) inhibeert
RNase, waardoor RNA wordt beschermd. Daarna werd het bekomen RNA (100ng/µl)
omgezet naar cDNA. Hiervoor werd 10 µl RNA samengevoegd met 1 µl Oligo dT-primer
(0,4 µg/µl) om te laten afschrijven. Beiden gingen samen 5 min aan 65°C in het PCR toestel.
Daarna werden RNAse vrij water (4,5 µl/per staal), first strand buffer (5 µl/per staal), DTT
0,1M ( 2,5 µl/per staal), 10 nMdNTP van bioline (1,25 µl/per staal), RNA sinn (0,5 µl/per
staal) en Superscript Reverse Transcriptase aan 200 U/ml (SSRT) (0,25 µl/per staal) gemixt.
Bij elk staal werd er dus 14 µl van de mix toegevoegd. Na mengen werd alles in de PCR
amplificatie machine (Biorad) geïncubeerd (50’ op 42°C, 15’ op 70°, onbeperkt op 4°C).
Voor de qPCR werd gebruik gemaakt van de primers van de huishoudgenen mGAPDH,
mSDHA, mHMBS en de primers van de te onderzoeken genen mMt1 en mMt2. Van elk staal
werd 3 µl cDNA (verdund met RNAse vrij water naar 1/8) samengevoegd met 4µl
SensiMixTM (bioline) en 1µl specifieke primer (reverse en forward). Met behulp van
LightCycler® Software, werden de multiwell plaatjes uitgelezen in het Lightcycler toestel
(Roche).
2. In vitro
De expressie van MTs in macrofagen en hun effect op macrofaagpolarisatie werd nagegaan
aan de hand van uit beenmerg geïsoleerde macrofagen en de THP-1 cellijn.
2.1 Bone marrow derived macrophages (BMDM) – test
Twee 14 weken oude C57BL/6 muizen werden gesacrificeerd en het beenmerg uit beide
femora en tibiae werd verzameld via flushen van het beenmergkanaal met koude PBS. Na het
verzamelen werden de cellen gecentrifugeerd (7 min./1200 rpm/4°C) en weer in oplossing
gebracht in 50 ml compleet DMEM medium, samen met 20 ng/ml recombinant muis
Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) (10µl/37°C; Gibco®). DMEM medium
bestaat uit een mix met verscheidene nutriënten die noodzakelijk zijn voor celculturen van
22
Methodologie
primair geïsoleerde macrofagen, namelijk DMEM/F12 invitrogen (Gibco®), 10mM Lglutamine (GlutaMAX™, Gibco®) en antibiotica (100IU/ml penicilline, 100 µg/ml
streptomycine en 40 ng/ml gentamycine). De cellen werden daarna gedurende 7 dagen in
cultuur gebracht in twee 10 cm petrischaaltjes (Greiner bio-one) per muis-geïsoleerde cellen,
met elk 25 ml medium. Dit werd in bepaalde condities uitgevoerd, namelijk 37°C + 5% CO2.
Het medium werd op dag 2, 4 en 6 ververst (medium met MCSF, 25 ml/schaaltje) en de nietadherente cellen werden op deze momenten weggewassen (medium zonder MCSF). Hierdoor
differentieerden de beenmergcellen tot macrofagen. Na zeven dagen werd het medium
verwijderd en werden de adherente cellen geïsoleerd aan de hand van 3 ml enzymvrije
dissociatie buffer. De cellen werden geteld aan de hand van een Bürkerse telkamer en
uitgezaaid aan 1x106 cellen/well in 6-well platen. Twee uur na het uitzaaien werden de
macrofagen 24 uur gestimuleerd met LPS (1µg/ml) of met IL4 (20ng/ml). Na 24 uur werd
mRNA van de cellen geïsoleerd, omgezet tot cDNA en de expressie van verschillende genen
werd bepaald aan de hand van qPCR. Dit gebeurde zoals hierboven beschreven, met
specifieke primers voor de huishoudgenen (mSDHA en mGAPDH) en de specifieke genen
mArg1, mChi 313 (Ym-1), mCXCL2, mILβ, mIL12 en mMt2.
2.2 THP-1 test
Vervolgens werden ook THP-1 cellen uitgezaaid aan 5x105 cellen /well in 24 well platen in
medium gesupplementeerd met phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA, InvivoGen) waardoor
de THP-1 monocyten differentieerden tot macrofagen. Nadien werden ze gestimuleerd zoals
getoond in onderstaande tabel. (Tabel 1)
1
Controle 24u
2
LPS 24u
3
recombinant MT 500 ng/ml 24u
4
recombinant MT 1 µg/ml 24u
5
LPS + recombinant MT 500 ng/ml 24u
6
LPS + recombinant MT 1 µg/ml 24u
7
LPS + recombinant MT 500 ng/ml + anti-MT antilichaam (clone E9) 24u
8
LPS + recombinant MT 1 µg/ml + anti-MT antilichaam (clone E9) 24u
9
anti-MT antilichaam (clone E9) 24u
10
Controle 48u
23
Methodologie
11
IL4 48u
12
recombinant MT 500 ng/ml 48u
13
recombinant MT 1 µg/ml 48u
14
IL4 + recombinant MT 500 ng/ml 48u
15
IL4 + recombinant MT 1µg/ml 48u
16
IL4 + recombinant MT 500 ng/ml + anti-MT antilichaam (clone E9) 48u
17
IL4 + recombinant MT 1µg/ml + anti-MT antilichaam (clone E9) 48u
18
anti-MT antilichaam (clone E9)
Tabel 1: Stimulatie bij THP-1 cellen
De resultaten werden met qPCR nagegaan aan de hand specifieke primers voor TGM2 en
TNF, samen met de huishoudgenen GAPDH en SDHA.
3. Statistische verwerking
De semi-kwantitatieve analyse van de coupes werd gedaan met het software programma CellD software (Olympus Imaging Solutions, Münster, Germany).
Bij de Sirius Red kleuring en de F4/80 kleuring werd hierbij gebruikt gemaakt van de ‘Region
of Interest’ (ROI) module. Met deze module is het mogelijk om specifieke delen van de coupe
aan te duiden, waardoor het programma het percentage van het oppervlakte aangeeft dat
aangekleurd is.
De statistische verwerking werd uitgevoerd met het programma GraphPad Prism® software
(GraphPad Software, Inc., California, USA). Voor de statistische analyse werd telkens eerst
gekeken of de gegevens Gaussiaans (normaal) verdeeld waren. Dit gebeurde door de ShapiroWilk normaliteitstest uit te voeren. Afhankelijk daarvan werd gebruik gemaakt van de
parametrische ANOVA test of de niet-parametrische Kruskal-Wallis test, bij vergelijking
tussen meer dan twee populaties. Werd er vergeleken tussen twee populaties, dan werd de
parametrische ongepaarde T test uitgevoerd of de niet-parametrische Mann-Whitley Test.
Continue data (zoals gewichtsverandering) werden geëvalueerd met lineaire gemixte
modellen.
Een
p-waarde
<
0,05
werd
als
statistisch
significant
beschouwd.
24
Resultaten
Resultaten
1.Chronische DSS-model
1.1 Epitheliale expressie van MT tijdens colitis.
De expressie van MTs tijdens chronische, DSS-geïnduceerde colitis bij muizen werd
vergeleken met niet DSS-behandelde muizen. Deze expressie werd nagegaan aan de hand van
qPCR door gebruik te maken van mRNA van de gecollecteerde darmepitheelcellen.
Alhoewel niet significant lijken Mt1 en Mt2 toch gedaald te zijn in het darmepitheel van
G e n o r m a lis e e r d e t r a n s c r ip t e n
G e n o r m a lis e e r d e t r a n s c r ip t e n
muizen tijdens chronische colitis (p=0.06 voor Mt1 en p=0.07 voor Mt2, Figuur 4).
Fig. 4 Mt1 en Mt2 expressie in epitheelcellen na chronische DSS colitis.
25
Resultaten
1.2 Rol van MT in colitis
1.2.1 Gewichtsevolutie
Zestien Mt+/+ en 16 Mt-/- muizen werden opgevolgd voor gewicht tijdens chronisch DSS
colitis. Het oorspronkelijke gewicht werd gelijk gesteld aan 100% en de gewichtsverandering
werd in percentage uitgezet (Figuur 5). Er is een significant verschil tussen de
P e r c e n t a g e o o r s p r o n k e lijk e g e w ic h t
gewichtsverandering van de Mt-/- en de Mt+/+, in het voordeel voor de Mt-/- muizen.
Fig 5 Gewichtsverandering bij Mt-/- en Mt+/+ muizen.
1.2.2 Colon lengte
Op dag 35 werden de muizen gesacrificeerd en de lengte van het colon werd onmiddellijk
gemeten (Figuur 6). Er was een significant verschil in de colonlengte, waarbij de Mt-/- muizen
een langer colon hadden (p<0,01). Bij de Mt+/+ groep was de gemiddelde colonlengte 7,23 cm
+/- 0,08, terwijl de Mt-/- muizen een gemiddelde colonlengte van 7,72 cm +/- 0,12 hadden.
26
C o lo n le n g h t c m
Resultaten
Fig 6 Colonlengte van Mt+/+ en Mt-/- muizen na chronische DSS colitis.
1.2.3 H&E kleuring: inflammatie score
Tijdens het histologisch scoren van de graad van inflammatie, werd specifiek gekeken naar
verlies van gobletcellen, cryptabcessen, de verdikking van de submucosa, cellulair infiltraat in
het epitheel, elongatie van de mucosa en epitheel erosie. Er werd geen significant verschil
(p=0,44) gevonden in histologische score tussen Mt+/+ en Mt-/- muizen (Figuur 7).
Fig. 7 Histologische inflammatiescore bij Mt+/+ en Mt-/- muizen
na chronische DSS colitis.
27
Resultaten
H&E kleuring van colon van Mt+/+ muizen zonder
chronische DSS toediening, 10x vergroot
H&E kleuring van colon van Mt+/+ muizen na chronische
DSS toediening, 10x vergroot
28
Resultaten
1.2.4 Sirius Red kleuring
De Sirius Red kleuring voor het aantonen van fibrose werd gescoord via het programma CellD. De hoeveelheid bindweefsel in de mucosa en submucosa van Mt-/- muizen werd vergeleken
O pp. % van R O I
met Mt+/+ muizen.
Fig. 8 Sirius Red kleuring bij Mt+/+ en Mt-/- muizen na chronische DSS colitis.
Als de submucosa en mucosa samen werd beschouwd als de ROI, was er geen significant
verschil te merken (p=0,16). De Mt+/+ groep had hier een gemiddelde aankleuring van 1,64%
+/- 0,50SD, terwijl de Mt-/- voor 1,25% +/- 0,72SD aangekleurd waren.
1.2.5 F4/80 kleuring
De F4/80 kleuring werd gebruikt om macrofaaginfiltratie in het colon aan te kleuren. Eerst
werd subjectief gekeken of coupes meer of minder aangekleurd waren. De coupes konden een
maximale score van drie bemachtigen. Daarna werd met het programma Cell-D een ROI
aangeduid en gescoord. Ook hier werden submucosa en mucosa samen beschouwd. Er werd
geen verschil gevonden in F4/80 positieve macrofagen in Mt+/+ of Mt-/- muizen. Voor beide
manieren was de p-waarde niet significant.
29
S c o re m a x . 3
Resultaten
opp. % van R O I
Fig. 9 Subjectieve score F4/80 bij Mt+/+ en Mt-/- muizen na chronische DSS colitis.
Fig. 10 F4/80 procentuele aankleuring bij Mt+/+ en Mt-/- muizen
na chronische DSS colitis.
2. TNFΔare-model voor ileïtis
2.1 Expressie MTs tijdens ileïtis
Om te weten wat het verloop is van MTs bij ileïtis, werd MT expressie gemeten in het ileum
van TNFΔare+/- Mt+/+ muizen. Als controlegroep werd ileum van littermate TNFΔare+/+ Mt+/+
muizen gebruikt.
30
G e n o r m a lis e e r d e t r a n s c r ip t e n
Resultaten
Fig. 11 Mt1 expressie in epitheel van TNF-geïnduceerde ileïtis
in vergelijking met littermate controls.
Het gemiddelde van Mt1 bij de controlegroep was 235,6 +/- 68,09SD, voor de TNFΔare+/-
G e n o r m a lis e e r d e t r a n s c r ip t e n
groep 188,4 +/- 71,58SD. De p-waarde was niet significant (p=0,48) (Figuur 11).
Fig. 12 Mt2 expressie bij ileïtis
Het gemiddelde van de Mt2 waarde bij de controlegroep was 84,39 +/- 48,50SD. Bij de
TNFΔare+/- muizen was dit 73,16 +/- 23,77SD. De p-waarde was niet significant (p=0,90)
(Figuur 12).
31
Resultaten
2.2 Rol van MT bij ileïtis.
2.2.1 Gewichtsevolutie
Om het effect van MTs te onderzoeken tijdens TNF-geïnduceerde ileïtis werden TNFΔare+/Mt+/+ muizen gekruist met TNFΔare+/+ Mt-/- muizen. De gewichtsevolutie van TNFΔare+/- Mt+/muizen werd uitgezet naast deze van hun littermates, de controlemuizen TNFΔare+/+ Mt+/-. Het
verschil tussen beide groepen werd vergeleken met het gewichtsverschil tussen TNFΔare+/+
L ic h a a m s g e w ic h t ( g )
Mt+/+ en TNFΔare+/- Mt+/+ (Figuur 13).
Fig. 13 Gewichtsevolutie TNFΔare+/+ Mt+/- en TNFΔare+/- Mt+/- muizen.
TNFΔare+/- Mt+/- muizen hebben een lager geboortegewicht in vergelijking met hun littermates,
de controlegroep TNFΔare+/+ Mt+/- muizen, maar tussen acht (volwassen leeftijd) en vijftien
weken wordt het verschil tussen beide groepen bijna onbestaand. Rond de leeftijd van 15
weken, stijgt het gewicht van de TNFΔare+/+ Mt+/- muizen en wordt het gewichtsverschil weer
groter.
32
L ic h a a m s g e w ic h t ( g )
Resultaten
Fig. 14 Gewichtsevolutie TNFΔare+/+ Mt+/+ en TNFΔare+/- Mt+/+ muizen.
TNFΔare+/- Mt+/+ muizen stijgen duidelijk minder in gewicht dan hun littermates TNFΔare+/+
Mt+/+ muizen (Figuur 14).
3. Invloed van MTs op macrofaag polarisatie
3.1 Inductie van MTs in BMDM
Om na te gaan of MTs worden opgereguleerd in bepaalde types macrofagen, werden
beenmerggedifferentieerde macrofagen gestimuleerd met LPS en IL4 om respectievelijk
inflammatoire (M1) en regulatoire (M2) type macrofagen te genereren. De expressie van MTs
in beide types werd nagegaan aan de hand van qPCR.
3.1.1 Validatie van het onderzoek
Eerst werd nagegaan of de macrofaagpolarisatie door IL4 en LPS op beenmerg-geïsoleerde
macrofagen (BMDM) uit muizen geslaagd was, door te zoeken naar specifieke muismerkers
van de verschillende macrofaagtypes. Voor de regulatoire macrofagen (M2), gestimuleerd
door toediening van IL4, werd hiervoor gezocht naar mRNA van mArg1 en mChi 313,
merkers voor muis M2 macrofagen. Om na te gaan of de LPS stimulatie zorgde voor
differentiatie naar inflammatoire M1 macrofagen, werd gezocht naar mRNA van proinflammatoire cytokines (CXCL2, IL1β en IL12).
33
Resultaten
IL4 leidde tot een duidelijke polarisatie van de BMDR- macrofagen naar het regulatoire type
(M2) met een significante opregulatie van Arg1 en Chi 313 (Ym1). Hoewel Arg1 ook licht
verhoogd was bij de LPS gestimuleerde cellen, was dit beduidend meer bij de IL4
t r a n s c r ip t e n A r g 1
G e n o r m a lis e e r d e
gestimuleerde.
Chi 313
t r a n s c r ip t e n
G e n o r m a lis e e r d e
Fig. 15 Arg1 expressie bij stimulatie met LPS en IL4.
Fig. 16 Chi 313 expressie bij stimulatie met LPS en IL4.
LPS stimulatie leidde duidelijk tot macrofagen van het pro-inflammatoire type (M1) met een
G e n o r m a lis e e r d e
tr a n s c r ip te n C X C L 2
significante opregulatie van CXCL2, IL1β en IL12.
Fig. 17 CXCL2 expressie bij stimulatie met LPS en IL4.
34
G e n o r m a lis e e r d e
t r a n s c r ip t e n IL 1 b e t a
Resultaten
t r a n s c r ip t e n IL 1 2
G e n o r m a lis e e r d e
Fig. 18 IL1β expressie bij stimulatie met LPS en IL4.
Fig. 19 IL12 expressie bij stimulatie met LPS en IL4.
Algemeen kan men besluiten dat stimulatie met IL4 en LPS bij muis 1 goed gelukt is, met
significante resultaten in productie van mRNA afhankelijk van stimulatie.
3.1.2 MT opregulatie
Na validatie werd nagegaan of M1 of M2 types macrofagen zorgen voor een verandering in
t r a n s c r ip t e n M t 2
G e n o r m a lis e e r d e
de opregulatie van MTs. Er werd hiervoor gezocht naar mRNA van Mt2.
Fig. 20 Mt2 expressie bij stimulatie
35
Resultaten
Er was een duidelijke stijging van Mt2 expressie te zien bij LPS gestimuleerde macrofagen,
dus M1 macrofagen. Regulatoire macrofagen (M2) hadden geen verschil in Mt2 expressie in
vergelijking met de controlegroep. Er blijkt dus enkel een opregulatie te zijn bij proinflammatoire macrofagen.
3.2 MTs en macrofaagpolarisatie in THP-1
3.2.1 Validatie van het onderzoek
Om te weten of MTs een invloed hebben op macrofaagpolarisatie, werd volgende test
uitgevoerd op de PMA-gedifferentieerde THP-1 macrofagen. Deze werden uitgezaaid en
gestimuleerd met verschillende concentraties van recombinant MT.
Ook hier werd ter controle eerst nagegaan of LPS en IL4 toevoeging de macrofagen deed
differentiëren. Toevoeging van IL4 bij THP-1 cellen geeft een differentiatie naar regulatoire
u
8
u
4
8
IL
4
4
tl
c
S
P
L
c
tl
2
2
4
4
u
u
G e n o r m a lis e e r d e t r a n s c r ip t e n
macrofagen, die gekenmerkt worden door opregulatie van TGM2 mRNA (Figuur 21).
Fig. 21 TGM2 expressie bij stimulatie met LPS of IL4.
Om te weten of de LPS stimulatie een differentiatie gaf naar M1, werd gezocht naar mRNA
van TNF. Dit was duidelijk opgereguleerd, wat een teken is van differentiatie naar proinflammatoire (M1) macrofagen (Figuur 22).
36
u
8
u
4
8
4
IL
4
tl
c
L
P
c
S
tl
2
2
4
4
u
u
G e n o r m a lis e e r d e t r a n s c r ip t e n
Resultaten
Fig. 22 TNF expressie bij stimulatie met LPS of IL4.
Men kan dus besluiten dat de LPS en IL4 gestimuleerde differentiatie naar respectievelijk M1
en M2 macrofagen in deze proef gelukt is.
3.2.2 Macrofaagpolarisatie
Daarna werd gekeken of toevoeging van recombinant MT in verschillende dosissen een
polarisatie gaf van macrofagen. Hiervoor werd opnieuw gekeken naar TGM2 en TNF, om na
u
8
l
4
M
M
T
5
T
0
1
0
n
u
g
g
/m
/m
l
4
IL
c
4
8
8
4
4
tl
2
1
T
M
u
u
u
8
u
4
u
4
l
2
g
u
n
0
0
5
T
M
/m
l
/m
g
L
P
c
S
tl
2
2
4
4
u
u
G e n o r m a lis e e r d e t r a n s c r ip t e n
te gaan of respectievelijk M2 of M1 macrofagen bekomen werden.
Fig. 23 TGM2 expressie bij stimulatie met LPS, IL4 of verschillende concentraties van
recombinant MT
37
Resultaten
Er werd geen verschil gevonden (p-waarden niet significant) in TGM2 expressie bij
toevoeging van MTs in de twee verschillende concentraties na 24u en 48u; er is dus geen
polarisatie naar M2 (Figuur 23). Het is mogelijk dat dit komt door een te lage concentratie
u
8
u
4
8
l
/m
l
4
M
5
T
T
0
1
0
n
u
g
g
IL
/m
4
tl
c
4
8
8
4
2
l
/m
u
u
u
4
u
4
2
l
T
M
M
M
T
5
0
1
0
n
u
g
g
/m
S
P
L
c
tl
2
2
4
4
u
u
G e n o r m a li s e e r d e t r a n s c r i p t e n
van recombinant MT.
Fig. 24 TNF expressie bij stimulatie met LPS, IL4 of verschillende concentraties van
recombinant MT.
Daarna werd gekeken of er een verhoogde TNF expressie was. Er werd echter geen verschil
gevonden in TNF expressie na 24u en 48u toediening van recombinant MT, in de twee
verschillende concentraties. De p-waarde was niet significant. Er was dus geen polarisatie
naar M1 na toediening van MT na 24u en 48u (Figuur 24). Ook hier is het mogelijk dat dit
komt door een te lage concentratie van recombinant MT.
38
Discussie
Discussie
De resultaten verkregen met het chronische DSS model toonden aan dat de epitheliale
expressie van Mt1 en Mt2 in het colon van de muizen met chronische colitis licht verlaagd
was in vergelijking met de controlegroep. Bij de TNF Δare+/- muizen werd in het ileum geen
significant verschil gevonden van Mt1 en Mt2 in vergelijking met de controlegroep.
Mogelijks is dit laatste door te lage power van de test.
De gedaalde expressie van MTs komt overeen met de resultaten die gevonden werden in
humane biopten van IBD patiënten; deze hebben namelijk een sterk verlaagde expressie in het
darmepitheel in zwaar necrotische gebieden. Er was bij deze biopten geen correlatie tussen de
graad van inflammatie en de epitheliale MT expressie. Er werd wel een verhoogde infiltratie
van MT positieve cellen in de lamina propria gezien. (42)
Deletie van het Mt1 en Mt2 gen (Mt-/-) leidde bij chronische DSS toediening tot een minder
ernstig klinisch beeld dan de controlegroep (Mt+/+). De gewichtsverandering voor beide
groepen was significant verschillend, met een voordeel bij de Mt-/- groep. Ook de colon lengte
was in het voordeel voor de Mt-/- muizen, deze was namelijk significant korter bij de Mt+/+.
Dit betekent dat het uitschakelen van het MT gen en dus de functie van MT, direct of indirect
een verband heeft met het klinisch lijden bij de muizen. Door het verschil in colonlengte kan
men aannemen dat er een betere bescherming is tegen structurele schade en remodellering in
Mt-/- muizen. Alhoewel niet significant, wijzen de histologische analyses ook op een voordeel
voor Mt-/- muizen.
Qua gewichtsverloop doen ook de TNF Δare+/- muizen het beter bij heterozygote Mt knockout
in vergelijking met TNF
TNF
Δare+/-
Δare+/-
Mt+/+. Er werd namelijk geen verschil gezien in gewicht bij
Mt+/- en hun littermates TNF
Δare+/+
Mt+/- in de periode tussen 8 en 15 weken
ouderdom, wat overeenkomt met de volwassen leeftijd van een muis. Dit in tegenstelling tot
het gewichtsverschil tussen TNF
Δare+/+
Mt+/+ en TNF
Δare+/-
Mt+/+ muizen. Men kan dus
vermoeden dat TNF Δare+/- Mt+/- muizen klinisch nog beter zijn dan TNF Δare+/- Mt+/+. Om de
groepen correct te kunnen vergelijken, moeten ze echter uit hetzelfde nest komen. Daarvoor
moet er gekweekt worden met TNFΔare+/- Mt+/- muizen en TNFΔare+/+ Mt+/-. Het is nuttig om dit
in de toekomst uit te voeren, om zo te achterhalen of het verwachte resultaat zich ook
daadwerkelijk stelt.
39
Discussie
Het gewicht van TNF
Δare+/+
Mt+/- muizen stijgt sterker rond de leeftijd van 15 weken, in
tegenstelling tot het gewicht van de TNF Δare+/+- Mt+/+ muizen. Dit kan verklaard worden door
het feit dat homozygote MT knockout normaal gezien zorgt voor obesiteit op latere leeftijd.
Dit werd aangetoond bij Mt-/- toen deze werden vergeleken met C57BL/6J wild types. Hierbij
zag men dat Mt-/- sterker stegen in gewicht tussen 5 en 8 weken oud. (53) Deze stijging is dus
vroeger dan de leeftijd van 15 weken bij TNF Δare+/+ Mt+/- muizen, waarschijnlijk omdat deze
laatste niet homozygoot zijn.
Er werden tegenstrijdige gegevens gepubliceerd over de rol van MTs in IBD. Om
overtuigbare resultaten te verkrijgen, zijn er echter enkele voorwaarden. Zo is het belangrijk
dat de gebruikte muizen eenzelfde oorsprong hebben, aangezien sommige muizen
verschillend reageren op experimentele colitis, met bv. DSS. (42) De muizen moeten
eenzelfde genetische achtergrond hebben, van dezelfde leeftijd zijn, samen opgegroeid zijn in
dezelfde omgeving en liefst uit hetzelfde nest komen. Gegevens vergelijken tussen groepen
die elk van een andere kweker komen, is bijzonder moeilijk.
Er werd reeds aangetoond dat blokkeren van extracellulair MT met anti-MT antilichaam
therapeutisch werkzaam is in acute colitis (DSS en TNBS geïnduceerd). (42) Aangezien IBD
echter een chronische aandoening is, is het nuttig om toediening van anti-MT antilichamen te
herhalen bij chronische modellen. In de toekomst zou hier meer onderzoek omtrent moeten
gebeuren, als mogelijk geneeskundig aangrijpingspunt.
Intestinale inflammatie is gekenmerkt door een infiltratie van MT positieve inflammatoire
cellen. (42) Door gebruik te maken van macrofaagcellijnen, werd gekeken of macrofagen
MTs kunnen induceren en/of er een polarisatie te induceren was met MTs.
De eerste test, bij de BMDM cellen, werd gevalideerd door het zoeken naar expressie van
inflammatoire en anti-inflammatoire mRNA. Zoals eerder onderzocht, zorgde stimulatie met
LPS ervoor dat de monocyten uit beenmerg van muizen naar inflammatoire macrofagen
differentiëren (gekenmerkt door een opregulatie van CXCL2, IL1β, IL12). Bij stimulatie met
IL4
werden
het
regulatoire
(M2)
macrofagen
(Arg1
en
Chi
313
(Ym1)).
Na validatie van het onderzoek werd gekeken of gedifferentieerde macrofagen een verhoogde
MT expressie vertonen. Bij de LPS gestimuleerde macrofagen (M1) werd een significant
gestegen Mt2 teruggevonden. Dit in tegenstelling tot de IL4 gestimuleerde (M2) macrofagen,
waar er geen verschil was in MT expressie in vergelijking met niet-gestimuleerde cellen. Men
40
Discussie
kan dus besluiten dat alleen inflammatoire macrofagen MTs opreguleren. De opregulatie van
MTs door pro-inflammatoire stimuli sluit aan bij hun rol als acute fase eiwit. (33)
Bij het onderzoek bij THP-1 cellen naar macrofaagpolarisatie, werd ook hier gezocht naar
specifieke mRNA sequenties. Ook hier werd de test eerst gevalideerd, door na te gaan of er
een verhoogde expressie was van TGM2 en TNF bij respectievelijk stimulatie met IL4 en
LPS. Daarna werd gekeken of toevoeging van MT een verandering bracht in expressie van
TGM2 of TNF. Moest dit zo zijn, zou men kunnen stellen dat MT een differentiatie van
macrofagen induceert. Toevoeging van recombinant MT toonde echter geen verschil in
expressie van TGM2 of TNF aan. Dat MTs geen rechtstreeks effect hebben op
macrofaagpolarisatie is een mogelijke verklaring, echter het is ook mogelijk dat de gebruikte
recombinant MT concentratie te klein was om een effect uit te lokken.
Om de expressie van MTs in IBD te kunnen verklaren, is het nodig om terug te koppelen naar
hun rol als acute fase eiwit en hypoxie bij inflammatie van de darm. Het epitheel in de darm
dient als barrière tegen de darmflora en als transportmechanisme, om bepaalde stoffen op te
nemen en afval te verwijderen. (4, 54, 55) Zuurstof speelt een rol in dit proces, aangezien het
deze functies kan beïnvloeden. Zuurstoflevels veranderen continu, aangezien de
bloedcirculatie afhankelijk is van de voedselinname. De perfusie stijgt namelijk bij eten en
daalt bij vasten. Er is ook een sterke zuurstofgradiënt, aangezien het lumen van de darm
anaeroob is maar de wand sterk doorbloed. (54)
Bij IBD is het epitheel aangetast, waardoor antigenen in het lumen in contact komen met het
immuunsysteem en zo verder het epitheel aantasten. (4, 55) Actieve inflammatie zorgt voor
relatieve hypoxie, door stijgende infiltratie van inflammatoire cellen (en zo stijgend
weefselmetabolisme) en een gedaalde doorbloeding. (54) Als reactie op de hypoxie en
inflammatoire cellen, stijgt de expressie van hypoxia inducible factor 1 en 2 alfa (HIF-1α en
HIF-2α) (56), wat aangetoond wordt in humane biopten. Beiden zorgen in normale
opstandigheden voor activatie van verschillende genen, waaronder VEGF. (56) Hierdoor
ontstaat er een verhoogde vasculaire densiteit. Bij IBD is er echter een gedaalde reactie van
VEGF op HIF-1α en HIF-2α, waarbij vooral in de acute fase er een verminderde expressie is.
(38, 56)
De overexpressie van HIFα in epitheel van IBD patiënten en de gedaalde MT expressie in
chronische muismodellen voor IBD en IBD patiënten, sluiten aan bij vorig mechanisme.
Eerder werd in colonocyten al aangetoond dat een down-regulatie van MTs wordt gemedieerd
41
Discussie
door HIFα en dat MTs op hun beurt HIFα stabilisatie kunnen verminderen. Dit omgekeerde
verband kan men verklaren door intestinale epitheelcellen te onderscheiden van andere
celtypes. (38) Het is aangetoond dat in acute DSS colitis de MTs expressie is verhoogd en de
VEGF expressie verlaagd. In de latere fase ziet met het omgekeerde, namelijk een gedaalde
MTs expressie en een verhoogd VEGF als reactie op de hypoxie tijdens de inflammatie. (38)
Knockout van Mt bij muizen zorgt in de acute inflammatiefase voor klinisch en histologisch
minder zieke muizen. (42) MTs worden dus als acute fase eiwit in een acute inflammatoire
omgeving met oa. LPS als stimulus, opgereguleerd. Echter in een chronische fase wordt er
geprobeerd om een herstelmechanisme in gang te zetten, met stijging van HIFα en VEGF.
Deze zijn nodig om de schade, die veroorzaakt is door de hypoxie als gevolg van inflammatie,
tegen te gaan. De omgekeerde correlatie van MTs en HIFα in intestinale epitheelcellen zou
dus kunnen wijzen op een protectief mechanisme van de epitheelcellen om zo de MT
concentratie en celinfiltratie tegen te gaan. MTs komen immers vrij uit necrotische
colonocyten en hebben een chemotactisch effect op leukocyten welke mede verantwoordelijk
zijn voor de schade in chronisch geïnflammeerd darmweefsel. (42)
Als besluit kan men algemeen stellen dat er bij chronische inflammatie een daling is van
epitheliale MT expressie. MTs worden opgereguleerd door inflammatoire (M1) macrofagen
op basis van een inflammatoire stimulus en een genetische deletie van MTs tijdens chronische
colitis en ileïtis verbetert de klinische tekenen van inflammatie. Inhibitie van MTs bij
chronische inflammatie kan aldus mogelijk toepasbaar zijn als geneeskundig aangrijpingspunt
en kan in de toekomst onderzocht worden door o.a. anti-MT antilichamen toe te dienen bij
chronische IBD muismodellen.
42
Referentielijst
Referentielijst
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Carter MJ, Lobo AJ, Travis SP. Guidelines for the management of inflammatory bowel disease in adults.
Gut. 2004;53 Suppl 5:V1-16.
Laass MW, Roggenbuck D, Conrad K. Diagnosis and classification of Crohn's disease. Autoimmunity
reviews. 2014.
Heresbach D, Gicquel-Douabin V, Birebent B, D'Halluin P N, Heresbach-Le Berre N, Dreano S, et al.
NOD2/CARD15 gene polymorphisms in Crohn's disease: a genotype- phenotype analysis. European
journal of gastroenterology & hepatology. 2004;16(1):55-62.
Khor B, Gardet A, Xavier RJ. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature.
2011;474(7351):307-17.
Spehlmann ME, Begun AZ, Burghardt J, Lepage P, Raedler A, Schreiber S. Epidemiology of
inflammatory bowel disease in a German twin cohort: results of a nationwide study. Inflammatory bowel
diseases. 2008;14(7):968-76.
Fava F, Danese S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World journal of
gastroenterology : WJG. 2011;17(5):557-66.
Cosnes J. Smoking, physical activity, nutrition and lifestyle: environmental factors and their impact on
IBD. Digestive diseases (Basel, Switzerland). 2010;28(3):411-7.
Bernstein CN, Rawsthorne P, Cheang M, Blanchard JF. A population-based case control study of
potential risk factors for IBD. The American journal of gastroenterology. 2006;101(5):993-1002.
Bernstein CN, Fried M, Krabshuis JH, Cohen H, Eliakim R, Fedail S, et al. World Gastroenterology
Organization Practice Guidelines for the diagnosis and management of IBD in 2010. Inflammatory bowel
diseases. 2010;16(1):112-24.
Satsangi J, Silverberg MS, Vermeire S, Colombel JF. The Montreal classification of inflammatory bowel
disease: controversies, consensus, and implications. Gut. 2006;55(6):749-53.
Conrad K, Roggenbuck D, Laass MW. Diagnosis and classification of ulcerative colitis. Autoimmunity
reviews. 2014.
Warren BF. Classic pathology of ulcerative and Crohn's colitis. Journal of clinical gastroenterology.
2004;38(5 Suppl 1):S33-5.
Langner C, Magro F, Driessen A, Ensari A, Mantzaris GJ, Villanacci V, et al. The histopathological
approach to inflammatory bowel disease: a practice guide. Virchows Archiv : an international journal of
pathology. 2014.
Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, Verspaget HW. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel
disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. The Journal of
pathology. 2003;201(1):28-36.
Cornaggia M, Leutner M, Mescoli C, Sturniolo GC, Gullotta R. Chronic idiopathic inflammatory bowel
diseases: the histology report. Digestive and liver disease : official journal of the Italian Society of
Gastroenterology and the Italian Association for the Study of the Liver. 2011;43 Suppl 4:S293-303.
Lee EY, Stenson WF, DeSchryver-Kecskemeti K. Thickening of muscularis mucosae in Crohn's disease.
Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc.
1991;4(1):87-90.
Yamagata M, Mikami T, Tsuruta T, Yokoyama K, Sada M, Kobayashi K, et al. Submucosal fibrosis and
basic-fibroblast growth factor-positive neutrophils correlate with colonic stenosis in cases of ulcerative
colitis. Digestion. 2011;84(1):12-21.
Pucilowska JB, Williams KL, Lund PK. Fibrogenesis. IV. Fibrosis and inflammatory bowel disease:
cellular mediators and animal models. American journal of physiology Gastrointestinal and liver
physiology. 2000;279(4):G653-9.
Graham MF, Diegelmann RF, Elson CO, Lindblad WJ, Gotschalk N, Gay S, et al. Collagen content and
types in the intestinal strictures of Crohn's disease. Gastroenterology. 1988;94(2):257-65.
Burke JP, Mulsow JJ, O'Keane C, Docherty NG, Watson RW, O'Connell PR. Fibrogenesis in Crohn's
disease. The American journal of gastroenterology. 2007;102(2):439-48.
Valatas V, Vakas M, Kolios G. The value of experimental models of colitis in predicting efficacy of
biologic therapies for inflammatory bowel diseases. American journal of physiology Gastrointestinal and
liver physiology. 2013.
Bhan AK, Mizoguchi E, Smith RN, Mizoguchi A. Colitis in transgenic and knockout animals as models
of human inflammatory bowel disease. Immunological reviews. 1999;169:195-207.
43
Referentielijst
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
Perse M, Cerar A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of biomedicine
& biotechnology. 2012;2012:718617.
Hudcovic T, Kozakova H, Kolinska J, Stepankova R, Hrncir T, Tlaskalova-Hogenova H.
Monocolonization with Bacteroides ovatus protects immunodeficient SCID mice from mortality in
chronic intestinal inflammation caused by long-lasting dextran sodium sulfate treatment. Physiological
research / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 2009;58(1):101-10.
Sartor RB. Therapeutic manipulation of the enteric microflora in inflammatory bowel diseases:
antibiotics, probiotics, and prebiotics. Gastroenterology. 2004;126(6):1620-33.
Jurjus AR, Khoury NN, Reimund JM. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of
pharmacological and toxicological methods. 2004;50(2):81-92.
Low D, Nguyen DD, Mizoguchi E. Animal models of ulcerative colitis and their application in drug
research. Drug design, development and therapy. 2013;7:1341-57.
Laroui H, Ingersoll SA, Liu HC, Baker MT, Ayyadurai S, Charania MA, et al. Dextran sodium sulfate
(DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in
the colon. PloS one. 2012;7(3)
Strober W, Fuss IJ, Blumberg RS. The immunology of mucosal models of inflammation. Annual review
of immunology. 2002;20:495-549.
Kontoyiannis D, Pasparakis M, Pizarro TT, Cominelli F, Kollias G. Impaired on/off regulation of TNF
biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated
immunopathologies. Immunity. 1999;10(3):387-98.
Kanai T, Kawamura T, Dohi T, Makita S, Nemoto Y, Totsuka T, et al. TH1/TH2-mediated colitis
induced by adoptive transfer of CD4+CD45RBhigh T lymphocytes into nude mice. Inflammatory bowel
diseases. 2006;12(2):89-99.
Hoffmann JC, Pawlowski NN, Kuhl AA, Hohne W, Zeitz M. Animal models of inflammatory bowel
disease: an overview. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology.
2002;70(3):121-30.
Coyle P, Philcox JC, Carey LC, Rofe AM. Metallothionein: the multipurpose protein. Cellular and
molecular life sciences : CMLS. 2002;59(4):627-47.
Morgan AR, Fraser AG, Ferguson LR. Metallothionein genes: no association with Crohn's disease in a
New Zealand population. Journal of negative results in biomedicine. 2012;11:8.
Karin M, Eddy RL, Henry WM, Haley LL, Byers MG, Shows TB. Human metallothionein genes are
clustered on chromosome 16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 1984;81(17):5494-8.
Waeytens A, De Vos M, Laukens D. Evidence for a potential role of metallothioneins in inflammatory
bowel diseases. Mediators of inflammation. 2009;2009:729172.
De SK, McMaster MT, Andrews GK. Endotoxin induction of murine metallothionein gene expression.
The Journal of biological chemistry. 1990;265(25):15267-74.
Devisscher L, Hindryckx P, Olievier K, Peeters H, De Vos M, Laukens D. Inverse correlation between
metallothioneins and hypoxia-inducible factor 1 alpha in colonocytes and experimental colitis.
Biochemical and biophysical research communications. 2011;416(3-4):307-12.
Dube A, Harrisson JF, Saint-Gelais G, Seguin C. Hypoxia acts through multiple signaling pathways to
induce metallothionein transactivation by the metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1).
Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire. 2011;89(6):562-77.
Tran CD, Cool J, Xian CJ. Dietary zinc and metallothionein on small intestinal disaccharidases activity in
mice. World journal of gastroenterology : WJG. 2011;17(3):354-60.
Kruidenier L, Kuiper I, Van Duijn W, Mieremet-Ooms MA, van Hogezand RA, Lamers CB, et al.
Imbalanced secondary mucosal antioxidant response in inflammatory bowel disease. The Journal of
pathology. 2003;201(1):17-27.
Devisscher L, Hindryckx P, Lynes MA, Waeytens A, Cuvelier C, Vos FD, et al. Role of metallothioneins
as danger signals in the pathogenesis of colitis. The Journal of pathology. 2014.
Tran C.D. BJM, Sundar S., Coyle P., Howarth G.S. The role of zinc and metallothionein in the dextran
sulfate sodium-induced colitis mouse model. Digestive Diseases and Sciences. 2007;52(9):2113-21.
Tsuji T, Naito Y, Takagi T, Kugai M, Yoriki H, Horie R, et al. Role of metallothionein in murine
experimental colitis. International journal of molecular medicine. 2013;31(5):1037-46.
Oz HS, Chen T, de Villiers WJ, McClain CJ. Metallothionein overexpression does not protect against
inflammatory bowel disease in a murine colitis model. Medical science monitor : international medical
journal of experimental and clinical research. 2005;11(3):Br69-73.
Al-Gindan Y, Shawarby M, Noto A, Taylor CG. Intestinal inflammation in rats induces metallothionein
in colonic submucosa. Journal of clinical biochemistry and nutrition. 2009;44(2):131-41.
44
Referentielijst
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature reviews
Immunology. 2008;8(12):958-69.
Martinez FO, Gordon S, Locati M, Mantovani A. Transcriptional profiling of the human monocyte-tomacrophage differentiation and polarization: new molecules and patterns of gene expression. Journal of
immunology (Baltimore, Md : 1950). 2006;177(10):7303-11.
Rogler G, Andus T, Aschenbrenner E, Vogl D, Falk W, Scholmerich J, et al. Alterations of the phenotype
of colonic macrophages in inflammatory bowel disease. European journal of gastroenterology &
hepatology. 1997;9(9):893-9.
Smith PD, Smythies LE, Mosteller-Barnum M, Sibley DA, Russell MW, Merger M, et al. Intestinal
macrophages lack CD14 and CD89 and consequently are down-regulated for LPS- and IgA-mediated
activities. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 2001;167(5):2651-6.
Kamada N, Hisamatsu T, Okamoto S, Chinen H, Kobayashi T, Sato T, et al. Unique CD14 intestinal
macrophages contribute to the pathogenesis of Crohn disease via IL-23/IFN-gamma axis. The Journal of
clinical investigation. 2008;118(6):2269-80.
Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nature reviews Immunology. 2003;3(1):23-35.
Beattie JH, Wood AM, Newman AM, Bremner I, Choo KH, Michalska AE, et al. Obesity and
hyperleptinemia in metallothionein (-I and -II) null mice. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 1998;95(1):358-63.
Taylor CT, Colgan SP. Hypoxia and gastrointestinal disease. Journal of molecular medicine (Berlin,
Germany). 2007;85(12):1295-300.
Xavier RJ, Podolsky DK. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature.
2007;448(7152):427-34.
Giatromanolaki A, Sivridis E, Maltezos E, Papazoglou D, Simopoulos C, Gatter KC, et al. Hypoxia
inducible factor 1alpha and 2alpha overexpression in inflammatory bowel disease. Journal of clinical
pathology. 2003;56(3):209-13.
45

Gratis Tennisles Tc Key point in Muizen

“Elke minuut gebeurt er wel iets geks”

Ledenlijst (registrerende leden) gesorteerd op fokkersnummer

Plaats 100.000 kg koeien Naam koe Vader Eigenaar

Bekijk de uitnodiging - St. Elisabeth Ziekenhuis

Uitslag veekeuring ZWH show 2014(koeien)

Prijs Cat.nr. Naam Vader Eigenaar Plaats kampioen alg kamp

Proefschriftsamenvatting L.P.E. van der Steen, februari 2014

Werkvoorbereider CV/AC/LB installaties

Torenvalk FH