Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2013 – 2014
Chemische synthese en enzymatische hydrolyse
van 4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen
Jeroen Bomon
Promotoren: Prof. dr. ir. M. D’hooghe
Prof. dr. T. Desmet
Tutoren:
dr. ir. K. Mollet
ir. K. De Winter
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Chemie en bioprocestechnologie
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2013 – 2014
Chemische synthese en enzymatische hydrolyse
van 4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen
Jeroen Bomon
Promotoren: Prof. dr. ir. M. D’hooghe
Prof. dr. T. Desmet
Tutoren:
dr. ir. K. Mollet
ir. K. De Winter
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Chemie en bioprocestechnologie
De auteur en de promotoren geven de toelating deze Masterproef voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik.
Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot
de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze
Masterproef.
The author and the promoters give the permission to make this Master dissertation available for
consultation and to copy parts of it for personal use.
Every other use is subject to the copyright law, more specifically the source must be extensively
specified when using results from this Master dissertation.
6 juni 2014
De promotoren,
Prof. dr. ir. M. D’hooghe
De auteur,
Prof. dr. T. Desmet
Jeroen Bomon
WOORD VOORAF
Vijf jaar geleden, in de zesde Latijn-wiskunde, maakte ik de keuze om een wetenschappelijke
opleiding te gaan studeren aan de Universiteit Gent. Het feit dat het eerste jaar bio-ingenieur een
zeer ruime wetenschappelijke kennis biedt, heeft mij over de streep getrokken om deze opleiding
aan te vatten. De vakken chemie in de eerste twee jaren boeiden mij het meest waardoor de keuze
voor de richting Chemie en Bioprocestechnologie snel gemaakt was. Op dit moment ben ik tevreden
een Masterproef te kunnen voorleggen, waarin de werelden van de organische chemie en
biokatalyse samen komen. In dit woord vooraf wil ik graag iedereen bedanken die bijgedragen heeft
tot het finaliseren van dit eindwerk.
In de eerste plaats wens ik mijn promotor, prof. dr. ir. Matthias D’hooghe, te bedanken voor de
schitterende begeleiding en motivatie. De aangename en ontspannen manier van omgang, uw
enthousiasme en het feit dat uw deur altijd open stond voor vragen hebben zeker een positieve
invloed gehad op de inspanningen doorheen het jaar. Ook wens ik mijn copromotor, prof. dr. Tom
Desmet, te bedanken voor de eveneens aangename begeleiding en het nalezen en verbeteren van
het enzymatisch deel van deze Masterproef.
Een volgende bedanking is voor mijn tutoren dr. ir. Karen Mollet en ir. Karel De Winter. Karen, ik
bedank jou voor de vele uren tijd die je in het verbeterwerk van mijn teksten en spectra gestoken
hebt tijdens de laatste maanden. Je bent een van de meest veeleisende tutoren in het labo, maar je
gedrevenheid en eeuwige passie voor de organische chemie hebben zeker positief bijgedragen tot
mijn motivatie om tot dit mooie geheel te komen. Ook wil ik je bedanken voor de babbeltjes en het
lachen tussen het vele werk door. Karel, jou wil ik bedanken om mij te introduceren in de wondere
wereld van de enzymen en om mij enthousiast een deel van je kennis door te geven en zeker voor de
begeleiding en sfeer op de tweede verdieping van blok B.
Iemand die ook zeker bedankt dient te worden is (bijna dr.) Matthias Moens om me wegwijs te
maken in het labo en om me gedurende het hele eerste semester te begeleiden. Ook bedankt dat ik
voor al mijn vragen bij jou terecht kon gedurende het ganse jaar! Verder wens ik jou veel succes bij
het weldra verdedigen van je doctoraat.
Naast mijn begeleiders wil ik ook de andere doctoraatsstudenten van beide labo’s bedanken voor de
hulp bij alle apparatuur. Iemand die zeker een extra bedanking verdient is ir. Nicola Piens voor de
vele babbels, de grappige opmerkingen en het feit dat je altijd bereid was om te helpen.
Verder wens ik alle collega-thesisstudenten te bedanken voor de sfeer binnen en buiten het labo. Het
kerstfeestje en de uitstap naar Bellewaerde waren zeker enkele hoogtepunten. In het bijzonder wil ik
Lena bedanken voor de vele uren die we naast elkaar in beide labo’s stonden, waarin we goed en
aangenaam samengewerkt hebben. Yves, jou wil ik bedanken voor onze dagelijkse babbels voor
halfnegen. Verder bedank ik nog Jan-Klaas, Sofie en Lieselotte om Tafel 1 zo onvergetelijk te maken!
Uiteraard was er ook nood aan ontspanning tijdens dit zeer drukke jaar. Hiervoor bedank ik mijn
vrienden, zowel in Gent als in Aalst, voor de leuke middagpauzes en de vele babbels over alles
behalve de thesis.
Ik zou ook graag mijn ouders bedanken voor alle kansen die ik al gekregen heb en om altijd in mij te
geloven. Als laatste bedank ik mijn vriendin Elien om er elke dag voor mij te zijn. Ik was dit jaar
waarschijnlijk niet de gemakkelijkste maar nu begrijp ik echt de stress die jij vorig jaar ook had.
Bedankt voor de vele liefde en steun de afgelopen jaren!
Jeroen Bomon, 6 juni 2014
INHOUDSOPGAVE
1
2
Situering en doel ........................................................................................................ 1
1.1
Situering .......................................................................................................................................... 1
1.2
Doel ................................................................................................................................................. 3
Literatuuroverzicht .................................................................................................... 7
2.1
2.1.1
Synthese van trans-3-[1-(tert-butyldimethylsilyloxy)ethyl]-4-(1-carboxyethyl)azetidin-2-on .......... 7
Synthese uitgaande van 3-[1-(tert-butyldimethylsilyloxy)ethyl]-4(methoxycarbonylmethyl)azetidin-2-on ............................................................................... 7
2.1.2
Synthese uitgaande van 4-acetoxy-3-[1-(tert-butyldimethylsilyloxy)ethyl]azetidin-2-on ........... 8
2.1.3
Synthese uitgaande van (R)-methyl-3-hydroxybutyraat ......................................................... 9
2.2
Het gebruik van trans-3-[1-(tert-butyldimethylsilyloxy)ethyl]-4-(1-carboxyethyl)azetidin-2-on in de
synthese van carbapenemen ......................................................................................................... 10
2.3
2.3.1
Het gebruik van 1-benzyloxy-4-(2-carboxyethyl)azetidin-2-on in de organische chemie ................ 13
1-Benzyloxy-4-(2-carboxyethyl)azetidin-2-on als intermediair in de synthese van
carbacephemen ............................................................................................................... 13
2.3.2
1-Benzyloxy-4-(2-carboxyethyl)azetidin-2-on als intermediair in de synthese van andere
bicyclische β-lactamen ...................................................................................................... 14
2.4
3
Besluit ........................................................................................................................................... 16
Bespreking van de resultaten ....................................................................................17
3.1
Synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen .................................................................. 17
3.1.1
Synthese van (R)-glyceraldehyde acetonide ........................................................................ 18
3.1.2
Synthese van (E)-N-[((4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl)methylideen]aminen ................... 19
3.1.3
Synthese van (3R,4S)-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl]azetidin-2-onen ...................... 19
3.1.4
Synthese van (3R,4S)-4-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]azetidin-2-onen ........................................ 22
3.1.5
Synthese van (3R,4R)-4-formylazetidin-2-onen ................................................................... 22
3.1.6
Synthese van (3R,4S)-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-onen ..................................................... 24
3.1.7
Synthese van (3R,4S)-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen .................................................... 24
3.1.8
Synthese van (3R,4R)-4-(joodmethyl)azetidin-2-onen .......................................................... 26
3.1.9
Synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen ........................................................ 26
3.2
Synthese van cis-4-formyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on .................................................... 28
3.2.1
Pogingen tot synthese van glyceraldehyde acetonide .......................................................... 28
3.2.2
Synthese van glyoxal-bis-(N-isopropylimine)....................................................................... 29
3.2.3
Poging tot synthese van cis-4-formyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on uitgaande van
glyoxal-bis-(N-isopropylimine) ........................................................................................... 30
3.3
3.3.1
Clusterscreening .............................................................................................................. 34
3.3.2
Enzymatische hydrolyse van 4-cyaanmethyl-β-lactamen ..................................................... 36
3.3.3
Verdere testreacties teneinde het verhogen van de reactiesnelheid .................................... 38
3.3.4
Opschaling ....................................................................................................................... 39
3.3.5
Besluit ............................................................................................................................. 40
3.4
5
Chemische hydrolyse van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen ............................................... 41
3.4.1
Pogingen tot zure hydrolyse van (3R,4S)-1-butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxy-azetidin-2-on ....... 41
3.4.2
Pogingen tot alkalische hydrolyse van (3R,4S)-1-butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxy-azetidin-2-on 41
3.4.3
Besluit ............................................................................................................................. 42
3.5
4
Enzymatische hydrolyse van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen .......................................... 33
Toekomstperspectief ..................................................................................................................... 43
3.5.1
Synthese van cis-4-formylazetidin-2-onen .......................................................................... 43
3.5.2
Reactiviteitsstudie van (3R,4S)-4-(carboxymethyl)azetidin-2-onen ....................................... 43
3.5.3
Synthese en hydrolyse van 4-cyaanethyl-β-lactamen .......................................................... 44
Samenvatting en besluit ............................................................................................47
4.1
Samenvatting ................................................................................................................................ 47
4.2
Besluit ........................................................................................................................................... 50
Experimenteel deel ...................................................................................................51
5.1
Analysemethoden ......................................................................................................................... 51
5.1.1
Dunnelaagchromatografie (TLC) ........................................................................................ 51
5.1.2
Preparatieve dunnelaagchromatografie (prep. TLC) ............................................................ 51
5.1.3
Kolomchromatografie ....................................................................................................... 51
5.1.4
Automatische kolomchromatografie .................................................................................. 51
5.1.5
Preparatieve HPLC ............................................................................................................ 52
5.1.6
NMR-spectroscopie .......................................................................................................... 52
5.1.7
Infraroodspectroscopie..................................................................................................... 52
5.1.8
Massaspectrometrie ......................................................................................................... 52
5.1.9
Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie .................................................................... 52
5.1.10
Gaschromatografie ........................................................................................................... 53
5.1.11
Smeltpuntbepaling ........................................................................................................... 53
5.1.12
Elementaire analyse ......................................................................................................... 53
5.1.13
Optische rotatie ............................................................................................................... 53
5.1.14
6
Microgolfreactor .............................................................................................................. 53
5.2
Droge solventen ............................................................................................................................ 53
5.3
Beschrijving van de experimenten ................................................................................................. 54
5.3.1
Synthese van (3R,4S)-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl]azetidin-2-onen 11 ................. 54
5.3.2
Synthese van (3R,4S)-4-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]azetidin-2-onen 89 .................................... 55
5.3.3
Synthese van (3R,4R)-4-formylazetidin-2-onen 94............................................................... 57
5.3.4
Synthese van (3R,4S)-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-onen 12 ................................................ 58
5.3.5
Synthese van (3R,4S)-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen 95 ................................................ 59
5.3.6
Synthese van (3R,4R)-4-(joodmethyl)azetidin-2-onen 99 ..................................................... 61
5.3.7
Synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13 ................................................... 62
5.3.8
Synthese van (3R,4S)-4-(carboxymethyl)azetidin-2-onen 17 ................................................ 63
5.3.9
Synthese van 4-4’-bis(1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on) 102 en 103 ............................... 65
Bronnenlijst ..............................................................................................................67
1 SITUERING EN DOEL
1.1 Situering
Sinds de toevallige ontdekking van penicilline 1 (R = Bn) door Alexander Fleming in 1928,1 hetgeen
hem in 1945 de Nobelprijs voor geneeskunde opleverde,2 zijn β-lactamen niet meer weg te denken
uit de farmaceutische wereld. Tot op de dag van vandaag vormen β-lactamantibiotica de eerste keus
bij het voorschrijven van antibacteriële verbindingen.3,4 Deze klasse van antibiotica omvat onder
meer de penicillinen 1, cefalosporinen 2, carbapenemen 3, penemen 4, monobactamen 5 en
carbacephemen 6.5,6
R
H
N
R1
H
S
O
R1
S
N
R
COOH
4
O
COOH
H
N
R2
O
N
O
5
R2
COOH
R1
H
N
H
O
R3
R1
3
2
H H
H H
N
R2
O
COOH
O
HO
S
N
1
HO
H
O
N
O
H
N
N
O
6
R2
COOH
Het werkingsmechanisme van β-lactamantibiotica berust op het feit dat de antibiotica de synthese
van de bacteriële celwand inhiberen, waardoor de cel zal lyseren en uiteindelijk afsterven. Dit heeft
zijn oorzaak bij de β-lactamring, dewelke zal binden aan de “penicillin binding proteins” (PBP’s)
waardoor de peptidoglycaanketens niet kunnen crosslinken, hetgeen noodzakelijk is voor een stevige
celwand.7
Een groot probleem is dat steeds meer bacteriën resistent raken aan deze antibiotica. Meestal volgt
dit uit de expressie van β-lactamase-enzymen die de amidebinding van de vierring irreversibel gaan
hydrolyseren, hetgeen de werking van het β-lactamantibioticum teniet doet. Daar waar
gramnegatieve bacteriën doorgaans dit mechanisme gebruiken, bezitten de grampositieve bacteriën
ook nog een andere vorm van resistentie, de zogenaamde “PBP alteration”. In dit geval bezitten de
bacteriën gemuteerde PBP’s, dewelke minder gevoelig zijn voor binding met de β-lactamantibiotica.
Naast deze twee wegen voor resistentie zijn er ook bacteriën met een gemodificeerde celwand met
effluxpompen, waarlangs de antibiotica terug uit de cel getransporteerd worden. Om deze reden
blijft onderzoek naar nieuwe β-lactamhoudende antibacteriële verbindingen noodzakelijk.8,9
1
Situering en doel
Naast hun toepassing o.w.v. hun directe antibacteriële activiteit, bestaan er ook β-lactamen die
toegevoegd worden aan antibiotica, meer bepaald als β-lactamase-inhibitoren. Deze verbindingen
worden samen met het antibioticum ingenomen en zullen irreversibel binden met de β-lactamaseenzymen van de bacterie, waardoor deze enzymen de werking van het antibioticum niet meer
kunnen belemmeren. Enkele voorbeelden van dergelijke β-lactamase-inhibitoren zijn clavulaanzuur 7
en sulbactam 8.10
H
HO O
S
OH
O
N
N
O
O
OH
O
O
7
OH
8
Hoewel β-lactamen vooral gebruikt worden als antibacterieel geneesmiddel, bestaan er ook
vertegenwoordigers met andere biologische activiteiten. Zo kunnen deze verbindingen ook ingezet
worden tegen HIV, diabetes, tumoren, malaria, Parkinson, etc.11-13
Naast de bovenvermelde biologische toepassingen vormen β-lactamen eveneens interessante
verbindingen in de synthetische organische chemie omwille van hun gespannen en reactieve
ringstructuur, hetgeen geleid heeft tot de introductie van de term “β-lactam synthon method”.14 Zo
wordt deze structurele eenheid onder meer ingezet in de synthese van polyamiden, met als
voorbeeld Nylon 3, azetidinen of polyaminen.15,16 Ook natuurproducten met biologische activiteit,
zoals alkaloïden en taxoïden, kunnen worden gesynthetiseerd uit β-lactamen.17,18
Carboxyl-β-lactamen, waarvan enkele voorbeelden zullen gesynthetiseerd worden in deze
Masterproef, vormen interessante verbindingen in de synthetische organische chemie, daar deze
gebruikt worden als precursoren voor de synthese van potentieel biologisch actieve verbindingen.
Het aanwenden van deze verbindingen in de synthese van carbapenem- 3 en carbacephem- 6
antibiotica vormt een onderdeel van het hoofdstuk “Literatuuroverzicht” van deze Masterproef.19,20
De verbinding lacteendiyn 9, een ethylester van een carboxyl-β-lactam, kan bijvoorbeeld worden
ingezet in de bestrijding van kanker.21,22
OEt
O
H
O
N
9
Het gebruik van enzymen in de organische chemie is de laatste jaren sterk toegenomen. Dit is toe te
schrijven aan het feit dat biokatalyse doorgaans minder drastische reactieomstandigheden vereist en
2
Situering en doel
dat enzymen vaak chemo-, regio- en enantioselectief omzettingen katalyseren op het niveau van
bepaalde functionele groepen en de rest van de molecule ongeroerd laten. Het is vooral dit laatste
argument dat vaak de doorslag geeft voor het gebruik van enzymen in de organische synthese,
aangezien in de klassieke chemie vaak beschermende groepen dienen aangewend te worden.23
1.2 Doel
In een eerste luik van deze Masterproef zal een waaier aan (3R,4S)-3-alkoxy- en (3R,4S)-3-aryloxy-4(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13 gesynthetiseerd worden. Deze syntheseroute is een toepassing van
de zogenaamde “chiral pool”-strategie, waarin gestart wordt met een chiraal zuivere verbinding,
dewelke omgezet wordt in een doelverbinding zonder racemiserende tussenstappen waardoor de
stereochemie behouden blijft.24
De synthese start bij het enantiomeer zuivere 1,2:5,6-bis-O-(1-methylethylideen)-D-mannitol 10,
hetgeen een oxidatieve splitsing m.b.v. natriumperjodaat zal ondergaan met vorming van twee
moleculen (R)-glyceraldehyde acetonide. Dit aldehyde zal vervolgens worden aangewend in de
synthese van gefunctionaliseerde β-lactamen 11. Dit zal gebeuren via een imineringsreactie, waarna
de gevormde aldiminen omgezet zullen worden tot β-lactamen 11 via de zogenaamde
Staudingersynthese.25 In deze [2+2]-cyclocondensatiereactie wordt gebruik gemaakt van een keteen,
in situ gevormd uit een zuurchloride in basische omstandigheden. Deze bekomen β-lactamen 11
waren reeds onderwerp van voorgaand onderzoek binnen de vakgroep Duurzame Organische
Chemie en Technologie (Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent).26 De volgende
reactiestappen betreffen het aanbrengen van modificaties in de zijketen op de 4-plaats van de βlactamring.
Deze
acetalen
11
zullen
achtereenvolgens
behandeld
worden
met
para-
tolueensulfonzuur, natriumperjodaat en natriumboorhydride, met de vorming van alcoholen 12.27,28
Deze verbindingen zullen tot slot omgezet worden in de gewenste nitrillen 13 door eerst een
tosylering van de hydroxylgroep, waarna twee opeenvolgende substitutiereacties, respectievelijk
door jodide en cyanide, de doelverbindingen 13 zullen genereren.28
3
Situering en doel
OH O
H
O
R
R
O HO
1) NaIO4
2) R1NH2
O
R2O
R
O
H
O
3) R2O
H
H H
R2O
R
S
N
R1
O
OH
R1
Cl
Et3N
10
O
S
S
N
1) pTsOH·H2O
2) NaIO4
3) NaBH4
O
H H
12
11
R2O
1) TsCl
DMAP, Et3N
H H
R
CN
S
N
O
2) NaI
3) NaCN
R1
13
Er werd eerder gesteld dat deze syntheseroute volgens de “chiral pool”-strategie verloopt. Teneinde
te kunnen bewijzen dat het beoogde eindproduct 13 effectief chiraal zuiver is, zal getracht worden
cis-4-cyaanmethyl-β-lactamen 16 ook op een racemische manier te bereiden. Deze racemische
synthese zal dezelfde route volgen, met uitzondering van de eerste stap. Het racemisch
glyceraldehyde acetonide 15 zal immers gesynthetiseerd worden m.b.v. een oxidatiereactie
uitgaande van solketal 14. Voor deze reactie zijn verschillende methoden beschreven in de
literatuur.29,30
O
HO
R2O
O
O
O
H
H H
CN
N
O
O
15
14
R1
16
In een tweede luik van deze Masterproef zal de cyaangroep in de bekomen 4-cyaanmethyl-βlactamen 13 en 16 gehydrolyseerd worden tot de overeenkomstige carbonzuren 17 en 18. Deze
omzettingen zullen gebeuren m.b.v. nitrilasen, en bijgevolg zal dit deel van de Masterproef
uitgevoerd worden in de vakgroep Biochemische & Microbiële Technologie (Faculteit Bioingenieurswetenschappen, Universiteit Gent). Naast deze enzymatische omzettingen zullen ook
chemische hydrolyses uitgevoerd worden, zowel in zuur als alkalisch milieu. Vervolgens zullen de
resultaten van de chemische en de enzymatische hydrolysereacties met elkaar vergeleken worden,
teineinde de relevantie van de enzymatische benadering goed te kunnen inschatten.
R2O
H H
CN
N
O
R1
13 en 16
R2O
H H
N
O
OH
R1
O
17 en 18
Zoals eerder gesteld vormen β-lactamen interessante startverbindingen voor de synthese van allerlei
biologisch waardevolle doelverbindingen. Omwille van deze reden zullen de bekomen carbonzuren
4
Situering en doel
17 en 18 onderworpen worden aan een reactiviteitsstudie met het oog op de vorming van een aantal
interessante azaheterocyclische verbindingen.
In deze reativiteitsstudie is één van de mogelijkheden de reductie van de β-lactamring tot een
azetidine 19 m.b.v. monochlooralaan (AlH2Cl2). Hetgeen aldus bekomen wordt noemt men
“constrained β-amino acids”, dewelke interesse opwekken daar β-aminozuren biologisch heel
relevant zijn. Zo zijn ze alomtegenwoordig in het domein van de natuurproducten en zijn ze chemisch
gezien stabieler dan α-aminozuren.31
Naast de synthese van azetidinen 19, bestaat ook de mogelijkheid om te werken naar een 3,4gefuseerd bicyclisch β-lactam 23. De tweede ring in deze verbinding opent nieuwe perspectieven
voor het onderzoek naar potentieel biologische activiteit. Verbindingen met een gelijkaardige
tweede ring, dewelke fungeren als β-lactamase-inhibitor, worden besproken in het hoofdstuk
“Literatuuroverzicht” van deze Masterproef. Een mogelijkheid tot de synthese van deze verbindingen
23 kan bestaan uit hydrogenolyse van de benzyloxygroep (indien R2 = Bn) in β-lactam 17 met
palladium op koolstof als katalysator. Vervolgens zou een ringsluiting kunnen plaatsvinden tussen de
gegenereerde hydroxylgroep en de aanwezige carbonzuurfunctie in alkalische omstandigheden.
Indien deze laatste stap moeizaam zou doorgaan kan getracht worden om initieel de
carbonzuurfunctie te transformeren in een zuurchloride, gebruik makend van thionylchloride en
vervolgens dezelfde reacties uit te voeren.
AlH2Cl
H H
R2O
OH
S
R
N
R1
O
19
SOCl2
H H
R2O
N
O
N
O
O
OH
S
R
R1
20
H H
R2O
Cl
S
R
R1
Pd/C
(R2 = Bn)
O
17
H H
HO
Cl
S
R
N
O
R1
O
O
21
O
Base
H
Pd/C
(R2 = Bn)
N
H H
HO
R
OH
S
N
O
RS
R1
O
O
H
R1
23
22
5
6
2 LITERATUUROVERZICHT
Deze literatuurstudie geeft een beknopt overzicht van de belangrijkste syntheseroutes tot
β-lactamen met een carbonzuurfunctie in één van de zijketens en gaat dieper in op het gebruik ervan
in de synthetische organische chemie. Aangezien het experimenteel werk van deze Masterproef
handelt over β-lactamen 24 met een carbonzuurfunctie in de zijketen op de 4-plaats, wordt enkel
deze laatste groep hier besproken. Het aantal methyleengroepen (n) tussen de β-lactamkern
enerzijds en de carbonzuureenheid anderzijds wordt beperkt tot 1 en 2.
R1
n COOH
N
O
R2
24
(n = 1,2)
2.1 Synthese van trans-3-[1-(tert-butyldimethylsilyloxy)ethyl]-4(1-carboxyethyl)azetidin-2-on
Het uitvoerig beschreven 4-(1-carboxyethyl)-β-lactam 25 vormt een belangrijk intermediair in de
synthese van de klasse der carbapenem-antibiotica 3.32 Voor de synthese van deze verbinding zijn
verschillende routes beschreven in de literatuur, al dan niet enantioselectief,33-36 of methoden die
gebruik maken van een Reformatsky-reactie,37 etc.
TBDMSO
H H
HO
OH
R1
H H
NH O
R2
N
O
O
25
2.1.1 Synthese uitgaande van
COOH
3
3-[1-(tert-butyldimethylsilyloxy)ethyl]-4-
(methoxycarbonylmethyl)azetidin-2-on
De synthese van β-lactam 25 werd voor het eerst gerapporteerd in 1984. De startverbinding 28 van
deze syntheseroute werd bekomen na bescherming van de hydroxylgroep in β-lactam 26, waarmee
reeds gewerkt werd in eerder onderzoek rond het carbapenemderivaat thienamycine 27.33
HO
R
HO
H H
S
R
COOMe
NH
O
NH2
H H
S
N
O
OH
O
26
27
7
Literatuuroverzicht
Reactie van methylester 28 met lithiumdiisopropylamide (LDA) en hexamethylfosfortriamide (HMPA)
in THF bij -78°C, gevolgd door behandeling met methyljodide, resulteert in de introductie van de
beoogde methylgroep in α-positie t.o.v. de esterfunctionaliteit. Deze stap, dewelke verloopt via een
sp2-gehybridiseerd carbanion, levert een diastereomeer mengsel van β-lactamen 29a en 29b in een
verhouding 29a/29b van 1/4. De twee bekomen diastereomeren kunnen chromatografisch
gescheiden worden, waarna het ongewenste diastereomeer 29a in het gewenste β-lactam 29b wordt
omgezet via
epimerisatie m.b.v. LDA en HMPA, gevolgd door protoneren m.b.v. azijnzuur.
Vervolgens wordt intermediair 29b omgezet in de vooropgestelde doelverbinding 25, in een
rendement van 83%, via een verzepingsreactie m.b.v. natriumhydroxide gevolgd door neutralisatie
met 6 M HCl.33 Wegens de vorming van een diastereomeer mengsel van β-lactamen 29a en 29b en
de daarop volgende moeilijke scheiding, is deze synthese niet geschikt voor opschaling.32,34
1) 2 equiv. LDA
1 equiv. HMPA
THF, -78°C, 30 min
2) 3 equiv. HOAc
THF, -78°C, 5 min
(78%)
29a/29b = 1/1
TBDMSO
R
H H
S
R
COOMe
1) 2 equiv. LDA
1 equiv. HMPA
THF, -78°C, 40 min
NH
2) 2,3 equiv. MeI
THF, -78°C, 1 h
(75%)
29a/29b = 1/4
Ref. 33
O
28
TBDMSO
R
H H
S
S
OH
R
NH
O
O
TBDMSO
R
TBDMSO
H H
S
S
S
COOMe
NH
R
+
H H
S
S
R
COOMe
NH
O
O
29a
29b
1) 1 equiv. NaOH
MeOH/H2O (4/1), k.t., 30 min
2) HCl (6 M)
50°C, 1 h
pH 7
25 (83%)
2.1.2 Synthese
uitgaande
van
4-acetoxy-3-[1-(tert-
butyldimethylsilyloxy)ethyl]azetidin-2-on
Deze synthese start met de N-acylering van 1,3-benzoxazin-4-onen 30 met propionylchloride in
aanwezigheid van triethylamine als base.38 De bekomen N-propionylderivaten 31 worden vervolgens
bij -60°C met NaN(TMS)2 omgezet tot de overeenkomstige enolaten 33, dewelke reageren met
4-acetoxy-β-lactam 32 tot hybriden 35. Bij deze omzetting ondergaat het intermediair
N-acyliminiumion 34, hetgeen in situ wordt gegenereerd uit 4-acetoxy-β-lactam 32, een synselectieve aldolcondensatie met benzoxazin-4-onen 33, resulterend in de synthese van hybriden 35.
De laatste stap in deze syntheseroute betreft de introductie van de carbonzuurgroep, hetgeen wordt
8
Literatuuroverzicht
bewerkstelligd door gebruik te maken van lithiumhydroxide en waterstofperoxide in THF/H2O (4/1).39
Deze reactie levert het beoogde carbonzuur 25 en 1,3-benzoxazin-4-on 30b, hetgeen voor 97%
gerecupereerd wordt.34
In de literatuur zijn gelijkaardige reacties beschreven met 4-acetoxy-β-lactamen, waaruit blijkt dat
deze verbindingen gevoelig zijn voor nucleofiele aanvallen op het koolstofatoom in de 3-positie, waar
de acetoxygroep vervangen wordt door de aanvallende groep.40,41
R
R
O
R
EtCOCl, Et3N
HN
O
R
O
R
1,1 equiv. NaN(TMS)2
N
tolueen, -60°C, 3 h
Ref. 38
30a (R = Me)
30b (R = Et)
30c (R = nBu)
30d (R = -(CH2)5-)
O
N
THF, -60°C, 1 h
Ref. 34
O
O
Na
31 (92-95%)
TBDMSO
R
H H
R
TBDMSO
R
H
R
NH
O
32
O
33
OAc
R
O
R
0,5 equiv. 32
THF, -60°C, 10 min
NH
O
34
R
TBDMSO
O
HN
+
R
H H
S
S
R
NH
O
O
30b (97%)
25 (89%)
COOH
4 equiv. H2O2
1,6 equiv. LiOH·7H2O
TBDMSO
THF/H2O (4/1), 5°C, 10 min
(R = Et)
Ref. 39
R
H H
S
O
R
RR
NH O
N
O
O
35 (70-87%)
d.r. > 99/1
2.1.3 Synthese uitgaande van (R)-methyl-3-hydroxybutyraat
Een andere enantioselectieve synthese van doelverbinding 25 gaat uit van (R)-methyl-3hydroxybutyraat 36.42 Deze syntheseroute bevat een groot aantal reacties en bijgevolg wordt,
wegens de beperkte lengte van deze literatuurstudie, enkel het laatste deel van deze route
weergegeven.
(R)-Methyl-3-hydroxybutyraat 36 wordt via verschillende reacties omgezet in alcohol 37.
Swernoxidatie van deze laatste verbinding leidt tot een β-amino-aldehyde, dewelke verder wordt
geoxideerd tot het overeenkomstige carbonzuur 38 gebruik makend van NaClO2. Katalytische
hydrogenatie verwijdert de benzyloxycarbonylgroep, hetgeen gevolgd wordt door een cyclisatie
onder Ohno-omstandigheden,43 leidend tot β-lactam 39.42 Deze verbinding wordt verder omgezet tot
de gewenste verbinding 25 door het selectief verwijderen van de primaire beschermende TBDMS-
9
Literatuuroverzicht
groep in licht zure omstandigheden,44 gevolgd door oxidatie tot carbonzuur 25 gebruik makend van
pyridiniumdichromaat (PDC). Dit is de zogenaamde Jones-oxidatie.45,46
O
OBn
TBDMSO
OH O
R
R
OMe
Ref. 42
HN
R
R
R
1) (COCl)2, DMSO, Et3N, -65°C
OTBDMS
2) NaClO2, 2-Me-2-buteen,
NaH2PO4, H2O, BuOH
HO
36
37
O
OBn
TBDMSO
R
H H
R
S
R
1) Pd/C, MeOH, H2 (1 atm)
OTBDMS
TBDMSO
R
2) PPh3, MeCN, 
NH
O
HO
39 (79%)
HN
S
R
R
OTBDMS
O
38 (71%)
0,15 equiv. HCl (1M)
MeOH/H2O (5/1), 0°C, 2 d
Ref. 44
TBDMSO
R
TBDMSO
H H
S
R
R
OH
1,2 equiv. PDC
NH
O
40 (80%)
R
H H
S
R
S
COOH
NH
DMF, k.t.
O
Ref. 45, 46
25 (91%)
2.2 Het gebruik van trans-3-[1-(tert-butyldimethylsilyloxy)ethyl]4-(1-carboxyethyl)azetidin-2-on
in
de
synthese
van
carbapenemen
β-Lactamen vormen gegeerde targets in de medicinale chemie wegens hun sterk antibiotische
eigenschappen en het klassieke probleem van resistentievorming.8 De klasse der carbapenemen 3
echter bevat nog verbindingen waartegen bacteriën niet resistent zijn, omdat hun structuur βlactamase-enzymen weerstaat. Ook hebben ze een breder werkingsspectrum dan het typevoorbeeld
van de β-lactamantibiotica, de penicillinen.47,48
HO
H H
N
O
R2
COOH
3
10
R1
Literatuuroverzicht
De synthese van het carbapenemderivaat meropenem 52 start met carbonzuur 41, een analoog van
de eerder beschreven verbinding 25. Verestering van dit zuur met thiofenol in aanwezigheid van
N,N’-carbonyldiimidazool (CDI) resulteert in de selectieve vorming van thioëster 42. De tertbutyldimethylsilyl- en tert-butylgroepen worden vervolgens verwijderd door behandeling met
titaniumtetrachloride en anisool, hetgeen aanleiding geeft tot carbonzuur 43. Dit carbonzuur 43
wordt vervolgens, door reactie met para-nitrobenzylbromide (PNB-Br) en γ-collidine 44, omgezet tot
het overeenkomstige PBN-ester 45, waarna silylering met tert-butyldimethylsilylchloride (TBDMSCl)
verbinding 46 oplevert.19
Deze laatste verbinding 46 wordt vervolgens ingezet in de synthese van carbapenemderivaat 50 in
een zogenaamde “one pot”-procedure in vier stappen. Vooreerst worden 2,3 equivalenten
natriumhydride toegevoegd in een mengsel van tolueen en THF (1/1) bij -20 °C. Deze stap levert het
bicyclisch β-lactam 47, hetgeen reageert met methyljodide en difenylchloorfosfaat (DCP) tot
fosfaatverbinding 48. Vervolgens worden thiol 49 (PNZ = para-nitrobenzyloxycarbonyl) en
1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-een (DBU) toegevoegd, en na twee uur roeren bij -20 °C wordt
product 50 bekomen via een Michael-additie, gevolgd door eliminatie van de fosfaatgroep. In een
volgende stap wordt de TBDMS-beschermende groep verwijderd in zure omstandigheden, hetgeen
leidt tot verbinding 51,19 waaruit meropenem 52 gevormd wordt door hydrogenolyse van de twee
resterende beschermende groepen over een palladium op koolstof katalysator (10 m% Pd).49 Deze
reactie vindt plaats in een solventmengsel bestaande uit THF en een MOPS-buffer (3-(Nmorpholino)propaansulfonzuur), in een rendement van 61%.50 Later werd aangetoond dat verbinding
50 rechtstreeks in meropenem 52 kan worden omgezet door hydrogenolyse.19 De omzetting van
verbinding 46 naar verbinding 47 noemt men de Dieckman-cyclisatie.51
11
Literatuuroverzicht
TBDMSO
R
1,2 equiv. CDI
1,2 equiv. PhSH
H H
S R
S
COOH
N
TBDMSO
R
COOtBu
S
COSPh
N
MeCN, k.t., 1 h
Ref. 19
O
SR
HO
3,2 equiv. anisool
1,9 equiv. TiCl4
H H
S
S
COSPh
O
COOtBu
41
R
N
CH2Cl2, 0°C, 1 h
O
H H
R
COOH
42 (100%)
43 (86%)
CH2Br
1,3 equiv.
2,4 equiv.
N
44
NO2
DMF, 60°C, 1,5 h
TBDMSO
R
TBDMSO
H H
R
2,3 equiv. NaH
R
S
R
O Na
N
O
SR
S
HO
2,2 equiv. imidazool
COSPh 1,4 equiv. TBDMSCl
N
tolueen / THF (1/1)
-20°C, 1 h
O
H H
R
S
S
COSPh
O
COOPNB
PNBO
47
R
N
DMF, k.t., 5 h
O
H H
COOPNB
46 (98%)
45 (93%)
1) 1 equiv. MeI in THF (2 M)
-20°C, 0,5 h
2) 1 equiv. DCP in tolueen (2 M)
-20°C, 1,5 h
HS
1 equiv.
TBDMSO
R
H H
R
S
S
N
O
O
OP(OPh)2
S
S
CONMe2
N
49
PNZ
TBDMSO
H H
R
1 equiv. DBU
R
tolueen / THF (4/1), -20°C, 2 h
O
S
S
S
N
COOPNB
S
S
N
CONMe2
PNZ
COOPNB
50 (83%)
48
fosfaatbuffer (pH 3)
THF, k.t., 2,5 h
Me
HO
R
H H
S
S
R
S
S
N
S
O
O
N
OH
NH
Me
HO
O
10 m% Pd/C
THF / MOPS-buffer (pH 7) (1/2)
H2 (1 atm), k.t., 3 h
Ref. 50
52 (61%)
R
H H
S
S
N
O
R
S
S
S
N
CONMe2
PNZ
COOPNB
51 (89%)
Meropenem 52 is een antibioticum dat werkzaam is tegen zowel Gram-positieve bacteriën,
waaronder Listeria monocytogenes, als Gram-negatieve bacteriën, zoals Pseudomonas. Het is, in
tegenstelling tot andere β-lactamen, een antibioticum dat zeer resistent is tegen β-lactamase,
cefalosporinase en dehydropeptidase-enzymen.52
12
Literatuuroverzicht
2.3 Het gebruik van 1-benzyloxy-4-(2-carboxyethyl)azetidin-2on in de organische chemie
2.3.1 1-Benzyloxy-4-(2-carboxyethyl)azetidin-2-on als intermediair in de
synthese van carbacephemen
Carbacephemen 6 zijn een klasse van breedspectrum-antibiotica nauw verwant aan cefalosporinen 2.
Het enige structurele verschil betreft de substitutie van een zwavelatoom in de zesring door een
methyleengroep. De zesring is hier dus een tetrahydropyridinering. Carbacephemen vertonen een
grotere chemische stabiliteit dan cefalosporinen, wat ertoe leidt dat meer structurele transformaties
kunnen uitgevoerd worden zonder dat het basisskelet wordt aangetast.53 Een ander belangrijk
verschil tussen carbacephemen en cefalosporinen is dat carbacephemen uitsluitend via chemische
synthese bereid worden, terwijl in de klasse der cefalosporinen zowel natuurlijke als semisynthetische voorbeelden te vinden zijn.20
R1
H
N
R1
H
O
N
O
6
H
N
H
O
R2
COOH
N
O
S
R2
COOH
2
Een mogelijke route voor de synthese van carbacephemen gaat uit van 1-benzyloxy-4-(2carboxyethyl)azetidin-2-on 53 als startproduct. Deze verbinding wordt met carbonyldiimidazool (CDI)
en Mg(O2CCH2CO2tBu)2, in situ gevormd uit mono-tert-butylmalonaat en dibutylmagnesium, omgezet
tot het overeenkomstige β-ketoëster 54.54,55 Deze verbinding wordt gehydrogeneerd door
behandeling met palladium op koolstof als katalysator (10 m% Pd),49 hetgeen leidt tot alcohol 55, dat
vervolgens reageert met 2,4,6-(triisopropylbenzeen)sulfonylazide 56, N,N-diisopropylethylamine en
trimethylsilylazide (TMSN3) tot β-lactam 63. TMSN3 neemt hier niet rechtstreeks deel aan de reactie,
maar toevoeging van deze verbinding levert hogere rendementen.20 Tijdens deze reactie wordt een
azidogroep geïntroduceerd op positie 3 van de β-lactamring, hetgeen simultaan verloopt met
activatie en vervolgens eliminatie van de N-hydroxylgroep. Op hetzelfde moment zal er ook een
azidetransferreactie plaatsvinden tussen de twee carbonylfuncties van β-keto ester 59. Deze
verschillende omzettingen samen verlopen in een rendement van 79%. Een laatste stap betreft de
ringsluiting van diazoverbinding 63 tot carbacephem 64 onder rhodiumkatalyse, een stap met een
rendement van 55%.20
13
Literatuuroverzicht
O
O
OH
N
O
OtBu
N
2) 1,2 equiv. mono-t-butylmalonaat
0,6 equiv. Bu2Mg
THF, -78°C, 15 min
k.t., 1,5 h
Ref. 54, 55
OBn
53
O
OBn
54 (90%)
10 m% Pd/C
MeOH, H2 (1 atm), k.t., 2 h
Ref. 20
iPr
SO2N3
1) 2,5 equiv.
56
iPr
O
O
iPr
O
1 equiv. iPr2NEt
CH3CN, N2, k.t., 10 min
OtBu
N
O
OtBu
O
57
OH
55
O
O
OtBu
O
H H
N3
N
O SO2Ar
O
OtBu
N
HO
O
N
2) 0,5 equiv. TMSN3
CH3CN, k.t., 4d
O SO2Ar
N3
O
1) 1,1 equiv. CDI
THF, k.t., 3 h
H
O
iPr2NEt
H
58
N N N SO2Ar
59
56
O
H H
N3
O
N3
OtBu
O
N
HN
H
O
OtBu
N
N
N
O
H H
O
H
H
SO2Ar
61
O
H H
N3
O
OtBu
N
O
N
N
H
62
N3
O
H H
O
OtBu
N
O
60
H
N
N
5 m% Rh2(OAc)4
C6H6, 68-80°C, 15 min
63 (79%)
N3
H H
N
O
OH
CO2tBu
64 (55%)
2.3.2 1-Benzyloxy-4-(2-carboxyethyl)azetidin-2-on als intermediair in de
synthese van andere bicyclische β-lactamen
Het chiraal zuivere β-lactam (4R)-1-benzyloxy-4-(2-carboxyethyl)azetidin-2-on 65 wordt eerst
gehydrogeneerd door behandeling met een palladium op koolstof katalysator (10 m% Pd),49 waarna
het intermediaire N-hydroxy-β-lactam wordt getosyleerd, hetgeen aanleiding geeft tot N-tosyloxy-βlactam 66. Deze geactiveerde verbinding 66 wordt vervolgens behandeld met diisopropylethylamine
(DIEA) in acetonitril, hetgeen leidt tot de vorming van een mengsel van 3,4-gefuseerde bicyclische β-
14
Literatuuroverzicht
lactamen 67 en 68. Het gewenste product 67 wordt bekomen na een intramoleculaire 6-exo-trigringsluiting.56,57 Er werd aangetoond dat plaats 3 van de β-lactamkern in het geval van een Ntosyloxy-β-lactam gevoelig is voor additie van nucleofielen, en dat de reactie in het geval van een
intramoleculaire additie cis-geconfigureerde bicyclische producten levert.58,59 Dit laatste is in
tegenstelling tot wat eerder beschreven werd voor de omzetting van verbinding 57 naar 3-azido-βlactam 59 – in dat geval is de nucleofiele aanval echter intermoleculair en is het product bijgevolg
trans-geconfigureerd.56
Bijproduct 68 wordt bekomen volgens volgende pathway: hydroxamaatanion 70 wordt bekomen na
een intramoleculaire substitutiereactie, waarna een daaropvolgende Lossen-omlegging aanleiding
geeft tot de vorming van een intermediair isocyanaat 71,60,61 hetgeen verder reageert met het
gewenste eindproduct 67 tot het ongewenste eindproduct 68.56
O
OH
R
N
O
OBn
65
OH
R
2) 1 equiv. TsCl
2 equiv. Et3N
MeOH, k.t., 10 min
Ref. 56
O
O
1) 10 m% Pd/C
MeOH, H2 (1 atm), k.t., 4 h
N
O
OTs
2 equiv. iPr2NEt
OH
R
N
CH3CN, k.t., 36 h
HO
OTs
69
66 (87%)
O
O
H
S R
H
NH
O
67 (17%)
O
H O
S
Lossen-omlegging
H
O C N
N
O
O
O
S
OTs
71
70
67
O
O
H
O
SR
H
N
H H
N
O
O
S
O
68 (34%)
15
Literatuuroverzicht
De bekomen verbinding 67 blijkt een precursor te zijn in de synthese van nieuwe β-lactamantibiotica
en verbindingen die fungeren als β-lactamase-inhibitoren. Deze inhibitoren zijn verbindingen die
samen met het antibioticum ingenomen worden en de werking van bacteriële β-lactamasen
stilleggen. Een aantal voorbeelden van β-lactamase-inhibitoren zijn clavulaanzuur 7 en sulbactam 8.62
H
HO O
S
OH
O
N
N
O
O
OH
O
7
O
OH
8
2.4 Besluit
Deze literatuurstudie omvat slechts een beperkt aantal van de beschreven syntheseroutes en
toepassingen van β-lactamen met een carbonzuurfunctie in de zijketen van het koolstofatoom in de
4-positie. Het feit dat er nog heel wat andere informatie in de literatuur te vinden is, toont aan dat
de β-lactamchemie en dat de synthese van carbacephemen en carbapenemen sterk bestudeerde
takken van de organische chemie zijn. De synthese en toepassingen van trans-3-[1-(tertbutyldimethylsilyloxy)ethyl]-4-(1-carboxyethyl)azetidin-2-on 25 zijn uitvoerig beschreven in de
literatuur, en dit sinds 1984.33 Ook nu nog worden nieuwe synthesemethoden voor deze verbinding
beschreven en gepatenteerd.63
De doelverbinding in het experimenteel deel van deze Masterproef betreft een 4-carboxymethyl-βlactam zoals verbinding 25 uit deze literatuurstudie. Eén van de mogelijke toepassingen van deze
verbinding zou kunnen zijn om een ringsluiting te bewerkstellingen die, net als in de ringsluiting van
het monocyclische 66 naar het bicyclische β-lactam 67, een extra ring genereert tussen de twee sp3gehybridiseerde koolstofatomen van de vierring.
16
3 BESPREKING VAN DE RESULTATEN
3.1 Synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen
In deze paragraaf wordt de synthese van 4-cyaanmethyl-β-lactamen 13 beschreven. Aansluitend op
voorgaand preliminair onderzoek binnen de vakgroep Duurzame Organische Chemie en Technologie
(Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent),28 wordt in deze Masterproef de synthese
van deze klasse der β-lactamen verder uitgewerkt.
R2O
H H
R
S
N
O
CN
R1
13
4-Cyaanmethyl-β-lactamen worden, net als 4-carboxymethyl-β-lactamen, beschouwd als precursoren
in de synthese van antibiotica. Een voorbeeld hiervan is de synthese van carbapenemderivaat
thienamycine 27, hetgeen reeds in de literatuur beschreven werd.64 Ook worden ze ingezet in de
synthese van β-peptiden 72,65 dewelke opgebouwd zijn uit een reeks van β-aminozuren. Deze
peptiden zijn chemisch gezien stabieler dan de in de natuur voorkomende α-peptiden en bevatten
min of meer dezelfde biologische werking. Om deze reden worden β-peptiden gebruikt in de
synthese van nieuwe antibiotische verbindingen.65
HO
N
O
NH2
H H
S
COOH
27
R1
N
H
R3
O
R2
N
H
O
R4
72
Een belangrijk woord in de naam van de vakgroep “Duurzame Organische Chemie en Technologie”
(Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent) is het begrip “duurzaam”. Vandaar dat
sedert 2013 onderzoek loopt naar het terugdringen van het gebruik van gehalogeneerde solventen.
Aangezien vijf van de negen vooropgestelde reacties ofwel enkel beschreven zijn in dichloormethaan,
ofwel de beste resultaten geven in dit solvent, was het in deze Masterproef een bijkomende
uitdaging om alternatieve oplosmiddelen te vinden voor deze reacties en de resultaten van de
verschillende solventen te vergelijken.
17
Bespreking van de resultaten
3.1.1 Synthese van (R)-glyceraldehyde acetonide
De synthese van (3R,4S)-4-cyaanmethyl-β-lactamen 13 start met de oxidatieve splitsing van het
commercieel beschikbare, chiraal zuivere 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol 10. Deze synthese
werd uitgevoerd met behulp van 2,3 equivalenten natriumperjodaat in aanwezigheid van
natriumbicarbonaat.66 Enkele uren hevig roeren bij kamertemperatuur levert het gewenste,
enantiomeer zuivere (R)-glyceraldehyde acetonide 73. Aangezien deze reactie in de literatuur enkel
beschreven werd in dichloormethaan,66 werden tijdens deze Masterproef ook andere solventen
getest voor deze reactie. De resultaten worden weergegeven in Tabel 1. Hieruit blijkt dat de reactie
in tetrahydrofuran de resultaten behaald met dichloormethaan het best benaderde. Er dient echter
wel gesteld te worden dat deze reactie in THF geen volledige omzetting gaf na twee uur roeren
(>95% op basis van 1H-NMR), waardoor een reactietijd van drie uur noodzakelijk was.
Nucleofiele aanval van elk van de twee hydroxylgroepen van 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol
10 op het joodatoom van perjodaat levert een intermediair 75 met uitstoot van water. De gevormde
vijfring zal terug opengaan waardoor de koolstof-koolstofbinding gebroken wordt, met de oxidatie
van de twee alcoholfuncties tot carbonylgroepen en vorming van natriumjodaat 77 tot gevolg.67
H
O
OH O
R
R
O
OH
2,3 equiv. NaIO4
0,4 equiv. NaHCO3 (v)
O
O
solvent/verz. NaHCO3 (25/1), k.t., tijd
H
O
10
O
R
H
H
73 (74-99%)
O Na
I
O
O
77
H
O
OH O
R
R
O
OH
O
O Na
O
I
O
O
H
Na O
O
O
I
HO O
H
O
O
R
O
OH
R
H
O
O
H2O
O
O O Na
O
O I
O
R
HH
O
R
O
74
76
75
Tabel 1: Synthese van (R)-glyceraldehyde acetonide 73
18
Solvent
Tijd (h)
Rendement (%)
CH2Cl2
2
99
2-Me-THF
2
93
THF
3
98
EtOAc
2
74
Bespreking van de resultaten
3.1.2 Synthese
van
(E)-N-[((4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-
yl)methylideen]aminen
Enantiomeer zuivere (E)-N-[((4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl)methylideen]aminen 79 werden
gesynthetiseerd uitgaande van (R)-glyceraldehyde acetonide 73. Hiertoe werd aldehyde 73 opgelost
in een organisch solvent, in aanwezigheid van één equivalent primair amine 78 en twee equivalenten
magnesiumsulfaat als droogmiddel.26 Deze imineringsreactie werd reeds beschreven met
dichloormethaan als solvent,26 waardoor in deze Masterproef de reactie ook in tetrahydrofuran
uitgevoerd werd. Het substitutiepatroon en de verkregen rendementen van iminen 79 worden
weergegeven in Tabel 2, waaruit kan besloten worden dat tetrahydrofuran voor deze reactie een
waardig alternatief vormt voor dichloormethaan.
O
R
H
O
1 equiv. R1NH2 78
2 equiv. MgSO4
O
H
O
solvent, k.t., 2 h
R1
73
S
H
N
O
H
79 (72-89%)
Tabel 2: Synthese van (E)-N-[((4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl)methylideen]aminen 79
3.1.3 Synthese
Verbinding
R1
79a
iPr
79b
nBu
van
Solvent
Rendement (%)
CH2Cl2
85
THF
72
CH2Cl2
88
THF
89
(3R,4S)-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-
yl]azetidin-2-onen
In een volgende fase werden de bekomen iminen 79 ingezet in de Staudingersynthese voor de
synthese van gefunctionaliseerde β-lactamen 11.
De Staudingersynthese vormt de meest frequent gerapporteerde synthesemethode voor de
bereiding van gefunctionaliseerde β-lactamen. Verschillende studies werden reeds verricht teneinde
het achterliggende mechanisme en het resultaat op stereochemisch vlak van deze [2+2]cyclocondensatie te verklaren en/of te voorspellen.68 Zo werd reeds ontrafeld dat deze keteen-iminecyclocondensatiereactie wellicht via een stapsgewijs mechanisme verloopt. Een eerste stap betreft
een nucleofiele additie van het vrije elektronenpaar van het stikstofatoom van imine 82 aan het sp-
19
Bespreking van de resultaten
gehybridiseerde koolstofatoom van keteen 81, in situ gegenereerd uit een zuurchloride 80 in
basische omstandigheden, met vorming van zwitterionisch intermediair 83. De nucleofiele aanval
gebeurt langs de sterisch minst gehinderde zijde van het keteen, de zogenaamde exo-aanval. Het
zwitterionisch intermediair 83 ondergaat vervolgens een conrotatorische elektrocyclische
ringsluiting, met vorming van cis-β-lactamen 84. Indien de substituent op het keteen (R3) een
elektronenzuigende groep betreft, en dit in combinatie met een elektronengevende groep op het
imine (R2), wordt deze ringsluiting vertraagd en heeft het intermediair 83 de kans om isomerisatie
rond de iminebinding te bewerkstelligen met vorming van zwitterion 85. Ringsluiting vormt bijgevolg
trans-β-lactamen 86. Indien echter R3 een elektronengever en R2 een elektronenzuiger betreffen,
wordt de ringsluiting in intermediair 83 versneld, met de vorming van cis-β-lactamen 84.69
Deze theoretische veronderstellingen werden ook experimenteel bewezen. Daar waar Bose-Evansketenen (R3 = O-alkyl, O-aryl, N-arylalkyl) resulteren in de vorming van cis-β-lactamen, leidt het
gebruik van Moore-ketenen (R3 = S-alkyl, S-aryl, alkyl, Cl, Br) tot trans-β-lactamen. Een derde groep
ketenen, de zogenaamde Sheenan-ketenen (R3 = vinyl, Phth), levert een mengsel van cis- en trans-βlactamen.69
R3
O
R3
Cl
H
H
R1
H
C
O
N
81
82
R2
R3
R1
H
H
N
O
R2
isomerisatie
R3
R1
H
H
N
O
R2
Base
80
85
83
R3 = e--gever
R3 = e--zuiger
R3
N
O
R1
R3
R2
O
R1
N
R2
cis--lactam
trans--lactam
84
86
In deze Masterproef werd gebruik gemaakt van methoxy- en fenoxyacetylchloride 87 (R3 = MeO,
PhO), dewelke zorgen voor directe ringsluiting van de initieel gevormde zwitterionen 83 en bijgevolg
aanleiding geven tot de vorming van cis-β-lactamen 11 en 88. Iminen 79 zorgen voor chirale inductie
waardoor voornamelijk diastereoisomeren 11 gevormd worden.26 Hierbij dient vermeld te worden
dat de twee diastereomeren 11 en 88 kunnen worden gescheiden m.b.v. kolomchromatografie
(SiO2).
Voor het uitvoeren van deze reactie werden iminen 79 opgelost in een droog organisch solvent in
aanwezigheid van drie equivalenten triëthylamine als base. Bij een temperatuur van 0°C werd
voorzichtig een oplossing van 1,3 equivalenten zuurchloride 87 in hetzelfde solvent toegedruppeld.
20
Bespreking van de resultaten
Overnacht roeren bij kamertemperatuur leverde de verwachte cis-β-lactamen 11 en 88 op in een
diastereomere verhouding van 90-96/4-10.26 De cis-stereochemie werd bevestigd door 1H-NMRanalyse, waarbij waarden bekomen werden van 5,0-5,2 Hz (CDCl3) voor de vicinale
koppelingsconstanten tussen de protonen op de 3- en de 4-plaats van de β-lactamring. Deze
waarden stemmen overeen met waarden vermeld in de literatuur voor cis-β-lactamen (4,7-5,8 Hz,
CDCl3).69 Een overzicht van het substitutiepatroon, rendementen en diastereomere ratio’s van de
gesynthetiseerde β-lactamen 11, wordt weergegeven in Tabel 3.
O
O
S
H
R1
O
H
N
1,3 equiv. R2O
3 equiv. Et3N
Cl
87
O
H HS
R2O
R
S
N
solvent, 0°C
k.t., 16 h
(52-98%)
O
79
O
H
S
+
R1
O
H HS
R2O
R
N
O
11 (48-89%)
O
H
R1
88
11/88
(90-96/4-10)
Tabel 3: Synthese van (3R,4S)-3-methoxy- en
(3R,4S)-3-fenoxy-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl]azetidin-2-onen 11
Verbinding
11a
11b
a
b
R1
iPr
nBu
R2
Me
Ph
Solvent
d.r. 11/88a
Rendement (%)b
CH2Cl2
96/4
84
THF
93/7
48
tolueen
93/7
57
CH2Cl2
90/10
89
THF
90/10
65
Bepaald via 1H-NMR- en GC-analyse
Na kolomchromatografie (SiO2)
De uitgevoerde reacties zijn in de literatuur beschreven in dichloormethaan.26 Uit de gegevens in
Tabel 3 blijkt dat het gebruik van tetrahydrofuran als alternatief solvent gevolgen heeft m.b.t. de
verkregen rendementen, en dan vooral voor het eerste derivaat (R1 = iPr, R2 = Me). Bijgevolg werd
voor dit derivaat de reactie nogmaals uitgevoerd, ditmaal in tolueen, naast dichloormethaan en
benzeen één van de klassieke solventen voor de Staudingersynthese.69 Ook de reactie in tolueen
leverde geen bevredigende resultaten wat betreft het bekomen rendement en de diastereoisomere
verhouding. Bijgevolg werd besloten dat voor deze reactie nog geen goed alternatief gevonden werd
voor dichloormethaan, aangezien in dit solvent, naast betere resultaten voor rendement en
diastereomere ratio, ook de zuiverheid van het ruwe reactiemengsel hoger was, hetgeen verdere
zuiveringsstappen m.b.v. kolomchromatografie (SiO2) vergemakkelijkt.
21
Bespreking van de resultaten
3.1.4 Synthese van (3R,4S)-4-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]azetidin-2-onen
De gesynthetiseerde β-lactamen 11 dienen vervolgens een aantal modificaties van de zijketen op de
4-positie te ondergaan teneinde de beoogde 4-cyaanmethyl-β-lactamen 13 op te leveren. Een eerste
stap betreft de zure hydrolyse van de acetaalfunctionaliteit ter vorming van de overeenkomstige
diolen 89. Hiertoe werden β-lactamen 11 samen met één equivalent para-tolueensulfonzuur
opgelost in THF/H2O (1/1), waarna 4-6 uur geroerd werd onder refluxomstandigheden. Neutralisatie
met natriumbicarbonaat en extractie met ethylacetaat leverde finaal de gewenste diolen 89, dewelke
zuiver genoeg waren (>95%, besloten op basis van 1H-NMR-analyse) om mee verder te werken
zonder verdere zuivering.26,70
Door het zure milieu wordt één van de zuurstofatomen in de dioxolaanring van β-lactamen 11
geprotoneerd, waarna via intramoleculaire omlegging intermediairen 91 worden gevormd. Deze
intermediairen zijn gevoelig voor nucleofiele additie van water. Tenslotte wordt aceton 93
uitgestoten met de vorming van diolen 89.
O
H H
R2O
R
S
S
N
O
O
1 equiv. pTsOH·H2O
H
R
O
(R1
11
S
N
THF/H2O (1/1), , 4-6 h
R1
OH
H H
R2O
OH
S
R1
R2
89a
= iPr,
= Me, 78%)
89b (R1 = nBu, R2 = Ph, 95%)
O
93
H2O
OH
O
H H
R2O
R
S
N
O
S
H
R1
OH
H H
R2O
R
90
S
S
N
O
O
OH
H
R1
91
OH
H H
R2O
R
N
O
S
S
OH
H
R1
92
3.1.5 Synthese van (3R,4R)-4-formylazetidin-2-onen
In de volgende fase werden de gesynthetiseerde (3R,4S)-4-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]-β-lactamen 89
onderworpen aan perjodaat-geïnduceerde oxidatieve splitsing ter vorming van (3R,4R)-4formylazetidin-2-onen 94. Het mechanisme verloopt gelijkaardig als de in Sectie 3.1.1 beschreven
synthese van (R)-glyceraldehyde acetonide 73.
22
Bespreking van de resultaten
Voor deze synthese werden twee verschillende methoden getest. In een eerste procedure werden
diolen 89 en twee equivalenten natriumperjodaat opgelost in een organisch solvent en een
verzadigde natriumbicarbonaatoplossing in een 15/1-verhouding.27 In het geval van diol 89a was
twee uur roeren bij kamertemperatuur voldoende voor volledige omzetting. Voor diol 89b was 16
uur nodig. Naast bovenvermelde procedure werd deze reactie ook uitgevoerd volgens de in Sectie
3.1.1 vermelde procedure bij de synthese van (R)-glyceraldehyde acetonide 73. Hier werden 2,3
equivalenten natriumperjodaat gebruikt en, naast verzadigde natriumbicarbonaatoplossing, ook 0,4
equivalenten NaHCO3 als vaste stof.66 Deze twee methoden leverden een gelijkaardig resultaat op,
zowel op vlak van rendement als zuiverheid. Wegens de onstabiliteit van de bekomen aldehyden 94
werden deze verbindingen meteen ingezet in een volgende reactie zonder verdere zuivering.
De twee uitgevoerde procedures zijn beiden beschreven met dichloormethaan als solvent, en dus
werd deze reactie bijgevolg ook uitgevoerd in tetrahydrofuran, zij het enkel voor de tweede methode
(aangezien, voor de reacties in dichloormethaan, deze methode eerder de hoogste rendementen
opleverde). Het substitutiepatroon en de verkregen rendementen van de gesynthetiseerde diolen 89
worden weergegeven in Tabel 4.
H H
2
R O
R
Methode A
2 equiv. NaIO4
solvent/verz. NaHCO3 (15/1), < 25°C, 2-16 h
OH
SS
OH
N
O
Methode B
2,3 equiv. verz. NaIO4
0,4 equiv. NaHCO3 (v)
solvent/verz. NaHCO3 (25/1), < 25°C, 2-16 h
R1
89
H H
R2O
R
O
R
H
N
R1
O
94 (62-82%)
Tabel 4: Synthese van (3R,4R)-3-methoxy- en (3R,4R)-3-fenoxy-4-formylazetidin-2-onen 94
Verbinding
R1
R2
94a
iPr
Me
94b
nBu
Ph
Solvent
CH2Cl2
Rendement (%)
Methode A
Methode B
69
77
THF
CH2Cl2
THF
62
78
82
78
De synthese van 4-formylazetidin-2-onen werd reeds meermaals beschreven in de literatuur,
aangezien deze verbindingen interessant startmateriaal vormen voor de synthese van verschillende
23
Bespreking van de resultaten
carbapenem- en monobactamantibiotica en andere biologisch waardevolle producten waaronder αen β-aminozuren.71,72
3.1.6 Synthese van (3R,4S)-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-onen
De bekomen (3R,4R)-4-formylazetidin-2-onen 94 werden vervolgens ingezet in de reductie tot de
overeenkomstige (3R,4S)-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-onen 12. Hiertoe werden aan een ijsgekoelde
oplossing van β-lactamen 94 in methanol twee equivalenten natriumboorhydride traag toegevoegd,
waarna één tot twee uur roeren bij refluxtemperatuur de beoogde alcoholen 12 in hoge zuiverheid
(>95%, besloten op basis van 1H-NMR-analyse) werden gevormd.27,28
Natriumboorhydride is een selectief reductans, hetgeen ketonen en aldehyden reduceert tot
respectievelijk secundaire en primaire alcoholen. Voor reductie van minder reactieve
carbonylverbindingen, zoals carbonzuren, esters en amiden dient een sterker reducerend agens,
zoals lithiumaluminiumhydride, gebruikt te worden.73 Aangezien in deze Masterproef een aldehyde
in de zijketen van een β-lactamring gereduceerd diende te worden, zonder aantasting van de
amidebinding in de ring, werd voor natriumboorhydride geopteerd.
O
H H
R2O
R
R
N
R1
O
2 equiv. NaBH4
H
MeOH, 0°C
94
, 1-2 h
R2O
H H
R
S
OH
N
O
R1
12a (R1 = iPr, R2 = Me, 82%)
12b: (R1 = nBu, R2 = Ph, 91%)
3.1.7 Synthese van (3R,4S)-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen
In de vorige paragraaf werd de synthese beschreven van (3R,4S)-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-onen
12. Om de doelverbindingen, namelijk (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13, te bereiden dient
de hydroxylgroep vervangen te worden door een cyaangroep. Dit zal uiteindelijk bewerkstelligd
worden door een nucleofiele substitutie met natriumcyanide. Om deze reactie vlot te laten verlopen
dient de hydroxylgroep eerst te worden omgezet tot een betere “leaving group”, hetgeen hier
uitgevoerd wordt door een tosylering.
Hiertoe werden β-lactamen 12 opgelost in een droog organisch solvent in aanwezigheid van vier
equivalenten triëthylamine en een katalytische hoeveelheid 4,4-(dimethylamino)pyridine (DMAP),
dewelke samen zorgen voor basische omstandigheden. Vervolgens werden 1,5 equivalenten para-
24
Bespreking van de resultaten
tolueensulfonylchloride, opgelost in hetzelfde organisch solvent, toegedruppeld.74 Voor optimalisatie
werden twee solventen aangewend, namelijk dichloormethaan en tetrahydrofuran, en werd geroerd
bij verschillende reactietijden en -temperaturen. De verschillende reactieomstandigheden worden,
samen met de waarnemingen, weergegeven in Tabel 5. Voor de keuze van reactietijden werd verder
gebouwd op voorgaand onderzoek in de vakgroep Duurzame Organische Chemie en Technologie
(Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent).28
De reactie start met de activatie van para-tolueensulfonylchloride door substitutie van chloride door
DMAP met de vorming van een intermediair iminiumion 97, hetgeen telkens gedetecteerd werd bij
opvolging van de reactie via LC-MS (m/z = 277). De tweede stap van het mechanisme betreft een
nucleofiele aanval van de aanwezige hydroxylgroep in β-lactam 12, hetgeen versneld wordt door de
base
Et3N,
waarna,
na
zuivering
m.b.v.
kolomchromatografie
(SiO2),
(3R,4S)-4-
(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen 95 bekomen werden.
4 equiv. Et3N
0,1 equiv. DMAP
1,5 equiv. TsCl
H H
R2O
S
R
N
O
OH
R1
solvent, temp., tijd
H H
R2O
R
O
12
Me
Me
N
Me
N
O
p-Tol
S
Cl
O
N
R1
95 (58-67%)
Me
H H
R2O
R
N
O S O
p-Tol
O
97
96
S
N
O
S
O
O
O
N
H
R1
Ts
S
Et3N
98
Tabel 5: Synthese van (3R,4S)-3-methoxy- en (3R,4S)-3-fenoxy-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen 95
Verbinding
95a
95b
a
R1
iPr
nBu
R2
Me
Ph
Solvent
Temp.
Tijd (h)
Waarneming 12/95a
THF
k.t.
2
95/5
THF
Δ
48
Complex mengsel
CH2Cl2
Δ
43
4/96
THF
Δ
16
9/91
THF
Δ
48
Complex mengsel
CH2Cl2
Δ
48
1/99
THF
Δ
6
8/92
Op basis van 1H-NMR-analyse (CDCl3).
25
Bespreking van de resultaten
Op basis van Tabel 5 kan besloten worden dat deze reactie dient uitgevoerd te worden bij
refluxtemperatuur om tot volledige omzetting te komen. Twee dagen roeren in dichloormethaan
levert de hoogste rendementen, namelijk 67% voor het eerste derivaat 95a (R1 = iPr, R2 = Me) en 62%
voor het andere 95b (R1 = nBu, R2 = Ph), na kolomchromatografie (SiO2). Deze reactietijd kan echter
aanzienlijk verkort worden door de reactie uit te voeren in tetrahydrofuran. De rendementen liggen
hier in dezelfde grootteorde (respectievelijk 58% voor 95a en 61% voor 95b) waardoor voor deze
reactie een goed alternatief gevonden werd voor dichloormethaan.
3.1.8 Synthese van (3R,4R)-4-(joodmethyl)azetidin-2-onen
Voorgaand onderzoek aan de vakgroep Duurzame Organische Chemie en Technologie (Faculteit Bioingenieurswetenschappen, Universiteit Gent) toonde aan dat directe nucleofiele substitutie van de
gegenereerde tosyloxygroep in 4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen 95 door een cyanide-anion niet
vlot verloopt.28 Bijgevolg werd besloten om een extra tussenstap in deze syntheseroute in te
bouwen, dewelke de tosyloxygroep vervangt door een joodatoom. Dit atoom wordt immers, net als
een tosyloxygroep, beschouwd als een goede “leaving group” maar zorgt voor minder sterische
hinder waardoor nucleofiele substitutiereacties vlotter zullen verlopen.75
Teneinde
(3R,4R)-4-(joodmethyl)azetidin-2-onen
99
te
synthetiseren,
werden
(3R,4S)-4-
(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen 95 opgelost in droge aceton samen met vier equivalenten
natriumjodide. Het reactiemengsel werd gedurende een bepaalde tijd verhit bij refluxtemperatuur
waarna het solvent de kans kreeg weg te dampen bij dezelfde temperatuur.75 Na optimalisatie en
opvolging van de reactie m.b.v. LC-MS werd besloten dat 40 uur reflux en aansluitend droogdampen
nagenoeg volledige omzetting gaf voor beide derivaten 95. Zuivering m.b.v. kolomchromatografie
(SiO2) leverde finaal de beoogde (3R,4R)-4-joodmethyl-β-lactamen 99 in goede rendementen.
H H
R2O
R
S
N
O
R1
R2O
4 equiv. NaI
OTs
aceton, , 40 h
95
H H
R
R
I
N
O
R1
99a (R1 = iPr, R2 = Me, 75%)
99b (R1 = nBu, R2 = Ph, 69%)
3.1.9 Synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen
De
laatste
stap
in
deze
chirale
syntheseroute
omvat
de
synthese
van
(3R,4S)-4-
(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13 uitgaande van (3R,4R)-4-(joodmethyl)azetidin-2-onen 99. Deze
26
Bespreking van de resultaten
reactie verloopt volgens een SN2-mechanisme waarin in één stap de jodidegroep vervangen wordt
door een cyaangroep. Om deze omzetting te bewerkstelligen werden 4-joodmethyl-β-lactamen 99 en
2,5 equivalenten fijngemalen natriumcyanide opgelost in droge dimethylformamide (DMF), waarna
dit reactiemengsel geroerd werd bij verschillende temperaturen gedurende verschillende
tijdsperioden.75 Een overzicht van de toegepaste reactieomstandigheden wordt, samen met de
ondervindingen, weergegeven in Tabel 6. De reactie werd eerst geoptimaliseerd voor derivaat 13b
(R1 = nBu, R2 = Ph), waarna de bekomen ideale omstandigheden overgenomen werden voor derivaat
13a (R1 = iPr, R2 = Me).
H H
R2O
R
S
N
O
R
O
99
CN
S
N
DMF, temp., tijd
R1
H H
R2O
2,5 equiv. NaCN
I
R1
13 (53-59%)
Tabel 6: Synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13
Verbinding
R1
R2
13a
iPr
Me
13b
a
b
nBu
Ph
Temp.
Tijd (h)
Rendement
50 à 60°C
6
Complex mengsela
k.t.
72
59%b
Δ
4
Complex mengsela
60 à 70°C
6
Complex mengsela
50 à 60°C
6
Complex mengsela
k.t.
72
53%b
Bepaald na 1H-NMR- en LC-MS-analyse
Na preparatieve TLC of kolomchromatografie (SiO2)
Er werd gestart met vier uur roeren bij refluxtemperatuur,28 maar aangezien dit volledige afbraak
teweegbracht, werd de temperatuur stelselmatig verlaagd. Uiteindelijk werd bekomen dat roeren bij
kamertemperatuur gedurende drie dagen de beste resultaten opleverde, en dit voor beide derivaten.
De reacties werden telkens opgevolgd met LC-MS tot wanneer de startproducten 99 niet meer
gedetecteerd werden. Zuivering m.b.v. preparatieve TLC of kolomchromatografie (SiO2) leverde de
beoogde doelverbindingen 13.
27
Bespreking van de resultaten
3.2 Synthese van cis-4-formyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2on
De gesynthetiseerde (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13 werden gesynthetiseerd volgens de
“chiral pool”-strategie. Dit betekent dat de chiraliteit ingebouwd werd vertrekkende vanuit een
optisch zuiver startproduct, in dit geval 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol 10. Op deze manier
kan verondersteld worden dat de eindverbindingen 13 eveneens enantiomeer zuiver zijn gezien in de
syntheseroute geen racemiserende tussenstappen voorkomen. Om dit te kunnen bewijzen werd
vooropgesteld dezelfde verbindingen te synthetiseren op een racemische manier, waarna zowel de
racemische (16) als de chirale (13) nitrillen onderworpen zullen worden aan een GC-analyse met een
chirale kolom.
Deze racemische synthese zal geëvalueerd worden voor één van de twee derivaten uit voorgaande
asymmetrische route.
3.2.1 Pogingen tot synthese van glyceraldehyde acetonide
De eerste stap in de eerder beschreven asymmetrische benadering betreft de oxidatieve splitsing van
1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol 10 met de generatie van twee moleculen (R)-glyceraldehyde
acetonide 73. Om deze laatste verbinding op een racemische manier te bekomen, dient een andere
strategie te worden aangewend. De gebruikte startverbinding in deze reactie betreft het
commercieel beschikbare racemisch solketal 14, hetgeen na oxidatie van de hydroxylgroep aldehyde
15 kan opleveren. In de literatuur zijn verschillende procedures beschreven om deze oxidatie uit te
voeren, gebruik makende van onder meer de pyridiniumchloorchromaat- (PCC) en de Swernoxidatie.76,77 Naast deze methoden werd ook een andere oxidatieprocedure, de zogenaamde 2jodoxobenzoëzuur-oxidatie (IBX),78 geprobeerd. De verschillende aangewende procedures, samen
met de verkregen resultaten, worden weergegeven in Tabel 7.
De in de literatuur beschreven PCC-oxidatie van solketal gaat uit van dichloormethaan als solvent.
Om deze reden werd de reactie uitgevoerd in twee andere solventen, namelijk terahydrofuran en
diëthylether. Aangezien dit niet het gewenste resultaat opleverde, werd de reactie later ook
uitgevoerd in dichloormethaan, hetgeen al evenmin succesvol was. Ook de oxidaties gebruik
makende van dimethylsulfoxide (DMSO) en jodoxobenzoëzuur resulteerden niet, of weinig, in het
gewenste product 15. Hierdoor werd besloten om af te zien van deze reactie en de racemische
28
Bespreking van de resultaten
synthese van cis-4-cyaanmethyl-β-lactamen 16 over een geheel andere boeg te gooien, hetgeen zal
beschreven worden in de volgende paragrafen.
O
HO
O
O
Tabel 7
H
O
14
O
15
Tabel 7: Pogingen tot synthese van glyceraldehyde acetonide 14
Reagentia
Solvent
Temp.
Tijd (h)
Waarneming 14/15a
2 equiv. PCC
moleculaire zeven
silica
Et2O
k.t.
5
75/25
2 equiv. PCC
moleculaire zeven
silica
THF
k.t.
5
Geen reactie
2 equiv. PCC
moleculaire zeven
silica
THF
k.t. → Δ
48 → 24
75/25
2 equiv. PCC
moleculaire zeven
silica
CH2Cl2
k.t. → Δ
24 → 6
Complex mengselb
1,1 equiv. (COCl)2
2,4 equiv. DMSO
5 equiv. Et3N
CH2Cl2
-78°C → k.t.
4
Complex mengselb
2 equiv. IBX
EtOAC
k.t. → Δ
48 → 96
Complex mengselb
a
b
Op basis van 1H-MR-analyse.
De reacties werden opgevolgd via LC-MS tot volledige omzetting van het substraat.
3.2.2 Synthese van glyoxal-bis-(N-isopropylimine)
Een geheel andere syntheseroute gaat uit van de iminering van het commercieel beschikbare glyoxal
100. Hiertoe werden twee equivalenten isopropylamine opgelost in water waarna glyoxal 100,
hetgeen commercieel beschikbaar is in een 40% waterige oplossing, voorzichtig toegedruppeld werd
bij een temperatuur van 0°C.79 Twee uur roeren bij 0°C leverde het gewenste diimine 101 in een
rendement van 85%.
29
Bespreking van de resultaten
N
O
H
H
O
100
2 equiv. iPrNH2
H2O, k.t., 2 h
H
H
N
101 (85%)
3.2.3 Poging tot synthese van cis-4-formyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin2-on uitgaande van glyoxal-bis-(N-isopropylimine)
Vervolgens werd het gesynthetiseerde diimine 37 aangewend voor de synthese van cis-4-formyl-1isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 41 via een zogenaamde “one pot”-procedure, bestaande uit twee
stappen.71
In een eerste poging werd diimine 101 opgelost in droge tolueen, waarna 2,2 equivalenten
triëthylamine werden toegevoegd. Vervolgens werden 2,2 equivalenten methoxyacetylchloride,
eveneens opgelost in tolueen, toegedruppeld aan het reactiemengsel.71 Twee uur roeren bij
kamertemperatuur resulteerde in volledige omzetting van diimine 101 (besloten na TLC-analyse),
waarna 14 equivalenten HCl werden toegevoegd in de vorm van een waterige oplossing (1,4 M) en
aansluitend gedurende 1,5 uur geroerd werd. Na opwerking van de reactie werden echter, niet
geheel onverwacht, geen karakteristieke signalen van het beoogde cis-4-formyl-β-lactam 105
teruggevonden. Uit grondige analyse van de verkregen spectrale gegevens kon immers worden
geconcludeerd dat bis-β-lactamen 102 en 103 werden gevormd in een diastereoisomere verhouding
van 90/10. De cis-stereochemie tussen de protonen op de 3- en de 4-plaats van de vierring werd
bevestigd door 1H-NMR-analyse, waar vicinale koppelingsconstanten bekomen werden van 5,5 Hz
voor major 102 en 3,3 Hz voor minor 103, dewelke overeenstemmen met hetgeen reeds in de
literatuur beschreven is over gelijkaardige bis-β-lactamen (3,3-5,4 Hz).71 Naast deze analyse werd de
vorming van bis-β-lactamen 102 en 103 eveneens bevestigd via LC-MS, waarin de massa van deze
verbindingen, 285 (M++1), waargenomen werd. Uit hetgeen te vinden is in de literatuur kan worden
besloten dat (3R*,3’R*,4S*,4’S*)-4-4’-bis(1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on) 102 het meest
gevormd wordt in deze reactie en bijgevolg het major-diastereoisomeer kan genoemd worden.71
Er is dus, na de initiële vorming van de eerste β-lactamkern in 1-isopropyl-3-methoxy-4-[(E)-(Nisopropylimino)methyl]azetidin-2-on 101 een tweede vierring gevormd met de iminefunctie in de
zijketen van de eerste ring.71 Dit is mogelijk daar hiervoor voldoende zuurchloride aanwezig was in
het reactiemengsel.
30
Bespreking van de resultaten
O
1) 2 equiv. MeO
N
H
H
N
Cl
O
2,2 equiv. Et3N
tolueen, k.t., 2 h
MeO
2) 14 equiv. HCl (1,4 M)
k.t., 1,5 h
H H
N
H H
H H
MeO
N
N
OMe
H H
O
102
H H
+
OMe
O
101
MeO
O
N
103
102/103 = 90/10
(39%)
N
H
N
O
104
Teneinde de vorming van bis-β-lactamen 102 en 103 te onderdrukken, werd in een tweede poging
het aantal equivalenten methoxyacetylchloride gehalveerd. Deze reactie gaf wel aanleiding tot het
beoogde cis-4-formyl-β-lactam 105. Er dient evenwel opgemerkt te worden dat de vorming van bisβ-lactamen 102 en 103 niet kon vermeden worden. Na de eerste reactiestap bestond het
reactiemengsel immers uit cis-4-imidoyl-β-lactam 104, diimine 101 en bis-β-lactamen 102 en 103.
Tijdens de hydrolysestap werd 4-imidoyl-β-lactam 104 volledig omgezet tot het vooropgestelde 4formyl-β-lactam 105, en diimine 101 werd terug glyoxal 100, hetgeen tijdens de waterige opwerking
verwijderd werd wegens zijn hoge oplosbaarheid in water. Naast signalen van deze verbindingen
bevatte het 1H-NMR-spectrum (CDCl3) ook signalen van andere, niet toegewezen verbindingen. Dit
zijn mogelijks afbraakverbindingen van het onstabiele 4-formyl-β-lactam 105 die gevormd worden
tijdens indampen van tolueen, hetgeen gebeurt bij relatief hoge temperatuur. Dit kan verklaren
waarom het aandeel 4-formyl-β-lactam 105 in het mengsel laag is na indampen.
O
1) 1 equiv. MeO
N
H
H
N
Cl
1,2 equiv. Et3N
tolueen, k.t., 2 h
2) 14 equiv. HCl (1,4 M)
k.t., 1,5 h
(49%)
101
MeO
H H
O
O
O
H
N
O
+
H
H
+
MeO
O
H H
N
N
H H
OMe
O
105
102
100
+
MeO
H H
105/100/102/103 = 17/2/36/4
N
O
H
N
MeO
H H
O
N
N
H H
OMe
O
104
103
31
Bespreking van de resultaten
Aangezien deze laatste ingreep geen aanleiding gaf tot selectieve synthese van cis-4-formyl-β-lactam
105, kan worden besloten dat deze strategie wellicht altijd mengsels van verbindingen 105, 102 en
103 zal opleveren. Scheiding m.b.v. kolomchromatografie (SiO2) was eveneens geen oplossing om
zuiver aldehyde 105 te bekomen aangezien de niet toegekende onzuiverheden uit het 1H-NMRspectrum niet van het beoogde product konden gescheiden worden. Bijgevolg wordt besloten dat
verdere optimalisatie noodzakelijk zal zijn teneinde de beoogde racemische cis-4-cyaanmethyl-βlactamen 16 te bekomen.
32
Bespreking van de resultaten
3.3 Enzymatische
hydrolyse
van
(3R,4S)-4-
(cyaanmethyl)azetidin-2-onen
Er zijn in de literatuur twee klassen van enzymen beschreven die nitrilfuncties kunnen
hydrolyseren.80 Enerzijds gaat het om nitril-hydrolasen of nitrilasen (EC 3.5.5.1), dewelke in deze
Masterproef zullen gebruikt worden, en anderzijds om nitril-hydratasen (EC 4.2.1.84). Nitrilasen
zullen de nitrilfunctie in 106 omzetten in een carbonzuurgroep in 107, met gebruik van water en
uitstoot van ammoniak. In tegenstelling tot deze enzymen zullen nitril-hydratasen nitril 107 omzetten
in een amide 108, met uitstoot van water, zonder dit verder te hydrolyseren. Amidasen kunnen
vervolgens dit amide omzetten tot het overeenkomstige carbonzuur 107, opnieuw met gebruik van
water en uitstoot van ammoniak.81,82 Een voorbeeld van het gebruik van deze enzymen in de
industrie is de biokatalytische omzetting van acrylonitril tot acrylamide m.b.v. nitril-hydratasen.83
R C N + H2O
106
O
Nitrilase
R
OH
+ NH3
107
O
Nitril-hydratase
R
Amidase
NH2
108
H2O
In deze sectie wordt beschreven hoe de gesynthetiseerde nitrillen 13a en 13b gehydrolyseerd
kunnen worden tot de overeenkomstige carbonzuren 17a en 17b. De enzymen die zullen gebruikt
worden zijn beschikbaar in de nitrilase screening kit van Codexis.84 In een eerste fase van dit
onderzoek zal, op analytische schaal, gezocht worden naar het enzym of de enzymen die het best
geschikt zijn om de omzetting van substraten 13 uit te voeren. Later zal de omzetting
geoptimaliseerd worden gebruik makende van het meest geschikte enzym. Een laatste luik bestaat
erin deze biokatalytische omzetting op te schalen teneinde een bepaalde hoeveelheid van
carbonzuren 17 te bekomen.
Sinds de ontdekking van het eerste nitrilase in de vroege jaren 1960,85 werd reeds veel onderzoek
verricht naar het werkingsmechanisme van deze groep enzymen. Er werd aangetoond dat een
belangrijk deel van het katalytisch centrum, essentieel voor de werking, bestaat uit drie aminozuren:
glutaminezuur, lysine en cysteïne.85 Waar Glu en Lys via niet-covalente bindingen het substraat op
zijn plaats houden, zal Cys met zijn thiolgroep deelnemen aan de hydrolysereactie van het nitril.
Algemeen wordt aanvaard dat deze groep een nucleofiele aanval uitoefent op het nitril, met de
generatie van een thiomidaatintermediair 109. Vervolgens zal tweemaal nucleofiele additie van
water en eliminatie van ammoniak leiden tot carbonzuur 17.86
33
Bespreking van de resultaten
H H
R2O
S
R
N
O
CN
R1
R2O
Nitrilase-P1-121
MeOH/Fosfaatbuffer (1/19), pH 7,5, 30°C, 200 rpm
H H
S
R
N
R1
O
13
COOH
17
H2O
R2O
H H
R
S-Enzym
H2O
N
R1
H H
R
S
O
R2O
N
NH
109
S
O
R1
OH
S-Enzym
NH2
110
R2O
H H
R
NH3
S-Enzym
S
N
O
R1
O
111
3.3.1 Clusterscreening
De gebruikte enzymkit bestaat uit twaalf verschillende nitrilasen. Onderzoek naar welk(e) van deze
enzymen het meest geschikt is (zijn) voor de hydrolyse van substraten 13 start met een zogenaamde
clusterscreening. In dit onderzoek worden de twaalf enzymen willekeurig verdeeld in vier groepen
van elk drie enzymen.
Voor de enzymatische omzettingen werd gebruik gemaakt van een solventsysteem bestaande uit een
waterige fosfaatbuffer en methanol in een 95/5-verhouding. Methanol werd toegevoegd teneinde de
oplosbaarheid van de slecht wateroplosbare verbindingen 13 te verhogen. De fosfaatbuffer (pH 7,5)
zorgde voor de ideale omstandigheden voor het enzym om te werk te gaan. Deze werd net als de
enzymen geleverd door Codexis.84 Het onderzoek naar het juiste solventsysteem gebeurde in een
gelijkaardige Masterproef tijdens vorig academiejaar.87
Om deze clusterscreening uit te voeren werd een 10 mM oplossing gemaakt van de substraten 13 in
0,5 ml van het eerder beschreven solventsysteem, waarna van elk enzym 2 mg/ml toegevoegd werd
en vervolgend werden de reactiemengsels bij 30°C en 200 rpm geïncubeerd. Op geregelde tijdstippen
werden stalen genomen, dewelke geanalyseerd werden via LC-MS teneinde de omzettingsgraad te
kunnen kwantificeren. Voor deze stalen werd een kleine hoeveelheid van het reactiemengsel
genomen, waarna de enzymen geïnactiveerd werden door een hittebehandeling (5 min bij 95°C).
Tien maal verdunnen in methanol en centrifugatie (5 min bij 14000 rpm) leverden een helder
supernatans met substraten 13 en producten 17. Naast de reactiemengsels met enzymen werd ook
een zogenaamde blanco geïncubeerd, dewelke hetzelfde bevat als de reacties maar geen enzymen.
34
Bespreking van de resultaten
Deze incubatie leert meer over de stabiliteit van de verbindingen 13 bij de incubatie- en inactivatieomstandigheden.
Een overzicht van de gebruikte enzymen wordt, samen met de geobserveerde omzettingsgraden,
weergegeven in Tabel 8.
Tabel 8: Clusterscreening voor de enzymatische hydrolyse van 4-cyaanmethyl-β-lactamen 13
13a → 17a
R = iPr, R2 = Me
13b → 17b
R = nBu, R2 = Ph
Omzettinga (%) na
Omzettinga (%) na
1
Groep
a
Enzymen
1
1d
4d
1d
4d
I
NIT-P1-121, NIT-104, NIT-102
16
33
13
38
II
NIT-103, NIT-P1-120, NIT-106
6
11
11
15
III
NIT-P1-126, NIT-111, NIT-P1-130
5
8
11
16
IV
NIT-P1-122; NIT-P1-118, NIT-105
9
12
9
11
Op basis van LC-MS-analyse.
Uit de gegevens in Tabel 8 blijkt dat voor beide verbindingen 13 groep I de beste omzettingen
leverde. Om deze reden werd besloten om de drie enzymen van deze groep in aparte reacties los te
laten op de substraten teneinde te besluiten welk van de drie enzymen de hoogste activiteit haalt.
LC-MS-analyses van de blanco-incubatie toonde aan dat er doorheen de tijd enkel substraat 13
aanwezig was. Hieruit wordt besloten dat gedurende de tijd van de clusterscreening het substraat
stabiel is bij de gegeven omstandigheden, zijnde het solventsysteem, de pH en de temperatuur en
dat substraten 13 de inactivatietemperatuur van 95°C weerstaan.
Naast deze waarnemingen dient ook vermeld te worden dat de enzymatische omzetting van
substraten 13 trager verloopt in vergelijking met hetgeen bekomen werd in voorgaand onderzoek in
de vakgroep Biochemische & Microbiële Technologie (Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen,
Universiteit Gent), waar al na minder dan een dag een omzettingsgraad van 100% werd bereikt.28 Dit
grote verschil in reactiesnelheid kan verklaard worden door de structuur van de substraten uit deze
Masterproef 13 en uit het eerder onderzoek 112 te vergelijken.
R2O
H H
S
R
N
O
13
R1
CN
N
CN
R
112 (R = H, 4-Cl)
35
Bespreking van de resultaten
In deze Masterproef wordt gewerkt met cyaanmethyl-β-lactamen 13. Twee structurele eenheden uit
deze verbindingen, namelijk de grote β-lactamring en de ene methyleengroep tussen deze ring en de
nitrilfunctie, zorgen ervoor dat deze verbindingen zich maar moeilijk kunnen ruimtelijk ordenen,
opdat ze goed in het katalytisch centrum van het enzym zouden passen, en zich niet correct kunnen
oriënteren in deze actieve site om katalyse toe te laten. Dit is in tegenstelling tot structuren 112,
waar de kern van de verbinding een aziridinering betreft, dewelke kleiner is dan een β-lactam.
Anderzijds bevinden er zich tussen de driering en de nitrilfunctie twee methyleengroepen, waardoor
de vrije draaibaarheid en ruimtelijke vervorming van deze keten gemakkelijker wordt. Om deze
redenen kan deze molecule zich beter oriënteren in het katalytisch centrum van het enzym teneinde
vlot omgezet te worden tot het overeenkomstige carbonzuur.
3.3.2 Enzymatische hydrolyse van 4-cyaanmethyl-β-lactamen
Voor de volgende testreacties werd te werk gegaan op een gelijkaardige manier als bij de
clusterscreening. Opnieuw werd 10 mM substraat 13 opgelost in 0,5 ml van het solventsysteem.
Vervolgens werd in elk epje één van de drie enzymen toegevoegd, waarna deze reacties geïncubeerd
werden bij 30°C en 200 rpm. Aangezien uit vorige analyse bleek dat na vier dagen nog maar een klein
deel van het substraat was omgezet, werd vanaf deze testreactie de enzymconcentratie verdubbeld
tot 4 mg/ml, teneinde sneller een omzettingsgraad van 100% te bekomen. Naast deze drie reacties
werd ook opnieuw een blanco geïncubeerd. Op geregelde tijdstippen werd een staal genomen en
geanalyseerd met LC-MS zoals eerder beschreven. De resultaten die bekomen werden in deze
testreacties worden weergegeven in Tabel 9.
Tabel 9: Enzymatische hydrolyse van 4-cyaanmethyl-β-lactamen 13 m.b.v. de enzymen uit groep I
13a → 17a
R = iPr, R2 = Me
13b → 17b
R = nBu, R2 = Ph
Omzettinga (%) na
Omzettinga (%) na
1
Enzym
a
1
1d
4d
1d
4d
NIT-P1-121
25
80
23
64
NIT-104
3
7
0
2
NIT-102
0
0
0
0
Op basis van LC-MS-analyse.
Op basis van Tabel 9 kan besloten worden dat de hydrolyse van nitrillen 13 tot carbonzuren 17
hoofdzakelijk gekatalyseerd wordt door NIT-P1-121. Bijgevolg werd voor volgende analyses enkel
36
Bespreking van de resultaten
gebruik gemaakt van dit enzym. Opnieuw toonde analyse van de blanco aan dat de substraten stabiel
zijn in de gegeven omstandigheden. Dit is volledig in overeenstemming met resultaten bekomen in
voorgaand onderzoek aan de vakgroep Biochemische & Microbiële Technologie (Faculteit Bioingenieurswetenschappen, Universiteit Gent), echter niet met exact dezelfde verbinding maar met
een variant (R1 = iPr, R2 = Bn).28
Naast voorgaand besluit dient ook te worden opgemerkt dat deze enzymatische omzettingen zeer
traag verlopen. De omzettingsgraad in deze testreacties m.b.v. NIT-P1-121 wordt, doorheen de tijd
gemeten, voor het eerste derivaat 13a (R1 = iPr, R2 = Me) weergegeven in Figuur 1.
R1 = i Pr, R2 = Me
Omzettingsgraad (%)
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tijd (d)
Figuur 1: Overzicht van de omzettingsgraad (op basis van LC-MS-analyse)
van de enzymatische hydrolyse van nitril 13a m.b.v. NIT-P1-121 doorheen de tijd
Uit Figuur 1 kan worden besloten dat de reactiesnelheid van deze omzetting niet constant is in de tijd
maar stelselmatig afneemt. Voor het tweede derivaat 13b (R1 = nBu, R2 = Ph) wordt een gelijkaardig
patroon geobserveerd, maar verloopt de reactie trager en wordt volledige omzetting pas bekomen
na tien dagen reactie. Dit kan te wijten zijn aan de aromaat in de structuur, waardoor het substraat
enerzijds moeilijker naar de waterige fase zal gaan en anderzijds, wegens de grotere structuur,
moeilijker in het katalytisch centrum van het enzym zal passen.
Tijdens deze reactie werd gewerkt met een hoge enzymconcentratie van 4 mg/ml. Het is mogelijk dat
substraten 13 slecht oplossen in het solventmengsel waardoor te weinig van deze verbindingen
aanwezig is om het enzym volledig te satureren. Ook is het zo dat bij substraatconcentraties onder
de KM van het enzym, de reactiesnelheid aanzienlijk zal afnemen. Bovendien is het mogelijk dat de
enzymen een deel van hun stabiliteit verliezen bij de gebruikte incubatieomstandigheden. Dit laatste
kan worden onderzocht door niet alle enzym van in het begin toe te voegen en later extra enzym toe
37
Bespreking van de resultaten
te voegen op vooraf bepaalde tijdstippen tijdens de incubatie. Dit zal in volgende paragraaf
beschreven worden.
3.3.3 Verdere testreacties teneinde het verhogen van de reactiesnelheid
Aangezien uit Figuur 1 blijkt dat na twee dagen al 50% omzetting en acht dagen ongeveer 100%
omzetting bereikt wordt, werd besloten om bij de start van de reactie slechts een kwart van de
enzymhoeveelheid toe te voegen, m.a.w. 1 mg/ml i.p.v. 4 mg/ml, en om de twee dagen opnieuw een
kwart toe te voegen, zodat zes dagen na de start van de reactie de volledige enzymhoeveelheid
aanwezig was. De rest van de proefopzet was identiek aan de in vorige paragraaf beschreven
proefopzet, met als enige verschil dat voor deze testreactie enkel enzym NIT-P1-121 gebruikt werd.
Naast deze reactie werd ook een reactie gestart waarbij van bij de start de volledige
enzymhoeveelheid werd toegevoegd. Deze laatste reactie is bijgevolg helemaal analoog aan deze
beschreven in voorgaande paragraaf. De resultaten worden weergegeven in Figuur 2, opnieuw voor
het eerste derivaat 13a (R1 = iPr, R2 = Me).
R1 = i Pr, R2 = Me
Omzettingsgraad (%)
100
80
60
40
20
0
0
100% enzym bij start
25% enzym om de 2 d
1
2
3
4
5
6
7
Tijd (d)
Figuur 2: Overzicht van de omzettingsgraad (op basis van LC-MS-analyse) van de
enzymatische hydrolyse van nitril 13a m.b.v. NIT-P1-121 doorheen de tijd.
Vergelijking tussen de twee strategieën van enzym toevoegen.
Uit de gegevens in Figuur 2 blijkt dat de resultaten van de reactie waarbij al het enzym van in het
begin toegevoegd werd, overeenkomt met de resultaten, dewelke werden weergegeven in Figuur 1.
Indien om de twee dagen nieuw enzym wordt toegevoegd, is te zien dat initieel de reactie trager
verloopt, hetgeen logisch is want er is minder enzym aanwezig, maar heel belangrijk is het feit dat de
reactiesnelheid nu nagenoeg constant blijft en dat 100% omzetting bekomen wordt na vijf dagen
38
Bespreking van de resultaten
reactie in plaats van acht. Dit impliceert dat de laatste toevoeging van het enzym, die gepland was na
zes dagen, niet meer nodig was.
De reactiesnelheid van de tweede testreactie mag dan wel lager zijn, er werd verwacht dat deze vier
keer lager zou zijn aangezien initieel slechts een kwart van de enzymhoeveelheid werd toegevoegd.
Dit is niet het geval: de snelheid is slechts ongeveer 20% lager. Ook werd verwacht dat deze
reactiesnelheid zou verdubbelen na twee dagen, aangezien op dat moment vers enzym werd
toegevoegd. De reactiesnelheid blijft nagenoeg constant tot wanneer 100% omzetting werd bereikt,
hetgeen niet voorkomt bij een reactie met een kinetiek van de eerste orde, waartoe de meeste
enzymatische reacties behoren.88,89 Hieruit werd besloten dat deze omzetting ook beïnvloed wordt
door andere achterliggende fenomenen, dewelke hier niet nader verklaard werden.
Voor het tweede derivaat 13b (R1 = nBu, R2 = Ph) waren de resultaten zeer gelijkaardig: initieel is de
reactie trager maar de reactiesnelheid blijft nagenoeg constant. Wel dient te worden opgemerkt dat
in dit geval wel de volledige enzymhoeveelheid – vier toevoegingen van een kwart van de
enzymhoeveelheid – nodig is om volledige omzetting te bekomen, hetgeen bereikt werd na acht
dagen reactie.
3.3.4 Opschaling
Aangezien uit voorgaande paragraaf blijkt dat 100% omzetting bekomen kan worden in ongeveer een
week, werd besloten om met deze omstandigheden reacties op grotere schaal – 40 mg voor het
eerste derivaat 13a (R1 = iPr, R2 = Me) en 80 mg voor het tweede 13b (R1 = nBu, R2 = Ph) – uit te
voeren. Doorgaans wordt voor een reactie op grotere schaal de enzymconcentratie verkleind,87 maar
aangezien uit voorgaande paragrafen blijkt dat de hydrolyse van nitrillen 13 zeer moeizaam verloopt,
werd besloten om te werken met de eerder gebruikte concentratie van 4 mg/ml. Om evenwel wat
enzym uit te sparen, werd de substraatconcentratie verdubbeld naar 20 mM waardoor relatief
gezien slechts de helft van de enzymhoeveelheid nodig zou zijn. Naast deze wijziging in
substraatconcentratie, werd ook het tijdstip waarop enzym toegevoegd wordt gewijzigd. Aangezien
deze reactie langer zal duren dan de testreacties, wegens de hogere substraatconcentratie, werd om
de drie dagen een kwart van het enzym toegevoegd (i.p.v. om de twee dagen).
Op de negende dag van de reactie, wanneer de laatste keer enzym toegevoegd werd, was nog lang
niet alle substraat omgezet. Bijgevolg werd besloten om de reacties nog langer te laten doorgaan.
Uiteindelijk werd de reactie stopgezet na drie weken voor het eerste derivaat (R1 = iPr, R2 = Me) en na
vier weken voor het tweede (R1 = nBu, R2 = Ph), en dit wegens het tijdsbestek van deze Masterproef.
39
Bespreking van de resultaten
LC-MS-analyse van de blanco- en de reactiestalen toonde aan dat op dat moment de twee
verbindingen, substraten 13 en producten 17, aanwezig waren, zonder vorming van
afbraakproducten.
Na het stopzetten van de reactie werden de enzymen geïnactiveerd door hittebehandeling (10
minuten bij 95°C) en vervolgens verwijderd door centrifugatie (10 min bij 14000 rpm). Uit
gelijklopend onderzoek bleek dat extractie van het waterig supernatans met ethylacetaat moeizaam
verliep wegens veel schuimvorming, hetgeen waarschijnlijk veroorzaakt werd door een minimale
hoeveelheid niet-afgecentrifugeerd enzym.90,91 Om deze reden werd besloten de opwerking geheel
anders uit te voeren: het waterig supernatans na centrigufatie werd rechtstreeks ingedampt onder
vacuüm. De overgebleven fractie, bestaande uit zouten van de buffermix en een mengsel van
substraat 13 en product 17, werd ontdaan van de zouten door de organische verbindingen op te
lossen in methanol. Vervolgens werden substraat en product gescheiden m.b.v. preparatieve HPLC
met een polaire kolom en een mengsel van water en methanol als mobiele fase.
Op basis van ruwe NMR-analyse werd vastgesteld dat de reactie gestopt werd bij 60% omzetting
voor het eerste derivaat (R1 = iPr, R2 = Me) en bij 70% omzetting voor het tweede derivaat (R1 = nBu,
R2 = Ph). De rendementen na zuivering (preparatieve HPLC) bedroegen respectievelijk 16% (17a) en
12% (17b). Zuivering van carbonzuur 17a werd bemoeilijkt door de kleine schaal van het experiment,
waardoor karkaterisatie van dit product niet mogelijk was.
Hoewel in de testreacties volledige omzetting bekomen werd, kon dit initieel niet gerealiseerd
worden op grotere schaal. Het moet evenwel mogelijk zijn om volledige omzetting te bewerkstelligen
door nog meer enzym te gaan gebruiken en door de reacties langer te incuberen. Het tijdsbestek van
deze Masterproef liet dit echter niet toe.
3.3.5 Besluit
Uit de resultaten blijkt dat de omzetting van nitrillen 13 moeizamer verloopt dan in voorgaand
onderzoek met 2-(cyaanethyl)aziridinen 112. Dit heeft tot gevolg dat slechts een kleine hoeveelheid
van de beoogde carbonzuren 17 bekomen werd. Indien de chemische hydrolyse, dewelke
beschreven wordt in volgende paragraaf, wel op een eenvoudige en selectieve manier de
nitrilfuncties gaat hydrolyseren, biedt het aanwenden van enzymen geen voordeel op vlak van
reactiesnelheid. Wel dient te worden opgemerkt dat deze biokatalytische reactie in ieder geval
doorgaat zonder vorming van bijproducten, hetgeen zeker een belangrijk voordeel is.
40
Bespreking van de resultaten
3.4 Chemische hydrolyse van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2onen
Naast de enzymatische hydrolyse van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13, is het ook nuttig
om te onderzoeken of chemische hydrolyse, hetzij in zure, hetzij in alkalische omstandigheden,
mogelijk is voor de selectieve synthese van (3R,4S)-4-(carboxymethyl)azetidin-2-onen 17.
3.4.1 Pogingen tot zure hydrolyse van (3R,4S)-1-butyl-4-cyaanmethyl-3fenoxy-azetidin-2-on
(3R,4S)-1-Butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxyazetidin-2-on 13b werd opgelost in water waarna 11
equivalenten HCl (3 M) en 45 equivalenten HOAc (6 M) werden toegevoegd. Vervolgens werd het
reactiemengsel gedurende een bepaalde tijd bij een bepaalde temperatuur geroerd, waarna
geneutraliseerd
werd
natriumbicarbonaat.92
met
Een
overzicht
van
de
geteste
reactieomstandigheden met bijhorende waarnemingen wordt weergegeven in Tabel 10.
11 equiv. HCl (3 M)
45 equiv. HOAc (6 M)
H H
O
R
S
CN
x
N
R
S
COOH
N
H2O, temp., tijd
O
H H
O
O
13b
17b
Tabel 10: Pogingen tot zure hydrolyse van
(3R,4S)-1-butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxyazetidin-2-on 13b
a
b
Temp.
Tijd
Waarneming
k.t.
14 d
Geen reactiea
Δ
1 week
Complex mengselb
Op basis van LC-MS-analyse
Op basis van 1H-NMR- en LC-MS-analyse
3.4.2 Pogingen tot alkalische hydrolyse van (3R,4S)-1-butyl-4-cyaanmethyl3-fenoxy-azetidin-2-on
(3R,4S)-1-Butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxyazetidin-2-on
13b
werd
in
aanwezigheid
van
vijf
equivalenten kaliumhydroxide opgelost in een solventmengsel bestaande uit ethanol en water met
een welbepaalde verhouding. Vervolgens werd het reactiemengsel gedurende een bepaalde tijd bij
een bepaalde temperatuur geroerd, waarna geneutraliseerd werd met HCl (1 M).87 Een overzicht van
41
Bespreking van de resultaten
de geteste reactieomstandigheden met bijhorende waarnemingen wordt weergegeven in Tabel 11.
De reacties werden opgevolgd met LC-MS tot wanneer het substraat niet meer gedetecteerd werd,
behalve voor de reactie bij kamertemperatuur, die na tien dagen werd stopgezet wegens het
tijdsgebrek in deze Masterproef.
H H
O
R
S
5 equiv. KOH
CN
x
N
EtOH/H2O, temp., tijd
O
13b
H H
O
R
S
COOH
N
O
17b
Tabel 11: Pogingen tot alkalische hydrolyse van
(3R,4S)-1-butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxyazetidin-2-on 13b
EtOH / H2O
Temp.
Tijd
Waarneming
3/1
k.t.
10 d
Geen reactiea
3/1
Δ
8h
Complex mengselb
5/1
100 °C (mwc)
15 min
Complex mengselb
a
Op basis van LC-MS-analyse
Op basis van 1H-NMR- en LC-MS-analyse
c
mw = reactie in microgolfreactor
b
3.4.3 Besluit
Op basis van de resultaten in Tabel 10 en Tabel 11 kan worden besloten dat zowel zure als alkalische
omstandigheden geen oplossing bieden voor selectieve hydrolyse van de nitrilfunctie in (3R,4S)-1butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxy-azetidin-2-on 13b. Bij de geobserveerde omstandigheden werd ofwel
volledige afbraak, zonder detectie van het gewenste product 17b via LC-MS, ofwel geen reactie
waargenomen. De reacties die afbraak van het substraat teweegbrachten, leverden waarschijnlijk
hydrolyse van de gevoelige β-lactamring, hetgeen besloten werd m.b.v. IR-analyse: het signaal bij
ongeveer 1740 cm-1, karakteristiek voor β-lactamen, werd niet meer waargenomen. Uit deze
gegevens kan besloten worden dat biokatalyse zeker een voordeel biedt voor de selectieve
omzetting van bepaalde functionele groepen aanwezig in chemisch reactieve substraten zoals
gespannen azaheterocyclische systemen.
42
Bespreking van de resultaten
3.5 Toekomstperspectief
3.5.1 Synthese van cis-4-formylazetidin-2-onen
Aangezien de vooropgestelde racemische synthese van cis-4-cyaanmethyl-β-lactamen 50 niet kon
worden afgewerkt binnen het tijdsbestek van deze Masterproef, behoort het onderzoek tot de
synthese van deze klasse der verbindingen tot toekomstig werk. In een eerste stap dient onderzoek
verricht te worden naar het bekomen van zuiver cis-4-imidoyl-β-lactam 40 en cis-4-formyl-β-lactam
41, waarna reeds gekende reacties kunnen toegepast worden voor de synthese van de gewenste
racemische doelverbinding 50.
O
H
MeO
H
O
100
H H
N
H
MeO
N
O
H H
O
H
N
O
104
MeO
H H
CN
N
O
105
MeO
H H
COOH
N
O
16a
18a
Vervolgens kan racemisch nitril 16a geanalyseerd worden m.b.v. chirale chromatografie, waarna ook
het chirale nitril 13a door dezelfde kolom kan gestuurd worden. Door het vergelijken van de twee
chromatogrammen kan dan bevestigd worden of de syntheseroute, beschreven in Sectie 3.1,
effectief verloopt zonder racemiserende tussenstappen.
Een tweede onderzoek met het racemische nitril 16a kan zijn om ook dit nitril door het NIT-P1-121
enzym om te zetten tot het overeenkomstige carbonzuur 18a. Vergelijken van de reactiesnelheid van
deze omzetting met de reactiesnelheid van de uitgevoerde reactie met de chirale verbindingen, zal
meer info geven i.v.m. de eventuele enantioselectiviteit van het enzym.
3.5.2 Reactiviteitsstudie van (3R,4S)-4-(carboxymethyl)azetidin-2-onen
De bekomen (3R,4S)-4-(carboxymethyl)azetidin-2-onen 17 kunnen uiteindelijk onderworpen worden
aan een uitgebreide reactiviteitsstudie. Deze β-lactamen 17 zouden, m.b.v. monochlooralaan,
kunnen gereduceerd worden tot de overeenkomstige azetidinen 19, dewelke in dit geval
“constrained β-amino acids” genoemd mogen worden gezien de aanwezigheid van een amine- en
carbonzuurfunctie, gescheiden door twee methyleengroepen. Deze verbindingen zouden verder
kunnen gebruikt worden in de synthese van allerlei doelverbindingen, zoals δ-lactonen 114.
43
Bespreking van de resultaten
Ook zou het interessant kunnen zijn om 4-cyaanmethyl-β-lactamen 13 eerst te reduceren met de
vorming van azetidine 113, hetgeen een aminonitrilfunctiebevat, waarvan de α-aminonitrillen
bekend zijn als intermediair in de Strecker-aminozuursynthese.93 Azetidine 113 zou vervolgens na
enzymatische hydrolyse opnieuw aanleiding zou kunnen geven tot carbonzuur 19. Aangezien een
azetidine een minder stugge ruimtelijke structuur heeft dan een β-lactam bestaat de kans dat deze
laatste enzymatische omzetting sneller zou verlopen.
Een andere mogelijkheid is het ontwikkelen van een reactiesequentie ter vorming van bicyclisch βlactamen 23, hetgeen ook al besproken werd in het hoofdstuk “Situering en doel”.
H H
R2O
CN
S
R
N
O
AlH2Cl
R2O
H H
S
R
N
R1
13
CN
R1
nitrilase
113
O
AlH2Cl
H H
R2O
O
O
R1
S
R
N HO
R1
19
SOCl2
H H
R2O
N
O
Cl
R1
O
OH
S
N
OR2
114
20
H H
R
N
H
R
S
R
O
R2O
S
R1
Pd/C
(R2 = Bn)
O
17
H H
HO
Cl
S
R
N
O
R1
O
O
O
21
H
Pd/C
(R2 = Bn)
N
H H
HO
OH
N
O
R1
O
H
R1
23
S
R
RS
O
22
3.5.3 Synthese en hydrolyse van 4-cyaanethyl-β-lactamen
In deze Masterproef werd gefocust op de synthese van 4-cyaanmethyl-β-lactamen 13, gevormd via
een nucleofiele substitutiereactie van 4-(joodmethyl)azetidin-2-onen 99 met natriumcyanide. Deze
44
Bespreking van de resultaten
laatste stap zou echter vervangen kunnen worden door een reactie met trimethylsilylacetonitril 115
in basische omstandigheden, dewelke gegenereerd zouden kunnen worden door het inzetten van
natriumhydride. In een tweede reactiestap zou het reactiemengsel kunnen worden toegevoegd aan
een verzadigde kaliumcarbonaatoplossing, hetgeen aanleiding zou kunnen geven tot de vorming van
4-cyaanethyl-β-lactamen 116.
1) NaH
H H
R2O
R
R
N
O
99
R1
I
TMS
CN 115
2) K2CO3, MeOH
H H
R2O
R
S
N
O
CN
Enzymatische hydrolyse
H H
R2O
R1
116
R
N
O
COOH
S
R1
117
Vervolgens zouden ook deze verbindingen 115 onderworpen kunnen worden aan een enzymatische
hydrolyse met het oog op de synthese van de overeenkomstige carbonzuren 117.
45
46
4 SAMENVATTING EN BESLUIT
β-Lactamen zijn azaheterocyclische verbindingen die om verscheidene redenen een veelbesproken
onderwerp vormen binnen het domein van de organische chemie. Enerzijds zijn er hun alom
bekende antibacteriële activiteit en hun andere medische toepassingen waaronder bestrijding van
malaria, tumoren, etc. Anderzijds kunnen ze ook worden ingezet in de synthese van een brede
waaier aan interessante, biologisch waardevolle stikstofhoudende organische verbindingen (“βlactam synthon method”). In deze Masterproef werd een synthese van chirale cis-4-cyaanmethyl-βlactamen uitgevoerd, waarna deze m.b.v. nitrilasen gehydrolyseerd werden met vorming van cis-4carboxymethyl-β-lactamen. Tevens werd de aanzet gegeven voor een racemische synthese van
dezelfde cis-4-cyaanmethyl-β-lactamen.
4.1 Samenvatting
De synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen xi startte met een perjodaat-geïnduceerde
oxidatieve splitsing van het commercieel beschikbare 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol,
waarna het bekomen aldehyde i geïmineerd werd m.b.v. primaire aminen ii, hetgeen aanleiding gaf
tot de vorming van (E)-N-[((4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl)methylideen]aminen iii. Deze iminen
iii werden vervolgens ingezet in de Staudingersynthese teneinde β-lactamen v te bekomen. Deze
reactie gebeurde in aanwezigheid van zuurchloriden iv en triëthylamine als base. De zes reacties die
hierna volgden betroffen allemaal modificaties in de zijketen gebonden aan het koolstofatoom op de
4-plaats van de β-lactamkern. Een eerste stap omvatte de zure hydrolyse van de acetaaleenheid in βlactamen v met vorming van diolen vi, dewelke vervolgens werden omgezet tot alcoholen vii door
achtereenvolgende
oxidatie
m.b.v.
natriumperjodaat
en
selectieve
reductie
m.b.v.
natriumboorhydride. In het laatste deel van deze syntheseroute werd de alcoholfunctie geactiveerd
door tosylering, waarna de tosyloxygroep van verbindingen ix achtereenvolgens gesubstitueerd werd
door een jodide-anion en een cyaangroep.
Een tweede doel in deze syntheseroute omvatte het terugdringen van het gebruik van
gehalogeneerde solventen om chemische synthese te bedrijven op een milieuvriendelijke en
duurzame manier. Om deze reden werden vijf van de negen reacties, dewelke in de literatuur
beschreven zijn in dichloormethaan, ook uitgebreid getest in andere solventen. Voor de synthese van
β-lactamen v, de Staudingersynthese, werden de beste resultaten nog altijd behaald in
47
Samenvatting en besluit
dichloormethaan, terwijl voor de andere reacties bleek dat deze ook in tetrahydrofuran het
gewenste product opleverden in gelijkaardige rendementen.
O
O
R
H
1 equiv. R1NH2 ii
2 equiv. MgSO4
O
H
O
O
CH2Cl2 of THF, k.t., 2 h
1
O
S
H
1,3 equiv. R2O
3 equiv. Et3N
H
N
CH2Cl2, 0°C
Cl
iv
R
k.t., 16 h
R
iii (72-89%)
i
R
R2O
H H
R
N
N
R1
O
vii (62-82%)
a (R1 = iPr, R2 = Me)
b (R1 = nBu, R2 = Ph)
S
R
S
N
O
CN
R1
xi (53-59%)
4 equiv. Et3N
0,1 equiv. DMAP
1,5 equiv. TsCl
OH
N
R1
O
viii (82-91%)
H H
R2O
THF / H2O (1/1), , 4-6 h
R1
H H
R
, 1-2 h
MeOH, 0°C
R1
vi (84-89%)
R2O
2 equiv. NaBH4
H
N
O
O
H
1 equiv. pTsOH·H2O
S
O
O
R
S
v (89-94%)
Methode A
OH
2 equiv. NaIO4
2O H H
R
OH
CH2Cl2 of THF/verz. NaHCO3 (15/1), < 25°C, 2-16 h
S
Methode B
2,3 equiv. NaIO4
0,4 equiv. NaHCO3 (v)
CH2Cl2 of THF/verz. NaHCO3 (25/1), < 25°C, 2-16 h
O
H HS
R2O
2,5 equiv. NaCN
CH2Cl2 of THF, , 6-48 h
H H
R2O
R
S
OTs
N
O
R1
ix (58-67%)
H H
R2O
R
DMF, k.t., 72 h
R
N
O
R1
I
4 equiv. NaI
aceton, , 40 h
x (69-75%)
Naast deze chirale benadering, dewelke verloopt volgens de “chiral pool”-strategie, werd gepoogd
dezelfde cis-4-cyaanmethyl-β-lactamen xi ook racemisch te bekomen voor één van de twee
gesynthetiseerde derivaten. De meeste vooruitgang werd bekomen na iminering van glyoxal xii,
hetgeen aanleiding gaf tot diimine xiii. Vanuit dit diimine xiii werden verschillende manieren
aangesproken voor de synthese van cis-4-formyl-β-lactamen xvii, dewelke een intermediair vormen
in de chirale synthese. Het bekomen van deze verbindingen was echter niet evident, aangezien
verschillende reactieomstandigheden leidden tot verschillende verbindingen. Behandeling van
diimine xiii met twee equivalenten zuurchloride iva leverde, eveneens via de Staudingersynthese,
bis-β-lactamen xiv en xv, terwijl reactie met één equivalent zuurchloride iva aanleiding gaf tot cis-4imidoyl-β-lactam xvi als intermediair, hetgeen in zure omstandigheden gehydrolyseerd werd met
vorming van cis-4-formyl-β-lactam xvii. Bij deze syntheseroute dient te worden opgemerkt dat geen
van de verbindingen xvi en xvii kon worden gezuiverd m.b.v. kolomchromatografie (SiO2 of “reversed
phase”-silica), waardoor verdere optimalisatie van deze racemische syntheseroute noodzakelijk is.
48
Samenvatting en besluit
2,2 equiv. Et3N
O
2 equiv. MeO
O
O
Cl
iva MeO
H H
N
tolueen, k.t., 2 h
N
H H
+ MeO
OMe
N
xiv
O
H
2 equiv. iPrNH2
H
H2O, 0°C, 1-2 h
O
xii
N
H
H
H H
OMe
Cl
iva
xv
xiv/xv = 90/10
(39%)
MeO
H H
N
H
N
tolueen, k.t., 2 h
N
N
O
O
1,2 equiv. Et3N
O
1 equiv. MeO
H H
O
xvi
xiii (85%)
MeO
H H
O
H
N
14 equiv. HCl (1,4 M)
EtOAc, k.t., 1,5 h
O
xvii
De nitrilfunctie in de gesynthetiseerde (3R,4S)-4-cyaanmethyl-β-lactamen xi werd vervolgens
selectief gehydrolyseerd m.b.v. nitrilasen tot de overeenkomstige carbonzuren xviii. Na
clusterscreening bleek dat, van de twaalf gebruikte enzymen, enkel het NIT-P1-121 in staat was om
deze omzetting te katalyseren. Deze reactie gebeurt echter zeer traag, hetgeen te wijten is aan de
stugge structuur van nitrillen xi waardoor deze moeilijk in het katalytisch centrum van het enzym
passen en er zich moeilijk kunnen oriënteren. Om deze reden werd besloten om voor deze omzetting
een hoge concentratie aan enzym, namelijk 4 mg/ml, te gebruiken en om de hoeveelheid enzym niet
volledig van bij de start toe te voegen maar geleidelijk tijdens de reactie. Deze laatste ingreep leverde
een min of meer constante reactiesnelheid waardoor sneller volledige omzetting bekomen werd.
Opschaling van deze testreacties verliep echter moeilijk en na drie of vier weken incubatie werd in dit
geval nog geen volledige omzetting bekomen (60-70%), hetgeen wellicht wel mogelijk zou zijn indien
meer enzym en een langere incubatietijd gebruikt zouden worden.
R2O
H H
S
R
N
O
xi
R1
CN
Nitrilase-P1-121
MeOH/Fosfaatbuffer (1/19), pH 7,5, 30°C, 200 rpm
R2O
H H
R
S
N
O
COOH
R1
xviii
Tot slot werden enkele reactieomstandigheden getest voor de chemische hydrolyse van nitril xib.
Enerzijds werd een alkalische hydrolyse geprobeerd m.b.v. vijf equivalenten kaliumhydroxide met als
solvent een mengsel van ethanol en water. Anderzijds werd een zure hydrolyse geprobeerd m.b.v.
49
Samenvatting en besluit
een mengsel van zoutzuur en azijnzuur. Voor beide omstandigheden leverde een reactie bij
kamertemperatuur geen omzetting en recuperatie van het beginproduct, terwijl reactie bij
refluxtemperatuur leidde tot afbraak van de verbindingen tot een complex mengsel.
H H
O
R
S
N
O
xib
CN
Methode A
5 equiv. KOH
EtOH/H2O, k.t. - , 15 min - 10 d
x
Methode B
11 equiv. HCl (3 M)
45 equiv. HOAc (6 M)
H2O, k.t. - , 7 d - 14 d
H H
O
R
S
COOH
N
O
xviiib
4.2 Besluit
Uitgaande
van
(3R,4S)-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl]-β-lactamen
werden
in
deze
Masterproef twee verschillende (3R,4S)-4-cyaanmethyl-β-lactamen gesynthetiseerd, hetgeen
gebeurde in negen opeenvolgende reactiestappen, startende met het commercieel beschikbare
1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol. Vervolgens werden de bekomen nitrillen enzymatisch
gehydrolyseerd tot de overeenkomstige carbonzuren. Een verdere reactiviteitsstudie zou nieuwe
perspectieven openen naar de synthese van nieuwe verbindingen met potentieel biologische
activiteiten. Gelijkaardige carboxyl-β-lactamen werden reeds in de literatuur beschreven als
precursoren voor bepaalde antibiotica en andere waardevolle verbindingen, hetgeen bleek uit het
hoofdstuk “Literatuuroverzicht” van deze Masterproef.
Hoewel de synthese van bepaalde verbindingen, zoals glyceraldehyde acetonide en het racemisch
cis-4-formyl-β-lactam, reeds in de literatuur beschreven is, bleek uit deze Masterproef dat het niet
altijd evident is om dezelfde of gelijkaardige reacties uit te voeren. Het was eveneens niet evident
om de enzymatische hydrolyse van (3R,4S)-4-cyaanmethylazetidin-2-onen te optimaliseren. Enkel op
analytische schaal werd hier volledige omzetting bekomen. Aangezien chemische hydrolyse niet het
beoogde carbonzuur levert, is het gebruik van nitrilasen voor deze reactie noodzakelijk. Aldus levert
dit Masterproefonderzoek een mooi voorbeeld van de succesvolle combinatie van organische
synthese en biokatalyse.
50
5 EXPERIMENTEEL DEEL
5.1 Analysemethoden
5.1.1 Dunnelaagchromatografie (TLC)
Voor de
analyse
van ruwe
reactiemengsels, controle van de
fracties bekomen na
kolomchromatografie en het bepalen van geschikte eluensmengsels voor kolomchromatografie werd
gebruik gemaakt van dunnelaagchromatografie. Deze analysemethode laat toe om retentiefactoren
(Rf-waarden) van verbindingen te bepalen. Hiervoor werd gebruik gemaakt van silicaplaatjes (Merck
Silicagel 60 F254, precoated, dikte 0,25 mm) met een experimenteel bepaald eluens. De gebruikte
detectiemethoden omvatten belichting met ultraviolet licht en/of kleuring door middel van een
waterige kaliumpermanganaatoplossing.
5.1.2 Preparatieve dunnelaagchromatografie (prep. TLC)
Voor de preparatieve dunnelaagchromatografie (prep. TLC) werd gebruik gemaakt van Analtech
Silicaplaten GF, precoated met UV 254, 20 x 20 cm en met een dikte van 2,0 mm. Voor de detectie
van de componenten werd ultraviolet licht gebruikt.
5.1.3 Kolomchromatografie
Ruwe reactiemengsels werden gezuiverd m.b.v. kolomchromatografie. Als stationaire fase werd
gebruik gemaakt van silicagel (Silicagel 60 (Fluka), deeltjesgrootteverdeling: 70-230 mesh). De
diameter van de gebruikte glazen kolommen was afhankelijk van de hoeveelheid op te zuiveren
product. Het geschikte eluens werd bepaald m.b.v. dunnelaagchromatografie. De uitloopsnelheid
van het solventfront bedroeg ongeveer 5 cm per minuut.
5.1.4 Automatische kolomchromatografie
Naast handmatige kolomchromatografie werd voor zuivering van ruwe reactiemengsels eveneens
gebruik gemaakt van de automatische variant. Dit laatste werd uitgevoerd m.b.v. het Grace
revelerisTM Flash chromatografie systeem. De kolommen met de stationaire fase (“normal
phase”- of “reversed phase”-silica) kunnen meerdere malen opnieuw gebruikt worden
(korreldiameter = 0,040 – 0,063 mm). De uitloopsnelheid van het solventfront hangt af van de
grootte van de kolom. Detectie van de verbindingen gebeurde aan de hand van twee UVdetectoren (254 en 280 nm) en een ELSD-detector (“Evaporative Light Scattering Detector”). Als
51
Experimenteel deel
mobiele fase werd gebruik gemaakt van een mengsel van petroleumether en ethylacetaat
(“normal phase”) of water en methanol (“reversed phase”)
5.1.5 Preparatieve HPLC
De scheidingen met behulp van analytische HPLC-MS werden uitgevoerd met een Agilent 1200 series
LC/MSD SL, uitgerust met een UV detector, een massaspectrometer met elektronspray ionisatie
geometrie (ESI 70 eV) en een quadrupool detector. De scheiding gebeurde in een Supelco Ascentis
Express C18 kolom (L 3 cm x I.D. 4.6 mm) met 2,7 µm fused-core partikels met een poriëngrootte van
90 Å.
5.1.6 NMR-spectroscopie
1
H- en 13C-NMR-spectra werden opgenomen met een Bruker Avance III Nanobay 400 MHz Nuclear
Magnetic Resonance spectrometer (respectievelijk 400 en 100 MHz). De verbindingen werden
hiertoe opgelost in een geschikt gedeutereerd solvent (CDCl3 of (CD3)2SO) met tetramethylsilaan
(TMS) als inwendige standaard in het geval van CDCl3. Het toewijzen van signalen gebeurde m.b.v.
COSY-H-, HSQC-, APT- en DEPT-spectra.
5.1.7 Infraroodspectroscopie
Voor het opnemen van infraroodspectra werd gebruik gemaakt van een Perkin-Elmer Spectrum BX
FT-IR spectrometer. Hiertoe werd telkens een kleine hoeveelheid van het product op een ZnSe-kristal
in ATR (Attenuated Total Reflectance) mode aangebracht.
5.1.8 Massaspectrometrie
Voor het opnemen van massaspectra werd gebruik gemaakt van een Agilent 1100 Series MS (ES,
4000 V) massaspectrometer.
Voor het opnemen van hoge resolutie elektronspray (ES) werd gebruik gemaakt van een Agilent
Technologies 6210 Series “Time-of-Flight” massaspectrometer.
5.1.9 Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie
Voor analyse van reactiemengsels werd gebruik gemaakt van vloeistofchromatografiemassaspectrometrie (LC-MS) met behulp van een Agilent Technologies 1200 Series toestel met UVDAD-detector. De gebruikte kolom was een Zorbax 18 RP of een Supelco Ascentis Express C18 (L 3 cm
x I.D. 4,6 mm; 2,7 µm fused-core partikels met een poriëngrootte van 90 Å) kolom. De gebruikte
52
Experimenteel deel
mobiele fase bestond uit methanol en water. De daarop volgende massaspectrometrie werd
uitgevoerd met behulp van een Agilent 1100 Series MS (ESI, 4000 eV) massaspectrometer met
quadrupool detector.
5.1.10
Gaschromatografie
Voor de bepaling van de zuiverheid van reactiemengsels en het bepalen van diastereoisomere ratio’s
werd gebruik gemaakt van een Delsi DI 200 gaschromatograaf (fused silica, AT-1, L 30 m, I.D. 0,25
mm, filmdikte 0,25 μm, N2 als dragergas, FID, H2-gas).
5.1.11
Smeltpuntbepaling
Het smeltpunt van vaste verbindingen werd bepaald met behulp van een Kofler-smeltbank, type
WME Heizbank van Wagner & Munz. Deze smeltbank bezit een temperatuurgradiënt van 50 tot
260°C. Enkele kristallen werden hiertoe op de koude zijde van de smeltbank aangebracht en
langzaam verschoven naar de warmere zijde tot het smeltpunt bereikt werd. De smeltbank werd
gekalibreerd door verschillende standaarden, elk met een specifiek smeltpunt.
5.1.12
Elementaire analyse
Elementaire analyse van vaste verbindingen werd uitgevoerd met een Perkin-Elmer 2400 Elemental
Analyzer.
5.1.13
Optische rotatie
Optische rotaties van chirale verbindingen werden gemeten met een Jasco P-2000 polarimeter. De
verbindingen werden hiertoe opgelost in chloroform (CHCl3), hetgeen eveneens als blanco diende.
5.1.14
Microgolfreactor
De microgolfreacties werden uitgevoerd in een CEM Discover Benchmate microgolfreactor, voorzien
van SynergyTM-software waarmee temperatuur en tijd van de reactie kunnen worden ingesteld.
Reacties werden uitgevoerd in speciale dikwandige glazen buisjes, voorzien van een aangepast
septum.
5.2 Droge solventen
Dichloormethaan (CH2Cl2) werd gedroogd door middel van destillatie in aanwezigheid van
calciumhydride. Diëthylether (Et2O) en tetrahydrofuran (THF) werden gedestilleerd over
53
Experimenteel deel
natriumdraad in aanwezigheid van benzofenon als indicator voor het droogproces. Tolueen werd
eveneens gedestilleerd over natriumdraad. Aceton werd gedroogd over magnesiumsulfaat en
dimethylformamide (DMF) over moleculaire zeven met een poriëngrootte van 4 Å.
5.3 Beschrijving van de experimenten
5.3.1 Synthese
van
(3R,4S)-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-
yl]azetidin-2-onen 11
Hierna volgt de beschrijving van de synthese van (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3dioxolaan-4-yl]-azetidin-2-on 11b als voorbeeld voor de algemene synthese van (3R,4S)-4-[(4S)-2,2dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl]-azetidin-2-onen 11.
In een kolf van 100 ml werd 1,85 g (10 mmol) (E)-N-[((4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4yl)methylideen]butylamine 79b opgelost in 50 ml droge dichloormethaan,26 waarna 3,03 g (30 mmol;
3 equiv.) triëthylamine werd toegevoegd. De inhoud van de kolf werd m.b.v. een ijsbad gekoeld tot
0°C, waarna een oplossing van 2,22 g (13 mmol; 1,3 equiv.) fenoxyacetylchloride 87b in 25 ml droge
dichloormethaan langzaam werd toegedruppeld.26 Na 16 uur roeren bij kamertemperatuur werd het
reactiemengsel gewassen met 50 ml water. De waterige fractie werd tweemaal geëxtraheerd met 30
ml dichloormethaan, waarna de gecombineerde organische fracties werden gedroogd met MgSO4.
Na affiltreren van het droogmiddel en indampen van het solvent werd het reactiemengsel gezuiverd
m.b.v. kolomchromatografie op silicagel (SiO2) met als eluens ethylacetaat/petroleumether (1/6). Na
deze zuiveringsstap werd 2,84 g (89%) (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4yl]-azetidin-2-on 11b bekomen.
(3R,4S)-1-Isopropyl-3-methoxy-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl]azetidin-2-on
11a
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,28 (6H, d, J = 6,8 Hz, NCH(CH3)2); 1,35 en 1,45 (2 x
MeO
H H
R
S
N
O
O
S
H
O
3H, 2 x s, Cquat(CH3)2); 3,53 (3H, s, OCH3); 3,59 (1H, d x d, J = 7,9, 5,5 Hz, O(HCH));
3,68 (1H, d x d, J = 8,7, 5,2 Hz, OCHCHN); 3,91 (1H, septet, J = 6,8 Hz, NCH(CH3)2);
4,13-4,22 (2H, m, O(HCH)CH); 4,35 (1H, d, J = 5,2 Hz, CH3OCH). 13C-NMR (100 MHz,
ref = CDCl3): δ 19,4 en 21,3 (NCH(CH3)2); 25,1 en 26,8 (Cquat(CH3)2); 44,3 (NCH(CH3)2); 59,1 (OCH3); 59,8
(OCHCHN); 66,9 (OCH2); 77,0 (CH2CHO); 82,0 (CH3OCH); 109,3 (Cquat(CH3)2); 166,9 (C=O). IR (ATR,
54
Experimenteel deel
cm-1): νC=O = 1747; νmax = 2982, 2936, 1370, 1211, 1064, 1034, 851. MS (70eV): m/z (%) 244 (M++1,
100). HRMS (ESI): berekend voor C12H22NO4: 244,1549 [M+H]+, gevonden: 244,1550. Gele olie. Rf =
0,13 (EtOAc/PE 1/4). Rendement na kolomchromatografie: 84%. [α]25
D = +37,2 (c = 0,33; CHCl3).
(3R,4S)-1-Butyl-3-fenoxy-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-yl]azetidin-2-on 11b
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,95 (3H, t, J = 7,4 Hz, N(CH2)3CH3); 1,36 (2H,
H H
O
R
S
N
O
S
O
H
sextet, J = 7,4 Hz, NCH2CH2CH2CH3); 1,37 en 1,46 (2 x 3H, 2 x s, Cquat(CH3)2);
1,57-1,72 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3); 3,29 (1H, d x d x d, J = 13,8, 7,7, 6,0 Hz,
O
N(HCH)); 3,50 (1H, d x t, J = 13,8, 7,4 Hz, N(HCH)); 3,68 (1H, d x d, J = 8,9, 6,3 Hz, O(HCH)); 3,82 (1H, d
x d, J = 9,0, 5,0 Hz, NCH); 4,18 (1H, d x d, J = 8,9, 6,3 Hz, O(HCH)); 4,42 (1H, d x t, J = 9,0, 6,3 Hz,
OCHCH2); 5,18 (1H, d, J = 5,0 Hz, PhOCH); 6,99-7,03 (1H, m, CHarom); 7,06-7,09 (2H, m, CHarom); 7,267,31 (2H, m, CHarom). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 13,6 (N(CH2)3CH3); 20,1 (NCH2CH2CH2CH3); 25,1 en
26,9 (Cquat(CH3)2); 29,4 (NCH2CH2CH2CH3); 41,3 (NCH2); 60,4 (NCH); 67,0 (OCH2); 77,2 (OCHCH2); 79,8
(PhOCH); 109,7 (Cquat(CH3)2); 115,8 (2 x HCarom); 122,5 (HCarom); 129,7 (2 x HCarom); 157,5 (Cquat,arom);
165,9 (C=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1746; νmax = 2955, 2872, 1599, 1589, 1492, 1418, 1370, 1294, 1227,
1154, 1070, 1061, 940, 856, 756, 697. MS (70eV): m/z (%) 320 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend
voor C18H26NO4: 320,1862 [M+H]+, gevonden: 320,1863. Witte kristallen. Rf = 0,24 (EtOAc/PE 1/4).
Rendement na kolomchromatografie: 89%. Tm = 52°C. Anal. berekend voor C18H25NO4: C, 67,69; H,
7,89; N, 4,39. Gevonden: C, 66,53; H, 8,48; N, 4,25. [α]25
D = +294,8 (c = 0,33; CHCl3).
5.3.2 Synthese van (3R,4S)-4-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]azetidin-2-onen 89
Hierna
volgt
de
beschrijving
van
de
synthese
van
(3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-[(1S)-1,2-
dihydroxyethyl]azetidin-2-on 89b als voorbeeld voor de algemene synthese van (3R,4S)-4-[(1S)-1,2dihydroxyethyl]azetidin-2-onen 89.
In een kolf van 100 ml werd 3,19 g (10 mmol) (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-[(4S)-2,2-dimethyl-1,3dioxolaan-4-yl]-azetidin-2-on 11b opgelost in 80 ml THF/H2O (1/1), waarna 1,90 g (10 mmol; 1 equiv.)
para-tolueensulfonzuurmonohydraat werd toegevoegd.26 Na zes uur roeren bij refluxtemperatuur
werd het reactiemengsel gekoeld tot kamertemperatuur. Vervolgens werd het reactiemengsel
geneutraliseerd m.b.v. vast NaHCO3 tot pH 7, waarna het driemaal werd geëxtraheerd met 35 ml
ethylacetaat. De gecombineerde organische fracties werden gedroogd met MgSO4. Na affiltreren van
het droogmiddel en indampen van het solvent werd 2,65 g (95%) (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-[(1S)-
55
Experimenteel deel
1,2-dihydroxyethyl]azetidin-2-on 89b bekomen. Wegens de hoge zuiverheid (>95%, bepaald m.b.v.
1
H-NMR-spectroscopie), was geen extra zuiveringsstap nodig.
Opmerking: Voor de synthese van (3R,4S)-4-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]-1-isopropyl-3-methoxyazetidin2-on 89a was een reactietijd van vier uur voldoende.
(3R,4S)-4-[(1S)-1,2-Dihydroxyethyl]-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 89a
H H
MeO
S
R
1
H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): δ 1,17 en 1,25 (2 x 3H, 2 x d, J = 6,7 Hz, NCH(CH3)2);
OH
OH
S
3,31-3,36 (1H, m, (HCH)OH); 3,41 (3H, s, CH3O); 3,43-3,48 (1H, m, (HCH)OH); 3,53-
N
3,59 (1H, m, CHOH); 3,64-3,71 (2H, m, NCH(CH3)2 en CHOCHN); 4,35 (1H, d, J = 5,1
O
Hz, CH3OCH); 4,56 (1H, t, J = 5,2 Hz, CH2OH); 4,84 (1H, d, J = 5,6 Hz, CHOH). 13C-NMR (100 MHz,
(CD3)2SO): δ 19,8 en 21,0 (NCH(CH3)2); 44,7 en 57,8 (NCH(CH3)2 en OCHCHN); 58,4 (CH3O); 63,0
(CH2OH); 71,6 (CHOH); 81,7 (CH3OCH); 166,7 (C=O). IR (ATR, cm-1): νOH = 3424; νC=O = 1731; νmax =
2935, 1458, 1369, 1234, 1215, 1068, 1035, 909, 728. MS (70eV): m/z (%) 204 (M++1, 100). HRMS
(ESI): berekend voor C9H18NO4: 204,1236 [M+H]+, gevonden: 204,1240. Gele olie. Rf = 0,18 (EtOAc/PE
= 1/3). Rendement: 78%. [α]25
D = +74,5 (c = 0,27; CHCl3).
(3R,4S)-1-Butyl-3-fenoxy-4-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]azetidin-2-on 89b
H H
O
R
S
N
O
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,94 (3H, t, J = 7,4 Hz, N(CH2)3CH3); 1,35 (2H,
OH
S
OH
sextet, J = 7,4 Hz, NCH2CH2CH2CH3); 1,53-1,70 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3); 2,19
(1H, s(breed), CH2OH); 2,76 (1H, d(breed), J = 2,5 Hz, CHOH); 3,22 en 3,58 (2 x
1H, 2 x (d x d x d), J = 13,8, 8,2, 8,1, 7,4, 5,6 Hz, N(HCH)); 3,67-3,73 en 3,79-3,85 (2 x 1H, 2 x m,
(HCH)OH); 3,97 (1H, d x d, J = 5,1, 5,0 Hz, NCH); 4,09-4,17 (1H, m, CHOH); 5,22 (1H, d, J = 5,0 Hz,
PhOCH); 7,02-7,06 (1H, m, CHarom); 7,08-7,12 (2H, m, CHarom); 7,28-7,33 (2H, m, CHarom). 13C-NMR (100
MHz, CDCl3): δ 13,6 (N(CH2)3CH3); 20,1 (NCH2CH2CH2CH3); 29,2 (NCH2CH2CH2CH3); 41,8 (NCH2); 58,2
(NCH); 63,8 (CH2OH); 71,7 (CHOH); 79,6 (PhOCH); 115,8 (2 x HCarom); 122,6 (HCarom); 129,7 (2 x HCarom);
157,4 (Cquat,arom); 166,9 (C=O). IR (ATR, cm-1): νOH = 3407; νC=O = 1735; νmax = 2932, 2873, 1591, 1494,
1416, 1354, 1231, 1174, 1089, 1038, 891, 842, 754, 734, 690. MS (70eV): m/z (%) 280 (M++1, 100).
HRMS (ESI): berekend voor C15H22NO4: 280,1549 [M+H]+, gevonden: 280,1552. Gele olie. Rf = 0,13
(EtOAc/PE 1/4). Rendement: 95%. [α]25
D = +150,6 (c = 0,27; CHCl3);
56
Experimenteel deel
5.3.3 Synthese van (3R,4R)-4-formylazetidin-2-onen 94
Hierna volgt de beschrijving van de synthese van (3R,4R)-1-butyl-3-fenoxy-4-formylazetidin-2-on 94b
als voorbeeld voor de algemene synthese van (3R,4R)-4-formylazetidin-2-onen 94.
In
een
kolf
van
25
ml
werd
1,40
g
(5
mmol)
(3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-[(1S)-1,2-
dihydroxyethyl]azetidin-2-on 89b opgelost in 15 ml dichloormethaan, waarna de temperatuur van
het reactiemengsel beneden de 25°C gehouden werd m.b.v. een koudwaterbad. Vervolgens werd
1 ml verzadigde NaHCO3-oplossing toegevoegd en werd in een tijdsspanne van 10 minuten 2,13 g (10
mmol; 2 equiv.) vast NaIO4 toegevoegd,27 waarna het reactiemengsel gedurende 16 uur hevig
geroerd werd bij dezelfde temperatuur. Na affiltreren werd het reactiemengsel gewassen met 25 ml
water en werd de organische fractie gedroogd m.b.v. MgSO4. Affiltreren van het droogmiddel en
indampen van het solvent leverde 1,02 g (78%) (3R,4R)-1-butyl-3-fenoxy-4-formylazetidin-2-on 94b.
Wegens de hoge zuiverheid (>95%, bepaald m.b.v. 1H-NMR-spectroscopie), was geen extra
zuiveringsstap nodig.
Opmerking: Voor de synthese van (3R,4R)-4-formyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 94a was een
reactietijd van twee uur voldoende.
(3R,4R)-4-Formyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 94a
H H
MeO
R
R
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,21 en 1,24 (2 x 3H, 2 x d, J = 6,7 Hz, NCH(CH3)2); 3,49
O
H
(3H, s, OCH3); 4,01 (1H, septet, J = 6,7 Hz, NCH(CH3)2); 4,15 (1H, d x d, J = 5,0, 4,0 Hz,
N
O
NCHCHO); 4,67 (1H, d, J = 5,0 Hz, OCH); 9,70 (1H, d, J = 4,0 Hz, HC=O). 13C-NMR (100
MHz, CDCl3): δ 20,2 en 21,6 (NCH(CH3)2); 44,6 (NCH(CH3)2); 59,2 (OCH3); 62,5 (NCHCHO); 84,9 (OCH);
165,7 (NC=O); 199,9 (HC=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1748, 1730; νmax = 2975, 2938, 2838, 1462, 1390,
1370, 1350, 1206, 1131, 1031, 732, 687. MS (70eV): m/z (%) 172 (M++1, 72); 189 (M+NH4+, 20).
HRMS (ESI): berekend voor C8H14NO3: 172,0974 [M+H]+, gevonden: 172,0966. Gele olie. Rf = 0,18
(EtOAc/PE 1/2). Rendement: 69%. [α]25
D = +16,7 (c = 0,40; CHCl3).
(3R,4R)-1-Butyl-3-fenoxy-4-formylazetidin-2-on 94b
H H
O
R
R
N
O
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,95 (3H, t, J = 7,3 Hz, N(CH2)3CH3); 1,32-1,45 (2H,
O
H
m, NCH2CH2CH2CH3); 1,46-1,62 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3); 3,36 en 3,47 (2 x 1H,
2 x (d x d x d), J = 14,2, 7,9, 6,7, 6,3 Hz, N(HCH)); 4,37 (1H, d x d, J = 5,0, 3,0 Hz,
57
Experimenteel deel
NCH); 5,45 (1H, d, J = 5,0 Hz, PhOCH); 7,01-7,07 (3H, m, CHarom); 7,28-7,34 (2H, m, CHarom); 9,75 (1H,
d, J = 3,0 Hz, HC=O). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 13,6 (N(CH2)3CH3); 20,2 (NCH2CH2CH2CH3); 29,9
(NCH2CH2CH2CH3); 42,0 (NCH2); 63,9 (NCH); 82,3 (PhOCH); 115,7 (2 x HCarom); 123,0 (HCarom); 129,8 (2
x HCarom); 157,1 (Cquat,arom); 165,0 (NC=O); 197,6 (HC=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1759, 1731; νmax = 2959,
2873, 1591, 1494, 1458, 1406, 1380, 1348, 1227, 1174, 1129, 1035, 888, 849, 753, 735, 690. MS
(70eV): m/z (%)248 (M++1, 85); 266 (M+NH4+, 100). HRMS (ESI): berekend voor C14H18NO3: 248,1287
[M+H]+, gevonden: 248,1281. Gele olie. Rf = 0,59 (EtOAc/PE 4/1). Rendement: 78%. [α]25
D = +46,1 (c =
0,40; CHCl3).
5.3.4 Synthese van (3R,4S)-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-onen 12
Hierna volgt de beschrijving van de synthese van (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-(hydroxymethyl)azetidin2-on 12b als voorbeeld voor de algemene synthese van (3R,4S)-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-onen 12.
In een kolf van 100 ml werd 1,24 g (5 mmol) (3R,4R)-1-butyl-3-fenoxy-4-formylazetidin-2-on 94b
opgelost in 50 ml methanol, waarna deze oplossing gekoeld werd tot 0°C d.m.v. een ijsbad.
Vervolgens werd 0,37 g (10 mmol; 2 equiv.) natriumboorhydride langzaam toegevoegd,27,28 en werd
het reactiemengsel gedurende twee uur geroerd bij refluxtemperatuur. Na toevoeging van 30 ml
water werd het reactiemengsel driemaal geëxtraheerd met 40 ml ethylacetaat. De gecombineerde
organische fracties werden gedroogd met MgSO4. Na affiltreren van het droogmiddel en indampen
van het solvent werd 1,12 g (91%) (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-on 12b
bekomen. Wegens de hoge zuiverheid (>95%, bepaald m.b.v. 1H-NMR-spectroscopie), was geen extra
zuiveringsstap nodig.
Opmerking: Voor de synthese van (3R,4S)-4-hydroxymethyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 12a
was een reactietijd van één uur voldoende.
(3R,4S)-4-Hydroxymethyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 12a
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,25 en 1,26 (2 x 3H, 2 x d, J = 6,8 Hz, NCH(CH3)2); 2,36-
H H
MeO
R
S
N
O
OH
2,39 (1H, m, OH); 3,62 (3H, s, OCH3); 3,80-3,94 (4H, m, NCHCH2 en NCH(CH3)2); 4,47
(1H, d, J = 4,7 Hz, OCH). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 20,0 en 21,6 (NCH(CH3)2); 44,1
(NCH(CH3)2); 56,7 (NCHCH2); 59,3 (OCH3); 61,1 (NCHCH2); 83,4 (OCH); 166,5 (C=O). IR (ATR, cm-1): νOH
= 3425; νC=O = 1726; νmax = 2934, 1461, 1350, 1213, 1140, 1034, 920, 792, 731, 646. MS (70eV): m/z
58
Experimenteel deel
(%) 174 (M++1, 61). HRMS (ESI): berekend voor C8H16NO3: 174,1130 [M+H]+, gevonden: 174,1130.
Gele olie. Rf = 0,32 (EtOAc/PE 1/2). Rendement: 82%. [α]25
D = +181,8 (c = 0,10; CHCl3).
(3R,4S)-1-Butyl-3-fenoxy-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-on 12b
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,95 (3H, t, J = 7,4 Hz, N(CH2)3CH3); 1,38 (2H,
H H
O
R
S
OH
sextet, J = 7,4 Hz, NCH2CH2CH2CH3); 1,51-1,69 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3); 1,97
N
O
(1H, s(breed), OH); 3,20 en 3,45 (2 x 1H, 2 x (d x d x d), J = 14,4, 8,0, 7,8, 6,5,
6,1 Hz, N(HCH)); 3,98-3,99 (3H, m, NCHCH2OH); 5,28 (1H, d, J = 4,5 Hz, OCH); 7,03-7,11 (3H, m,
CHarom); 7,29-7,34 (2H, m, CHarom).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 13,6 (N(CH2)3CH3); 20,3
(NCH2CH2CH2CH3); 29,8 (NCH2CH2CH2CH3); 40,8 (NCH2); 58,3 (NCH); 60,3 (CH2OH); 80,6 (OCH); 115,7
(2 x HCarom); 122,7 (HCarom); 129,7 (2 x HCarom); 157,3 (Cquat,arom); 165,8 (C=O). IR (ATR, cm-1): νOH =
3424; νC=O = 1739; νmax = 2932, 2874, 1598, 1494, 1415, 1353, 1233, 1174, 1108, 1047, 961, 886, 842,
753, 734, 691. MS (70eV): m/z (%) 250 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C14H20NO3: 250,1443
[M+H]+, gevonden: 250,1446. Gele olie. Rf = 0,44 (EtOAc/PE 1/1). Rendement: 91%. [α]25
D = +53,3 (c =
0,17; CHCl3).
5.3.5 Synthese van (3R,4S)-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen 95
Hierna
volgt
de
beschrijving
van
de
synthese
van
(3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-
(tosyloxymethyl)azetidin-2-on 95b als voorbeeld voor de algemene synthese van (3R,4S)-4(tosyloxymethyl)azetidin-2-onen 95.
In een kolf van 100 ml werd 1,25 g (5 mmol) (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-(hydroxymethyl)azetidin-2-on
12b opgelost in 15 ml droge tetrahydrofuran, waarna deze oplossing gekoeld werd tot 0°C m.b.v. een
ijsbad. Hieraan werd vervolgens een oplossing van 2,02 g (20 mmol; 4 equiv.) triëthylamine en 0,06 g
(0,5 mmol; 0,1 equiv.) 4,4-dimethylaminopyridine in 20 ml droge tetrahydrofuran toegedruppeld.
Aansluitend werd een oplossing van 1,43 g (7,5 mmol; 1,5 equiv.) para-tolueensulfonylchloride in 10
ml droge tetrahydrofuran toegedruppeld,74 waarna het reactiemengsel gedurende zes uur geroerd
werd bij refluxtemperatuur. Vervolgens werd 50 ml ethylacetaat toegevoegd en werd tweemaal
gewassen met 25 ml pekel en tweemaal met 25 ml verzadigde NaHCO3-oplossing. De bekomen
waterige fasen werden tweemaal geëxtraheerd met 30 ml ethylacetaat. De gecombineerde
organische fracties werden gedroogd met MgSO4. Na affiltreren van het droogmiddel, indampen van
het solvent en zuivering via kolomchromatografie (SiO2) met als eluens ethylacetaat/petroleumether
59
Experimenteel deel
(1/3) werd 1,25 g (61%) zuiver (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-on 95b
bekomen.
Opmerking: Voor de synthese van (3R,4S)-1-isopropyl-3-methoxy-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-on
90a was een reactietijd van 16 uur noodzakelijk.
(3R,4S)-1-Isopropyl-3-methoxy-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-on 95a
1
H H
MeO
R
S
N
O
S
O
O
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,17 en 1,22 (2 x 3H, 2 x d, J = 6,8 Hz,
NCH(CH3)2); 2,47 (3H, s, PhCH3); 3,45 (3H, s, OCH3); 3,82 (1H, septet, J = 6,8
Hz, NCH(CH3)2); 3,99 (1H, d x d x d, J = 7,2, 4,8, 4,5 Hz, NCHCH2); 4,09 en
O
4,24 (2 x 1H, 2 x (d x d), J = 10,7, 7,2, 4,5 Hz, NCH(HCH)); 4,43 (1H, d, J = 4,8
Hz, OCH); 7,38 (2H, d x d, J = 8,5, 0,6 Hz, 2 x CHarom); 7,81 (2H, d, J = 8,5 Hz, 2 x CHarom). 13C-NMR (100
MHz, ref = CDCl3): δ 19,8 en 21,6 (NCH(CH3)2); 21,7 (PhCH3); 44,4 (NCH(CH3)2); 55,0 (NCHCH2); 59,4
(OCH3); 69,3 (CH2O); 82,6 (OCH); 128,0 en 130,0 (4 x HCarom); 132,3 (CH3Cquat,arom); 145,4 (SCquat,arom);
166,3 (C=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1748; νmax = 2936, 1598, 1454, 1360, 1175, 1096, 1032, 974, 815,
767, 731, 666. MS (70eV): m/z (%) 328 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C15H22NO5S: 328,1219
[M+H]+,
gevonden:
328,1217.
Gele
olie.
Rf
=
0,28
(EtOAc/PE
1/1).
Rendement
na
kolomchromatografie: 58%. [α]25
D = +329,5 (c = 0,23; CHCl3).
(3R,4S)-1-Butyl-3-fenoxy-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-on 95b
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,92 (3H, t, J = 7,4 Hz, N(CH2)3CH3); 1,31
H H
O
R
S
N
O
O
S
O
O
(2H, sextet, J = 7,4 Hz, NCH2CH2CH2CH3); 1,47-1,64 (2H, m,
NCH2CH2CH2CH3); 2,46 (3H, s, ArCH3); 3,11 en 3,40 (2 x 1H, 2 x (d x d x
d), J = 14,0, 8,1, 8,0, 7,2, 5,9 Hz, N(HCH)); 4,18 (1H, d x d x d, J = 7,7, 4,6, 3,5 Hz, NCH); 4,24 en 4,37 (2
x 1H, 2 x (d x d), J = 10,4, 7,7, 3,5 Hz, (HCH)O); 5,24 (1H, d, J = 4,6 Hz, OCH); 6,91-7,05 (3H, m, CHarom);
7,28-7,34 (4H, m, CHarom); 7,71-7,73 (2H, m, CHarom). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 13,5 (N(CH2)3CH3);
20,1 (NCH2CH2CH2CH3); 21,6 (ArCH3); 29,5 (NCH2CH2CH2CH3); 41,2 (NCH2); 56,1 (NCH); 69,0 (CH2O);
80,0 (OCH); 115,5 (2 x HCarom), 122,5 (HCarom), 127,9 (2 x HCarom); 129,6 (2 x HCarom); 130,0 (2 x HCarom);
132,2 (CH3Cquat,arom); 145,3 en 157,2 (OCquat,arom en SCquat,arom); 165,3 (C=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1746;
νmax = 2949, 2873, 1598, 1492, 1418, 1355, 1292, 1238, 1228, 1189, 1171, 968, 896, 850, 829, 812,
764, 735, 699, 656. MS (70eV): m/z (%) 404 (M++1, 10); 421 (M+NH4+, 100). HRMS (ESI): berekend
voor C21H26NO5S: 404,1532 [M+H]+, gevonden: 404,1539. Gele kristallen. Rf = 0,27 (EtOAc/PE = 1/3).
60
Experimenteel deel
Rendement na kolomchromatografie: 61%. Tm = 68°C. Anal. berekend voor C21H25NO5S: C, 62,51; H,
6,25; N, 3,47. Gevonden: C, 62,85; H, 6,46; N, 3,37. [α]25
D = +23,0 (c = 0,33; CHCl3).
5.3.6 Synthese van (3R,4R)-4-(joodmethyl)azetidin-2-onen 99
Hierna
volgt
de
beschrijving
methoxyazetidin-2-on
99a
als
van
de
voorbeeld
synthese
voor
de
van
(3R,4R)-1-isopropyl-4-joodmethyl-3-
algemene
synthese
van
(3R,4R)-4-
(joodmethyl)azetidin-2-onen 99.
In een kolf van 25 ml werd 0,33 g (1 mmol) (3R,4S)-1-butyl-3-fenoxy-4-(tosyloxymethyl)azetidin-2-on
95a opgelost in 10 ml droge aceton, waarna 0,60 g (4 mmol; 4 equiv.) natriumjodide aan deze
oplossing werd toegevoegd.75 Vervolgens werd het reactiemengsel gedurende 40 uur geroerd bij
refluxtemperatuur, waarna het solvent de kans kreeg te verdampen. Wanneer alle solvent verdampt
was, werd 10 ml water toegevoegd en werd driemaal geëxtraheerd met 15 ml ethylacetaat. De
gecombineerde organische fracties werden gedroogd met MgSO4. Na affiltreren van het
droogmiddel, indampen van het solvent en zuivering via kolomchromatografie (SiO2) met als eluens
ethylacetaat/petroleumether (1/3) werd 0,21 g (75%)
(3R,4R)-1-isopropyl-4-joodmethyl-3-
methoxyazetidin-2-on 99a bekomen.
Opmerking: Voor de synthese van (3R,4R)-1-butyl-3-fenoxy-4-(joodmethyl)azetidin-2-on 99b was het
eluensmengsel voor de zuiveringsstap ethylacetaat/petroleumether (1/4).
(3R,4R)-1-Isopropyl-4-joodmethyl-3-methoxyazetidin-2-on 99a
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,27 en 1,30 (2 x 3H, 2 x d, J = 6,8 Hz, NCH(CH3)2); 3,28 en
H H
MeO
R
R
N
O
I
3,31 (2 x 1H, 2 x (d x d), J = 10,0, 8,4, 4,8 Hz, (HCH)I); 3,62 (3H, s, CH3O); 3,86 (1H,
septet, J = 6,8 Hz, NCH(CH3)2); 4,11 (1H, d x d x d, J = 8,4, 4,8, 4,7 Hz, NCHCH2); 4,41
(1H, d, J = 4,7 Hz, OCH). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ -1,5 (CH2I); 18,2 en 20,2 (NCH(CH3)2); 42,4
(NCH(CH3)2); 56,7 (NCHCH2); 58,5 (CH3O); 81,6 (OCH); 164,7 (C=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1740; νmax =
2971, 2932, 1462, 1389, 1340, 1236, 1212, 1170, 1143, 1033, 861, 730. MS (70eV): m/z (%) 284
(M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C8H15INO2: 284,0148 [M+H]+, gevonden: 284,0151. Gele olie.
Rf = 0,24 (EtOAc/PE 1/3). Rendement na kolomchromatografie: 75%. [α]25
D = +138,1 (c = 0,39; CHCl3).
61
Experimenteel deel
(3R,4R)-1-Butyl-3-fenoxy-4-(joodmethyl)azetidin-2-on 99b
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,96 (3H, t, J = 7,4 Hz, N(CH2)3CH3); 1,37 (2H,
H H
O
R
R
I
sextet, J = 7,4 Hz, NCH2CH2CH2CH3); 1,58-1,73 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3); 3,32
N
O
(1H, d x d x d, J = 14,0, 8,1, 5,7 Hz, N(HCH)); 3,35 en 3,39 (2 x 1H, 2 x (d x d), J =
10,5, 6,7, 6,5 Hz, (HCH)I); 3,47 (1H, d x d x d, J = 14,0, 8,3, 7,2 Hz, N(HCH)); 4,28 (1H, d x d x d, J = 6,7,
6,5, 4,7 Hz, NCH); 5,21 (1H, d, J = 4,7 Hz, OCH); 7,01-7,11 (3H, m, CHarom); 7,29-7,34 (2H, m, CHarom).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ -0,1 (CH2I); 13,7 (N(CH2)3CH3); 20,2 (NCH2CH2CH2CH3); 29,9
(NCH2CH2CH2CH3); 40,6 (NCH2); 59,5 (NCH); 81,1 (OCH); 115,9 (2 x HCarom); 122,5 (HCarom); 129,7 (2 x
HCarom); 157,5 (Cquat,arom); 165,8 (C=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1751; νmax = 2957, 2929, 1597, 1590, 1493,
1402, 1347, 1233, 1171, 1045, 931, 884, 862, 752, 690. MS (70eV): m/z (%) 360 (M++1, 100). HRMS
(ESI): berekend voor C14H19INO2: 360,0461 [M+H]+, gevonden: 360,0467. Gele olie. Rf = 0,21
(EtOAc/PE = 1/4). Rendement na kolomchromatografie: 69%. [α]25
D = +281,2 (c = 0,37; CHCl3).
5.3.7 Synthese van (3R,4S)-4-(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13
Hierna volgt de beschrijving van de synthese van (3R,4S)-4-cyaanmethyl-1-isopropyl-3methoxyazetidin-2-on
13a
als
voorbeeld
voor
de
algemene
synthese
van
(3R,4S)-4-
(cyaanmethyl)azetidin-2-onen 13.
In een kolf van 10 ml werd 0,28 g (1 mmol) (3R,4R)-1-isopropyl-4-joodmethyl-3-methoxyazetidin-2on 99a opgelost in droge dimethylformamide, waarna 0,12 g (2,5 mmol; 2,5 equiv.) fijngemalen
NaCN werd toegevoegd.75 Vervolgens werd het reactiemengsel gedurende 72 uur geroerd bij
kamertemperatuur, waarna 30 ml pekel werd toegevoegd. Aansluitend werd dit mengsel
achtereenvolgens geëxtraheerd met tweemaal 20 ml diëthylether en éénmaal 20 ml ethylacetaat.
De gecombineerde organische fracties werden gedroogd met MgSO4. Na affiltreren van het
droogmiddel, indampen van het solvent en zuivering via kolomchromatografie (SiO2) met als eluens
ethylacetaat/petroleumether (1/4) werd 0,11 g (59%) (3R,4S)-4-cyaanmethyl-1-isopropyl-3methoxyazetidin-2-on 13a bekomen.
(3R,4S)-4-Cyaanmethyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 13a
R
S
N
O
62
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,28 en 1,31 (2 x 3H, 2 x d, J = 6,8 Hz, NCH(CH3)2); 2,64
H H
MeO
CN
en 2,74 (2 x 1H, 2x (d x d), J = 17,1, 6,1, 5,8 Hz, (HCH)CN)); 3,60 (3H, s, CH3O); 3,88
Experimenteel deel
(1H, septet, J = 6,8 Hz, NCH(CH3)2); 4,05 (1H, d x d x d, J = 6,1, 5,8, 5,3 Hz, NCHCH2); 4,48 (1H, d, J = 5,3
Hz, OCH). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 18,9 (CH2CN); 20,1 en 21,8 (NCH(CH3)2); 44,5 (NCH(CH3)2);
53,1 (NCHCH2); 59,6 (CH3O); 82,7 (OCH); 117,1 (CN); 166,0 (C=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1743; νCN =
2251; νmax = 2936, 2840, 1672, 1465, 1394, 1370, 1344, 1250, 1214, 1140, 1089, 1034, 729, 647. MS
(70eV): m/z (%) 183 (M++1, 65); 200 (M+NH4+, 100). HRMS (ESI): berekend voor C9H15N2O2: 183,1134
[M+H]+, gevonden: 183,1134. Gele olie. Rf = 0,12 (EtOAc/PE = 1/4). Rendement na
kolomchromatografie: 59%. [α]25
D = +50,6 (c = 0,20; CHCl3).
(3R,4S)-1-Butyl-4-cyaanmethyl-3-fenoxyazetidin-2-on 13b
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,97 (3H, t, J = 7,4 Hz, N(CH2)3CH3); 1,39 (2H,
H H
O
R
S
N
O
CN
sextet, J = 7,4 Hz, NCH2CH2CH2CH3); 1,57-1,71 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3); 2,75
en 2,81 (2 x 1H, 2 x (d x d), J = 17,2, 7,3, 5,2 Hz, (HCH)CN); 3,26 en 3,52 (2 x 1H,
2 x (d x d x d), J = 14,1, 8,2, 8,1, 7,1, 5,9 Hz, N(HCH)); 4,23 (1H, d x d x d, J = 7,3, 5,2, 4,9 Hz, NCH);
5,30 (1H, d, J = 4,9 Hz, CHO); 7,04-7,08 (3H, m, CHarom); 7,30-7,34 (2H, m, CHarom). 13C-NMR (100 MHz,
ref = CDCl3): δ 13,6 (N(CH2)3CH3); 18,4 (CH2CN); 20,2 (NCH2CH2CH2CH3); 29,7 (NCH2CH2CH2CH3); 40,9
(NCH2); 54,2 (NCH); 80,3 (CHO); 115,7 (2 x HCarom); 116,8 (CN); 122,9 (HCarom); 129,8 (2 x HCarom);
156,9 (Cquat,arom); 164,9 (C=O). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1753; νCN = 2252; νmax = 2931, 1591, 1494, 1458,
1407, 1351, 913, 754, 731, 691. MS (70eV): m/z (%) 259 (M++1, 12); 276 (M+NH4+, 100). HRMS (ESI):
berekend voor C15H19N2O2: 259,1447 [M+H]+, gevonden: 259,1445. Gele kristallen. Rf = 0,15
(EtOAc/PE = 1/4). Rendement na kolomchromatografie: 53%. Tm = 55°C. Anal. berekend voor
C15H18N2O2: C, 69,74; H, 7,02; N, 10,84. Gevonden: C, 69,37; H, 7,89; N, 10,28. [α]25
D = +67,2 (c = 0,23;
CHCl3).
5.3.8 Synthese van (3R,4S)-4-(carboxymethyl)azetidin-2-onen 17
Hierna volgt de beschrijving van de synthese van (3R,4S)-1-butyl-4-carboxymethyl-3-fenoxyazetidin2-on 17b als voorbeeld voor de algemene synthese van (3R,4S)-4-(carboxymethyl)azetidin-2-onen
17.
In een falcon van 50 ml werd een 20 mM oplossing van (3R,4S)-1-butyl-4-cyaanmethyl-3fenoxyazetidin-2-on 13b in een waterige fosfaatbuffer (95%) en methanol (5%) bereid. De
kaliumfosfaatbuffer werd geleverd door Codexis (pH 7,5, 50 mM kaliumfosfaat, 20 mM dithiotreïtol
(DTT), 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en gedeïoniseerd water). 20 ml van dit
63
Experimenteel deel
reactiemengsel werd geïncubeerd samen met 1 mg/ml NIT-P1-121-enzym bij 30°C en 200 rpm. Om
de 72 uur werd nogmaals 1 mg/ml enzym toegevoegd tot wanneer 4 mg/ml bereikt werd. Onder
dezelfde omstandigheden werd 0,5 ml van het reactiemengsel zonder enzym geïncubeerd, dewelke
als referentie (blanco) diende. Na vier weken incubatie (omzettingsgraad 75%, bepaald met LC-MSanalyse) werd het enzym geïnactiveerd door hittebehandeling (95°C, 10 min – 0°C, 10 min), waarna
het verwijderd werd door centrifugatie (14000 rpm, 10 min). De vloeibare fractie werd ingedampt,
waarna de zouten van de buffermix verwijderd werden door de organische verbindingen 13b en 17b
op te lossen in methanol en ethylacetaat. Substraat 13b en product 17b werden gescheiden m.b.v.
preparatieve HPLC waarna zuiver (3R,4S)-1-butyl-4-carboxymethyl-3-fenoxyazetidin-2-on 17b werd
bekomen.
Opmerking: Voor de synthese van (3R,4S)-4-cyaanmethyl-1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on 17a
werd de incubatie gestopt na drie weken (omzettingsgraad 60%, bepaald met 1H-NMR-analyse). Door
de kleine schaal van dit experiment werd zuivering van carbonzuur 17a bemoeilijkt, waardoor
karakterisatie niet mogelijk was.
(3R,4S)-1-Butyl-4-carboxymethyl-3-fenoxyazetidin-2-on 17b
1
H H
O
R
S
N
O
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,93 (3H, t, J = 7,3 Hz, N(CH2)3CH3); 1,34 (2H,
COOH
sextet, J = 7,3 Hz, NCH2CH2CH2CH3); 1,49-1,63 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3); 2,79
en 2,87 (2 x 1H, 2 x (d x d), J = 17,5, 6,9, 6,1 Hz, (HCH)COOH); 3,08 en 3,43 (2 x 1H, 2 x (d x d x d), J =
14,1, 7,8, 7,5, 7,5, 6,1 Hz, N(HCH); 4,35 (1H, d x d x d, J = 6,9, 6,1, 4,8 Hz, NCH); 5,29 (1H, d, J = 4,8 Hz,
OCH); 6,99-7,05 (3H, m, CHarom); 7,27-7,30 (2H, m, CHarom).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 13,6
(N(CH2)3CH3); 20,1 (NCH2CH2CH2CH3); 29,8 (NCH2CH2CH2CH3); 33,6 (CH2COOH); 40,6 (NCH2); 54,2
(NCH); 80,3 (OCH); 115,6 (2 x HCarom); 122,4 (HCarom); 129,6 (2 x HCarom); 157,4 (Cquat,arom); 165,7
(NC=O); 175,5 (COOH). IR (ATR, cm-1): νOH = 3423; νNC=O = 1731; νOC=O = 1700; νmax = 2957, 2871, 1589,
1486, 1433, 1354, 1307, 1212, 1185, 1144, 1111, 1074, 1034, 841, 753, 692, 669. MS (70eV): m/z (%)
278 (M++1, 100). HRMS berekend voor C15H20NO4: 278,1392 [M+H]+, gevonden: 278,1397. Witte
kristallen. Rf = 0,13 (EtOAc/PE = 1/2). Rendement na preparatieve HPLC: 12%. [α]25
D = +48,0 (c = 0,13;
CHCl3).
64
Experimenteel deel
5.3.9 Synthese van 4-4’-bis(1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on) 102 en
103
In een kolf van 25 ml werd 0,14 g (1 mmol) glyoxal-bis-(N-isopropylimine) 101 opgelost in 10 ml
droge tolueen,71 waarna 0,23 gl triëthylamine (2,2 mmol; 2,2 equiv.) werd toegevoegd. Vervolgens
werd dit mengsel gekoeld tot 0°C d.m.v. een ijsbad, waarna een oplossing van 0,21 g (2 mmol; 2
equiv.) methoxyacetylchloride 87a in 1 ml droge tolueen traag werd toegedruppeld.71 Het
reactiemengsel werd gedurende twee uur geroerd bij kamertemperatuur. Aansluitend werd 10 ml
(14 mmol; 14 equiv.) 1,4 M HCl toegevoegd,71 waarna 1,5 uur geroerd werd bij dezelfde
temperatuur. Vervolgens werd het reactiemengsel uitgegoten in 25 ml tolueen en achtereenvolgens
gewassen met tweemaal 10 ml 1,4 M HCl, 10 ml water en 10 ml pekel. De organische fractie werd
gedroogd met MgSO4. Na affiltreren van het droogmiddel en indampen van het solvent werd 0,07 g
(39%) 4-4’-bis(1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on) 102 en 103 bekomen. Wegens de hoge
zuiverheid (>95%, bepaald met 1H-NMR-analyse) werden deze producten niet verder gezuiverd.
4-4’-Bis(1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on) 102 en 103
Verhouding major/minor: 9/1.
Data afgeleid uit het mengsel der isomeren.
(3R*,3’R*,4S*,4’S*)-4-4’-Bis(1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on) 102
Major-diastereoisomeer
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,22 en 1,46 (2 x 6H, 2 x d, J = 6,7 Hz, 2 x
O
MeO
H H
N
N
H H
NCH(CH3)2); 3,57 (2H, septet, J = 6,7 Hz, 2 x NCH(CH3)2); 3,58 (6H, s, 2 x OCH3);
OMe
O
3,96 (2H, d x d, J = 5,5, 1,1 Hz, 2 x OCHCHN); 4,39 (2H, d, J = 5,5 Hz, 2 x OCH). 13CNMR (100 MHz, ref = CDCl3): δ 20,4 en 20,5 (2 x NCH(CH3)2); 47,4 (2 x NCH(CH3)2);
55,2 (2 x OCHCHN); 59,0 (2 x OCH3); 82,3 (2 x OCH); 167,7 (2 x C=O).
(3R*,3’S*,4S*,4’R*)-4-4’-Bis(1-isopropyl-3-methoxyazetidin-2-on) 103
Minor-diastereoisomeer
1
O
MeO
H H
N
N
H H
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,24 en 1,34 (2 x 6H, 2 x d, J = 7,0 Hz, 2 x
NCH(CH3)2); 3,61 (6H, s, 2 x OCH3); 3,61-3,66 (2H, m, 2 x NCH(CH3)2); 3,94 (2H, d x
OMe
d, J = 3,3, 1,9 Hz, 2 x OCHCHN); 4,41 (2H, d x d, J = 3,3, 1,9 Hz, 2 x OCH). 13C-NMR
O
65
Experimenteel deel
(100 MHz, ref = CDCl3): δ 20,3 en 20,8 (2 x NCH(CH3)2); 46,5 (2 x NCH(CH3)2); 57,0 (2 x OCHCHN); 58,4
(2 x OCH3); 82,6 (2 x OCH); 167,3 (2 x C=O).
IR (ATR, cm-1): νC=O = 1734; νmax = 2936, 1458, 1307, 1208, 1145, 1063, 1036, 1017, 629. MS (70eV):
m/z (%) 285 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C14H25N2O4: 285,1814 [M+H]+, gevonden:
285,1804. Gele olie. Rf = 0,18 (EtOAc/PE = 1/1). Rendement: 39%.
66
6 BRONNENLIJST
(1)
Fleming, A. Br. J. Exp. Pathol. 1929, 10, 226.
(2)
Kardos, N.; Demain, A. L. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97, 6613.
(3)
Elander, R. P. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 61, 385.
(4)
Quintiliani, R. Scand J. Infect. Dis. Suppl. 1984, 42, 99.
(5)
Testero, S. A.; Fisher, J. F.; Mobashery, S.; Abraham, D. J. In Burger's Medicinal Chemistry and
Drug Discovery; John Wiley & Sons, Inc.: 2003.
(6)
Llarrull, L. I.; Testero, S. A.; Fisher, J. F.; Mobashery, S. Curr. Opin. Microbiol. 2010, 13, 551.
(7)
Frere, J. M. Biochemical Pharmacology 1977, 26, 2203.
(8)
Hou, J. P.; Poole, J. W. J. Pharm. Sci. 1971, 60, 503.
(9)
Fisher, J. F.; Meroueh, S. O.; Mobashery, S. Chem. Rev. (Washington, DC, U. S.) 2005, 105,
395.
(10)
Drawz, S. M.; Bonomo, R. A. Clinical Microbiology Reviews 2010, 23, 160.
(11)
Veinberg, G.; Shestakova, I.; Vorona, M.; Kanepe, I.; Lukevics, E. Bioorg. Med. Chem. Lett.
2004, 14, 147.
(12)
Singh, P.; Singh, P.; Kumar, M.; Gut, J.; Rosenthal, P. J.; Kumar, K.; Kumar, V.; Mahajan, M. P.;
Bisetty, K. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 57.
(13)
Mehta, P. D.; Sengar, N. P. S.; Pathak, A. K. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 5541.
(14)
Ojima, I. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 383.
(15)
Yamashita, M.; Ojima, I. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 6339.
(16)
Ojima, I.; Yamato, T.; Nakahashi, K. Tetrahedron Lett. 1985, 26, 2035.
(17)
Nicolaou, K. C.; Valiulin, R. A. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 4154.
(18)
Alcaide, B.; Almendros, P.; Aragoncillo, C. Chem. Rev. (Washington, DC, U. S.) 2007, 107,
4437.
(19)
Sunagawa, M.; Sasaki, A.; Matsumura, H.; Goda, K.; Tamoto, K. Chem. Pharm. Bull. 1994, 42,
1381.
(20)
Teng, M.; Gasparski, C. M.; Williams, M. A.; Miller, M. J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3,
2431.
(21)
Basak, A.; Mandal, S. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 4241.
(22)
Banfi, L.; Guanti, G. Eur. J. Org. Chem. 2002, 3745.
(23)
Meyer, H.-P.; Eichhorn, E.; Hanlon, S.; Lutz, S.; Schurmann, M.; Wohlgemuth, R.;
Coppolecchia, R. Catal. Sci. Technol. 2013, 3, 29.
67
Bronnenlijst
(24)
Blaser, H. U. Chemical Reviews 1992, 92, 935.
(25)
Jiao, L.; Liang, Y.; Xu, J. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6060.
(26)
Mollet, K.; Goossens, H.; Piens, N.; Catak, S.; Waroquier, M.; Törnroos, K. W.; Van
Speybroeck, V.; D'hooghe, M.; De Kimpe, N. Chem. Eur. J. 2013, 19, 3383.
(27)
Van Brabandt, W.; Vanwalleghem, M.; D'hooghe, M.; De Kimpe, N. J. Org. Chem. 2006, 71,
7083.
(28)
Mincke, J. Ingenieursthesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 2013.
(29)
Krief, A.; Froidbise, A. Tetrahedron 2004, 60, 7637.
(30)
Hong, J. H.; Oh, C.-H.; Cho, J.-H. Tetrahedron 2003, 59, 6103.
(31)
Kiss, L.; Forro, E.; Martinek, T. A.; Bernath, G.; De Kimpe, N.; Fulop, F. Tetrahedron 2008, 64,
5036.
(32)
Berks, A. H. Tetrahedron 1996, 52, 331.
(33)
Shih, D. H.; Baker, F.; Cama, L.; Christensen, B. G. Heterocycles 1984, 21, 29.
(34)
Yamanaka, T.; Seki, M.; Kuroda, T.; Ohmizu, H.; Iwasaki, T. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 4967.
(35)
Tseng, W.-H.; Chuang, S.-T.; Hung, Z.-Y.; Wu, C.-I. Savior Lifetec Corporation, Taiwan 2011,
EP2345645A1.
(36)
Tseng, W.-H.; Chuang, S.-T.; Hung, Z.-Y.; Wu, C.-I. Savior Lifetec Corporation, Taiwan 2011,
US20110144326A1.
(37)
Hong, H.; Gage, J.; Chen, C.; Li, J. Asymchem Laboratories Tianjin Co., Ltd., Peop. Rep. China;
Asymchem Life Science Tianjin Co., Ltd.; Tianjin Asymchem Pharmaceutical Co., Ltd.;
Asymchem Laboratories Fuxin Co., Ltd.; Asymchem Laboratories Jilin Co., Ltd. 2013,
CN102977134A.
(38)
Kondo, K.; Seki, M.; Kuroda, T.; Yamanaka, T.; Iwasaki, T. J. Org. Chem. 1995, 60, 1096.
(39)
Gage, J. R.; Evans, D. A. Org. Synth. 1990, 68, 83.
(40)
Lee, S. H. Bull. Korean Chem. Soc. 2013, 34, 121.
(41)
Nagao, Y.; Kumagai, T.; Nagase, Y.; Tamai, S.; Inoue, Y.; Shiro, M. J. Org. Chem. 1992, 57,
4232.
(42)
Oh, C.-Y.; Ham, W.-H. Chem. Commun. 1999, 2365.
(43)
Kobayashi, S.; Iimori, T.; Izawa, T.; Ohno, M. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 2406.
(44)
Ito, Y.; Kimura, Y.; Terashima, S. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987, 60, 3337.
(45)
Corey, E. J.; Schmidt, G. Tetrahedron Lett. 1979, 399.
(46)
Kawabata, T.; Kimura, Y.; Ito, Y.; Terashima, S.; Sasaki, A.; Sunagawa, M. Tetrahedron Lett.
1986, 27, 6241.
(47)
Oh, C. H.; Lee, S. C.; Cho, J. H. Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 841.
68
Bronnenlijst
(48)
Goldstein, E. J. C. J. Antimicrob. Chemother. 2004, 53, 5.
(49)
Mozingo, R. Org. Synth. 1946, 26, 77.
(50)
Sunagawa, M.; Matsumura, H.; Inoue, T.; Fukasawa, M.; Kato, M. J. Antibiot. 1990, 43, 519.
(51)
Schaefer, J. P.; Bloomfield, J. J. Org. React. (N. Y.) 1967, 15, 1.
(52)
Ferrara, A.; Grassi, G.; Grassi, F. A.; Piccioni, P. D.; Grassi, G. G. J. Antimicrob. Chemother.
1989, 24, 239.
(53)
Cooper, R. D. G. Am. J. Med. 1992, 92, S2.
(54)
Gasparski, C. M.; Ghosh, A.; Miller, M. J. J. Org. Chem. 1992, 57, 3546.
(55)
Williams, M. A.; Miller, M. J.; Rath, N. P. J. Org. Chem. 1991, 56, 1293.
(56)
Guzzo, P. R.; Teng, M.; Miller, M. J. Tetrahedron 1994, 50, 8275.
(57)
Baldwin, J. E. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1976, 734.
(58)
Gasparski, C. M.; Teng, M.; Miller, M. J. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 2741.
(59)
Teng, M.; Miller, M. J. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 548.
(60)
Jasikova, L.; Hanikyrova, E.; Skriba, A.; Jasik, J.; Roithova, J. J. Org. Chem. 2012, 77, 2829.
(61)
Kreye, O.; Wald, S.; Meier, M. A. R. Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 81.
(62)
Teng, M.; Miller, M. J. University of Notre Dame Du Lac, USA 1998, US5750681A.
(63)
Zhang, B.; Zhang, X.; Wu, Z.; Wang, P. Jiangxi Fushine Pharmaceutical Co., Ltd., Peop. Rep.
China 2013, CN103059025A.
(64)
Fetter, J.; Lempert, K.; Kajtar-Peredy, M.; Simig, G.; Hornyak, G. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1
1986, 1453.
(65)
Zanobini, A.; Gensini, M.; Magull, J.; Vidovic, D.; Kozhushkov, S. I.; Brandi, A.; de Meijere, A.
Eur. J. Org. Chem. 2004, 4158.
(66)
Hirth, G.; Walther, W. Helv. Chim. Acta 1985, 68, 1863.
(67)
Malaprade, L. Bull. Soc. Chim. Fr., Mem. 1934, 1, 833.
(68)
Khangarot, R. K.; Kaliappan, K. P. Eur. J. Org. Chem. 2013, 2013, 7664.
(69)
Jiao, L.; Liang, Y.; Xu, J. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6060.
(70)
Leemans, E. Doctoraatsthesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent,
2010.
(71)
Alcaide, B.; Martin-Cantalejo, Y.; Perez-Castells, J.; Rodriguez-Lopez, J.; Sierra, M. A.; Monge,
A.; Perez-Garcia, V. J. Org. Chem. 1992, 57, 5921.
(72)
Alcaide, B.; Almendros, P. Chem. Soc. Rev. 2001, 30, 226.
(73)
Chen, S.-T.; Yu, H.-M.; Chen, S.-T.; Wang, K.-T. J. Chin. Chem. Soc. (Taipei) 1999, 46, 509.
69
Bronnenlijst
(74)
Mollet, K.; D'hooghe, M.; Broeckx, L.; Danneels, B.; Desmet, T.; De Kimpe, N. Tetrahedron
2013, 69, 2603.
(75)
Simig, G.; Doleschall, G.; Hornyak, G.; Fetter, J.; Lempert, K.; Nyitrai, J.; Huszthy, P.; Gizur, T.;
Kajtar-Peredy, M. Tetrahedron 1985, 41, 479.
(76)
Hong, J. H.; Oh, C.-H.; Cho, J.-H. Tetrahedron 2003, 59, 6103.
(77)
Krief, A.; Froidbise, A. Tetrahedron 2004, 60, 7637.
(78)
Pan, Z.-L.; Liu, X.-Y.; Liang, Y.-M. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 4101.
(79)
Haaf, M.; Schmiedl, A.; Schmedake, T. A.; Powell, D. R.; Millevolte, A. J.; Denk, M.; West, R. J.
Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12714.
(80)
Fischer-Colbrie, G.; Matama, T.; Heumann, S.; Martinkova, L.; Cavaco Paulo, A.; Guebitz, G. J.
Biotechnol. 2007, 129, 62.
(81)
Davis, B. G.; Boyer, V. Nat. Prod. Rep. 2001, 18, 618.
(82)
Kobayashi, M.; Shimizu, S. FEMS Microbiol. Lett. 1994, 120, 217.
(83)
Hamde, V. S.; Andhale, M. S. J. Microb. World 2009, 11, 211.
(84)
Codexis Codex® Nitrilase Screening Kit 2014
http://www.codexis.com/documents/Codexis%20Codex%20NIT%20Screening%20Kit%20Prot
ocol%20-%20UPDATED.pdf.
(85)
Pace, H. C.; Hodawadekar, S. C.; Draganescu, A.; Huang, J.; Bieganowski, P.; Pekarsky, Y.;
Croce, C. M.; Brenner, C. Curr. Biol. 2000, 10, 907.
(86)
Gong, J. S.; Lu, Z. M.; Li, H.; Shi, J. S.; Zhou, Z. M.; Xu, Z. H. Microb. Cell. Fact. 2012, 11, 18.
(87)
Vander Meeren, S. Ingenieursthesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit
Gent, 2013.
(88)
Ninham, B.; Nossal, R.; Zwanzig, R. J. Chem. Phys. 1969, 51, 5028.
(89)
Cornish-Bowden, A. FEBS Lett. 2013, 587, 2725.
(90)
Dewinter, K.; Decuyper, L. Ongepubliceerd werk.
(91)
Patino, J. M. R.; Nino, M. R. R.; Sanchez, C. C. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2003, 8, 387.
(92)
Vervisch, K. Doctoraatsthesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent,
2011.
(93)
Strecker, A. Justus Liebigs Annalen der Chemie 1850, 75, 27.
70

Samenvatting Het Nieuwste Trucje van Isocyanides - VU

opgaven - Protagoras

1415 Rooster 2014

SYNTHESE (5.18) (G) EENHEID – ratio en intuïtie

Programma Kennisdag 2014

Dutch summary - Dissertations

Geschillenbemiddeling en -beslechting

B. Theunissen en M.J. Donath* DE PLAATS VAN DE MORFOLOGIE

klik hier - FAC Philipstoren Leuven

Routebeschrijving - Nederlands Centrum voor Handelsbevordering