UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
INTERACTIES TUSSEN HELICOBACTER SUIS EN DE MAAGMICROFLORA VAN HET VARKEN:
MOGELIJKE IMPLICATIES VOOR DE ONTWIKKELING VAN EEN ANTI-H. SUIS THERAPIE
door
Chloë DE WITTE
Promotoren:
Dr. B. Flahou
Onderzoek in het kader
E. De Bruyne
van de Masterproef
© 2014 Chloë De Witte
Universiteit Gent, haar medewerkers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de
juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze
masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op rechten van derden.
Universiteit Gent, haar medewerkers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of
verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de
masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de
masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
INTERACTIES TUSSEN HELICOBACTER SUIS EN DE MAAGMICROFLORA VAN HET VARKEN:
MOGELIJKE IMPLICATIES VOOR DE ONTWIKKELING VAN EEN ANTI-H. SUIS THERAPIE
door
Chloë DE WITTE
Promotoren:
Dr. B. Flahou
Onderzoek in het kader
E. De Bruyne
van de Masterproef
© 2014 Chloë De Witte
VOORWOORD
Graag wil ik meerdere personen bedanken die een belangrijke rol gespeeld hebben in het voltooien
van mijn onderzoek. Eerst en vooral wil ik mijn co-promotor, Ellen De Bruyne, bedanken. Zonder haar
hulp en kennis had ik dit onderzoek niet succesvol ten einde kunnen brengen. Ze heeft me
verscheidende technieken en experimenten uitgelegd zodat ik deze niet enkel zelf kon uitvoeren,
maar eveneens de onderliggende theorie begreep. Haar kennis, enthousiasme, doorzettingsvermogen
en geduld hebben ervoor gezorgd dat ik een nog grotere passie voor onderzoek ontwikkelde. Ook wil
ik mijn promotor, Dr. Bram Flahou, bedanken voor zijn vele verbeteringen, tips, steun, enthousiasme
en kennis. Dankzij hem heb ik immers dit interessant en leerzaam onderzoek kunnen uitvoeren als
vervolg op mijn literatuurstudie van vorig jaar. Professor dr. Freddy Haesebrouck wil ik eveneens
hartelijk
bedanken, hij
heeft me de kans
geboden om
zowel mijn literatuurstudie als
onderzoeksonderwerp uit te kunnen voeren op de dienst Bacteriologie. Ik ben hem dan ook bijzonder
dankbaar voor het vertrouwen in mijn capaciteiten en kennis. Christian Puttevils wil ik ook bedanken
om de vele HE-kleuringen uit te voeren. In het bijzonder wil ik ook Sofie De Bruyckere bedanken voor
haar uiterst efficiënte hulp in het laatste deel van mijn onderzoek, zonder haar was ik ongetwijfeld in
tijdsnood geraakt. Daarnaast wil ik iedereen op de dienst Bacteriologie bedanken. Het zijn stuk voor
stuk leuke collega’s die graag een handje toesteken en altijd te vinden zijn voor een gezellige babbel.
Ook mijn ouders, zus en vriend, Robrecht Dockx, wil ik bedanken voor de vele steun, begrip en
nalezen van dit onderzoeksonderwerp. Mijn collega’s van optie onderzoek, die zeker vrienden mogen
genoemd worden, wil ik ook bedanken. Het was een fantastisch jaar en ik hoop elkaar na het
afstuderen nog terug te zien. En liefste peter, ik weet dat je trots op mij zou geweest zijn. Daarom wil
ik je ook bedanken om altijd voor me klaar te staan en als groot voorbeeld voor me te dienen.
INHOUDSOPGAVE
VOORWOORD
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING .................................................................................................................................... 1
INLEIDING ............................................................................................................................................... 2
MATERIAAL EN METHODEN............................................................................................................... 10
1.
2.
3.
Detectie van H. suis in varkensmagen en pathologische veranderingen in de maag ................ 10
1.1.
Staalname.......................................................................................................................... 10
1.2.
Incubatie en beoordeling van de agarplaten ..................................................................... 11
1.3.
Histopathologisch onderzoek ............................................................................................ 11
1.4.
Detectie van H. suis in de maagmucosa via DNA extractie en qPCR .............................. 13
1.5.
Detectie van H. suis in de mucus via DNA extractie en qPCR ......................................... 15
1.6.
Afwijkende smeltpiek na gebruik primerpaar 2 .................................................................. 16
1.7.
Kodon en BLAST van de bekomen sequenties ................................................................. 17
Analyse van de gastrale microbiota van H. suis-positieve en -negatieve varkens .................... 17
2.1.
Selectie en indeling van de varkensmagen ....................................................................... 17
2.2.
Macroscopisch en biochemisch onderzoek van de kolonies ............................................ 17
2.3.
PCR en gelelektroforese ................................................................................................... 19
2.4.
Kodon en BLAST ............................................................................................................... 21
2.5.
Analyse van de gastrale microbiota ................................................................................... 21
Interacties tussen H. suis en de gastrale microbiota .................................................................. 23
3.1.
Cultivatie van de geselecteerde bacteriën en H. suis ....................................................... 23
3.2.
Interacties tussen H. suis en de geselecteerde bacteriën ................................................. 25
RESULTATEN ....................................................................................................................................... 27
1.
Analyse van de varkensmagen: H. suis kolonisatie, gastritis en ulcera ..................................... 27
2.
Analyse van de maagmicrobiota: uitplaten en sequeneren ........................................................ 39
3.
Selectie van magen en vergelijking van de microbiota .............................................................. 44
4.
3.1.
Geselecteerde varkensmagen: toegekende scores .......................................................... 44
3.2.
Microbiota samenstelling ................................................................................................... 46
Interacties tussen H. suis en de gastrale microbiota .................................................................. 54
BESPREKING ....................................................................................................................................... 61
REFERENTIELIJST .............................................................................................................................. 70
SAMENVATTING
Helicobacter (H.) suis koloniseert frequent de magen van slachtvarkens, waarbij deze infectie een
nefaste invloed heeft voor zowel de individuele gastheer (veroorzaken van ontsteking en ulceraties in
de maag) als de landbouweconomie. Daarnaast is H. suis de meest frequent voorkomende nietHelicobacter pylori Helicobacter bij humane patiënten met maagklachten. Intensieve behandelingen
met antibiotica zijn niet verantwoord in de varkensindustrie, waardoor een nieuwe anti-H. suis therapie
gewenst is. Tot op heden is er weinig tot niets gekend omtrent de samenstelling van de
maagmicrobiota bij het varken en de eventuele inhiberende invloed van bepaalde bacteriën op de
groei van H. suis. Dit onderzoek heeft als doel deze ontbrekende informatie aan te vullen om zo een
mogelijke basis te vormen voor de ontwikkeling van een probioticum. Uit het slachthuis ‘De Lokery’
werden 68 gesloten magen van slachtvarkens ad random verzameld. Deze werden gescoord op
visueel zichtbare hyperkeratose en erosies/ulcera ter hoogte van de pars oesophagea en gastritis na
HE-kleuring van (sub)mucosale biopten uit cardia, fundus en antrum. Een swab van het oppervlak van
elke maagregio werd geënt op een bloedagarplaat en 24 h geïncubeerd bij 37°C in een micro-aërofiel
milieu. Aan- of afwezigheid en kwantificatie van het ureA gen van H. suis in pars oesophagea, cardia,
fundus, antrum en mucus werd aangetoond door middel van qPCR. Zes H. suis-negatieve varkens
met milde laesies en gastritis en 6 H. suis-positieve varkens met ernstige laesies en gastritis werden
geselecteerd. Door middel van sequenering van het 16S rRNA gen van de bacteriële populatie en
aansluitende metagenomics analyse, werd de samenstelling van de maagmicrobiota bepaald bij de
geselecteerde varkens. Bacteriën aanwezig in de H. suis-negatieve magen maar afwezig in de
positieve magen, en omgekeerd, werden geselecteerd voor (co-)cultivatie met H. suis bacteriën of in
het supernatans van een H. suis cultuur, om op die manier mogelijke directe interacties tussen H. suis
en andere bacteriële species na te gaan. De zuurgevoeligheid werd eveneens getest (in de maag is
immers een erg zuur milieu aanwezig) en een groeicurve van de bacteriën en H. suis werd opgesteld
na 6 h, 24 h en 30 h (co-)cultivatie. Van het totaal aantal magen werd 90,77% positief bevonden op
H. suis. Een hyperkeratose die meer dan 50% van het oesophagale oppervlak bedekt, werd
gedetecteerd bij 67,65% van de dieren. In het antrum werd vaak een meer uitgesproken gastritis
waargenomen dan in de fundus, terwijl het aantal H. suis bacteriën vaak hoger was in deze laatste
maagregio. De H. suis-negatieve magen vertoonden een lagere score voor laesies ter hoogte van
pars oesophagea en gastritis ter hoogte van het antrum in vergelijking met H. suis-positieve varkens.
Na incubatie van de bloedagarplaten waarop de mucosale swabs waren uitgeënt, werd een grote
diversiteit aan bacteriële species waargenomen, met weinig tot geen verschillen tussen de regio’s van
eenzelfde maag. Ook metagenomics analyse toonde aan dat de samenstelling van de
maagmicrobiota zeer divers was met grote variaties tussen varkensmagen. Escherichia (E.) coli en
Fusobacterium necrophorum bleken meer voor te komen bij H. suis-positieve magen, Campylobacter
(C.) jejuni en Actinobacillus porcinus meer bij H. suis-negatieve magen. Een nieuwe Fusobacterium
soort werd ontdekt bij meerdere H. suis-positieve magen. Co-cultivatie van E. coli en C. jejuni (die
beiden in staat waren te groeien bij een zure pH) met H. suis toonde aan dat deze laatste de groei van
de hoger genoemde species significant bevordert. Daartegenover werd een significante, milde inhibitie
van de groei van H. suis in aanwezigheid van E. coli of C. jejuni waargenomen. Een nieuw
geïsoleerde Lactobacillus soort kon de groei van H. suis niet remmen.
Sleutelwoorden: Co-cultivatie - Gastrale microbiota – Helicobacter suis – Interactie – Varken
INLEIDING
Helicobacter suis: een beknopt overzicht van de literatuur
Taxonomie
Het genus Helicobacter omvat meerdere species, waarvan Helicobacter (H.) pylori ongetwijfeld de
meest bekende soort is. De andere niet-Helicobacter pylori helicobacters (NHPH) kunnen
onderverdeeld worden in enterohepatische NHPH die hoofdzakelijk de lever of darmen van de
gastheer kunnen koloniseren en al dan niet klachten kunnen veroorzaken en gastrale NHPH die in de
maag van dier en mens kunnen worden aangetroffen. Tot op heden zijn er 32 officieel erkende
species van het genus Helicobacter, deze zijn reeds beschreven in 142 vertebraten en ongetwijfeld
zal dit aantal nog toenemen in de toekomst (1-7). Helicobacter suis, de gastrale Helicobacter soort die
onderwerp uitmaakt van deze masterproef, behoort tot de groep van de NHPH en koloniseert
voornamelijk de maag van varkens, maar is tevens de meest voorkomende gastrale NHPH bij de
mens (1,8-10).
Helicobacter suis is een Gram-negatieve, micro-aërofiele, niet sporulerende bacterie en bezit
dezelfde typische spiraalvorm als de meeste andere NHPH. Vaak zijn 3 tot 8 dense wendingen
aanwezig. De bacterie heeft daarnaast 4 tot 10 flagellen aan beide afgeplatte uiteinden, waardoor
deze mobiel is en zich snel kan voortbewegen in de maagmucus. De lengte van de bacterie varieert
van 2,3 tot 6,7 µm en de breedte van 0,9 tot 1,2 µm (11). Aangezien deze kiem het specifieke en zure
milieu van de maag koloniseert, zijn isolatie en cultuur in vitro zeer moeilijk uit te voeren. Pas in 2008
is er voor het eerst een succesvolle isolatiemethode beschreven (12). Naast isolatie zijn er nog andere
testen beschikbaar om H. suis, en in het algemeen de gastrale helicobacters, te identificeren. Deze
methodes zijn velerlei: zilverkleuring, scanning elektronen microscopie, transmissie elektronen
microscopie, histologie,… Om echter de verschillende gastrale helicobacters, die een sterk gelijkende
morfologie kunnen vertonen, te differentiëren van elkaar, kan er gebruik gemaakt worden van
sequentiebepaling van het hsp60 gen, urease A en B genen, gyrB gen, isolatie en/of speciesspecifieke polymerase chain reaction (PCR) op basis van de bovengenoemde genen. (1,3,13-20).
Epidemiologie
Verschillende studies hebben onderzoek verricht naar het voorkomen van H. suis bij slachtvarkens en
over het algemeen wordt een prevalentie van boven de 60% beschreven (12,21-22). Dit percentage
kan echter variëren, namelijk afhankelijk van de gebruikte diagnostische test(en), het ras van het
varken, regio van huisvesting, hygiëne en management op het bedrijf en de leeftijd van de varkens
(23-24). Dit laatste heeft een vrij grote invloed op de prevalentie: zuigende biggen vertonen immers
een zeer lage prevalentie tot afwezigheid van de kiem, terwijl de prevalentie bij gespeende biggen
stijgt naar 25% en bij slachtvarkens tot 80% en meer kan bedragen. Aangezien de prevalentie bij
volwassen varkens hoog is, kan men besluiten dat er vaak een soort evenwicht ontstaat tussen de
kiem en haar gastheer, waarbij de uitgelokte immuunrespons niet voldoende is om de kiem volledig te
elimineren (22). Daarnaast heeft de leeftijd van het varken een duidelijke invloed op de distributie van
de kiem in de maag. Helicobacter suis bevindt zich vooral in het antrum of de pylorus regio bij
zuigende biggen tot en met hun slachtleeftijd. Bij het volwassen worden van de gastheer, worden de
kiemen meer en meer teruggevonden in de fundus regio (22,25).
2
Naast het varken kan ook de mens geïnfecteerd worden met H. suis. Zoals reeds vermeld, is
deze laatste de meest voorkomende NHPH soort bij humane patiënten met maagklachten (8).
Aangezien deze bacterie zowel bij het varken als de mens voorkomt, zijn er heel wat hypotheses
opgesteld over de mogelijke transmissie van H. suis van varken naar mens, maar tot op heden zijn
hierover weinig wetenschappelijke feiten aangetoond. De ontwikkeling van een multilocus sequentie
typeringsmethode (MLST), waarbij de genetische variatie tussen H. suis stammen in kaart wordt
gebracht, zal wellicht meer duidelijkheid kunnen scheppen over de mogelijke transmissie van
eenzelfde H. suis stam van varken naar mens (26). In een studie, gebruik makend van de MLST, is
aangetoond dat een H. suis stam in een varkensdierenarts nauw verwant is met varkensstammen die
aangetroffen worden in België (27). Frequent en intens contact met geïnfecteerde varkens (27),
consumptie of hanteren van gecontamineerd/rauw/niet genoeg doorbakken varkensvlees (28-29) en
contact met faeces/braaksel/speeksel van besmette dieren (30-33)
zijn enkele mogelijke
transmissieroutes van gastrale helicobacters van dier naar mens.
Belang van Helicobacter suis infecties bij varken en mens
Gezien de hoge prevalentie van H. suis infecties bij varkens kan men nefaste effecten verwachten,
zowel voor de gastheer zelf als voor de varkenshouderij. Meerdere studies hebben een significant
verband aangetoond tussen een H. suis infectie en de ontwikkeling van een chronische gastritis,
waarbij er een infiltratie is met lymfoïde cellen en lymfoïde follikels gevormd worden in de gastrale
mucosa van voornamelijk het antrum (25,34-38). Niet enkel H. suis, maar ook andere agentia zoals
Hyostrongylus rubidus, Ascarops spp., Physocephalus spp., Simondsia spp., Candida spp.,… kunnen
een chronische gastritis veroorzaken, eveneens in het pylorus gebied (36,39). Ook voeding kan
bijdragen tot de ontwikkeling van een chronische ontsteking van de maag (36,40). Naast het
ontwikkelen van een chronische gastritis, speelt H. suis een rol in de ontwikkeling van hyperkeratose
en ulcera ter hoogte van de pars oesophagea van de maag (22,25,37,41-43), hoewel hieromtrent nog
heel wat controverse bestaat (23-24,35-36,38,44-45). Momenteel is het immers niet duidelijk of H. suis
een primaire veroorzaker is van gastrale ulcera of eerder een secundair nefast effect heeft,
bijvoorbeeld door het vertragen van de heling van reeds bestaande ulcera ontstaan ten gevolge van
andere agentia. Voorlopig kan men enkel concluderen dat de ontwikkeling en verdere evolutie van
maagzweren multifactorieel is, waarbij niet enkel een H. suis infectie van belang is, maar wel de
combinatie met stress, slechte voeding, andere infecties,... (38,46). Het percentage slachtvarkens met
erosies of ulcera in de maag varieert tussen de 5 en 100%, met een gemiddelde rond de 60% (43,4764). Hoewel H. suis de meer distale regio’s van de maag (antrum en fundus) koloniseert, ontwikkelen
de ulcera zich voornamelijk in het meest proximale deel, de pars oesophagea. Het epitheel in deze
regio is immers niet beschermd door mucus of bicarbonaat producerende cellen, waardoor de licht
verhoornde epitheellaag heel gevoelig is aan irritatie door zuren (1,63-66). Na contact met zuren,
zoals HCl en galzuren, ontstaat er hyperkeratose en parakeratose in een poging van het epitheel om
zich te beschermen, waarna epitheeldefecten ontstaan met ontwikkeling van ulcera bij langdurig
contact met de irriterende stoffen. Op welke manier de pars oesophagea in contact komt met de
zuren, is nog niet helemaal duidelijk. Hoogstwaarschijnlijk is de oorzaak multifactorieel, met een
mogelijke belangrijke rol voor H. suis. Deze bacterie wordt immers dichtbij de pariëtale cellen, die HCl
produceren, aangetroffen, waardoor er mogelijks een directe of indirecte invloed is op de productie
van HCl met een veranderde concentratie aan maagzuur tot gevolg (1,38,41,43,45,66). Helicobacter
suis zou echter ook de productie van gastrine, dat de pariëtale cellen stimuleert, kunnen verhogen en
zo indirect een invloed hebben op de pH van de maag (37,45). Een andere verklaring zou kunnen zijn
3
dat H. suis een daling veroorzaakt van de somatostatine producerende cellen en een stijging van de
G-cellen, waardoor er een daling is van de remmende werking van somatostatine en een gestegen
gehalte aan gastrine. Dit zou kunnen gebeuren op een directe manier (67) of indirect door een
gestegen gehalte aan cytokines tijdens H. suis infecties (37,45). Naast Helicobacter suis hebben ook
andere factoren een invloed op de ontwikkeling van ulcera, zoals: ongesatureerde vetten, korte keten
vrije vetzuren, geperoxideerde vetten,… (45,65).
Vanuit economisch standpunt zijn de daling van de dagelijkse gewichtsaanzet en mogelijke
sterfte van slachtvarkens belangrijke verliesposten tijdens H. suis infecties. Experimentele infectie van
varkens met H. suis resulteert in een daling van de dagelijkse gewichtsaanzet met ongeveer 60 gram
(25). Meerdere hypotheses zijn opgesteld om dit fenomeen te kunnen verklaren. Chronische gastritis
veroorzaakt klieratrofie met een daling van het gesecreteerd pepsine, waardoor er een minder
efficiënte vertering is van voeder en aldus minder nutriënten beschikbaar zijn. Daarnaast gebruikt
H. suis als energiebron preferentieel glutamine voor zijn eigen metabolisme, wat eveneens een
belangrijke energiebron en beschermend agens is voor de gastrale en dunne darm epitheelcellen.
Mogelijks komt bij een H. suis infectie de energievoorziening voor deze laatste in het gedrang met
gedaalde functionaliteit en minder efficiënte vertering tot gevolg (68). De inflammatie, veroorzaakt door
H. suis, zorgt mogelijks ook voor een herverdeling van de energie naar het afweerstelsel, zodat er
minder energie beschikbaar is voor bijvoorbeeld de spieraanmaak. Inflammatie zorgt wellicht ook voor
een daling van de eetlust, waardoor het varken minder energie opneemt (69-70). Varkens met
ernstige ulcera, al dan niet gerelateerd aan een H. suis infectie, kunnen na een korte of lange periode
van H. suis infestatie sterven. De prevalentie van sterfte varieert van 1% tot 23% (49,71-73). De
verklaring voor deze plotse sterfte kan gezocht worden in het steeds dieper doordringen van de ulcera
met finaal een volledige perforatie van de maagwand en de ontwikkeling van fatale peritonitis tot
gevolg. Daarnaast kunnen er bloedvaten, zowel grote als kleine, beschadigd worden, waardoor het
dier in shock gaat en als het ware leegbloedt in zijn eigen maag (49,59,71-77).
Tot op heden is er weinig gekend over de mogelijke virulentieverschillen tussen NHPH voor de
mens, aangezien in het verleden vaak geen onderscheid gemaakt werd tussen de verschillende
NHPH (22,78). Het symptomenbeeld van patiënten besmet met een NHPH varieert van dysfagie,
misselijkheid, braken, abdominale pijn, opbraken van bloed, verteringsstoornissen, vermageren,
vertraagde groei tot ongemakken na het eten (79-80). Lang niet alle patiënten vertonen symptomen,
soms verloopt de infectie immers asymptomatisch (79-80). Macroscopisch zichtbare veranderingen,
die opgemerkt kunnen worden tijdens gastroscopie van patiënten besmet met NHPH, zijn het vaakst
zichtbaar in het antrum en duodenum en kunnen gaan van roodheid en oppervlakkige erosies tot
diepe ulcera met korstvorming (81-89). Naast de ontwikkeling van een chronische, actieve gastritis
(83), is er een verhoogd risico op de ontwikkeling van een mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel
(MALT) lymfoom in de maag (90).
Bestrijding van H. suis infecties
Omwille van het economisch verlies, namelijk sterfte en daling van de dagelijkse gewichtsaanzet, ten
gevolge van H. suis infecties bij slachtvarkens, de mogelijke transmissie van H. suis van varken naar
mens en de nefaste invloed van de infectie op het dierwelzijn, is het van algemeen belang de
prevalentie van H. suis infecties bij slachtvarkens te laten dalen. Gezien de nog onvolledig gekende
pathogenese van H. suis infecties en de multifactoriële oorsprong van maagulcera bij varkens, staat
de bestrijding nog niet op punt en zullen er meerdere zaken, zoals hygiëne en huisvestiging,
geoptimaliseerd moeten worden. Het gebruik van antibiotica, naar analogie met de behandeling van
4
H. pylori infecties bij de mens, is niet haalbaar in de varkensindustrie omwille van meerdere zaken.
Het financiële aspect, de gestegen arbeidsintensiviteit en de toenemende resistentieproblematiek
tegenover antimicrobiële middelen, laten het massale gebruik van antibiotica in de varkenshouderij
niet toe. Humane patiënten, geïnfecteerd met H. suis of andere gastrale helicobacters, kunnen
behandeld worden via een ‘triple therapy’, waarbij er twee antimicrobiële middelen (bijvoorbeeld
amoxicilline, clarithromycine, metronidazole,…) gecombineerd worden met een proton pomp inhibitor
(omeprazole, lansoprazole) (91). De ontwikkeling van een vaccin zou een mogelijkheid kunnen bieden
in de bestrijding van H. suis infecties bij slachtvarkens, maar tot op heden is er nog geen
vaccinformulering ontwikkeld die een volledige bescherming kan bieden tegen deze infectie (92). Wel
is er reeds onderzoek verricht naar de ontwikkeling van een potentieel vaccin tegen H. suis en aldus is
er reeds heel wat nuttige informatie verzameld, waardoor de ontwikkeling en commercialisering van
een vaccin in de nabije toekomst niet uitgesloten is. Zo weet men reeds dat er een zekere
kruisimmuniteit bestaat tussen de verschillende NHPH (93), ureA en ureB goede antigenen zijn (9495), profylactische vaccinatie meer beschermt dan therapeutische (96) en dat mucosale toediening
meer bescherming biedt dan subcutane/intramusculaire vaccinatie (97-98).
Interacties in de maag tussen gastrale helicobacters en andere micro-organismen
Tot op heden is er weinig gekend, op een paar studies na, over de mogelijke interacties tussen H. suis
en andere micro-organismen. Helicobacter suis veroorzaakt apoptose en primaire necrose van de
epitheelcellen van de maag tijdens infectie (99), waardoor gesuggereerd wordt dat de afgestorven
cellen een ideale voedingsbodem vormen voor andere agentia, zoals Lactobacillus spp. Op die manier
zou er dus mogelijks een indirecte interactie zijn tussen Helicobacter spp. en andere microorganismen (100-105). In Mongoolse gerbils is recent een interactie beschreven tussen H. suis en een
gist, Kazachstania heterogenica. Beide micro-organismen koloniseren het antrum van de maag.
Wanneer de gerbils enkel geïnfecteerd werden met de gist, was er weinig tot geen histologische
inflammatie waarneembaar. Wanneer enkel H. suis geïnoculeerd werd, was er een duidelijke
inflammatie waarneembaar die echter meer uitgesproken was na inoculatie met zowel de gist als
H. suis. Op welke manier beide micro-organismen met elkaar interageren, moet nog onderzocht
worden (106). Aangezien chronische gastritis veroorzaakt kan worden door andere agentia zoals
Hyostrongylus rubidus, Ascarops spp., Physocephalus spp., Simondsia spp. en Candida spp. (36,39)
en maagzweren ook veroorzaakt kunnen worden door andere agentia zoals Lactobacillus en Bacillus
sp. (45), kan een indirecte interactie tussen Helicobacter suis en deze micro-organismen niet
uitgesloten worden.
In tegenstelling tot H. suis is er reeds heel wat meer gekend over de flora van de maag bij
mensen en de mogelijke interacties tussen H. pylori en andere micro-organismen. Verschillende
studies hebben aangetoond dat niet enkel H. pylori de maag van mensen kan koloniseren, maar dat
eveneens andere micro-organismen kunnen overleven in deze specifieke omgeving (107-108). De
flora van de maag bij mensen kan, naast helicobacters, aldus bestaan uit een brede waaier aan
verschillende micro-organismen, zoals Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp.,
Stomatococcus
spp.,
Streptococcus
spp.,
Acinetobacter
spp.,
Brevundimonas
spp.,
Enterobacteriaceae spp., Propionibacter spp., Rhizobium spp.,… Aangezien de meerderheid van
deze bacteriën deel uitmaken van de normale flora van de mondholte en het ademhalingsstelsel,
kunnen deze mogelijks na inslikken in de maag terecht komen (107,109). Niettegenstaande de vele
klachten die gepaard kunnen gaan met een H. pylori infectie, wordt soms gesuggereerd dat deze kiem
misschien ook tot de normale gastrale flora van mensen kan gerekend worden. Niet elke stam is
5
immers even pathogeen en voor sommige stammen is zelfs beschreven dat deze bescherming
kunnen bieden tegen de ontwikkeling van andere letsels, zoals adenocarcinoma’s van de slokdarm,
alhoewel dit een controversiële bevinding blijft (107,110-112). Helicobacter pylori is in staat om
cecropins, peptides met een antibacteriële werking, te produceren die een mogelijke bescherming
kunnen bieden tegen pathogene bacteriën, zoals Escherichia coli (113-114). Daarnaast is H. pylori
niet het enige agens dat gastritis kan veroorzaken. Andere micro-organismen uit de normale gastrale
flora zoals Streptococcus spp., Pseudomonas spp. en Staphylococcus spp. zijn hiertoe eveneens in
staat (115). In een bepaalde studie is aangetoond dat bij een toename van de gastrale inflammatie
reeds aanwezige Streptococcus spp. de overhand kunnen krijgen in de maag, in het nadeel van H.
pylori kolonisatie (116). Tijdens een H. pylori infectie vertoont de pH van de maag meestal een stijging
ten gevolge van een verminderde productie van maagzuur, hoewel dit niet steeds het geval is, zoals
bijvoorbeeld bij een antrum-predominante gastritis. Het pH verhogend effect kan nogmaals worden
versterkt wanneer er proton pomp inhibitoren, zoals omeprazole, toegediend worden ter behandeling
van de infectie (117-119). Door deze pH stijging wordt een minder zuur en nefast milieu gecreëerd,
waardoor de maagmucosa gekoloniseerd kan worden door andere, minder zuurresistente bacteriën.
Dit kan beschouwd worden als een indirecte interactie tussen H. pylori en andere micro-organismen
(117,120). Er wordt gesuggereerd dat een gecombineerde infectie van H. pylori met andere bacteriën,
die ten gevolge van de pH stijging kunnen prolifereren, een sterkere inflammatie teweeg brengt, wat
op zijn beurt mogelijks aanleiding geeft tot atrofische gastritis van het corpus gedeelte van de maag
(120). Naast interacties met bacteriën kan H. pylori eveneens met gisten, voornamelijk Candida spp.,
interageren. Deze directe interactie bestaat uit een stevige adhesie van H. pylori aan de gist, hoewel
deze binding hoogstwaarschijnlijk geen enkele invloed heeft tijdens een H. pylori infectie (121).
Reeds heel wat studies zijn verricht naar mogelijke gunstige werking(en) van Lactobacillus (L.)
spp. op H. pylori infecties en de resultaten zijn veelbelovend om deze bacteriën als mogelijk
probioticum in te zetten. Lang niet alle Lactobacillus stammen komen hiervoor in aanmerking. Slechts
bepaalde stammen vertonen een inhiberende invloed op de groei van H. pylori, zoals L. plantarum
MLBPL1, L. pentosus, L. salivarius WB 1004, L. acidophilus LB, L. johnsonii La1, L. casei subspecies
rhamnosus,… (122-128). Deze interacties kunnen zich op meerdere manieren uiten, zoals een
remmende werking op de groei van H. pylori, zowel in vitro (122-124,126,128-129) als in vivo
(116,123,125-127,130), hoewel Lactobacillus spp. over het algemeen een minder remmende werking
bezitten onder in vivo omstandigheden. De resultaten van sommige studies tonen aan dat een hoge
concentratie melkzuur, een belangrijke metaboliet van Lactobacillus spp., aan de basis ligt van de
groeiremming op H. pylori (123,128). Een behandeling per os met enkel melkzuur is echter niet in
staat een volledige eradicatie van H. pylori te veroorzaken bij een experimenteel geïnduceerde
gastrale infectie, terwijl dit wel het geval was na behandeling met enkel Lactobacillus spp. Mogelijks
kan deze bevinding te wijten zijn aan het gebruik van gnotobiotische muizen (123). Omwille van die
tegenstrijdigheden zijn er studies uitgevoerd naar mogelijke metabolieten die een groeiremming
kunnen veroorzaken. Niettegenstaande exacte molecule(s), die een remmende werking uitoefenen op
H. pylori, tot op heden nog niet geïdentificeerd zijn, zijn de desbetreffende molecules al wel deels
gekarakteriseerd. Het moleculair gewicht ligt tussen 3000 en 10000 Da (uitsluiting van organische
zuren), er treedt een verlies op van werking bij een pH van 6 of meer, de molecule(s) zijn
hitteresistent, onafhankelijk van het al dan niet voorkomen van ureum en bovendien ook resistent
tegenover de werking van meerdere enzymes zoals pepsine, amylase, proteïnase K, N-glycosidase F
en neuraminidase (122,124,126,129,131-132). Aangezien de nog onbekende molecule(s) van
Lactobacillus spp. resistent is tegenover al deze enzymes, behoort deze hoogstwaarschijnlijk niet tot
de reeds ontdekte en beschreven bacteriocines. Een interessante bijkomende bevinding was dat na
6
toevoeging van N-glycosidase F, de remmende werking van een Lactobacillus stam, MLBPL1,
tegenover H. pylori nog meer uitgesproken was, waardoor de onbekende, actieve molecule mogelijks
ontstaat na klieving van een grotere, inactieve molecule (122). Een andere mogelijkheid om de
remming op H. pylori infecties te verklaren, is de competitieve binding tussen Lactobacillus spp. en
H. pylori voor dezelfde receptoren die zich bevinden op het maagepitheel (123,133) of ten gevolge
van aspecifieke, sterische hinder na binding van Lactobacillus spp. aan andere bindingsplaatsen,
waarna H. pylori niet meer kan binden op de gastrale receptoren waar de kiem normaal aan kan
binden. (125,134). Naast productie van een molecule, competitie voor bindingsplaatsen en sterische
hindering van receptoren, zou immunomodulatie eveneens een verklaring kunnen zijn voor de
remmende werking van Lactobacillus spp. op H. pylori. In een studie met Lactobacillus spp.
geïnfecteerde muizen waarna H. pylori oraal werd toegediend, is immers aangetoond dat de productie
van IL-8, een pro-inflammatoir cytokine dat vrijgesteld wordt na binding van H. pylori met de gastrale
epitheelcellen, sterk onderdrukt wordt. Om deze reden is de algemene ontstekingsreactie minder
uitgesproken. Deze daling van de expressie van IL-8 kan mogelijks verklaard worden door de
gedaalde binding van H. pylori met de receptoren op het maagepitheel door de aanwezigheid van
Lactobacillus spp. en productie van inhiberende metabolieten (125).
Tijdens een menginfectie met meerdere Helicobacter spp., kan mogelijks interactie tussen
deze bacteriën tot stand komen. Een studie naar de prevalentie van Helicobacter spp. bij 425 wilde
huismuizen in centraal Europa heeft aangetoond dat 42% van de muizen een co-infectie met 2
Helicobacter species vertoonden en 21% een infectie met 3 verschillende Helicobacter species.
Slechts 30% van de onderzochte muizen waren geïnfecteerd met één bepaald Helicobacter species
(135). Bij humane patiënten zijn er eveneens co-infecties aangetoond (136), meerbepaald met
“Helicobacter heilmannii” en H. pylori. Deze dubbele infectie werd slechts aangetoond bij 2 van de 8
patiënten met een “H. heilmannii” infectie. Belangrijk is hierbij te vermelden dat de aangetroffen
bacteriën tot de NHPH groep behoren, zonder exacte species identificatie, waardoor in een aantal
gevallen mogelijks H. suis aanwezig was. In deze patiënten werd bij een menginfectie een actieve
inflammatie opgemerkt, terwijl bij patiënten die enkel met “H. heilmannii” geïnfecteerd waren een
chronische gastritis werd opgemerkt. Mogelijks heeft dit te maken met het veroorzaken van een
verschillende immuunrespons door beide Helicobacter spp., H. pylori infectie geeft immers een sterke
stijging van tumor necrosis factor alfa (TNF-α), in tegenstelling tot “H. heilmannii”/NHPH (136).
Experimenteel onderzoek met muizen heeft eveneens een lagere expressie van TNF-α aangetoond bij
co-infectie met H. pylori en andere Helicobacter spp. (137). Een andere studie bij humane patiënten
uit Zuid-Afrika heeft echter aangetoond dat een co-infectie met H. felis en H. pylori geen duidelijke
verschillende pathologieën veroorzaakt, vergeleken met een infectie met enkel H. pylori. Gezien bij
een H. felis infectie vaak minder atrofie wordt opgemerkt in vergelijking met H. pylori, wordt
gesuggereerd dat deze eerste mogelijks een beschermende functie zou uitoefenen tegen de atrofie
veroorzaakt tijdens een H. pylori infectie (138). Dit zou volgens de auteurs een mogelijke verklaring
kunnen zijn voor de lagere prevalentie van gastrale carcinoma’s bij een Afrikaanse populatie met een
hoge prevalentie van H. pylori (139). Een gewijzigde immuunrespons werd eveneens opgemerkt in
een studie met C57BL/6 muizen, geïnfecteerd met de combinatie H. pylori en H. muridarum of H.
pylori en H. hepaticus. Bij de eerste gecombineerde infectie waren de gastritis en gastrale laesies
minder uitgesproken en daarnaast werd er ook een minder uitgesproken T-helper 1 (Th-1)
lymfocytenrespons (met gedaalde expressie aan TNF-α, interferon gamma (IFN-γ) en interleukine 1
bèta (IL-1β)) en een minder uitgesproken Th-17 respons (met gedaald gehalte aan IL-17A)
waargenomen. Bij een co-infectie met H. hepaticus werd echter een ergere graad van gastrale
pathologieën vastgesteld, gecorreleerd met een meer uitgesproken Th-17 respons. Bij beide
7
co-infecties werd een hogere kolonisatiegraad van H. pylori in de maag waargenomen. De reden voor
de ergere graad van gastritis moet dus hoogstwaarschijnlijk gezocht worden in het gestegen gehalte
aan IL-17A (137). In een bepaalde studie werd bij humane patiënten met de ziekte van Parkinson een
significant hogere prevalentie van H. suis in de maag aangetoond na een anti-H. pylori behandeling
(amoxicilline of chlarythromycine met een proton pomp inhibitor). Hoogstwaarschijnlijk was er reeds
een co-infectie met beide gastrale kiemen aanwezig voor de behandeling, waarna H. suis de
bovenhand kon nemen na het verdwijnen van H. pylori uit de maag (140). Dit werd eveneens
aangetoond in een studie met rhesus apen, waarbij een omgekeerd evenredige relatie bestond tussen
de kolonisatiegraad van H. suis en H. pylori in de maag. Hoogstwaarschijnlijk zijn deze fluctuaties te
wijten aan individuele, tot op heden ongekende factoren (141).
Doel van het onderzoek
Zoals hoger beschreven, veroorzaakt een H. suis infectie nefaste effecten voor mens, varken en
economie, waardoor H. suis bestrijding bij slachtvarkens van algemeen belang is. Op deze manier kan
de prevalentie van H. suis bij slachtvarkens dalen en zo ook de kans op transmissie van varken naar
mens verkleinen. Systematische toediening van antibiotica, zoals in de humane geneeskunde, wordt
niet aangeraden in de industriële varkenshouderij omwille van opkomende resistentieproblematiek
tegen antimicrobiële middelen, financiële redenen en arbeidsintensiviteit. In ontwikkelingslanden geldt
eveneens de financiële beperking, waardoor antibiotica toediening niet steeds haalbaar is in de
humane geneeskunde. Wanneer aldus de primaire bron van H. suis infecties, namelijk varkens, wordt
aangepakt, zullen minder humane patiënten behoefte hebben aan een H. suis antibiotica behandeling.
Daarnaast is er nog geen optimaal vaccin ontwikkeld tegen H. suis infecties voor gebruik bij varkens,
waardoor vaccinatie tot op heden niet commercieel ingezet kan worden. Omwille van deze redenen
bestaat het hoofddoel van dit onderzoek erin om na te gaan of een haalbaar alternatief ontwikkeld kan
worden in de bestrijding van H. suis infecties bij slachtvarkens.
Een mogelijk alternatief zou namelijk de ontwikkeling van een probioticum kunnen zijn. Dit
omvat het per oraal toedienen van andere, levende micro-organismen aan het dier waardoor de
kolonisatie van pathogene kiemen sterk gereduceerd wordt door bijvoorbeeld competitie voor
nutriënten, bindingsplaatsen, productie van inhiberende metabolieten,... Het gebruik van probiotica
kan in de varkenshouderij immers financieel haalbaar zijn, is relatief vlot te commercialiseren en
bovendien wordt op die manier de ontwikkeling van antimicrobiële resistentie bij H. suis of andere
micro-organismen niet in de hand gewerkt. Tot op heden is er echter geen informatie bekend omtrent
de inhiberende interacties van micro-organismen op H. suis, in tegenstelling tot H. pylori.
Vooraleer een dergelijk probioticum ontwikkeld kan worden, is het noodzakelijk na te gaan
welke mogelijke, al dan niet directe, interacties er bestaan tussen H. suis en andere micro-organismen
in de maag. Hiertoe zal de samenstelling van de gastrale microbiota bij H. suis-negatieve varkens met
een gezonde maag onderzocht worden en bovendien zal worden nagegaan in welke opzichten deze
verschilt van H. suis-geïnfecteerde varkens, al dan niet met gastritis of andere laesies. Om de
microbiota te kunnen vergelijken, zullen stalen genomen worden van ad random verzamelde
varkensmagen afkomstig uit het slachthuis. Deze stalen zullen onderzocht worden op aan- of
afwezigheid van H. suis koloniserende kiemen, graad van gastritis en ergheid van laesies ter hoogte
van de pars oesophagea. Aan de hand van deze criteria zullen 2 groepen dieren gevormd worden die
verder onderzocht zullen worden: 1. aanwezigheid van H. suis, erge gastritis en uitgesproken laesies
ter hoogte van de pars oesophagea; 2. afwezigheid van H. suis, milde gastritis en weinig tot geen
laesies ter hoogte van de pars oesophagea. Vervolgens dienen interacties tussen H. suis en andere
8
micro-organismen bestudeerd en gunstige micro-organismen geselecteerd te worden. Vooraleer dit
mogelijk is, zal de samenstelling van de gastrale microbiota bij de geselecteerde H. suis-positieve en
–negatieve dieren bepaald worden door middel van bacteriële cultivatie, sequenering en een
metagenomics benadering. Vervolgens zal via in vitro (co-)cultuur experimenten nagegaan worden of
bepaalde bacteriën een inhiberende invloed kunnen uitoefenen op H. suis. Op deze manier kunnen
interessante stammen geselecteerd worden als mogelijk probioticum. Dit moet daarna nog getest
worden in vivo om het gunstig effect van het probioticum al dan niet aan te tonen. De beperkte tijd
beschikbaar voor dit onderzoek laat echter niet toe om dit zelf uit te voeren.
9
MATERIAAL EN METHODEN
1. Detectie van H. suis in varkensmagen en pathologische veranderingen in de maag
1.1. Staalname
Al het materiaal (scharen, pincetten, mesjes, epjes, schalen,…) werd voor gebruik gesteriliseerd in de
autoclaaf Matachana S1000® (Matachana, Barcelona, Spanje). Na sterilisatie werd het materiaal in
een gesloten ruimte onder een UV-lamp geplaatst gedurende een twintigtal minuten om eventuele
contaminatie met DNA van prokaryoten uit te sluiten. Gespreid over meerdere weken werden ad
random 68 ongeopende magen van klinisch gezond verklaarde slachtvarkens (geen fokzeugen)
verzameld uit het slachthuis ‘De Lokery’, te Lokeren. Slachtvarkens worden in België geslacht op een
gemiddelde leeftijd van 26-28 weken. Deze gesloten magen werden elk afzonderlijk in een plastic,
steriele zak geplaatst en meteen overgebracht naar het laboratorium waar deze bewaard werden bij
4°C tot verdere verwerking binnen een tijdspanne van maximaal 2 h. Vervolgens werden de magen
één voor één geopend langs de curvatura major, gaande van de slokdarmopening tot de pylorische
sfincter, met behulp van een weefselschaar. De resterende maaginhoud werd voorzichtig uitgespoeld
met een geautoclaveerde fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Deze PBS wordt zelf aangemaakt
in het laboratorium met 1 liter Aqua Dest. (pH 7,3) waaraan 8 g natriumchloride, 0,34 g KH2PO4 en
1,21 g K2HPO4 (watervrij) per liter wordt toegevoegd.
De magen werden macroscopisch onderzocht op aanwezigheid van laesies ter hoogte van de
pars oesophagea, waarna een score per varkensmaag werd toegekend, gaande van 0 tot 5, via de
methode van Hessing (142). Score 0 staat voor een normale mucosa, score 1 een milde
hyperkeratose die minder dan 50% van het oppervlak bedekt, score 2 een erge hyperkeratose die
meer dan 50% van het oppervlak bedekt, score 3 hyperkeratose met een paar kleine erosies (minder
dan 5 en/of kleiner dan 2,5 cm), score 4 hyperkeratose met veel erosies (meer dan 5 en/of groter dan
2,5 cm) en score 5 hyperkeratose met heel veel erosies (meer dan 10 en/of groter dan 5 cm) en/of
ulcer(a). Daarna werden er, voor elke maag afzonderlijk, ad random stalen genomen van de pars
oesophagea, cardia, fundus en het antrum (dichtbij de torus pyloricus) (figuur 1). Hierbij werd gewerkt
met een fijne weefselschaar en een atraumatische pincet. Voor elke regio van de maag en voor de
verschillende magen afzonderlijk werden andere instrumenten gebruikt om kruiscontaminatie te
vermijden. Het proces werd voor elke maag 2 keer (voor DNA extractie en histopathologisch
onderzoek) herhaald, zodat er in totaal 8 stalen per slachtvarken bekomen werden.
De stalen voor DNA extractie werden enkel van de maagmucosa genomen zonder
submucosa en diepere weefsellagen, gezien de oppervlakkige kolonisatie van de bacteriën in de
maag (36,38,43), wogen elk gemiddeld 40-50 mg en werden afzonderlijk bewaard in 1,5 ml Eppendorf
PCR tubes® (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) (epjes). Deze laatste waren reeds elk met 180 µl ALT
buffer® (Qiagen, Hilden, Duitsland) (de eerste stap voor de DNA extractie, zie 1.4.) gevuld om
uitdroging van de stalen te voorkomen. De biopten voor histopathologisch onderzoek werden van de
volledige maagwand (zowel maagmucosa als tunica muscularis) gepreleveerd, waren gemiddeld 2 cm
lang, 0,5 cm breed en 0,5 cm dik en werden met behulp van kopspelden vastgemaakt op een blokje
isomo, waarna ze gefixeerd en bewaard werden in een 10% fosfaat gebufferde formaline oplossing tot
verder gebruik. Eveneens werden er stalen genomen van de maagmucosa met een gemiddeld
gewicht rond 300 mg, deze werden bewaard bij -70°C als reservemateriaal.
Om een globaal idee te krijgen over mogelijke verschillen in bacteriële kolonisatie tussen de
verschillende regio’s van de maag, werden er per slachtvarken extra stalen genomen van de pars
oesophagea, cardia, fundus en het antrum. Deze stalen werden bekomen door het voorzichtig rollen
10
van een steriele, katoenen swab over een deel van het oppervlak van de gewenste maagregio. Per
slachtvarken werden telkens 2 agarplaten (BP5039A Columbia agar with sheep blood PLUS® (Oxoid,
Basingstoke, Verenigd Koninkrijk)) gebruikt, waarbij elke helft gecodeerd werd voor één van de vier
bemonsterde regio’s. Daarna werden de swabs uitgerold over de helft van de agar van de
overeenkomstige regio. Om het effect van het reinigen van de maaginhoud met PBS na te gaan,
werden er bij een viertal magen (P13-16, P = varken) swabs genomen, zowel voor als na het spoelen
en overgeënt op een agarplaat. Nadat al de bovenstaande stappen uitgevoerd waren, werd de mucus
van de maag (cardia, fundus en antrum) vanaf P6 afgeschraapt met behulp van een glazen
dekplaatje, in een steriel, plastic potje gebracht en bewaard bij -20°C tot verder gebruik.
Fig. 1: Maag van slachtvarken 5, geopend langs de curvatura major. De regio’s van staalname voor
histopathologisch onderzoek, DNA extractie en swabs zijn aangeduid met de volgende cijfers: 1 =
pars oesophagea, 2 = cardia, 3 = fundus, 4 = antrum.
1.2. Incubatie en beoordeling van de agarplaten
De agarplaten werden gedurende 24 h geïncubeerd in een broedstoof bij een temperatuur van 37°C
en een micro-aërofiele atmosfeer met 10% CO2, 5% O2 en 85% N2. De platen werden daarna
gecontroleerd op aanwezigheid van bacteriële groei, het type kolonie, aantal kolonies en eventuele
duidelijke verschillen tussen de 4 maagregio’s. Na beoordeling werden de platen bewaard bij 4°C.
1.3. Histopathologisch onderzoek
Na 24 h fixatie in de 10% fosfaat gebufferde formaline, werden de stalen uit de oplossing gehaald en
met een steriel bistourimesje, nummer 24, werd gezorgd voor minstens één rechte zijde van het
weefselstukje. De biopten werden elk afzonderlijk overgebracht in biopsy cassettes® (Leica
Biosystems, Wetzlar, Duitsland) en vervolgens ingebed in een blokje paraffine in het laboratorium van
de Vakgroep Pathologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, Salisburylaan nr. 133,
Merelbeke). Per staal werd een coupe van 5 µm dik gesneden met behulp van een microtoom. Na het
snijden, werden de coupes gehydrateerd en gedeparaffineerd in alcohol-xyleen oplossingen,
vervolgens gekleurd met haematoxyline en eosine (HE) en daarna gedehydrateerd. Het gehanteerde
protocol wordt vermeld in tabel 1. Als laatste stap werden de coupes met een dekglaasje gemonteerd.
Deze coupes werden vervolgens beoordeeld met een lichtmicroscoop, waarbij gelet werd op
infiltratie met ontstekingscellen en vorming van lymfoïde follikels. De gastritis in de fundus en het
antrum werd gescoord aan de hand van beschrijvingen van een tweetal studies (25,143). Als eerste
11
werd de vorming van lymfoïde follikels in de mucosa en submucosa gescoord per coupe. Score 0
staat voor een totale afwezigheid van lymfoïde aggregaten, score 1 voor de aanwezigheid van enkele
lymfoïde aggregaten (< 5), score 2 voor een groot aantal lymfoïde aggregaten (≥ 5) en/of de
aanwezigheid van 1 georganiseerde lymfoïde follikel en score 3 voor de aanwezigheid van minstens 2
georganiseerde lymfoïde follikels. Een georganiseerde lymfoïde follikel is te herkennen aan het
blekere, germinaal centrum omgeven door een meer dense band van lymfocyten. Daarna werd de
infiltratie met lymfoïde ontstekingscellen in de lamina propria gescoord, waarbij score 0 een
afwezigheid van infiltratie betekent, score 1 een lichte infiltratie, score 2 een matige infiltratie en score
3 een erge infiltratie (figuur 3). Vervolgens werd het biopt van de pars oesophagea beoordeeld om na
te gaan of de reeds toegekende, visuele score voor laesies correct gegeven was. Daarna werd de
cardia beoordeeld op aanwezigheid van mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel en infiltratie met
ontstekingscellen, wat eveneens gescoord werd zoals hoger beschreven voor fundus en antrum.
Een mogelijk verband tussen zowel laesies ter hoogte van de pars oesophagea en gastritis in
cardia, fundus en antrum als gastritis in cardia, fundus en antrum onderling werd onderzocht met
behulp van de SPSS statistics 22® (IBM, Armonk, New York) software. Hiervoor werden de opties
‘bivariate correlations’, ‘pearson correlation coefficient’ en ‘two tailed test of significance’ geselecteerd.
Tabel 1: Protocol voor HE-kleuring.
Fase
Tijd (min)
Reagens
Deparaffinatie
3
Xyleen
Deparaffinatie
3
Xyleen
Deparaffinatie
3
Xyleen
Deparaffinatie
3
Isopropylalcohol
Deparaffinatie
3
Isopropylalcohol
Deparaffinatie
3
95% alcohol
Deparaffinatie
3
50% alcohol
Spoelen
3
Leidingwater
Kleuren
3
Hematoxyline
Spoelen
3
Leidingwater
Kleuren
3
Zure alcohol
Spoelen
3
Leidingwater
Kleuren
3
Alkalische alcohol
Spoelen
3
Leidingwater
Kleuren
3
Eosine
Dehydratatie
3
95% alcohol
Dehydratatie
3
Isopropylalcohol
Dehydratatie
3
Xyleen
Dehydratatie
3
Xyleen
Dehydratatie
3
Xyleen
De stappen worden in volgorde vermeld van uitvoering. Tijd = hoelang de coupe in het reagens
verblijft uitgedrukt in minuten, reagens = oplossing waarin de coupe wordt gehouden. Op deze manier
worden de 5 µm dunne coupes van de maag aangekleurd met haematoxyline en eosine, waarbij de
zure componenten in de cel blauw tot paars aankleuren (door haematoxyline) en de basische
componenten roze aankleuren (door eosine, dat zelf een zure kleurstof is).
12
Fig. 2: Om de histologische coupes, genomen van elke regio van de maag, te kunnen scoren op
lymfoïde infiltratie werd gebruik gemaakt van een gemodificeerde schaal. In deze afbeelding wordt de
graad van lymfoïde infiltratie visueel voorgesteld met, van links naar rechts, de volgende graden:
normaal, licht, matig en erg (Uit Dixon et al, 1996) (143).
1.4. Detectie van H. suis in de maagmucosa via DNA extractie en qPCR
De aan- of afwezigheid en kolonisatiegraad van H. suis in de maag van de slachtvarkens werd door
middel van DNA extractie en qPCR onderzocht. Het DNA van de verschillende stalen werd
geëxtraheerd met behulp van DNeasy Tissue Kit® (Qiagen, Hilden, Duitsland). Hierbij werd het
protocol van de fabrikant grotendeels gevolgd, maar extra stappen werden toegevoegd. Nadat de
eerste stappen van het protocol, namelijk het toevoegen van 180 µl ALT buffer® (reeds toegevoegd
tijdens de staalname, zie 1.1.) en 20 µl proteïnase K® (Qiagen, Hilden, Duitsland) uitgevoerd waren,
werd het geheel overnacht geïncubeerd bij 56°C om volledige lyse te verkrijgen. Vervolgens werd een
1,2% hoeveelheid van het eindvolume aan Triton
TM
X-100® (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri) en
20 mg/ml lysozyme (from chicken egg white: cat. no. 62971-10G-F® (Sigma-Aldrich, Saint Louis,
TM
Missouri)) toegevoegd en daarna 1 h geïncubeerd bij 37°C. Triton
X-100® werd toegevoegd om het
taaie mucus te lyseren en lysozyme voor een betere lyse van bepaalde Gram-positieve bacteriën,
zoals Corynebacterium spp. en Bacillus subtilis, met een moeilijk lyseerbare celwand. Na een paar
seconden in de vortex werd 4µl RNase® (100 mg/ml) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri)
toegevoegd om de afwezigheid van het mogelijks interfererende RNA tijdens de qPCR te verzekeren,
het geheel werd daarna 5 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. Vervolgens werd 200 µl AL buffer®
(Qiagen, Hilden, Duitsland) toegevoegd en 30 min geïncubeerd bij 56°C. Vanaf hier werd het protocol
van de fabrikant opnieuw gevolgd: het toevoegen van ethanol, op kolom brengen, wassen en bufferen
van het mengsel. Het incuberen van de epjes op een bepaalde temperatuur gebeurde met behulp van
een blokthermostaat, waarbij de gewenste temperatuur ingesteld werd. Nadat het DNA geëxtraheerd
was, werd 20 µl van elk staal overgebracht in een apart epje en bewaard bij -20°C tot verder gebruik
in het eigen laboratorium. Het resterende geëxtraheerde DNA werd eveneens bewaard bij -20°C als
reservemateriaal.
Er dient vermeld te worden dat na het toevoegen van ethanol en de eerste centrifugatie stap
(1 min aan 8000 rpm), er regelmatig kleine propjes van ongelyseerde mucus een blokkade van de
filter veroorzaakten. Om het probleem op te lossen, moest er een extra minuut aan 8000 rpm
gecentrifugeerd worden om de bovenstaande vloeistof af te centrifugeren. Zoals hieronder vermeld
wordt, had de extra minuut echter geen invloed op de DNA extractie zelf.
13
Om uit te sluiten dat het aangepaste DNeasy Tissue Kit® protocol een mogelijke invloed had
op het gehalte aan geëxtraheerd DNA, werd het aangepaste en het oorspronkelijke protocol
vergeleken met elkaar op één staaltje: de mucosa van de pars oesophagea van P4. Daarna werd een
analyse van een druppeltje geëxtraheerd DNA uitgevoerd met behulp van de spectrofotometer
NanoDrop 3300® (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware), waarbij een vergelijkbare concentratie
aan DNA van een gelijkaardige kwaliteit werd bekomen. Hieruit kan besloten worden dat het
aangepaste protocol zeer weinig tot geen invloed heeft op de DNA extractie.
Vervolgens werd een qPCR uitgevoerd om de aan- of afwezigheid van H. suis aan te tonen en
het aantal bacteriën te bepalen. De qPCR werd uitgevoerd met behulp van een Hard-Shell 384-Well
480 PCR Plate® (Bio-Rad, Hercules, California) ingebracht in een C1000 Touch
TM
Thermal cycler®
TM
(Bio-Rad, Hercules, California) toestel uitgerust met de CFX384 Touch -Real Time PCR Detectie
Systeem® (Bio-Rad, Hercules, California) software. Voor detectie van H. suis werd gebruik gemaakt
van de forward (5’-AAA ACA MAG GCG ATC GCC CTG TA-3’’) en reverse (5’-TTT CTT CGC CAG
GTT CAA AGC G-3’’) primers (primerpaar 1) (Integrated DNA technologies, Coralville, Iowa), elk aan
een eindconcentratie van 0,5 pmol/µl, die een 150 basenparen fragment van het ureA gen
amplificeren. Telkens werd er in duplicaat gewerkt. In de plaat werd ook een externe standaardreeks
aangelegd met een gekend aantal kopijen van een 1541 baseparen lang fragment van de ureA-ureB
genencluster. Hiervoor werden eerst 10 epjes gevuld met 45 µl water for chromatography LiChrosolv®
10
(HPLC) (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland), waarna 5 µl van een standaardhoeveelheid (10 kopijen
per µl) werd overgebracht in het eerste epje met water. Daarna werd 5 µl genomen van dit eerste
epje, overgebracht in het tweede, etc. Op deze manier werd een verdunningsreeks bekomen gaande
9
0
van 10 tot 10 aantal kopijen van het ureA-ureB gen van H. suis per epje. De bekomen hoeveelheid
geamplificeerd ureA gen per staal kon daarna vergeleken worden met de standaardreeks om een vrij
nauwkeurige schatting van de hoeveelheid aanwezige H. suis bacteriën mogelijk te maken.
Kwantificatie werd mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een fluorescente merker (SYBR
green I) die specifiek bindt op dubbelstrengig DNA en emissielicht uitzendt wanneer de plaat belicht
wordt met een laser van een welbepaalde golflengte (excitatielicht). Elke well van de plaat, zowel voor
de verdunningsreeks als de stalen zelf, werd gevuld met 5 µl SensiFAST™ SYBR No-ROX® (Bioline,
Londen, Verenigd Koninkrijk), 0,25 µl van elke primer (Integrated DNA technologies, Coralville, Iowa)
en 3,5 µl HPLC water. De SensiFAST
TM
SYBR No-ROX® bevat SYBR green I, DNA polymerase en
een mengsel van de 4 deoxyribonucleoside trifosfaten (dNTP’s: dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Tussen
de standaard-verdunningsreeks en de stalen werden 2 rijen welletjes niet gebruikt om contaminatie
van deze eerste naar de stalen te vermijden. In elke well, behalve deze van de standaardverdunningsreeks, werd vervolgens 1 µl van het geëxtraheerde DNA van elk staal toegevoegd zodat
een eindvolume van 10 µl bekomen werd. Voor de standaardreeks werd elke well eveneens gevuld
met 1 µl DNA, maar dan van de verschillende verdunningen, aangemaakt zoals hierboven
beschreven. Als laatste stap van de voorbereiding werd de plaat afgedekt met een Microseal B
Adhesive Sealer MSB-1001® (Bio-Rad, Hercules, California) en gecentrifugeerd gedurende 1 min aan
1500 omwentelingen per minuut (rpm). De initiële fase van het qPCR programma bestaat uit een
activatie fase (95,0°C gedurende 10 min), gevolgd door 47 cycli elk bestaande uit een denaturatie
stap (95,0°C gedurende 20 s, DNA wordt enkelstrengig gemaakt), gevolgd door een annealing stap
(62,0°C gedurende 20 s, primers hechten aan) en een elongatie stap (72,0°C gedurende 20 s,
activatie DNA polymerase en aanmaken van de complementaire DNA streng in de 5’-3’ richting met
verbruik van de dNTP’s), waarbij de fluorescentie van SYBR green I gemeten wordt op het einde van
de elongatie. Er bestaat een recht evenredig verband tussen de hoeveelheid geamplificeerd DNA en
de fluorescentie intensiteit door het binden van SYBR green I aan dubbelstrengig DNA. Op deze
14
manier kan een nauwkeurige kwantificatie van een bepaald doelwitgen (in casu een deel van het ureA
gen van H. suis) in het onbekend staal bekomen worden. Het toestel leest daarna de totale
fluorescentie van de plaat af, waarbij de begintemperatuur van 65°C telkens met 5°C wordt
opgedreven tot 95°C, waardoor het mogelijk wordt een smeltcurve op te stellen van het geamplificeerd
DNA. Bij een bepaalde temperatuur treedt voor een specifiek DNA fragment namelijk dissociatie op,
wat gepaard gaat met een sterke daling van de fluorescentie. Naargelang de lengte en samenstelling
van de dubbelstrengige fragmenten verschilt de dissociatietemperatuur. Analyse van deze
zogenaamde smeltcurve met behulp van CFX Manager
TM
Version 2.1 software® (Bio-Rad, Hercules,
California) laat met andere woorden toe om aspecifieke reacties te detecteren. Het fluorochroom
SYBR green I bezit een hoge affiniteit voor elk dubbelstrengig DNA en kan dus eveneens binden op
andere DNA fragmenten, zoals bijvoorbeeld aspecifiek geamplificeerde PCR fragmenten met een
andere lengte of AT/GC verhouding. De specifieke smelttemperatuur van het geamplificeerde H. suis
ureA fragment kon nauwkeurig afgeleid worden uit de standaardreeks en bedroeg 80,5°C. Elk staal
waarbij de smelttemperatuur gelegen was tussen 79,5 en 81,5°C werd beschouwd als sterk verdacht
positief voor aanwezigheid van H. suis. Alles wat niet tussen deze grenzen viel, was negatief,
aangezien de bekomen signalen afkomstig waren van het fluorochroom gebonden aan ander
dubbelstrengig DNA dan het ureA gen. Wanneer de quantification cycle (Cq) van de stalen, met een
0
smelttemperatuur binnen het interval, gelegen was onder de Cq van de laagste standaard (10 ), dan
werd dit staal beschouwd als zijnde positief. Stalen met een Cq hoger dan deze van de laagste
standaard waren hoogstwaarschijnlijk vals positief ten gevolge van contaminatie (eventueel vanuit de
standaardreeks naar de stalen). Indien de variatie van de hoeveelheid geamplificeerd ureA gen tussen
de duplicaten van elk staal niet meer bedroeg dan 0,5, werd het gemiddelde van de duplicaten
genomen als opbrengst aan aantal H. suis kiemen. Wanneer het verschil meer dan 0,5 bedroeg, werd
de qPCR opnieuw uitgevoerd voor dit staal.
De qPCR werd nogmaals uitgevoerd op dezelfde wijze voor alle stalen, maar dan met andere
forward (5’-CAC CAC CCC GGG GAA GTG ATC TTG-3’’) en reverse (5’-CTA CAT CAA TCA AAT
GCA CGG TTT TTT CT-3’’) primers (primerpaar 2) (Integrated DNA technologies, Coralville, Iowa),
verschillend in nucleotidensequentie van de eerste primers. Deze primers amplificeren ook het ureA
gen van H. suis, maar dan van een langer DNA fragment van dit gen, namelijk 252 baseparen. Het
volgend PCR programma werd gebruikt: 95,0°C gedurende 15 min, gevolgd door 47 cycli telkens
bestaande uit een opeenvolging van 95,0°C gedurende 20 s, 60,0°C gedurende 30 s en 73,0°C
gedurende 30 s. Het aflezen van de plaat, analyse van data en bepaling van smeltcurve gebeurde op
dezelfde wijze zoals reeds hoger beschreven.
1.5. Detectie van H. suis in de mucus via DNA extractie en qPCR
Uit de mucus van elke maag werd eveneens het DNA geëxtraheerd, waarna met behulp van qPCR de
aan- of afwezigheid van H. suis werd gedetecteerd en gekwantificeerd. Vervolgens werden de
resultaten van de maagmucus vergeleken met de genomen stalen voor DNA extractie beschreven
onder 1.4. De H. suis-positieve en -negatieve varkens werden vervolgens geselecteerd aan de hand
van de resultaten van H. suis detectie uit zowel biopten als mucus om de kans op vals negatieve
resultaten te minimaliseren.
Van de verzamelde mucus per maag (1.1.) werd gemiddeld 2 g afgewogen en overgebracht in
een steriel, plastic potje. Vervolgens werd 2 ml DL-Dithiothreitol® (Sigma-Aldrich, Saint Louis,
Missouri) toegevoegd per staal om de mucus te lyseren, waarna het geheel overnacht geïncubeerd
werd bij 37°C. Tijdens incubatie werd de suspensie continu geschud aan 80 rpm. Na incubatie werd
15
1 ml gepipetteerd, overgebracht in een epje en gecentrifugeerd gedurende 5 min aan een snelheid
van 8000 rpm bij 4°C. Daarna werd het supernatans afgenomen en de pellet, waarin het DNA zich
bevond, werd geresuspendeerd in 180 µl ATL buffer® en 20 µl proteïnase K®. Het geheel werd
gedurende 1 h geïncubeerd bij 56°C met behulp van een blokthermostaat. Vervolgens werd de
verdere DNA extractie uitgevoerd zoals reeds hoger beschreven bij de DNA extractie uit de
maagmucosa (1.4.). Per staal werd uiteindelijk 20 µl bewaard bij -20°C tot verder gebruik in het eigen
laboratorium en de resterende 180 µl werd bewaard bij -70°C als reserve. De qPCR werd uitgevoerd
zoals beschreven onder 1.4. en dit eveneens met de beide primerparen (primerpaar 1 en 2).
1.6. Afwijkende smeltpiek na gebruik primerpaar 2
Aangezien na uitvoering van de qPCR met primerpaar 2 frequent een afwijkende smeltpiek (82,583,5°C) werd bekomen tijdens analyse van de ongekende stalen, waarbij een smeltpiek van 80-81°C
aanwezig was in de standaardreeks, werden stalen met een afwijkende smeltpiek van de laatst
uitgevoerde qPCR opgestuurd naar een extern laboratorium (GATC Biotech®, Constance, Duitsland)
voor sequentiebepaling via Sanger sequenering. Van de volgende stalen werden fundus en antrum
opgestuurd: P8, P12, P22, P30, P37, P38, P66 en P67 en daarnaast werden de stalen van de mucus
van P12, P30, P66 en P67 tevens opgestuurd. Als controle werden de fundus en het antrum van P68
bijgevoegd, elk met een normale smeltpiek (zowel bij primerpaar 1 als 2), waarbij H. suis dus zeker
aanwezig was. Elk staal, bestaande uit 12 µl, werd vanuit de well overgebracht in een nieuw epje
waaraan 8 µl HPLC water werd toegevoegd om een eindvolume van 20 µl te bekomen.
Sanger sequenering maakt gebruik van chain terminators: aan een DNA bevattend staal wordt
een mengsel van nucleotiden, DNA polymerase en primers, die een fragment van het ureA gen
aflijnen, toegevoegd. Dit mengel van nucleotiden bestaat uit de 4 normale deoxyribonucleoside
trifosfaten (dNTP’s: dATP, dGTP, dCTP, dTTP) en 4 dideoxyribonucleoside trifosfaten (ddNTP’s), bij
deze laatste is de 3’-hydroxide (OH) groep afwezig en is elk nucleotide gemerkt met een specifiek
fluorochroom. Na het enkelstrengig maken van het aanwezig DNA door verhoging van de
temperatuur, wordt de temperatuur terug verlaagd naar de optimale waarde voor DNA polymerase
activiteit. Het enzyme maakt het enkelstrengig DNA (sDNA) vervolgens weer dubbelstrengig door het
inbouwen van nucleotiden op basis van de sequentie van de complementaire streng. Bij het inbouwen
van een ddNTP stopt deze reactie, aangezien geen 3’-OH groep aanwezig is waarmee de 5’-fosfor (P)
groep van de volgende nucleotide kan binden. Wanneer een ddNTP wordt ingebouwd, is volledig
bepaald door toeval. Na de PCR reactie bekomt men dus een mengsel van DNA fragmenten met
verschillende lengtes, telkens met een verschil in lengte van 1 basepaar. Sequentiebepaling is dan
mogelijk door scheiding van de fragmenten op basis van grootte in een capillair elektroforese. Bij
belichting met excitatielicht door een laser op het einde van het capillair, kan het fluorochroom een
specifiek emissielicht uitzenden dat gedetecteerd wordt door een detector. Afhankelijk van het soort
fluorochroom op het 3’-einde van het DNA fragment, wordt een ander emissielicht uitgezonden per
fragment en kan men de identiteit van het gekoppelde nucleotide achterhalen om zo tot een volledige
sequentie te komen van het geamplificeerde gen. Voor sequentiebepaling werden zowel de forward
als de reverse primer in een aparte reactie gebruikt, waardoor voor elk staal in principe 2
complementaire nucleotidensequenties werden verkregen.
16
1.7. Kodon en BLAST van de bekomen sequenties
Voor de bekomen nucleotidensequenties van de opgestuurde stalen uit 1.6. werd vervolgens
gecontroleerd in welke mate er overeenstemming was met het ureA gen van H. suis. Hiertoe werden
de sequenties van elk staal, bekomen door sequenering met zowel de forward als de reverse primer,
tot 1 enkele consensus sequentie gealigneerd met behulp van het programma Kodon Sequence Data
Module® (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België). De 5’-uiteinden van beide strengen werden
weggetrimd, aangezien deze vaak aspecifieke pieken van fluorescentie vertoonden. Er gaat echter
geen informatie verloren, aangezien de primersequentie mee ingebouwd werd in het fragment en op
die manier het uiteinde vormt van het 3’ uiteinde van elke complementaire sDNA streng. Vervolgens
werden de 2 complementaire strengen met elkaar gealigneerd, waarna deze met elkaar vergeleken
werden op aanwezigheid van correcte baseparing, met name of elke A tegenover een T (of
omgekeerd) en elke C tegenover een G (of omgekeerd) stond. Bij een mismatch tussen 2 baseparen
werd het basepaar geselecteerd met de meest zuivere piek, om aldus tot een volledige match te
komen tussen beide strengen. De nucleotidensequenties werden vervolgens vergeleken met
sequenties uit de NCBI GenBank gebruik makende van de Basic Local Alignment Search Tool®
(BLAST)
op
de
website
van
‘National
Center
for
Biotechnology
Information’®
(NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Deze centrale database omvat alle reeds gekende en gesequeneerde
genen van verscheidene organismen, waaronder bijvoorbeeld het ureA gen van H. suis. Na invoer
vergelijkt dit algoritme de opgegeven sequentie met elke reeds gekende sequentie en wordt een
resultaat weergegeven, waarbij het gen van een bepaald species, waarmee de nog ongekende
sequentie de meeste gelijkenis vertoont, bovenaan vermeld wordt. De gegeven E-value dient zo laag
mogelijk te zijn, het % coverage en % identity zo hoog mogelijk. De E-value geeft de significantie weer
van het resultaat, Query coverage is een maat voor de lengte van een nucleotidensequentie waarvoor
een overeenkomstig fragment gedetecteerd werd na BLAST analyse en Maximum identity is een maat
voor de exacte overeenkomst na BLAST analyse tussen de nucleotidensequentie van het
aangetoonde DNA en een gekende DNA sequentie. Na analyse van deze resultaten kon met grote
zekerheid gezegd worden of H. suis al dan niet voorkwam in de stalen met een afwijkende smeltpiek
en/of er rekening gehouden moest worden met de afwijkende smeltpieken.
2. Analyse van de gastrale microbiota van H. suis-positieve en -negatieve varkens
2.1. Selectie en indeling van de varkensmagen
Met behulp van een viertal criteria, waarbij vooral (maar niet uitsluitend) de nadruk op H. suis
kwantificatie in mucus en mucosa lag, werden varkensmagen geselecteerd. Voor de H. suis-negatieve
varkens werden dieren die uitgesproken laesies ter hoogte van de pars oesophagea of een erge
gastritis hadden, uitgesloten. Voor de positieve varkens werden deze dieren geselecteerd die een
hoge graad van H. suis kolonisatie in mucus en mucosa vertoonden (vaak gerelateerd aan ernstige
laesies in de pars oesophagea en/of een hoge graad van gastritis). Voor de positieve groep werden
eenzelfde aantal varkensmagen als de negatieve groep gekozen en dit uit de grote groep van H. suispositieve magen. Na deze opdeling zal enkel worden verder gewerkt met de geselecteerde varkens.
2.2. Macroscopisch en biochemisch onderzoek van de kolonies
De geïncubeerde agarplaten uit 1.2. werden onderzocht op aanwezigheid van morfologisch identieke
kolonies. Per plaat werden 1 à 2 abundant aanwezige kolonies met behulp van een entoog
17
overgebracht op een BP5039A Columbia agar with sheep blood PLUS® via twee entstrepen loodrecht
op elkaar (figuur 3). De platen werden gedurende 24 h geïncubeerd in een broedstoof bij 37°C en een
atmosfeer met 6% CO2. Na incubatie werden deze macroscopisch gecontroleerd op aanwezigheid
van een reincultuur afkomstig van de oorspronkelijk geselecteerde kolonie. Wanneer geen reincultuur
aanwezig was (polybacterieel beeld), werd de oorspronkelijk geselecteerde kolonie overgebracht op
een nieuwe agarplaat en terug geïncubeerd. Bij overgroei van Proteus spp. werd de kolonie van
interesse overgebracht op een Macconkey agar no.3® (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk) en
gedurende 24 h geïncubeerd. Indien na 24 h incubatie in beide bovenstaande gevallen geen
reincultuur bekomen werd, werden deze uitgesloten voor verder onderzoek. Bij afwezigheid van
bacteriële groei, werd een nieuwe kolonie geselecteerd uit de oorspronkelijke agarplaten en overgeënt
e
op een nieuwe plaat. Wanneer geen groei werd bekomen na de 2 poging, werd de plaat uitgesloten
voor verder onderzoek.
Bij aanwezigheid van een reincultuur werden enkele biochemische testen uitgevoerd om een
mogelijke eerste identificatie van het genus te bekomen. Voor de eerste test werd een druppel
kaliumhydroxide (KOH) op een glazen draagplaatje gebracht waarin een kolonie met behulp van een
entoog heen en weer werd bewogen. Aanwezigheid van dradentrekkend slijm wijst op lyse van de
celwand en aldus een Gram-negatieve kolonie. Deze hebben immers, in vergelijking met Grampositieve kiemen, een meer kwetsbare celwand door aanwezigheid van slechts 1 enkele laag
peptidoglycanen in plaats van meerdere zoals bij de Gram-positieven. Door deze dunne laag zijn de
Gram-negatieve bacteriën gevoelig aan de inwerking van KOH, terwijl de dikkere wand de Grampositieve beschermt. De 3% KOH werd zelf bereid in het laboratorium door 3 g KOH (VWR
International, Radnor, Pennsylvania) op te lossen in 100 ml Aqua Dest. Bij een positieve KOH-test
werd een oxidase-test uitgevoerd met behulp van 113300 Bactident Oxidase strips® (Merck KGaA,
Darmstadt, Duitsland), waarop een kolonie werd gebracht. Een paarsverkleuring van de strip wijst op
aanwezigheid van het cytochroom oxidase, een enzyme aanwezig in oa. Pseudomonaceae,
Pasteurellaceae,
Campylobacteraceae,…
Deze
enzymatische
activiteit
is
afwezig
bij
Enterobacteriaceae. Bij een negatieve KOH-test, werd een kolonie in een druppel 3%
waterstofperoxide (H2O2) gebracht om aan- of afwezigheid te testen van het katalase enzyme.
Afwezigheid van bruisvorming wees op de afwezigheid van dit enzyme. De 3% H2O2 werd bereid
vanuit de commerciële 30% H2O2 (VWR International, Radnor, Pennsylvania) door 3 ml van de 30%
oplossing aan te lengen met 7 ml Aqua Dest. De kolonies van de reinculturen werden ook visueel
beoordeeld op geur, kleur, glans, aflijning, grootte,... om een idee te krijgen van het genus.
Aangezien bepaalde reinculturen een andere morfologie vertoonden (klein, groen en
hemolyse, zie resultaten 2.) ten opzichte van de meer grijze tot witte, glanzende en niet-hemolytische
kolonies, werd een Gram-kleuring uitgevoerd op een kolonie afkomstig uit de reincultuur van P20. Een
druppel PBS werd op een glazen draagglaasje gebracht waarin een kolonie met behulp van een
entoog voorzichtig werd gesuspendeerd. Daarna werd dit gedroogd met behulp van een
bunsenbrander. De Gram-kleuring zelf werd in deze volgorde uitgevoerd: 10 druppels crystal violet
oplossing gedurende 1 min laten inwerken op het draagglaasje, spoelen met koud leidingwater,
waterrestant wegspoelen met iodine oplossing, iodine oplossing gedurende 1 min laten inwerken,
spoelen met koud leidingwater, afspoelen met enkele druppels alcohol gedurende enkele seconden,
spoelen met koud leidingwater, waterrestant wegspoelen met safarine oplossing en laten inwerken
gedurende 1 min, spoelen met koud leidingwater en drogen door aandrukken tegen filtreerpapier.
Vervolgens werd dit glaasje bekeken onder de lichtmicroscoop met behulp van immersieolie bij een
vergroting van 10x (oculaire lens) en 100x (objectief).
18
Daarna werden, voor elke reincultuur, 3 epjes gevuld met 1 ml invriesmedium, waarna in elk
epje een drietal kolonies werden gesuspendeerd en vervolgens bewaard als reservemateriaal bij
-70°C. Het invriesmedium werd in het laboratorium bereid met 75 ml HyClone™ Donor Equine
Serum® (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware), 7,5 g D(+)-Glucose monohydrate® (Merck KGaA,
Darmstadt, Duitsland) en 25 ml Brain heart broth® (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland). Om het
serum gebruiksklaar te maken, werd het eerst 30 min bij 56°C geïncubeerd om complement te
inactiveren. De Brain heart infusion broth® werd voor gebruik eerst geautoclaveerd, vervolgens werd
7,5 g glucose opgelost in 25 ml van de geautoclaveerde vloeistof en gesteriliseerd met behulp van
een celluloseacetaat filter (0,45 µm poriëngrootte, FP 30/0 0,45 CA-S® (neoLab, Heidelberg,
Duitsland)). Voor elke reincultuur werd tevens een epje gevuld met 100 µl PrepMan Ultra Sample
Preparation Reagent® (Life Technologies, Carlsbad, California) waarin een aantal kolonies werden
gesuspendeerd. Dit geheel werd daarna enkele seconden in de vortex gebracht en vervolgens 10 min
bij 100°C geïncubeerd met behulp van een blokthermostaat. Na een korte afkoeling werden de epjes
gedurende 2 min aan 13000 rpm gecentrifugeerd, waarna het supernatans, waarin het DNA van de
bacteriën zich bevond, werd overbracht in een nieuw epje. Deze werden daarna bewaard bij -20°C
voor later gebruik in de PCR ter identificatie van de bacteriële species (2.3.).
Fig. 3: De gebruikte methode voor het enten van een geselecteerde kolonie op een agarplaat. De
tweede entstreep (gele pijl) is een verdunning en wordt verkregen door loodrecht op de richting van de
eerste entstreep (witte pijl) de bacterie verder te verdelen op de agarplaat.
2.3. PCR en gelelektroforese
Om amplificatie van het bacterieel 16S rRNA gen van de geïsoleerde reinculturen mogelijk te maken,
werd gebruik gemaakt van twee universele primers, namelijk de forward primer αβ-NOT (5’-TCA AAC
TAG GAC CGA GTC-3’) en reverse primer ωMB (5’-TAC CTT GTT ACT TCA CCC CA-3’) (Integrated
DNA technologies, Coralville, Iowa) elk aan een eindconcentratie van 0,5 pmol/µl. Dit primerpaar lijnt
het 16S rRNA gen af dat algemeen voorkomt in bacteriën (144), waardoor dit gen van eender welk
bacterieel species, zonder het te kennen, geamplificeerd kan worden. De volgende PCR mix werd
bereid voor ieder DNA staal: 10 µl Accuzyme™ Mix® (Bioline, Londen, Verenigd Koninkrijk), 0,2 µl
forward primer, 0,2 µl reverse primer en 7,6 µl HPLC water. De Accuzyme™ Mix® bevat het DNA
polymerase en een mengsel van dNTP’s. Van deze mix werd 18 µl telkens overgebracht in een 0,5 ml
epje, daarbij werd 2 µl van het geëxtraheerd DNA van de reinculturen toegevoegd zodat een
eindvolume van 20 µl bekomen werd in elk epje. Helicobacter suis DNA en HPLC water werden
ingesloten, respectievelijk als positieve en negatieve controle. Met deze 2 controles was het mogelijk
19
na te gaan of de PCR reactie al dan niet succesvol verlopen was. De PCR reactie werd uitgevoerd
met het GeneAmp PCR system 9600® (Life Technologies, Carlsbad, California) toestel. Het PCR
programma bestaat, zoals reeds hoger beschreven, uit een opeenvolging van verschillende fases:
95°C gedurende 5 min, een eerste cyclus met 3 maal herhaling van 95°C gedurende 45 s, 55°C
gedurende 2 min en 72°C gedurende 1 min, een tweede cyclus met 30 maal herhaling van 95°C
gedurende 20 s, 55°C gedurende 1 min, 72°C gedurende 1 min en als laatste stap 72°C gedurende 7
min waarbij eventuele ‘gaps’ worden opgevuld door het DNA polymerase. Dezelfde reactie werd
nogmaals herhaald, maar met een 1 op 10 verdunning van de stalen. Hiervoor werd 1 µl van het
geëxtraheerd DNA toegevoegd aan 9 µl HPLC water, waarna het protocol werd gevolgd zoals reeds
beschreven voor het onverdunde DNA. Zowel de geamplificeerde onverdunde als verdunde stalen
werden verder gevisualiseerd door middel van agarose gelektroforese.
Voor de gelelektroforese werd gebruik gemaakt van een 1,5% agarosegel. Hiervoor werd 3 g
Agarose MP® (Roche Applied Science, Penzberg, Duitsland) in 200 ml 1x geconcentreerde TBEbuffer gebracht. De 1x geconcentreerde TBE-buffer bevat tris-base, boorzuur en EDTA en werd
bekomen door TBE 10X Liquid Concentrate® (Amresco, Solon, Ohio) te verdunnen in Aqua Dest. De
buffer heeft meerdere functies: tris-base zorgt ervoor dat de pH neutraal blijft gedurende het proces,
boorzuur levert de nodige ionen om het elektrisch veld te onderhouden en EDTA capteert calcium en
magnesium, deze laatste zijn cofactoren noodzakelijk voor de activiteit van DNAnucleases die DNA
kunnen afbreken. De agarose werd vervolgens opgelost in de buffer door het mengsel een drietal
minuten op te koken. Na afkoeling tot 55°C werd 400 µl GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10000X in
DMSO® (Biotium, Hayward, California) toegevoegd. Het mengsel werd in een tray gegoten, waarna
de kammetjes werden geplaatst. Na 15 tot 20 min werden de kammetjes verwijderd en werd een 0,5x
geconcentreerde TBE-buffer oplossing op de gel gebracht. Per uitsparing in de gel werd telkens een
8 µl mengsel gebracht bestaande uit 5 µl PCR product en 3 µl ladingsbuffer (5 ml glycerol, 1 ml
cresolrood 10mM, 4 ml Aqua Dest.). Glycerol heeft een hoog moleculair gewicht en zorgt ervoor dat
het staal niet naast de uitsparing komt te liggen, maar mooi naar beneden zakt. Het cresolrood kleurt
het staal rood aan, waardoor het inbrengen van de stalen vlotter verloopt. In de eerste uitsparing werd
8 µl GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, Ready-to-Use 100 to 3000 bp® (Thermo Scientific,
Wilmington, Delaware) gebracht, een DNA ladder waarvan het moleculair gewicht van de fragmenten
gekend is. Hierbij moet geen ladingsbuffer meer toegevoegd worden, aangezien deze commerciële
ladder reeds bromofenolblauw en glycerol bevat. Op deze manier kunnen de fragmenten van de
onbekende stalen vergeleken worden met deze ladder, waardoor een indicatie verkregen wordt van
de lengte in baseparen van het geamplificeerd staal. Tijdens de gelelektroforese werd een elektrisch
veld aangelegd gedurende 75 min (170 Volt en 400 milliampère), waardoor een scheiding ontstaat
van DNA fragmenten op basis van het moleculair gewicht. De minst zware fragmenten migreren het
snelst doorheen de agarose gel naar de positieve pool, terwijl de zwaardere fragmenten minder ver
zullen migreren. Aangezien DNA reeds lineair is en dezelfde hoeveelheid negatieve ladingen bezit per
lengte-eenheid (door de fosfaten), hebben beide geen invloed op de snelheid van migratie van DNA.
Om het bandenpatroon zichtbaar te maken, werd de gel na 75 min uit de buffer gehaald, afgedept en
TM
geplaatst in het toestel PhotoDoc-It
Imaging Systems, benchtop 2 UV Transilluminator® (UVP,
Upland, California), waarbij met behulp van UV-licht het fluorochroom Gelred geëxciteerd werd. Dit
fluorochroom bindt specifiek aan dubbelstrengig DNA en bij het belichten van de gel met een
golflengte van 302 nanometer (nm), worden de gescheiden DNA fragmenten zichtbaar door uitstraling
van licht met een golflengte van 600 nm door het fluorochroom.
Met behulp van de spectrofotometer Nanodrop® werd eerst het gehalte aan geamplificeerd
DNA bepaald. Voor alle stalen bedroeg dit 150-200 ng/µl, waarna elk staal verdund werd met HPLC
20
water tot een eindconcentratie van 10-50 ng/µl. De gebruikte primers werden eveneens verdund met
HPLC water tot 10 pmol/µl. De stalen met een duidelijk bandje en het gebruikte primerpaar werden
vervolgens opgestuurd naar GATC Biotech® (Constance, Duitsland) voor sequenering van het
geamplificeerde 16S rRNA gen. De techniek werd reeds beschreven onder 1.6.
2.4. Kodon en BLAST
De verkregen sequenties van 2.3. werden via Kodon en BLAST geanalyseerd, zoals reeds
beschreven onder 1.7.
2.5. Analyse van de gastrale microbiota
Om een meer volledig beeld te krijgen van de microbiota in de maag van H. suis-positieve en
-negatieve varkens, werd de samenstelling van gastrale microbiota bij een aantal dieren bepaald door
middel van sequenering en metagenomics. De DNA extracties van elk deel van de geselecteerde
varkensmagen (1.4.), ongeveer 180 µl per epje, werden uit de -20°C gehaald. Na het ontdooien werd
dit geheel goed gemengd met behulp van een vortex. Uit elk epje werd 50 µl gehaald en overgebracht
in een nieuw, waarbij de stalen van de pars oesophagea, cardia, fundus en het antrum van eenzelfde
varkensmaag werden overgebracht in hetzelfde epje. Op deze manier werd een gepoolde DNA
extractie bekomen voor elk varken uit de positieve en negatieve groep. Dit geheel werd vervolgens op
CO2 ijs verstuurd naar het ‘Laboratoire de Microbiologie des Denrées alimentaires, Département des
denrées alimentaires d’origine animales, Faculté de Médecine vétérinaire, Université de Liège’ voor
verdere analyse van de microbiota door middel van pyrosequencing.
Zoals hierboven reeds aangehaald, is het op basis van het 16S rRNA gen mogelijk om
bacteriële species te identificeren en differentiëren van elkaar. Het gen is ongeveer 1500 baseparen
lang en bevat, naast sterk geconserveerde regio’s, een negental variabele regio’s (V1-9) die
verschillen van species tot species, waardoor deze kunnen gebruikt worden om het species te
identificeren (144). De opgestuurde stalen bevatten verschillende genen, waaronder het 16S rRNA
gen van bacteriën behorend tot de, al dan niet normale, gastrale microbiota van varkens. Na
amplificatie en sequenering van 2 variabele regio’s van dit gen (V3 en V4), werden de bekomen
sequenties in de centrale databank ingevoerd (zie 1.7. voor de methode), om aldus identificatie van
genus en species te bekomen. Op deze manier werd de samenstelling van de gastrale microbiota
bekomen voor elk varken uit de positieve en negatieve groep. Daarnaast werd ook de graad van
verwantschap weergegeven tussen elk species met behulp van taxonomie en fylogenese.
Om amplificatie van de variabele regio’s van het 16S rRNA gen mogelijk te maken, werden
primerpaar E9 en E29 en primerpaar E514 en E430 gebruikt. Aan het 5’-uiteinde van elke primer
werden 454 Life Sciences A/B titanium adapters® (Roche Diagnostics, Vilvoorde, België) toegevoegd
om sequenering en detectie mogelijk te maken. Vervolgens werd per staal, bestaande uit 100 ng DNA
in 100 µl, 5 U FastStart high fidelity polymerase® (Roche Diagnostics, Vilvoorde, België), 1x enzym
reactie buffer, 200 µM dNTPs® (Eurogentec, Liège, België) en 0,2 µM van elke primer toegevoegd.
Het geheel werd in het Mastercycler pro® (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) toestel gebracht met
opeenvolging van volgende PCR fases: 15 min bij 94°C, gevolgd door 25 cycli bestaande uit 40 s bij
94°C, 40 s bij 56°C, 1 min bij 72°C en een finale elongatiestap van 7 min bij 72°C. De geamplificeerde
16S rRNA fragmenten werden gescheiden op een 1% agarose zoals reeds hoger beschreven onder
2.3. De gescheiden fragmenten werden uit de agarose gehaald met behulp van Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System® (Promega Benelux, Leiden, Nederland), waarbij het protocol van de fabrikant
21
gevolgd werd. De kwaliteit en kwantiteit van de verkregen fragmenten werd geanalyseerd met
Picogreen Assay for dsDNA® (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware), bestaande uit een
fluorochroom dat specifiek bindt aan dubbelstrengig DNA, waarbij het uitgezonden emissielicht
gedetecteerd werd door een fluorospectrofotometer. De geamplificeerde 16S rRNA fragmenten
werden vervolgens gesequeneerd met het Genome Sequencer Junior System® (Roche, Vilvoorde,
België) dat werkt volgens de 454 pyrosequenering techniek. Voor deze techniek wordt een DNA
polymerase en 3 enzymes, met name sulfurylase, luciferase en apyrase toegevoegd. Het DNA wordt
enkelstrengig gemaakt, waarna telkens een mengsel van eenzelfde soort nucleotiden wordt
toegevoegd in een welbepaalde volgorde (dGTP -> dATP -> dTTP -> dCTP). Bij inbouw van de
toegevoegde nucleotide wordt een lichtsignaal gedetecteerd, bij geen inbouw van de gegeven
nucleotide wordt deze afgebroken door apyrase. Op deze manier verkrijgt men snel en nauwkeurig de
nucleotidensamenstelling van een DNA fragment.
De gesequeneerde DNA fragmenten werden geanalyseerd met mothur
software®
(Department of Microbiology and Immunology, The University of Michigan Medical School, Michigan).
Enkel zuivere DNA fragmenten werden, na gebruik van het Pyronoise algoritme, geselecteerd, waarbij
volgende criteria werden gehanteerd: minstens 425 baseparen lang, exacte overeenstemming met de
barcode en maximaal 1 mismatch van de forward primer. Aangezien diversiteit tussen bacteriën
verkeerdelijk gedetecteerd kan worden door vorming van chimere producten, werden de
geselecteerde DNA fragmenten geanalyseerd met Chimera Slayer® (Broad Institute, Cambridge,
Verenigd Koninkrijk). Chimeren zijn hybride fragmenten door binding van een enkelstrengig,
onvolledig geamplificeerd DNA fragment met een ander enkelstrengig DNA fragment. Dit gebeurt
echter op een andere plaats dan deze waar de toegevoegde primer normaal bindt. Deze onvolledig
geamplificeerde streng fungeert dan als nieuwe primer voor het DNA fragment van interesse, waarbij
dergelijk gevormd dubbelstrengig DNA verkeerdelijk als een nieuw bacterieel species aanzien wordt.
Door gebruik van mothur software® werden DNA fragmenten op basis van homogeniteit geclusterd in
operationele taxonomische eenheden (OTU). Hiervoor werd het Nearest neighbor algoritme met een
cut-off waarde van 0,03 gebruikt. De taxonomische eenheid (fylum tot en met genus) van de OTU’s
werd vervolgens achterhaald door de sequentie van de OTU’s te aligneren met reeds gekende
sequenties in de SILVA rDNA database® (Microbial Genomics and Bioinformatics Research Group,
Bremen, Duitsland). Een minimum waarde van 80% homogeniteit werd hierbij gehanteerd. Om
species identificatie mogelijk te maken, werden de sequenties van elke OTU vergeleken met de SILVA
dataset 111 door gebruik te maken van blastn®. Opdat een bepaald species gelinkt kon worden met
de onbekende stalen, werd een 1% mismatch toegelaten. Nieuwe species werden op deze manier
ontdekt indien geen match of een mismatch van meer dan 1% bekomen werd.
Vervolgens werd nagegaan of de geïdentificeerde bacteriën afkomstig van de reinculturen uit
2.4, eveneens gedetecteerd werden in de gastrale microbiota van de gepoolde stalen. Wanneer dit
niet het geval bleek te zijn, werden nucleotidensequenties van nieuwe species uit de gepoolde stalen
gealigneerd met de nucleotidensequentie van de reincultuur met behulp van BLAST. Hierbij werden 2
voorwaarden gehanteerd: de nieuwe species moesten behoren tot hetzelfde genus van de bacteriën
uit de reincultuur en een mismatch van maximum 1% werd toegelaten. Wanneer niet voldaan werd
aan deze voorwaarden, werden de bacteriën afkomstig uit de reinculturen beschouwd als mogelijks
nieuwe species van een bepaald genus.
22
3.
Interacties tussen H. suis en de gastrale microbiota
Na metagenomics analyse werd een eerste indicatie bekomen van mogelijks belangrijke verschillen in
maagmicrobiota samenstelling tussen H. suis-positieve en –negatieve varkens. Bacteriële species die
frequent voorkwamen in de negatieve magen maar niet in de positieve magen, en omgekeerd, werden
geselecteerd voor (co-)cultivatie. In dit deel werd nagegaan of de geselecteerde bacteriële species
konden overleven en groeien in een vloeibaar en zuur milieu, eigen aan de maag. Tegelijk werd
nagegaan of er een al dan niet (in)directe interactie aanwezig is tussen H. suis en bacteriën afkomstig
uit de gastrale microbiota.
3.1. Cultivatie van de geselecteerde bacteriën en H. suis
Stammen van H. suis, Escherichia (E.) coli en Campylobacter (C.) jejuni waren aanwezig in het
laboratorium zelf en werden bewaard bij -70°C in 1,5 ml invriesmedium (zie 2.2. voor samenstelling).
De nieuwe Lactobacillus soort afkomstig uit de reincultuur van de pars oesophagea van P20 werd, na
bewaring in het invriesmedium bij -70°C (2.2.), ontdooid. In een poging om de nieuwe Fusobacterium
soort te isoleren, werden nieuwe magen van slachtvarkens verzameld uit het slachthuis ‘De Lokery’.
Na het openen en spoelen van de magen (zie 1.1 voor werkwijze), werd met een katoenen, steriele
swab over het gehele oppervlak van de maag gerold. Deze genomen swabs werden vervolgens
uitgerold op selectieve agarplaten. Hiervoor werd 18,5 g Columbia Blood Agar Base® (Oxoid,
Basingstoke, Verenigd Koninkrijk) aan 500 ml Aqua Dest. toegevoegd, waarna het geheel werd
opgekookt en geautoclaveerd. Na afkoeling tot 56°C werd 25 ml BBL
TM
Sheep Blood Defibrinated®
(BD, Franklin Lakes, New Yersey), 50 mg neomycine en 2,5 mg vancomycine toegevoegd. Na
zorgvuldige vermenging werd de vloeistof in steriele petriplaten gegoten en na uitharden werden de
platen bij 4°C bewaard. Aangezien Fusobacterium sp. slechts groeien in een anaëroob milieu, werden
de selectieve platen in een GasPak
gebracht waarbij een GasPak
TM
TM
EZ Anaerobe Container® (BD, Franklin Lakes, New Yersey)
EZ Gas Generating Container Systems® (BD, Franklin Lakes, New
Yersey) werd toegevoegd. De container werd luchtdicht afgesloten en 48 h bij 35°C en 5% CO 2
geïncubeerd. Na incubatie werden de platen gecontroleerd op aanwezigheid van kleine, grijze tot
groene kolonies die qua morfologie overeenstemden met Fusobacterium spp. Met behulp van een
entoog werd 1 verdachte kolonie overgebracht op een nieuwe agarplaat en terug gedurende 48 h
anaëroob geïncubeerd. Na incubatie werden de platen gecontroleerd op aanwezigheid van een
mogelijke Fusobacterium sp reincultuur. Een Gram-kleuring, zoals beschreven onder 2.2., werd
uitgevoerd om de aan- of afwezigheid van de typerende filamenteuse vorm na te gaan. Bij
aanwezigheid van de typerende morfologie werd het 16S rRNA gen van de desbetreffende bacterie
gesequeneerd en geïdentificeerd door middel van PCR en nucleotide sequenering, zoals reeds
beschreven onder 2.3. en 2.4. De verkregen sequentie werd vervolgens vergeleken met deze
verkregen uit de microbiota analyse (zie resultaten 3.2.).
Om H. suis cultivatie mogelijk te maken, werden specifieke agarplaten aangemaakt door 21,5
TM
g BBL
Brucella Agar® (BD, Franklin Lakes, New Yersey) aan 500 ml Aqua Dest. toe te voegen. Het
mengsel werd enkele minuten in een microgolfoven opgekookt en daarna 20 min geautoclaveerd bij
121°C. Na afkoeling tot 56°C werd 100 ml geïnactiveerd Fetal Bovine Serum® (Thermo Scientific,
Wilmington, Delaware), 2,5 mg amfotericine B, 3 ml Vitox supplement® (Oxoid, Basingstoke, Verenigd
Koninkrijk), 1 ml Campylobacter-selective supplement Skirrow® (Oxoid, Basingstoke, Verenigd
Koninkrijk) en 0,7 ml HCl® (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri) toegevoegd om een pH van 5 te
verkrijgen. Na zorgvuldige vermenging, werd de vloeistof in steriele petriplaten gegoten. Brucella
23
TM
bouillon werd aangemaakt door 14 g BBL
Brucella Broth® (BD, Franklin Lakes, New Yersey) bij
500 ml Aqua Dest. te brengen, waarna het geheel werd opgekookt en geautoclaveerd. Vervolgens
e
werd 0,7 ml HCl toegevoegd om een pH van 5 te verkrijgen. Een 10 passage van een reeds
T
T
T
geïsoleerde H. suis stam, met name HS1 (= 5LMG 23995 = 5DSM 19735 ) (12), werd geselecteerd
voor (co-)cultivatie. Na het ontdooien van het invriesmedium met de aanwezige H. suis stam, werd
hiervan 8 µl afgenomen en op een microscoopglaasje gebracht om de viabiliteit van H. suis na te
gaan. Met behulp van een lichtmicroscoop met vergroting 400x werd gezocht naar motiele,
spiraalvormige bacteriën. Vervolgens werd 750 µl van het medium telkens overgebracht op een
Brucella agarplaat. Daaraan werd 750 µl Brucella bouillon toegevoegd, waarna de platen geïncubeerd
werden bij 37°C in een atmosfeer met 10% CO 2, 5% O2 en 85% N2. Na 24 h incubatie werd de
viabiliteit gecontroleerd en 0,5 ml Brucella bouillon toegevoegd per plaat om uitdroging te verkomen.
Bij een te hoge H. suis concentratie op de agarplaat, werd de helft van het vloeibare medium
e
afgenomen en op een nieuwe agarplaat gebracht. Deze werd dan beschouwd als een 11 passage
van de H. suis stam. Na controle werden de platen opnieuw gedurende 24 h geïncubeerd.
Om de hemolytische en virulente E. coli stam, geïsoleerd uit varkens met speendiarree, te
cultiveren, werd 25,75 g MacConkey Agar® (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk) aan 500 ml
Aqua Dest. toegevoegd, waarna het geheel werd opgekookt, geautoclaveerd en na afkoeling in
steriele petriplaten gegoten werd. Een steriele, katoenen swab werd vervolgens in het ontdooide
invriesmedium met E. coli (labonummer 2319) gebracht en voorzichtig uitgerold over de agarplaat.
Daarna werd de plaat gedurende 24 h geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Na incubatie werd 1 kolonie
geselecteerd met een entoog, geënt op een nieuwe agarplaat en terug 24 h geïncubeerd. Dit proces
werd nogmaals herhaald om met grote zekerheid een reincultuur te verkrijgen afkomstig van één
enkele E. coli bacterie.
Om C. jejuni te cultiveren, werden 3 types agarplaten gebruikt om na te gaan welke het meest
geschikt was voor de groei van C. jejuni. Dit bacterieel species groeit immers moeilijk in laboratorium
omstandigheden (145). Het eerste type was een commercieel aangemaakte Columbia agar with
sheep blood PLUS® (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk). Voor het tweede type werd 22,75 g
Campylobacter Blood Free Selective Agar Base® (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk) aan
500 ml Aqua Dest. toegevoegd, waarna het geheel werd opgekookt en geautoclaveerd. Na afkoeling
tot 56°C werd 2 ml CCDA Selective Supplement® (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk)
toegevoegd, waarna het geheel gemengd en in steriele petriplaten gegoten werd. Voor het laatste
type werd 21,5 g Brucella Agar® bij 500 ml Aqua Dest. gebracht, opgelost en geautoclaveerd. Na
afkoeling werd 100 ml geïnactiveerd foetaal kalfsserum en 3 ml Vitox supplement® toegevoegd,
waarna het geheel gemengd en in steriele petriplaten gegoten werd. Net zoals voor E. coli, werd met
een swab het invriesmedium met C. jejuni (labonummer KC40) overgeënt op de verschillende
agarplaten. De platen werden 48 h geïncubeerd bij 37°C en een atmosfeer met 10% CO2, 5% O2 en
85% N2. Na incubatie werd de groei van deze bacterie beoordeeld, waarna 1 kolonie geselecteerd en
overgeënt werd op een nieuwe agarplaat om nogmaals 48 h te incuberen.
Cultivatie van Lactobacillus sp. werd mogelijk gemaakt door 30,58 g MRS Agar® (SigmaAldrich, Saint Louis, Missouri) aan 500 ml Aqua Dest. toe te voegen, waarna het geheel werd
opgekookt, geautoclaveerd en in steriele petriplaten gegoten werd. Net zoals voor E. coli, werden de
bacteriën met een swab overgeënt op de selectieve agarplaat en 24 h geïncubeerd bij 37°C en
6% CO2. Na incubatie werd de groei gecontroleerd, waarna 1 kolonie werd geselecteerd en op een
nieuwe agarplaat gebracht werd. Deze plaat werd opnieuw 24 h geïncubeerd bij 37°C en 6% CO2.
Vooraleer over te gaan tot de (co-)cultivatie experimenten met H. suis, werd nagegaan of de
geselecteerde bacteriële species overleven en groeien in het cultuurmedium van H. suis, Brucella
24
bouillon. De bacteriën werden geïncubeerd in een Brucella bouillon met pH 7 (zonder toegevoegd
HCl), waarna het aantal kolonie vormende eenheden (kve) bepaald werd. Eerst werd 50 ml Brucella
bouillon met pH 7 in een 75 cm² celcultuurfles® (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Duitsland)
gebracht. Met behulp van een entoog werd hierin 1 kolonie, afkomstig van de hierboven beschreven
E. coli reincultuur, gesuspendeerd en achtereenvolgens 6 h, 24 h en 30 h geïncubeerd bij 37°C en
10% CO2, 5% O2 en 85% N2. Tijdens incubatie werd de suspensie continu geschud aan 80 rpm.
Hetzelfde proces werd herhaald voor Lactobacillus sp. en C. jejuni. Na elke incubatieperiode werd een
0
-10
tienvoudige verdunningsreeks aangelegd voor de geselecteerde bacteriën, gaande van 10 tot 10 ,
om zo de groeicurve van de bacterie te bepalen. Hiertoe werd 200 µl van de geïncubeerde Brucella
0
bouillon (= 10 ) in een well gebracht, waarvan 20 µl werd genomen en overgebracht in 180 µl Brucella
-1
bouillon. Op deze manier werd verdunning 10 bekomen. Hiervan werd opnieuw 20 µl genomen en
-2
overgebracht in 180 µl Brucella bouillon om verdunning 10 te bekomen. Dezelfde stappen werden
herhaald tot de volledige verdunningsreeks bekomen werd. Van elke verdunning werden vervolgens 6
druppels van 20 µl gepipetteerd en overgebracht als 6 aparte druppels op een selectieve agarplaat:
voor E. coli was dit de MacConkey®, voor Lactobacillus sp. de MRS agar® en voor C. jejuni de
Campylobacter Blood Free Selective Agar®. De platen werden daarna 24 h geïncubeerd bij 37°C in
een atmosfeer met 5% CO2 voor E. coli en 48 h bij 37°C in een micro-aërofiele omgeving voor
Lactobacillus sp. en C. jejuni.
3.2. Interacties tussen H. suis en de geselecteerde bacteriën
In dit experiment werden verschillende condities onderzocht: 1. groei van de geselecteerde bacteriën
bij pH 7 als controle; 2. groei bij pH 5 om de zuurgevoeligheid na te gaan (in de maag is namelijk ook
een zure pH aanwezig en H. suis is bovendien beter cultiveerbaar in een zuur milieu (pH van 5)); 3.
groei bij pH 2,5 om na te gaan hoe uitgesproken de zuurresistentie/gevoeligheid is; 4. groei in het
supernatans van een 90 h oude H. suis cultuur om na te gaan of geproduceerde metabolieten van
H. suis een effect bezitten op de groei; 5. groei van de geselecteerde bacteriën in aanwezigheid van
H. suis bacteriën om na te gaan of er een direct effect is tussen H. suis en de geselecteerde bacterie
(co-cultivatie); 6. groei van H. suis alleen ter controle; 7. groei van H. suis in het supernatans van een
24 h oude cultuur van de geselecteerde bacterie om na te gaan of geproduceerde metabolieten van
de bacterie een effect hebben op de groei van H. suis. Voor condities 1-4 en 6-7 werd gewerkt met
7
een startconcentratie van 2,5x10 bacteriën per ml Brucella bouillon/supernatans. Voor conditie 5 werd
7
gewerkt met 2 verschillende startconcentraties: 2,5x10 bacteriën per ml voor zowel H. suis als de
7
7
geselecteerde bacterie en 2,5x10 H. suis per ml met 1x10 kve van de geselecteerde bacterie per ml.
Aangezien Lactobacillus sp. te traag groeide in een vloeibaar milieu met pH 7 (zie resultaten 4.),
werden de condities 1-5 enkel uitgevoerd voor E. coli en C. jejuni. Om toch een indicatie te krijgen van
7
het effect van Lactobacillus sp. op de groei van H. suis, werden 2,5x10 Lactobacillus sp. per ml bij
7
2,5x10 H. suis per ml gebracht (conditie 8). Voor elke conditie werd er telkens in duplicaat gewerkt.
Met behulp van een entoog werd 1 kolonie, afkomstig van de reincultuur van E. coli en C.
jejuni (3.1.), gesuspendeerd in 50 ml Brucella bouillon met pH 7 en 24 h geïncubeerd bij 37°C en 10%
CO2, 5% O2 en 85% N2, waarbij de suspensie continu geschud werd aan 80 rpm. Na incubatie werd
de concentratie van de bacteriële suspensie bepaald met een Neubauer-improved Counting Chamber
with Special Depth 0,02 mm® (Marienfeld Supe-Rior, Lauda-Königshofen, Duitsland). Voor conditie 1
7
werd de gewenste concentratie van 2,5x10 bacteriën per ml bekomen door, indien nodig, een deel
van de suspensie te verdunnen met behulp van Brucella bouillon pH 7. Voor condities 2 en 5 werd
een deel van de bacteriële suspensie verdund met Brucella bouillon met een pH van 5, voor conditie 3
25
met een pH van 2,5 om de gewenste concentraties te bekomen. Om pH 5 en 2,5 te bekomen, werd
voorafgaand een bepaalde hoeveelheid HCl toegevoegd aan 500 ml Brucella bouillon. Met behulp van
de HI 2211 Basic pH/ORP Benchtop Meter® (Hanna Instruments, Smithfield, Rhode Island) werd de
pH gemeten tot de gewenste waarde bekomen werd. Helicobacter suis werd 90 h geïncubeerd via de
methode zoals reeds beschreven onder 3.1., waarna de concentratie bepaald werd met behulp van
een Neubauer-improved Counting Chamber with Special Depth 0,02 mm®. Met Brucella bouillon pH 5
werden de verschillende concentraties voor condities 5, 6 en 8 bekomen. Het supernatans werd
verkregen door de vloeibare fase van de 90 h geïncubeerde H. suis af te nemen en gedurende 15 min
te centrifugeren aan 2800 rpm. Het supernatans van E. coli en C. jejuni werd bekomen door een
hoeveelheid van de 24 h geïncubeerde Brucella bouillon af te nemen en eveneens 15 min te
centrifugeren aan 2800 rpm. Het supernatans van H. suis en de geselecteerde bacterie werden
vervolgens gebruikt om de bacteriële suspensie te verdunnen en aldus de gewenste concentratie te
bereiken, resp. voor condities 4 en 7. Voor conditie 8 werden de kolonies van de Lactobacillus sp.
reincultuur (3.1.) afgenomen met een steriele, katoenen swab en gesuspendeerd in 2 ml Brucella
bouillon met pH 5. De concentratie werd bepaald met behulp van de Neubauer-improved Counting
Chamber with Special Depth 0,02 mm® en verdund met Brucella bouillon pH 5 tot de gewenste
concentratie bekomen werd. Na het aanmaken van de gewenste concentraties voor de verschillende
condities, werden de concentraties van de bacteriën nogmaals gecontroleerd met een Neubauerimproved Counting Chamber with Special Depth 0,02 mm® om zeker te zijn dat de verdunningen
correct uitgevoerd waren.
Voor condities 1-4 werd 5 ml Brucella bouillon (pH7, 5 of 2,5) of supernatans, telkens met
7
2,5x10 kiemen per ml, in een celcultuurfles gebracht. Alle celcultuurflessen werden achtereenvolgens
6 h, 24 h en 30 h geïncubeerd bij 37°C en 10% CO2, 5% O2 en 85% N2, waarbij de suspensie continu
geschud werd aan 80 rpm. Voor condities 5-8 werd 5 ml Brucella bouillon of supernatans voor elk
bacterieel species, met de specifieke concentraties per ml zoals hoger beschreven, op Brucella
agarplaten gebracht die vervolgens 6 h, 24 h en 30 h geïncubeerd werden bij 37°C en 10% CO 2,
5% O2 en 85% N2.
Na de verschillende incubatietijden werd telkens een verdunningsreeks aangemaakt voor de 2
geselecteerde bacteriën (zie 3.1. voor methode). Daarna werden 6 druppels, elk 20 µl, per verdunning
op een selectieve agarplaat gebracht: voor E. coli was dit de MacConkey® en voor C. jejuni
Campylobacter Blood Free Selective Agar®. De platen werden daarna geïncubeerd: voor E. coli 24 h
bij 37°C en 5% CO2 en voor C. jejuni 48 h bij 37°C en 10% CO2, 5% O2 en 85% N2. Na incubatie werd
het aantal kve geteld, gecorrigeerd voor de verdunning en het gemiddelde berekend. Na 24 h en 30 h
(co-)cultivatie werd met een lichtmicroscoop de viabiliteit en motiliteit van H. suis beoordeeld op de
wijze beschreven onder 3.1. Om de H. suis concentratie na 24 h en 30 h nauwkeurig te kunnen
bepalen, werd gebruik gemaakt van een qPCR reactie. Gezien H. suis een trage groeier is (12),
werden geen significante verschillen verwacht na 6 h (co-)cultivatie. Om deze reden werd de
concentratie enkel bepaald na 24 h en 30 h. Hiervoor werd 50 µl vloeibare fase van de geïncubeerde
H. suis (co-)cultuur afgenomen, daarbij werd 100 µl PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent®
toegevoegd om het DNA te extraheren op de wijze beschreven onder 2.2. Na DNA extractie werd een
qPCR uitgevoerd met primerpaar 1 op de methode beschreven onder 1.4. De qPCR reactie werd voor
elke conditie en duplicaat in drievoud uitgevoerd. Na de verkregen concentraties werd statistische
analyse uitgevoerd met behulp van SPSS statistics 22® om na te gaan of er relevante verschillen
waren tussen de verschillende cultivatie condities. Om verschillen tussen H. suis concentraties na te
gaan, werd gebruik gemaakt van ‘one-way ANOVA’ met een Bonferroni Post hoc test, voor E. coli en
C. jejuni werd de non-parametrische test ‘2 independent samples’ met ‘Mann-Whitney’ gebruikt.
26
RESULTATEN
1.
Analyse van de varkensmagen: H. suis kolonisatie, gastritis en ulcera
Vooraleer de H. suis-positieve en -negatieve groep kon samengesteld worden, werden alle
verzamelde varkensmagen uit het slachthuis afzonderlijk onderzocht op hyperkeratose en laesies ter
hoogte van de pars oesophagea, graad van gastritis, aan- of afwezigheid van H. suis en aantal H. suis
koloniserende kiemen.
Tabel 2 geeft een samenvatting weer van de toegekende scores voor laesies ter hoogte van
de pars oesophagea en gastritis ter hoogte van cardia, fundus en antrum. Na de visuele beoordeling
van laesies ter hoogte van de pars oesophagea, vertoonden de meeste varkensmagen een
hyperkeratose die meer dan 50% van het oppervlak bedekte. Van het totaal aantal varkensmagen
vertoonde 11,76% een score 0 of 1, 67,65% een score 2 en 20,59% een score hoger dan 2
(figuur 4-9). Na beoordeling van de histologische coupes kon geconcludeerd worden dat de cardia de
hoogste graad van gastritis vertoonde. In deze regio werd zowel een sterke infiltratie met lymfoïde
ontstekingscellen als lymfoïde follikels met germinale centra, waarbij de follikels vaak samen
gegroepeerd lagen, bijna steeds opgemerkt (figuur 10-11). Enkel de HE-kleuring van de cardia van
P26 kon niet beoordeeld worden, aangezien slechts de lamina muscularis zichtbaar was onder de
lichtmicroscoop. Na het scoren van gastritis ter hoogte van fundus en antrum, kan besloten worden
dat over het algemeen een meer uitgesproken ontstekingsbeeld kan waargenomen worden in het
antrum, zowel wat betreft lymfoïde infiltratie als vorming van lymfoïde follikels (figuur 12-16). De
lichtmicroscopische analyse van coupes afkomstig van de pars oesophagea was in overeenstemming
met de toegekende visuele scores (niet weergegeven in tabel 2 of 3).
Tabel 3 geeft een algemeen overzicht weer voor elke varkensmaag, betreffende zowel scores
toegekend aan de pars oesophagea en gastritis als H. suis detectie, lokalisatie en aantal. Hierbij
kunnen de scores toegekend aan de pars oesophagea en gastritis onderling en met elkaar vergeleken
worden. Van de 5 varkensmagen met ernstige laesies ter hoogte van de pars oesophagea (score 4 of
5) waren P27 en P28, beide score 4, afkomstig van dezelfde ophaalbeurt. Van de 9 varkens met een
score 3 waren 2 maal 2 magen, namelijk P33 met P34 en P51 met P52, afkomstig van dezelfde
ophaalbeurt. Op het eerste zicht kon geen duidelijk rechtlijnig verband opgemerkt worden tussen de
ernst van laesies ter hoogte van de pars oesophagea en de graad van gastritis ter hoogte van fundus
en antrum. Bij slechts 6 van de 68 varkensmagen (8,82%) werden zowel ernstige laesies ter hoogte
van de pars oesophagea als ernstige gastritis ter hoogte van fundus en antrum opgemerkt, terwijl 28
magen (41,18%) een ernstige gastritis vertoonden met enkel een hyperkeratose ter hoogte van de
pars oesophagea en 7 magen (10,29%) erosies en/of ulcera ter hoogte van de pars oesophagea met
enkel een milde gastritis. Statistische analyse toonde daarnaast aan dat de ernst van de laesies ter
hoogte van de pars oesophagea significant omgekeerd evenredig was met lymfoïde infiltratie in cardia
(correlation coefficient: -0,241; P-value: 0,049) en fundus (correlation coefficient: -0,258; P-value:
0,034). Aanwezigheid van erosies en ulcera ter hoogte van de pars oesophagea is dus geen
voorwaarde voor een hoge graad van infiltratie met ontstekingscellen en/of vorming van lymfoïde
follikels. Tussen de toegekende scores voor gastritis ter hoogte van cardia, fundus en antrum
onderling kon op het eerste zicht geen duidelijk verband aangetoond worden. Na statistische analyse
werd een significant recht evenredig verband aangetoond tussen:
- de aanwezigheid van lymfoïde follikels in de cardia en lymfoïde infiltratie in de cardia (correlation
coefficient: 0,248; P-value: 0,043)
27
- de aanwezigheid van lymfoïde follikels in de cardia en lymfoïde follikels in de fundus (correlation
coefficient: 0,241; P-value: 0,050)
- de aanwezigheid van lymfoïde follikels in de cardia en lymfoïde follikels in het antrum (correlation
coefficient: 0,243; P-value: 0,048)
- lymfoïde infiltratie in de cardia en lymfoïde infiltratie in het antrum (correlation coefficient: 0,248; Pvalue: 0,043)
- lymfoïde infiltratie in de fundus en lymfoïde infiltratie in het antrum (correlation coefficient: 0,294; Pvalue: 0,015)
Om H. suis detectie, kwantificatie en lokalisatie mogelijk te maken, werden de qPCR
resultaten van beide primerparen geanalyseerd. Slechts 6 van de 68 varkensmagen waren volledig
negatief voor H. suis kolonisatie in zowel mucosa als mucus. Varken 1, 2 en 4 waren eveneens
negatief voor H. suis kolonisatie in de mucosa, maar aangezien de mucus pas verzameld werd vanaf
P6, kon niet met zekerheid gezegd worden dat deze volledig negatief waren. Deze 3 magen werden
dan ook niet gebruikt in de berekening van het voorkomen van H. suis infecties bij slachtvarkens.
Helicobacter suis was aanwezig bij 59 van de 65 varkensmagen, waardoor een prevalentie van
90,77% bekomen werd. Bij alle H. suis-positieve magen werd vervolgens de lokalisatie nagegaan
waar de kiem het meest voorkwam. Om dit mogelijk te maken, werd de gemiddelde opbrengst
genomen van beide primperparen. Van de 59 positieve magen vertoonden 31 de hoogste H. suis
kolonisatiegraad in de fundus, 25 in het antrum en 2 in de cardia. Van P66 kon geen regio met de
hoogste kolonisatiegraad aangeduid worden ten gevolge van een afwijkende smeltpiek (82,5-83,5°C).
Tijdens analyse van de qPCR resultaten van primerpaar 2 werd frequent een afwijkende
smeltpiek gedetecteerd bij de stalen, gaande van 82,5 tot 83,5°C. De standaardreeks vertoonde
daarentegen steeds een normale smeltpiek gaande van 80 tot 81°C, zowel voor primerpaar 1 als 2.
Aangezien de smeltpieken van de stalen meer dan 1 graad afweken van de standaardreeks, waren
deze als H. suis negatief te beschouwen. In tabel 4 zijn de stalen met een afwijkende smeltpiek bij
primerpaar 2 opgelijst, hierbij kan opgemerkt worden dat veel stalen met een afwijkende smeltpiek bij
primerpaar 2, negatief waren bij primerpaar 1. Voor bijvoorbeeld P12, P66 en P67 waren alle biopten
en mucus negatief met primerpaar 1, terwijl een afwijkende smeltpiek werd bekomen bij primerpaar 2.
Gezien de afwijking frequent voorkwam, werden bepaalde stalen opgestuurd voor sequenering (zie
materiaal en methoden 1.6.) om zo meer zekerheid te krijgen over het al dan niet voorkomen van
H. suis. In tabel 5 zijn de geïdentificeerde bacteriële species weergegeven van de stalen met een
afwijkende smeltpiek. Over het algemeen kan geconcludeerd worden dat de meeste stalen, hoewel
negatief na beoordeling van de smeltpieken, toch positief waren voor H. suis. Bij de meerderheid van
de stalen werd immers een match bekomen van minstens 99% voor zowel coverage als identity met
het ureA gen van H. suis. Varken 12 kon zowel positief als negatief beschouwd worden op H. suis,
aangezien voor de fundus maar 96% identity werd bekomen en voor het antrum slechts 25% coverage
met het ureA gen, terwijl de mucus positief leek te zijn. Varken 67 vertoonde een duidelijke
afwezigheid van H. suis, aangezien een ander bacterieel species de hoogste graad van homologie
vertoonde met het staal. Hoewel de mucus van P67 een hoog % identity met het ureA gen vertoonde,
was de kans op aanwezigheid van H. suis laag, aangezien slechts een laag % coverage bekomen
werd. Het antrum kon niet geanalyseerd worden door te sterk afwijkende pieken tijdens analyse met
Kodon®. Aangezien de meeste gesequeneerde stalen H. suis positief bleken te zijn, werden varkens
met een afwijkende smeltpiek (82,5-83,5°C) bij primerpaar 2 allen beschouwd als H. suis positief. Dit
was noodzakelijk om geen vals negatieve varkens te selecteren voor de H. suis-negatieve
controlegroep. Kwantificatie van deze stalen bij primerpaar 2 was echter niet meer mogelijk ten
28
gevolge van de afwijkende smeltpiek, omwille van deze reden werd in tabel 2 ‘positief’ vermeld in
plaats van het aantal H. suis bacteriën per mg.
Wanneer, aan de hand van tabel 3, de detectie en kwantificatie van H. suis in mucus en
biopten van beide primerparen uitgezet worden tegenover elkaar, valt op dat de resultaten sterk
afhankelijk zijn van het gebruikte primerpaar. Bij het optellen van het aantal biopten (voor elk deel van
de maag apart) en mucus die eenzelfde uitkomst (positief of negatief) bezitten voor beide primerparen,
waren slechts 166 van de 324 stalen (afwijkende duplicaten en afwezige mucus buiten beschouwing
gelaten) identiek. In percentage uitgedrukt komt dit neer op 51,23% overeenkomst tussen primerpaar
1 en 2, die beide het ureA gen amplificeren. Na gebruik van primerpaar 1 en 2 waren resp. 162 en 239
stalen positief voor H. suis en resp. 162 en 92 stalen negatief voor H. suis (afwijkende duplicaten voor
primerpaar 1 en afwezige mucus voor beide primerparen buiten beschouwing gelaten). Wanneer de
resultaten van mucus en biopten vergeleken worden, ligt de detectie van H. suis in de biopten hoger
dan de mucus. Geen enkel staal was immers positief voor de mucus en negatief voor elk biopt van de
maag, zowel bij primerpaar 1 als 2, terwijl dit omgekeerd wel het geval was. Na gebruik van
primerpaar 1 en 2 waren resp. 18 en 8 varkensmagen positief voor H. suis op minstens 1 van de 4
bemonsterde delen uit de maag, terwijl deze negatief waren in de mucus. Na gebruik van primerpaar 1
en 2 testten resp. 8 en 6 varkensmagen zowel H. suis negatief in de mucus als de 4 delen van de
maagmucosae. Van het totaal aantal varkensmagen waren 29 en 44 magen H. suis positief op zowel
mucus als minstens 1 van de 4 delen van de maagmucosae voor resp. primerpaar 1 en 2.
Tabel 2: Algemeen overzicht van de toegekende scores voor laesies ter hoogte van de pars
oesophagea en gastritis ter hoogte van cardia, fundus en antrum na onderzoek van de 68 verzamelde
varkensmagen.
Varkens (n=68)
Laesies
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
Po
follikels C
infiltratie C
follikels F
infiltratie F
follikels A
infiltratie A
Gemiddelde
2,00
2,69
2,72
1,04
1,81
1,69
2,10
SD
0,89
0,70
0,52
0,56
0,58
0,97
0,65
Aantal 0
1
2
0
9
0
8
0
(1,47%)
(2,99%)
(0,00%)
(13,24%)
(0,00%)
(11,76%)
(0,00%)
7
3
2
47
19
21
11
(10,29%)
(4,48%)
(2,99%)
(69,12%)
(27,94%)
(30,88%)
(16,18%)
46
9
15
12
43
23
39
(67,65%)
(13,43%)
(22,39%)
(17,65%)
(63,24%)
(33,82%)
(57,35%)
9
53
50
0
6
16
18
(13,24%)
(77,94%)
(74,63%)
(0,00%)
(8,82%)
(23,53%)
(26,47%)
3
3
1
2
2
2
Aantal 1
Aantal 2
Aantal 3
Aantal 4
2
(2,94%)
Aantal 5
3
(4,41%)
Meest frequente
2
score
Het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD), het aantal varkens per score en de meest frequente score
worden weergegeven over alle varkensmagen heen. Het totaal aantal verzamelde magen (= n)
bedraagt 68, uitgezonderd voor de gastritis ter hoogte van de cardia waar n = 67 door het wegvallen
van 1 niet te beoordelen histologische coupe. De scores voor laesies ter hoogte van de pars
oesophagea gaan van 0 tot 5, voor lymfoïde follikels en infiltratie ter hoogte van de 3 overige gastrale
29
delen van 0 tot 3. Tussen haakjes wordt het percentage vermeld, bekomen door het aantal varkens
voor een bepaalde score te delen door het totaal aantal magen. Po = pars oesophagea, C = cardia, F
= fundus, A = antrum. Hyperkeratose komt frequent voor, terwijl gastritis of de aanwezigheid van
mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel het meest uitgesproken is ter hoogte van de cardia.
Fig. 4-9: Detailbeelden van laesies ter hoogte van de pars oesophagea met, van links naar rechts, de
scores 0, 1, 2, 3, 4 en 5 afkomstig van resp. P12, P15, P16, P5, P28 en P9, waarbij P… = varken.
P16 vertoont duidelijk meer hyperkeratose (witte ster) dan P15, P5 vertoont 1 kleine erosie (witte pijl)
net onder de oesophagale opening, P28 vertoont een zestal kleine erosies (zwarte pijlen) gelegen
rondom de oesophagale opening en P9 vertoont een diep gelegen ulcer over het volledige oppervlak
van de pars oesophagea.
Tabel 3: Overzicht van de toegekende scores voor laesies ter hoogte van de pars oesophagea,
gastritis ter hoogte van cardia, fundus en antrum en het aantal H. suis bacteriën. Dit is weergegeven
voor elke gastrale regio, inclusief mucus, per individuele varkensmaag.
Score
Varken
Deel
Laesies
Po
P1
Po
2
P2
P3
P4
P5
P6
Lymfoïde
follikels
qPCR resultaten
Lymfoïde
infiltratie
Mucus
primer 1
Mucus
primer 2
Biopt
primer 1
Biopt
primer 2
Afwezig
Afwezig
Negatief
Negatief
C
3 (7x)
3
Negatief
Negatief
F
2
3
Negatief
Negatief
A
2
3
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
Po
2
Afwezig
Afwezig
C
3 (4x)
3
Negatief
Negatief
F
2
2
Negatief
Negatief
A
2
1
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
Po
3
Afwezig
Afwezig
C
3 (2x)
2
95,21
195,79
F
2
1
113,84
85,42
A
2
2
1422,63
1545,79
Negatief
Negatief
Po
2
Afwezig
Afwezig
C
3 (8x)
3
Negatief
Negatief
F
1
1
Negatief
Negatief
A
1
2
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
Po
3
Afwezig
Afwezig
C
3 (6x)
3
Negatief
Negatief
F
1
2
Negatief
Negatief
A
1
2
859322,03
66610,17
Negatief
Positief
Po
2
0,38
Positief
C
3 (15x)
3
Negatief
Negatief
F
2
3
373,58
Negatief
30
A
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
Po
2
2
2
Negatief
Negatief
Negatief
Positief
Negatief
Positief
C
3 (9x)
3
Negatief
Negatief
F
2
1
261,67
389,58
A
2
2
Negatief
296,45
Negatief
Negatief
Po
2
Afwezig
Afwezig
C
3 (3x)
3
Negatief
Negatief
F
2
2
Negatief
317,50
A
2
1
Negatief
Positief
5486,84
8921,05
Po
5
Afwezig
Afwezig
C
0
2
3457,50
5550,00
F
0
1
4604,65
9488,37
A
1
1
841,18
1905,88
Negatief
5971,15
Po
2
2670,00
1220,00
C
3 (10x)
3
Negatief
189,57
F
1
1
1473,91
1350,00
A
2
2
763,89
841,67
Negatief
512,50
Po
2
10,90
7,85
C
3 (10x)
3
44659,09
25875,00
F
1
2
10687,50
9781,25
A
2
2
943,90
925,61
Negatief
Negatief
Po
0
Negatief
Negatief
C
3 (9x)
3
Negatief
Negatief
F
1
2
Negatief
Negatief
A
0
1
Negatief
Negatief
Negatief
1347,00
Po
2
Afwezig
Afwezig
C
0
3
Negatief
300,00
F
1
2
12233,33
5066,67
A
0
2
Negatief
529,79
Negatief
200,68
Po
1
65,00
31,70
C
3 (2x)
3
Negatief
2568,75
F
0
2
Negatief
876,92
A
3
2
2313,00
2451,00
Negatief
Negatief
Po
1
340,50
110,50
C
3 (9x)
3
Negatief
433,70
F
2
2
78461,54
73846,15
A
3
3
5407,89
7500,00
Negatief
Negatief
Po
2
90,50
46,15
C
3 (4x)
3
Negatief
188,75
F
1
2
2713,04
2250,00
A
1
3
Negatief
870,65
Negatief
Negatief
Po
2
Negatief
Negatief
C
1
3
Negatief
Negatief
F
1
3
Negatief
Negatief
A
1
2
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
Po
2
Negatief
31
Negatief
C
3 (9x)
3
Negatief
Negatief
F
1
2
Negatief
Negatief
0
2
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
A
P19
PO
2
3 (14x)
3
Negatief
Negatief
F
1
1
Negatief
Negatief
2
1
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
Po
2
3
Negatief
Negatief
F
1
2
Negatief
Negatief
1
2
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
Po
2
3
Negatief
93,00
F
1
2
1960,47
1953,49
1
2
1786,05
1768,60
Negatief
Positief
Po
2
3
Negatief
Positief
F
1
3
Negatief
Positief
2
2
Negatief
220,80
Negatief
Negatief
Po
2
3
Negatief
211,07
F
1
2
3595,95
3510,81
1
2
1809,00
1854,00
Negatief
Negatief
Po
2
Negatief
Negatief
C
2
3
Negatief
Negatief
F
1
2
975,00
1541,25
0
2
Negatief
Negatief
Nb
Negatief
Po
2
Negatief
13,85
C
3 (6x)
2
Nb
Negatief
F
2
2
Nb
1248,75
1
2
Nb
311,63
Negatief
Negatief
Po
3
73,00
44,05
C
Nb
Nb
Negatief
933,75
F
1
1
Negatief
Negatief
1
1
1800,00
1882,50
Negatief
Negatief
Po
4
67,50
28,75
C
3 (4x)
3
Negatief
Negatief
F
1
1
2436,67
2060,00
3
2
1548,75
1770,00
Negatief
Negatief
Po
4
Nb
9,10
C
3 (3x)
3
Negatief
Negatief
F
1
1
Negatief
547,67
3
2
2293,42
3228,95
Negatief
Positief
A
P29
Negatief
3 (15x)
A
P28
Negatief
C
A
P27
Afwezig
3 (6x)
A
P26
Afwezig
C
A
P25
Negatief
2
A
P24
Negatief
C
A
P23
Negatief
3 (14x)
A
P22
Negatief
C
A
P21
Negatief
C
A
P20
Negatief
PO
2
Negatief
Negatief
C
3 (3x)
3
Negatief
Positief
F
1
2
4794,23
7788,46
32
A
P30
P31
P32
P33
P34
P35
P36
P37
P38
P39
P40
P41
Po
3
3
2
Negatief
Positief
Negatief
125,42
Negatief
Positief
C
3 (3x)
3
Negatief
Positief
F
1
2
Negatief
806,25
A
2
3
Negatief
Positief
Negatief
120,50
Po
2
Negatief
Negatief
C
3 (3x)
3
Negatief
72,35
F
2
2
90750,00
102750,00
A
2
2
Negatief
64,20
Negatief
97,00
Po
2
Negatief
Negatief
C
3 (3x)
3
Negatief
57,38
F
1
2
1766,25
1980,00
A
1
2
Negatief
83,91
Negatief
Negatief
Po
3
Negatief
3,74
C
3 (9x)
1
Negatief
Negatief
F
1
2
14340,00
17220,00
A
3
3
259,88
77,44
Negatief
Negatief
Po
3
Negatief
4,94
C
3 (4x)
3
Negatief
Negatief
F
1
2
5785,71
2566,07
A
0
2
Negatief
Negatief
Negatief
Negatief
Po
2
Negatief
3,28
C
3 (9x)
3
Negatief
Negatief
F
0
2
1326,00
990,00
A
1
2
Negatief
Negatief
Negatief
163,00
Po
2
5550,00
2595,00
C
3 (4x)
3
653,33
276,33
F
1
2
126000,00
155400,00
A
0
3
461,25
372,38
Negatief
Positief
Po
2
Negatief
0,46
C
2
2
Negatief
Positief
F
0
1
Negatief
Positief
A
3
2
15,63
Positief
Negatief
Positief
Po
2
Negatief
1,33
C
3 (3x)
2
Negatief
Positief
F
2
2
Negatief
Positief
A
1
2
41,95
Positief
1268,97
841,38
Po
2
Nb
28,65
C
3 (10x)
3
704,00
376,40
F
1
1
Negatief
Positief
A
3
2
35692,31
29846,15
171,43
185,00
Po
2
Negatief
2,29
C
3 (15x)
3
80,20
74,20
F
1
1
Negatief
Positief
A
3
2
346,88
218,13
Negatief
Positief
Po
2
Nb
33
0,47
C
3 (3x)
3
Negatief
36,25
F
1
1
Negatief
Positief
3
2
Negatief
Positief
Negatief
Positief
A
P42
Po
2
3 (5x)
2
Negatief
Positief
F
1
2
Negatief
Positief
3
2
11,43
13,02
194,44
145,33
Po
3
2
47,09
55,27
F
2
1
Negatief
Negatief
2
1
18547,62
12571,43
21,53
13,98
Po
2
2
0,32
1,07
F
1
2
308,82
Negatief
2
1
3,75
Positief
Negatief
579,07
Po
2
3
6120,00
6560,00
F
1
2
593,15
Positief
3
2
29060,61
32121,21
201,05
183,68
Po
2
2
4159,09
5181,82
F
1
2
10864,41
11711,86
3
1
24705,88
22156,86
Negatief
19,25
Po
2
13,10
0,08
C
3 (3x)
1
3,70
Positief
F
1
1
Negatief
Negatief
2
1
70,31
96,62
30,48
26,67
Po
2
19,45
2,13
C
2
3
3,63
Positief
F
1
2
1923,26
Negatief
1
2
39,33
37,17
89,14
93,28
Po
5
17,55
16,25
C
3 (3x)
3
10,21
Positief
F
0
1
498,04
462,75
3
2
1038,00
1462,00
748,00
534,00
Po
5
Negatief
18,35
C
3 (4x)
3
4162,79
2604,65
F
1
1
988,57
Negatief
1
3
13125,00
12031,25
147,14
89,00
Po
3
Negatief
40,35
C
2
3
68,17
43,33
F
1
2
92666,67
68166,67
1
2
10450,00
9200,00
1240,00
831,25
A
P52
13,50
1
A
P51
17,40
C
A
P50
6,55
3 (2x)
A
P49
15,75
C
A
P48
0,19
3 (2x)
A
P47
10,35
C
A
P46
1,20
3 (5x)
A
P45
6,30
C
A
P44
Negatief
C
A
P43
Negatief
PO
3
1,57
5,80
C
3 (5x)
2
1420,75
813,21
F
1
2
11775,00
5750,00
34
A
P53
P54
P55
P56
P57
P58
P59
P60
P61
P62
P63
P64
Po
2
2
1
7,25
16,80
753,33
1015,00
51,29
28,71
C
3 (3x)
3
115,00
65,63
F
2
2
11934,21
6986,84
A
2
3
155,00
78,00
24,04
14,89
Po
2
6,95
2,58
C
2
3
9,64
9,05
F
1
2
936,67
1015,00
A
2
3
20,68
25,08
Negatief
Positief
Po
2
12,80
1,63
C
3 (3x)
3
Negatief
Positief
F
1
2
Negatief
Negatief
A
2
3
33,00
31,60
Negatief
Positief
Po
1
15,60
16,55
C
2
2
Negatief
Positief
F
0
1
450,00
Negatief
A
1
1
9945,95
12540,54
4,23
Positief
Po
1
1,04
0,82
C
3 (7x)
3
1,18
Positief
F
1
1
300,00
347,73
A
2
3
319,15
342,55
1,05
Positief
Po
1
1,45
1,10
C
3 (11x)
3
1,37
Positief
F
0
1
210,50
230,50
A
3
2
25857,14
33714,29
106,15
64,62
Po
1
40,40
1,19
C
3 (7x)
3
9,14
18,14
F
1
3
2431,37
Negatief
A
1
2
262,14
266,79
400,00
427,78
Po
3
467,50
590,00
C
1
2
200,00
260,00
F
1
2
7500,00
8636,36
A
1
3
700,00
1007,14
218,33
343,33
Po
2
2930,00
2700,00
C
3 (6x)
3
266,67
371,43
F
1
2
7400,00
7650,00
A
3
3
2180,00
2910,00
170,23
207,27
Po
2
47,65
65,50
C
3 (4x)
3
778,57
1047,62
F
0
2
7439,02
8097,56
A
0
2
509,76
568,29
484,09
606,82
Po
2
129,50
155,00
C
2
2
570,00
832,00
F
1
2
29406,25
25906,25
A
1
3
4023,81
4190,48
8,26
Positief
Po
2
12,25
35
3,62
C
2
3
8,42
12,89
F
1
2
1776,09
1800,00
2
2
150,91
197,58
214,84
138,71
A
P65
Po
2
3 (2x)
3
130,00
Positief
F
0
3
Negatief
Positief
2
3
28250,00
27250,00
Negatief
Positief
Po
2
Positief
3 (7x)
3
Negatief
Positief
F
1
2
Negatief
Positief
0
3
Negatief
Positief
Negatief
Negatief
Po
2
Negatief
Negatief
C
3 (3x)
3
Negatief
Negatief
F
1
2
Negatief
Negatief
2
2
Negatief
Negatief
Negatief
78,53
A
P68
Negatief
C
A
P67
4,66
C
A
P66
Negatief
Po
2
Negatief
17,75
C
3 (4x)
3
88,26
70,43
F
1
2
5650,00
4420,00
A
1
3
40333,33
38666,67
De scores voor laesies ter hoogte van de pars oesophagea gaan van 0 tot 5, voor lymfoïde follikels en
lymfoïde infiltratie ter hoogte van de 3 overige delen in de maag van 0 tot 3, (…x) = aantal getelde
lymfoïde follikels aanwezig ter hoogte van de cardia. Het aantal H. suis bacteriën is weergegeven per
mg biopt en mucus, zowel voor primerpaar 1 als 2. P… = varken, Po = pars oesophagea, C = cardia,
F = fundus, A = antrum, nb = niet te bepalen door een te grote afwijking tussen de duplicaten van
eenzelfde staal (standaarddeviatie > 0,5), positief = aanwezigheid van H. suis maar met afwijkende
smeltpiek (82,5-83,5°C), negatief = afwezigheid van H. suis met normale smeltpiek (80-81°C), afwezig
= geen verzamelde mucus aanwezig. Een grote variabiliteit van de resultaten kan opgemerkt worden,
zowel tussen de verschillende varkensmagen als de delen van eenzelfde varkensmaag.
Fig. 10-11: Lichtmicroscopisch beeld van een biopt (mucosa tot en met submucosa), afkomstig van
een bepaalde regio van de varkensmaag (= P), na HE-kleuring. Figuur links: Cardia van P19 met
groepering van lymfoïde follikels (witte ster) met germinaal centrum (bleek centrum en donkere rand)
(vergroting: x25). Figuur rechts: Cardia van P55 met een sterke diffuse lymfoïde infiltratie (zwarte
pijlen), score 3, in de lamina propria (vergroting: x100). De lengte van de balk is telkens 500 µm.
36
Fig. 12-13: Lichtmicroscopisch beeld van een biopt (mucosa tot en met submucosa), afkomstig van
een bepaalde regio in de varkensmaag (= P), na HE-kleuring. Figuur links: Fundus van P1 met
aanwezigheid van 3 kleine lymfoïde aggregaten (zwarte pijlen) in de submucosa (vergroting: x25).
Figuur rechts: Antrum van P15 met aanwezigheid van een grote, lymfoïde follikel (witte ster) in de
lamina propria (vergroting: x50). De lengte van de balk is telkens 500 µm.
Fig.14-16: Lichtmicroscopisch beeld van een biopt (mucosa tot en met submucosa), afkomstig van
een bepaalde regio in de varkensmaag (= P), na HE-kleuring. Figuur links boven: Fundus van P19
met een graad 1 lymfoïde infiltratie in de lamina propria (vergroting: x100). Figuur rechts boven:
Fundus van P16 met een graad 2 lymfoïde infiltratie in de lamina propria (vergroting: x100). Figuur
links onder: Antrum van P16 met een graad 3 lymfoïde infiltratie in de lamina propria (vergroting:
x100). De lymfoïde infiltratie is telkens aangeduid met een zwarte pijl. De lengte van de balk is telkens
500 µm.
37
Tabel 4: Weergave van de maagregio’s met een afwijkende smeltpiek (82,5-83,5°C) na gebruik van
primerpaar 2 ter detectie en kwantificatie van het ureA gen van H. suis.
Detectie van H. suis met primerpaar 2
Varken
Detectie van H. suis met pimerpaar 1
Po
C
F
A
M
Po
C
F
A
M
P6
*
-
-
*
*
-
-
+
-
-
P7
*
-
+
+
-
-
-
+
-
-
P8
-
-
+
*
/
-
-
-
-
/
P12
*
*
*
*
*
-
-
-
-
-
P22
*
*
*
+
/
-
-
-
-
/
P30
*
*
+
*
*
-
-
-
-
-
P37
*
*
*
*
+
-
-
-
+
-
P38
*
*
*
*
+
-
-
-
+
-
P39
+
+
*
+
+
+
+
-
+
/
P40
+
+
*
+
+
+
+
-
+
+
P41
*
+
*
*
+
-
-
-
-
/
P42
*
*
*
+
-
-
-
-
+
-
P44
+
+
-
*
+
+
+
+
+
+
P45
+
+
*
+
+
-
+
+
+
+
P48
+
*
-
+
+
+
+
+
+
+
P49
+
*
+
+
+
+
+
+
+
+
P55
*
*
-
+
+
-
-
-
+
+
P56
*
*
-
+
+
-
-
+
+
+
P57
*
*
+
+
+
+
+
+
+
+
P58
*
*
+
+
+
+
+
+
+
+
P64
*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
P65
+
*
*
+
+
+
+
-
+
-
P66
*
/
*
*
*
-
-
-
-
-
P67
*
/
/
*
*
-
-
-
-
-
+ deel
P… = varken, Po = pars oesophagea, C = cardia, F = fundus, A = antrum, M = mucus, * = afwijkende
smeltpiek met primerpaar 2 (82,5-83,5°C), - = negatief met normale smeltpiek (80-81°C), + = positief
met normale smeltpiek (80-81°C), / = niet te beoordelen door een te grote afwijking tussen de
duplicaten van eenzelfde staal (standaarddeviatie > 0,5). Er worden frequent stalen met een
afwijkende smeltpiek gedetecteerd na gebruik van primerpaar 2, in tegenstelling tot primerpaar 1
waarbij de stalen grotendeels negatief zijn.
38
Tabel 5: Species identificatie na sequenering en BLAST analyse van het geamplificeerd ureA gen,
afkomstig uit de biopten met een afwijkende smeltpiek (82,5-83,5°C) na gebruik van primerpaar 2.
Varken +
deel
Identificatie
%
Coverage
E-value
%
Identity
Accession
number
P8F
99%
1,00E128
1,00E128
2,00E116
3,00E07
1,00E128
1,00E128
1,00E128
1,00E128
3,00E40
1,00E128
1,00E128
1,00E128
1,00E128
1,00E128
1,00E128
1,00E128
1,00E109
1,00E45
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
96%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
96%
AB694698.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
99%
AC010976.6
P67F
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Uncultured diatom gene for 18S rRNA, partial
sequence, clone: PJ33
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Homo sapiens BAC clone RP11-286H15 from 2,
complete sequence
Sus scrofa clone KVL3231 microsatellite sequence
97%
EF133004.1
P67A
Niet mogelijk
P67M
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
Helicobacter suis clone HS-HA UreA (ureA) gene,
partial cds
1,00E09
1,00E128
1,00E128
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
100%
KC748473.1
P8A
P12F
P12A
P12M
P22F
P22A
P30F
P30A
P30M
P37F
P37A
P38F
P38A
P66F
P66A
P66M
P68F
P68A
99%
99%
25%
99%
99%
99%
99%
37%
83%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
89%
80%
40%
99%
99%
P…= varken, F = fundus, A = antrum, M = mucus, identificatie = de bacterie waarmee na BLAST
analyse de grootste overeenkomst wordt waargenomen, E-value = maat voor significantie van het
resultaat, % coverage = maat voor de lengte van een nucleotidensequentie waarvoor een
overeenkomstig fragment gedetecteerd werd, % identity = maat voor de exacte overeenkomst tussen
de nucleotidensequentie van het aangetoonde DNA en een gekende DNA sequentie, accession
number = unieke code die in de NCBI databank gelinkt is aan een welbepaalde sequentie. Het ureA
gen van H. suis wordt frequent gedetecteerd.
2.
Analyse van de maagmicrobiota: uitplaten en sequeneren
Vooraleer interacties tussen H. suis en andere micro-organismen bestudeerd kunnen worden, moet de
samenstelling van de gastrale microbiota bij de geselecteerde H. suis-positieve en –negatieve dieren
(zie resultaten 3.1.) gekend zijn. Om een eerste indruk te krijgen, werden de geënte agarplaten
visueel beoordeeld, zowel voor alle varkensmagen als de geselecteerde. Daarna werden de
reinculturen van de meest frequent voorkomende bacterie gesequeneerd, dit enkel voor de H. suis-
39
positieve en -negatieve geselecteerde dieren waarvan de maagmicrobiota samenstelling later bepaald
werd (zie resultaten 3.1. en 3.2.).
Zowel de agarplaten van pars oesophagea en cardia als fundus en antrum vertoonden na
incubatie een vrij gelijkaardig aantal kolonies. Geen enkele regio van de maag vertoonde dus duidelijk
meer of minder kolonies dan een andere. Het macroscopisch aflezen van de platen van P13-16
leverde zowel voor als na spoelen met PBS hetzelfde resultaat op, er werd immers geen duidelijk
verschil bemerkt in aantal aanwezige kolonies (figuur 17-18). Tussen de varkens zelf was er heel wat
variatie op te merken, sommige varkens vertoonden vooral kleine, groene kolonies terwijl andere meer
grote, witte tot grijze kolonies vertoonden. Af en toe kon een kolonie van een schimmel of gist
opgemerkt worden.
Na analyse van de geïncubeerde agarplaten van de geselecteerde varkens, werden over het
algemeen twee types of soorten reinculturen bekomen (tabel 6): kleine, groene, hemolytische kolonies
en grote, witte tot grijze, glanzende, niet hemolytische kolonies. Deze eerste waren negatief op de
KOH- en H2O2-testen. In combinatie met hun uitzicht wees dit mogelijks in de richting van
Lactobacillus spp., die inderdaad aanwezig kunnen zijn in de maag (107,109). De grote, witte tot
grijze, glanzende kolonies waren allen positief op de KOH-test en eveneens oxidase negatief, behalve
het antrum van P12. In combinatie met hun uitzicht wees dit in de richting van Enterobacteriacea spp.
(figuur 19-20). De Gram-kleuring van de reincultuur van P20 leverde een beeld van paarse, smalle en
lange staafjes met kettingvorming op onder de lichtmicroscoop en was dus sterk indicatief voor
Lactobacillus spp. (figuur 21). Bij een poging om een reincultuur te bekomen van het antrum van P18,
werd een vermoedelijke groei van Proteus spp. opgemerkt (figuur 22). Na overbrengen van de
oorspronkelijk geselecteerde kolonie op een meer selectieve Macconkey agar no.3® (Oxoid,
Basingstoke, Verenigd Koninkrijk), werd deze terug overwoekerd door Proteus spp. en aldus
uitgesloten voor verder onderzoek. Voor de cardia en het antrum van P17 kon geen bacteriële groei
opgemerkt worden na purificatie en 72 h incubatie in de broedstoof. Bij selectie van een nieuwe
kolonie, maar dan enkel van het antrum van P17, kon wel een reincultuur opgemerkt worden na 24 h
incubatie (tabel 6).
Van de volgende reinculturen werd een duidelijk bandje, na agarose gelelektroforese van het
geamplificeerde 16S rRNA gen, opgemerkt bij de 1 op 10 verdunde stalen en deze werden dan ook
opgestuurd voor sequenering: P11 fundus, P27 pars oesophagea B, P28 antrum A, P28 antrum B,
P33 cardia, P49 cardia, P50 pars oesophagea A, P50 pars oesophagea B, P12 antrum, P17 antrum,
P19 cardia A, P19 cardia B, P20 pars oesophagea en P67 cardia (figuur 23). Op basis van de
commerciële ladder kon afgeleid worden dat de gescheiden fragmenten tussen de 1200 en 2000
baseparen lang waren, waarbij weinig verschil opgemerkt kon worden tussen de fragmenten zelf. Dit
was aldus een bevestiging dat de PCR reactie van het 16S rRNA gen, ongeveer 1500 baseparen
lang, hoogstwaarschijnlijk succesvol verlopen was. Er werden geen bandjes waargenomen bij de
onverdunde stalen, maar wel van de positieve controle en commerciële ladder. Dit laatste toonde aan
dat de gelelektroforese zelf gelukt was. Met behulp van sequenering en BLAST analyse werden de
gecultiveerde bacteriële species geïdentificeerd, waarbij de resultaten zijn weergegeven in tabel 7.
Aangezien voor de meeste bacteriën geen 100% identity bekomen werd, kunnen de bacteriën van de
reinculturen mogelijks ook nieuwe species of stammen zijn van resp. hetzelfde genus of species.
Daarnaast geven de bekomen resultaten een bevestiging dat de 16S rRNA amplificatie succesvol
verlopen was, aangezien bij elk staal het 16S rRNA gen geïdentificeerd werd. Frequent werd E. coli
gedetecteerd, namelijk bij 10 van de 14 stalen, waarbij meer E. coli werd gevonden in de H. suispositieve magen (7/8) dan de negatieve magen (3/6). De negatieve magen vertoonden op hun beurt
meer Lactobacillus spp. (2/6) dan de positieve magen (1/8).
40
Wanneer het genus, bekomen na analyse van de morfologie en biochemische testen,
vergeleken wordt met de species identificatie na sequenering (tabel 7), is dit in overeenstemming met
elkaar. De Enterobacteriaceae spp. werden geïdentificeerd als E. coli, de Lactobacillus spp. als
Lactobacillus reuteri. Daarnaast werden Streptococcus hyointestinalis en Enterococcus cecorum
geïdentificeerd, wat ook overeenstemt met de morfologie van de geïsoleerde kolonies/bacteriën.
Fig. 17-18: Macroscopisch uitzicht van de bekomen bacteriële kolonies na incubatie van
bloedagarplaten, geënt met een genomen swab van het oppervlak van de 4 maagregio’s. De platen
werden gedurende 24 h geïncubeerd bij 37°C in een micro-aërofiele atmosfeer. Van rechts naar links:
de pars oesophagea (= Po) en cardia (= C) (op 1 plaat), fundus (= F) en antrum (= A) (op 1 plaat).
Figuur links: De swabs zijn genomen van P15 voor het spoelen van de maaginhoud. Figuur rechts: De
swabs zijn genomen van P15 na het spoelen van de maaginhoud met PBS. In grote lijnen zien de
platen er macroscopisch identiek uit. P… = varken.
Tabel 6: Weergave van het morfologisch uitzicht en resultaat van de biochemische testen op de
reinculturen afkomstig uit de geselecteerde H. suis-positieve en -negatieve varkensmagen.
Varken + deel
qPCR
Morfologisch uitzicht
KOH
H2O2
oxidase
P11 fundus
Positief
Klein, groen, hemolyse
Negatief
Negatief
Nvt
P27 pars oesophagea
Positief
Polybacterieel
Nvt
Nvt
Nvt
P27 pars oesophagea A
Positief
Klein, wit, mat, bol
Negatief
Nvt
Negatief
P27 pars oesophagea B
Positief
Groot, grijs, glanzend, rafelig
Positief
Nvt
Negatief
P28 antrum A
Positief
Groot, grijs, glanzend, bol
Positief
Nvt
Negatief
P28 antrum B
Positief
Groot, grijs, glanzend, bol
Positief
Nvt
Negatief
P33 cardia
Positief
Groot, grijs, glanzend, bol
Positief
Nvt
Negatief
P49 cardia
Positief
Groot, blauwgrijs, glanzend, bol
Positief
Nvt
Negatief
P50 pars oesophagea A
Positief
Groot, grijs, glanzend, bol
Positief
Nvt
Negatief
P50 pars oesophagea B
Positief
Klein, grijs, glanzend, bol, hemolyse
Positief
Nvt
Negatief
P12 antrum
Negatief
Klein, witgeel, rafelig, matige glans
Positief
Nvt
Positief
P17 antrum
Negatief
Groot, grijs, glanzend, bol
Positief
Nvt
Negatief
P18 antrum
Negatief
Proteus spp. overgroei
Nvt
Nvt
Nvt
P19 cardia
Negatief
Groot, grijs, glanzend, bol
Positief
Nvt
Negatief
P20 pars oesophagea
Negatief
Klein, groen, hemolyse
Negatief
Negatief
Nvt
P67 cardia
Negatief
Klein, blauwgrijs, glanzend, bol
Negatief
Negatief
Nvt
Resultaat qPCR negatief = volledige afwezigheid van het ureA gen van H. suis in elk deel van de
maag én mucus, positief = minstens 1 positief deel en/of mucus. KOH positief, negatief = resp. aan-,
41
afwezigheid van slijmvorming na aanbrengen van 1 kolonie in kaliumhydroxide. H2O2 positief, negatief
= resp. aan-, afwezigheid van bruisvorming na aanbreng van 1 kolonie in waterstofperoxide. Oxidase
positief, negatief = resp. aan-, afwezigheid van paarsverkleuring van de teststrip na het aanbrengen
van 1 kolonie. P… = varken, nvt = niet van toepassing. A en B = 2 verschillende bacteriële kolonies
abundant aanwezig op de agarplaat van eenzelfde deel van hetzelfde varken, waardoor beide
geselecteerd werden om een reincultuur aan te maken. Een variabel morfologisch uitzicht kan
opgemerkt worden tussen de reinculturen van verschillende varkens.
Fig. 19-20: Duidelijke aanwezigheid van een reincultuur op beide agarplaten na 24 h incubatie bij
37°C en 6% CO2. Hiervoor werd een abundante kolonie geselecteerd en overgeënt op een
bloedagarplaat. Figuur links: aanwezigheid van grote, grijze en glanzende kolonies van de cardia van
P9. Figuur rechts: aanwezigheid van kleine, groene kolonies van de pars oesophagea van P20. P… =
varken.
Fig. 21: Gram-kleuring van een Lactobacillus sp. verdachte reincultuur afkomstig uit de pars
oesophagea van P20. De bacteriën vertonen de typerende Lactobacillus sp. morfologie: paarse,
smalle en lange staafjes, waarbij kettingvorming kan opgemerkt worden (zwarte pijlen). De lengte van
de balk is 50 µm. P… = varken.
42
Fig. 22: Vermoedelijke aanwezigheid van Proteus spp. groei na overenten van een abundante kolonie
afkomstig uit de cardia van P18. Na 24 h incubatie bij 37°C en 6% CO2 werden multifocale, kleine
indrukkingen (witte pijl) in de bloedagarplaat opgemerkt. P… = varken.
Figuur 23: Agarose gelelektroforese waarbij de geamplificeerde 16S rRNA fragmenten, na PCR
reactie, gescheiden werden. De fragmenten zijn afkomstig van reinculturen uit de geselecteerde H.
suis-negatieve en positieve varkensmagen. De merker (M) vertoont een duidelijk bandenpatroon, de
positieve controle (Hs = H. suis) en 14 van de 15 stalen vertonen een duidelijk bandje. De negatieve
controle (N) en P27 PoA vertonen geen bandenpatroon. P… = varken, Po = pars oesophagea, c =
cardia, f = fundus, a = antrum, A en B = twee verschillende, abundante kolonies op een geënte
agarplaat van hetzelfde varken waarbij beide werden geselecteerd voor DNA extractie.
43
Tabel 7: Species identificatie na sequenering en BLAST analyse van de geamplificeerde 16S rRNA
fragmenten, afkomstig uit de reinculturen van de geselecteerde H. suis-positieve en –negatieve
magen.
Varken +
deel
Identificatie
%
Coverage
Evalue
%
Identity
Accession
number
P11F
Streptococcus hyointestinalis strain 1616a 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
Escherichia sp. LS-125 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
Escherichia coli strain DSPV 247T 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Escherichia coli strain Q1 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
Escherichia coli strain Q1 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
Escherichia coli strain UPEC-SR71 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Escherichia coli O111:H- str. 11128 DNA, complete genome
99%
0.0
99%
JN613172.1
99%
0.0
99%
KF870457.1
99%
0.0
99%
FJ997269.1
99%
0.0
99%
HM371196.1
99%
0.0
99%
HM371196.1
99%
0.0
99%
KF192074.1
99%
0.0
99%
AP010960.1
Escherichia coli strain Q1 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
Alcaligenes sp. XJ149Q-12-2NYS2 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Escherichia coli strain DSPV 247T 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Escherichia coli strain chicken11 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Escherichia coli strain Q1 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
Lactobacillus reuteri strain ZJ667 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Enterococcus cecorum 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
99%
0.0
99%
HM371196.1
98%
0.0
98%
JQ975900.1
99%
0.0
99%
FJ997269.1
99%
0.0
99%
JX041515.1
99%
0.0
99%
HM371196.1
99%
0.0
97%
JX523999.1
100%
0.0
97%
AY365054.1
P27Po b
P28A a
P28A b
P33C
P49C
P50Po a
P50Po b
P12A
P17A
P19C a
P19C b
P20Po
P67C
P… = varken, F = fundus, A = antrum, a en b = twee verschillende, abundante kolonies op een geënte
agarplaat van hetzelfde varken waarbij beide werden geselecteerd voor DNA extractie, identificatie =
de bacterie waarmee na BLAST analyse de grootste overeenkomst wordt waargenomen, E-value =
maat voor significantie van het resultaat, % coverage = maat voor de lengte van een
nucleotidensequentie waarvoor een overeenkomstig fragment gedetecteerd werd, % identity = maat
voor de exacte overeenkomst tussen de nucleotidensequentie van het aangetoonde DNA en een
gekende DNA sequentie, accession number = unieke code die in de NCBI databank gelinkt is aan een
welbepaalde sequentie.
3. Selectie van magen en vergelijking van de microbiota
Om een meer volledig beeld te krijgen van de microbiota in de maag van H. suis-positieve en
-negatieve varkens, werd de samenstelling van gastrale microbiota bij een aantal dieren bepaald door
middel van sequenering en metagenomics.
3.1. Geselecteerde varkensmagen: toegekende scores
Om de varkensmagen voor metagenomics analyse te kunnen selecteren, werd gebruik gemaakt van
volgende criteria: aan- of afwezigheid van H. suis, aantal H. suis kiemen, score voor laesies ter hoogte
van de pars oesophagea en score voor gastritis ter hoogte van fundus en antrum. Een ernstige score
voor de pars oesophagea betekende een score van minstens 3 (aanwezigheid van erosies). Een
ernstige gastritis ter hoogte van fundus en antrum betekende minstens één score 3 voor de vorming
van lymfoïde follikels of infiltratie met ontstekingscellen. De toegekende scores voor de cardia werden
niet in acht genomen als selectiecriterium, gezien bijna alle magen een score 3 vertoonden voor
gastritis in deze regio (tabel 3).
44
Op basis van deze criteria werden 6 varkens geselecteerd voor de negatieve groep: P12, P1720 en P67. Al deze vertoonden afwezigheid van H. suis in zowel mucus als biopten, een maximale
score van 2 voor laesies ter hoogte van de pars oesophagea en geen tot slechts milde gastritis in
fundus en antrum. Voor de positieve groep werden volgende 6 varkens geselecteerd met een hoog
aantal H. suis koloniserende bacteriën: P11, P27, P28, P33, P49 en P50. Naast aanwezigheid van
H. suis vertoonden deze magen ook ernstige gastritis met erosies en/of ulcera ter hoogte van de pars
oesophagea.
Uit tabel 8 kan afgeleid worden dat de negatieve groep, ten opzichte van de positieve groep
en alle positieve varkens, de laagste waarde vertoonde voor de gemiddelde score en meest frequente
score voor lymfoïde follikels ter hoogte van het antrum en voor de gemiddelde score voor lymfoïde
infiltratie ter hoogte van het antrum. De sterkste associatie tussen H. suis kolonisatie en gastritis wordt
immers in het antrum gevonden (25). Tussen de 3 groepen kon weinig relevant verschil opgemerkt
worden voor het scoren van gastritis ter hoogte van cardia en fundus. Zoals reeds hoger vermeld (zie
resultaten 1.), kwam hyperkeratose met een score van 2 het meeste voor ter hoogte van de pars
oesophagea, zowel bij de negatieve als alle positieve varkensmagen. In vergelijking met de
geselecteerde positieve varkensmagen vertoonde de negatieve groep een gemiddeld lagere score
voor laesies ter hoogte van de pars oesophagea. De cardia vertoonde eveneens de hoogste graad
van gastritis, gevolgd door antrum en als laatste fundus.
Tabel 8: Overzicht van de toegekende scores voor laesies ter hoogte van de pars oesophagea en
gastritis ter hoogte van cardia, fundus en antrum. Deze werden toegekend voor zowel de
geselecteerde H. suis-positieve en –negatieve varkensmagen als alle H. suis positieve varkensmagen.
Laesies
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
Lymfoïde
pars
follikels
infiltratie
follikels
infiltratie
follikels
infiltratie
oesophagea
cardia
cardia
fundus
fundus
antrum
antrum
Gemiddelde
1,67
2,67
3,00
1,00
2,00
1,00
1,67
SD
0,82
0,82
0,00
0,00
0,63
0,89
0,52
Aantal 0
1
0
0
0
0
2
0
(17%)
(0%)
(0%)
(0%)
(0%)
(33%)
(0%)
0
1
0
6
1
2
2
(0%)
(17%)
(0%)
(100%)
(17%)
(33%)
(33%)
5
0
0
0
4
2
4
(83%)
(0%)
(0%)
(0%)
(67%)
(33%)
(67%)
0
5
6
0
1
0
0
(0%)
(83%)
(100%)
(0%)
(17%)
(0%)
(0%)
2,00
3,00
3,00
1,00
2,00
0,00
2,00
3,83
3,00
2,67
0,83
1,33
2,50
2,17
Negatieve
varkens (n=6)
Aantal 1
Aantal 2
Aantal 3
Aantal 4
0
(0%)
Aantal 5
0
(0%)
Meest
frequente score
Positieve
varkens (n=6)
Gemiddelde
45
SD
1,17
0,00
0,82
0,41
0,52
0,84
0,75
Aantal 0
0
0
0
1
0
0
0
(0%)
(0%)
(0%)
(17%)
(0%)
(0%)
(0%)
0
0
1
5
4
1
1
(0%)
(0%)
(17%)
(83%)
(67%)
(17%)
(17%)
1
0
0
0
2
1
3
(17%)
(0%)
(0%)
(0%)
(33%)
(17%)
(50%)
1
6
5
0
0
4
2
(17%)
(100%)
(83%)
(0%)
(0%)
(67%)
(33%)
4,00
3,00
3,00
1,00
1,00
3,00
2,00
Gemiddelde
2,25
2,67
2,71
1,02
1,78
1,76
2,15
SD
0,90
0,71
0,53
0,57
0,56
0,97
0,64
Aantal 0
0
2
0
9
0
6
0
(0%)
(3%)
(0%)
(15%)
(0%)
(10%)
(0%)
7
2
2
40
17
18
8
(12%)
(3%)
(3%)
(68%)
(29%)
(31%)
(14%)
38
9
13
10
38
19
34
(64%)
(15%)
(22%)
(17%)
(64%)
(32%)
(58%)
9
45
43
0
4
16
17
(15%)
(76%)
(73%)
(0%)
(7%)
(27%)
(29%)
3,00
3,00
1,00
2,00
2,00
2,00
Aantal 1
Aantal 2
Aantal 3
Aantal 4
2
(33%)
Aantal 5
2
(33%)
Meest
frequente score
Alle positieve
varkens (n=59)
Aantal 1
Aantal 2
Aantal 3
Aantal 4
2
(3%)
Aantal 5
3
(5%)
Meest
frequente score
2,00
Weergave van het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD), het aantal varkens per score en de meest
frequente score. De scores voor laesies in de pars oesophagea gaan van 0 tot 5, voor lymfoïde
follikels en infiltratie van 0 tot 3. Het aantal varkens voor zowel de H. suis-positieve als -negatieve
groep bedraagt 6. In totaal werden 59 H. suis-positieve varkensmagen gedetecteerd.
3.2. Microbiota samenstelling
Na sequenering werd een metagenomics analyse uitgevoerd zoals hoger beschreven (zie materiaal
en methoden 2.5.). In totaal werden 1115 verschillende bacteriën (genera met gekende of nieuwe
species) gedetecteerd waarvan 115, 201, 241, 157, 103, 253, 262, 125, 243, 264, 242 en 321 in de
gastrale microbiota van resp. P11, P27, P28, P33, P49, P50, P12, P17, P18, P19, P20 en P67 werden
gedetecteerd. Figuur 24 toont aan dat een betrouwbaar resultaat bekomen werd van de microbiota
samenstelling voor elke varkensmaag. Er werd aldus met vrij grote zekerheid een representatieve
46
identificatie bekomen van de aanwezige genera en species na 16S rRNA sequenering en analyse. In
figuur 25 wordt een overzicht van de gastrale microbiota per geselecteerd dier weergegeven. Enkel
het aandeel van de meest frequent voorkomende bacteriën wordt hierbij weergegeven. Als eerste
werd nagegaan of de H. suis-positieve en -negatieve varkensmagen correct werden geselecteerd op
basis van de qPCR resultaten (zie resultaten 1.), waarbij H. suis aan- of afwezigheid in de microbiota
werd nagegaan. Alle varkens uit beide groepen werden aldus correct geselecteerd voor H. suis aanof afwezigheid. Varken 12, hoewel een twijfelgeval na analyse van de mucosale biopten (zie
resultaten 1.), was duidelijk negatief voor H. suis en kon verder behouden worden in de negatieve
groep. De microbiota van P11 was voornamelijk samengesteld uit H. suis, namelijk 77,07%, wat in
sterk contrast staat met de andere positieve varkensmagen waar H. suis 0,3-13% van de microbiota
uitmaakte. De 3 hoogste aantallen van H. suis werden gedetecteerd bij P11 (77,07%), P27 (9,77%) en
P50 (12,98%). De overige positieve varkens (P28, P33 en P49) hadden een H. suis aandeel lager dan
1%, waarbij weinig relevant verschil opgemerkt kon worden tussen de graad van laesies en gastritis in
vergelijking met de 3 varkens met een hoger H. suis aandeel. Hoewel H. suis negatief, werd
Helicobacter HM124320 bij P12 (3,47% aandeel) en Helicobacter rappini bij P18 (1,15%) en P19
(3,39%) gedetecteerd.
Een hoge diversiteit van de microbiota werd opgemerkt (figuur 25), zowel binnen eenzelfde
maag als tussen verschillende magen, waardoor geen duidelijke significante verschillen verkregen
werden, hoogstwaarschijnlijk ook door het beperkte aantal dieren per groep (persoonlijke mededeling
B. Taminiau, Laboratoire de Microbiologie des Denrées alimentaires, Département des denrées
alimentaires d’origine animales, Faculté de Médecine vétérinaire, Université de Liège). De gastrale
microbiota van P11 bestond voor het grootste deel uit H. suis (77,07%), van P27 en P50 uit E. coli
(resp. 22,26% en 17,61%), van P28 en P33 uit een mogelijks nieuw Fusobacterium species
(Fusobacterium OTU4) (resp. 11,05% en 32,70%), van P49 uit Lactobacillus amylovorus (51,05%),
van P12 uit een mogelijks nieuw Campylobacter species (Campylobacter OTU10) (29,38%), van P17
uit Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis (18,15%), van P18 uit Campylobacter jejuni
(46,39%), van P19 en P67 uit Actinobacillus porcinus (resp. 13,83% en 45,14%) en van P20 uit
Lactobacillus johnsonii (19,59%). Escherichia (E.) coli kwam frequenter voor bij de H. suis-positieve
varkensmagen met een gemiddeld aandeel van 7,55% in de maagmicrobiota samenstelling in
vergelijking met de negatieve magen waarbij het gemiddelde 1,21% bedroeg. Daarnaast werden een
nieuw species van Fusobacterium (OTU4, zie figuur 25) en Fusobacterium necrophorum voornamelijk
gedetecteerd in de positieve groep met een gemiddeld aandeel van resp. 8,64% en 2,70%, hoewel
het verschil met de negatieve groep met resp. 5,29% en 0,17% niet sterk uitgesproken was.
Campylobacter jejuni bleek daarnaast meer voor te komen bij de negatieve varkens met gemiddeld
8,14% aandeel in de maagmicrobiota, in tegenstelling tot de positieve magen waarbij het gemiddelde
slechts 0,029% was. Dit was ook het geval voor Actinobacillus porcinus en Campylobacter
hyointestinalis subsp. hyointestinalis met een gemiddelde van resp. 6,75% en 3,08% in de negatieve
magen en resp. 1,83% en 0% in de positieve magen, hoewel het verschil tussen beide groepen niet
sterk uitgesproken was. Het aantal reads van de hierboven vermelde bacteriën is weergegeven per
bacterieel species bij elk varken in tabel 9. Clostridium HQ716310, Clostridium GU120126, Veillonella
AF371939 en Moraxella DQ860033 werden frequent aangetroffen in de microbiota van de varkens
met sterke variatie tussen de varkens zelf, onafhankelijk van de groep waartoe ze behoorden. De
code die na het genus vermeld wordt, staat voor het accessienummer van een nucleotidensequentie
van een bepaald bacteriaal species in GenBank (NCBI), waarbij de bacterie tot op heden nog niet
gecultiveerd en geïsoleerd is. Opvallend was dat Lactobacillus EU774884, Lactobacillus EU778514,
Lactobacillus GQ267943, Lactobacillus EU774884 meer frequent voorkwamen in de H. suis-positieve
47
magen, Lactobacillus HQ716416 meer in de negatieve magen en Lactobacillus johnsonii,
Lactobacillus EU778525, Lactobacillus EU475128, Lactobacillus fermentum en Lactobacillus
salivarius in dezelfde mate in beide groepen magen.
Wanneer de resultaten van de gepoolde stalen vergeleken worden met deze van de
gepurificeerde reinculturen (zie resultaten 2.), wordt frequent een verschillend dominant bacterieel
species verkregen. Enkel de pars oesophagea van P27 en P50 vertoonden dezelfde uitkomst,
namelijk E. coli als meest frequent voorkomend species van de gastrale microbiota. De geïsoleerde
bacteriële species uit de reinculturen van P17, P19, P20, P28, P33 en P49 konden gedetecteerd
worden in de gastrale microbiota van de gepoolde stalen, hoewel niet als meest frequent voorkomend.
Alcaligenes sp. afkomstig uit het antrum van P12 kon niet gedetecteerd worden. Na het aligneren van
de gesequeneerde reinculturen afkomstig uit de fundus van P11 en de pars oesophagea van P20 met
de nucleotidensequenties verkregen na metagenomics analyse van de gepoolde stalen, werd geen
betrouwbare match bekomen.
Sommige van de bacteriën afkomstig uit de geïsoleerde reinculturen kunnen mogelijks
beschouwd worden als nieuwe species. De nucleotidensequentie van de reincultuur afkomstig uit de
fundus van P11 vertoonde 99% identiteit met Streptococcus hyointestinalis, hoewel dit species niet
naar voor komt uit de metagenomics analyse (figuur 25). Mogelijks gaat het hier over een nog niet
eerder beschreven Streptococcus soort. De sequentie van de reincultuur afkomstig uit de cardia van
P67 (overeenkomst van 97% met Enterococcus cecorum, zie tabel 7) vertoonde, op 2 basen na, een
goede overeenkomst met Enterococcus DQ057377 uit het gepoolde staal. De sequentie van
Enterococcus DQ057377 vertoonde na verdere BLAST analyse echter een 100% overeenkomst met
Enterococcus faecalis (accessienummer KC511554) en Enterococcus cecorum (accessienummer
AY365054). Deze tegenstrijdige gegevens wijzen erop dat het hier in feite over één en dezelfde
bacteriële soort kan gaan. Verder onderzoek zal moeten uitwijzen of het hier om Enterococcus
cecorum dan wel een nog niet eerder beschreven Enterococcus soort gaat. In tabel 10 zijn enkele
nucleotidensequenties van deze, mogelijks nieuwe, bacteriële species weergegeven.
Na anaërobe incubatie van de geënte agarplaten met het oppervlak van de maag, vertoonden
slechts 6 nieuwe varkensmagen kleine, grijsgroene kolonies verdacht voor Fusobacterium spp. Na het
aanmaken van een reincultuur en vervolgens uitvoeren van een Gram-kleuring, werd de typerende
Fusobacterium sp. morfologie duidelijk opgemerkt bij 1 reincultuur (figuur 26). Bij 4 andere reinculturen
werd een twijfelachtige Gram-kleuring bekomen, waardoor het 16S rRNA gen van deze eveneens
werd gesequeneerd. Na BLAST analyse van de gesequeneerde reinculturen, werd geen match
bekomen met de mogelijks nieuwe Fusobacterium soort (tabel 11).
48
400
350
P67
aantal geobserveerde OTUs
P20
300
P19
P18
250
P17
P12
200
P50
P49
150
P33
P28
100
P27
P11
50
0
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
aantal geanalyseerde reads
Fig. 24: Grafische weergave van de variabiliteit na sequenering en analyse van het geamplificeerde
16S rRNA gen. Op de x-as wordt het aantal gesequeneerde en geanalyseerde 16S rRNA fragmenten
weergegeven per staal, op de y-as het aantal operationele taxonomische eenheden (OTU). De
kleuren gebruikt voor elke curve stemmen overeen met de legende rechts, waarbij P…= varken. Hoe
steiler de curve, des te meer fragmenten van eenzelfde staal moeten geanalyseerd worden om
eenzelfde OTU te bekomen, wat echter niet het geval is voor deze stalen. Hier wordt immers een
afvlakking van de curves gedetecteerd, wat een aanvaardbare betrouwbaarheid weerspiegelt.
49
1
Aandeel bacterie in
microbiota (log)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Microbiota samenstelling per varken
P67
P20
P19
P18
P17
P12
P50
P49
P33
P28
P27
P11
0
Helicobacter_rappini
Turicibacter_EU009765
Haemophilus_Actinobacillus_indolicus
Propionibacterium_GU940713
Neisseria_BramFlahou_2014_16S_OTU102
Neisseria_BramFlahou_2014_16S_OTU78
Clostridium_GQ136565
Bergeyella_BramFlahou_2014_16S_OTU36
Johnsonella_BramFlahou_2014_16S_OTU70
Lactobacillus_EU778514
Prevotella_BramFlahou_2014_16S_OTU60
Streptococcus_suis
Mitsuokella_EU474927
Fastidiosipila_BramFlahou_2014_16S_OTU52
Leptotrichia_BramFlahou_2014_16S_OTU55
Gemella_AF371537
Proteocatella_BramFlahou_2014_16S_OTU68
Acinetobacter_BramFlahou_2014_16S_OTU75
Lactobacillus_GQ267943
Peptostreptococcaceae_GQ136657
Actinobacillus_BramFlahou_2014_16S_OTU29
Porphyromonas_BramFlahou_2014_16S_OTU44
Prevotella_BramFlahou_2014_16S_OTU25
Prevotella_BramFlahou_2014_16S_OTU35
Prevotella_BramFlahou_2014_16S_OTU26
Megasphaera_elsdenii
Actinobacillus_BramFlahou_2014_16S_OTU20
Rothia_nasimurium
Fusobacterium_necrophorum_subsp._funduliforme
Megasphaera_EU157187
Peptostreptococcaceae_GQ139152
Prevotella_BramFlahou_2014_16S_OTU22
Campylobacter_hyointestinalis_subsp._hyointestinalis
Prevotella_BramFlahou_2014_16S_OTU24
Moraxella_DQ860033
Prevotella_HQ399837
Campylobacter_BramFlahou_2014_16S_OTU10
Veillonella_AF371939
Clostridium_GU120126
Clostridium_HQ716310
Lactobacillus_johnsonii
Campylobacter_jejuni
Actinobacillus_porcinus
Escherichia_coli
Lactobacillus_amylovorus
Fusobacterium_BramFlahou_2014_16S_OTU4
Helicobacter_suis
Fig. 25: Weergave van de samenstelling van de maagmicrobiota na sequenering en metagenomics
van het geamplificeerde 16S rRNA gen voor elk geselecteerd varken. Op de x-as staat het varken
(= P…) vermeld. Op de y-as staat het aandeel van de bacterie in de microbiota samenstelling
uitgedrukt in een logaritmische schaal. De kleuren gebruikt in de grafiek stemmen overeen met de
kleuren in de legende rechts, waarbij de proportie van een bepaalde bacterie afgelezen kan worden.
Een grote diversiteit in microbiota samenstelling is hier waarneembaar.
50
Tabel 9: Het aantal bekomen reads na metagenomics analyse van het geamplificeerd 16S rRNA gen,
weergegeven voor de voornaamste bacteriële species voorkomend in de gastrale microbiota van de
H. suis-positieve en -negatieve varkens.
P11
P27
P28
P33
P49
P50
P12
P17
P18
P19
P20
P67
Helicobacter suis
5175
669
34
35
29
888
0
0
0
0
0
0
Escherichia coli
31
1525
174
122
1
1205
0
2
304
88
29
77
Fusobacterium OTU4
26
202
638
2079
13
314
62
10
179
889
204
714
Fusobacterium necrophorum
17
1
3
63
0
1019
3
1
34
8
29
1
Campylobacter jejuni
0
12
0
0
0
0
1
16
3437
179
5
0
Lactobacillus johnsonii
11
105
20
2
41
4
1
0
2
4
3142
9
Actinobacillus porcinus
21
58
368
197
8
16
16
47
335
1144
121
943
Campylobacter OTU10
0
0
0
0
0
3
2815
0
0
0
0
0
subsp. hyointestinalis
0
0
0
0
0
0
4
1333
11
6
0
2
Lactobacillus amylovorus
27
1
7
7
4030
1
30
181
8
24
3
20
6715
6850
5773
6357
7894
6841
9580
7343
7409
8270
6961
4813
Campylobacter hyointestinalis
Totaal
aantal
varkensmaag
reads
per
Het genus van de bacterie wordt steeds vermeld en, indien gedetecteerd, ook het species. De
bacteriën waarbij het genus gevolgd wordt door OTU (operationele taxonomische eenheden) konden
niet tot op species niveau geïdentificeerd worden na BLAST analyse in de NCBI databank. P… =
varken.
Tabel 10: Nucleotidensequenties van het geamplificeerde 16S rRNA gen van enkele, mogelijks
nieuwe, bacteriële species afkomstig uit de gastrale microbiota van varkens.
Genus
Sequentie nieuw species (5’-3’)
Streptococcus
GGGATTTATTGGGGCGTAAAAGCGAGCGCAGGGCGGTTTCATAAGTCTGAAGTTAAAGGGCAGTGGCT
afkomstig uit de
TAAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGTGAGACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAG
fundus van P11
CGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGC
TGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT
GCTAGGTGTTGGGTCCTTTCCGGGACTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT
ACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCCCGCTCTAGAGATAGAGTTTTT
CTTCGGAACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT
CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTGAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGG
TAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT
GCTACAATGGCTGGTACAACGAGTCGCAAGTCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAGTCTCAG
TTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCG
CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGAACACCCGAAGTC
GGTGAGGTAACCTTTAGAGCCACCCGCCAAGGGA
Lactobacillus
GGGCCGGGGGTTGCTAATACATGCAGGTCGTACGGCACTGGCCCAACTGAAATTGATGGTGCCTTTGC
afkomstig uit de
ACCTGATTGACGAATGTGATCACCAGGTTGGAGTGGCGGGAACGGGTGAGCTAACACGGTAGGCTAAC
pars
CTGCCCCGGCAGCGGGGGATAACATTTGGCAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACAT
oesophagea
GGCATTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGT
van P20
AAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTG
51
AGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATG
GAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGT
GAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG
CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTA
GGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAA
GAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGAGGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGGCGAA
GGCGGGCTGTCTGGTCCTGCAACTTGACGACGTTGAGGCTCGAAAGCCAATGGGTAAGCGAACAGGA
AATTAGGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCA
GTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAAT
TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAG
GTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCA
TGGTCGTCGTCAGCTCCGTGTCGTGAGGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTAC
TAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAC
GACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTC
GCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCT
ACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA
CACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGAACGCCCAAAGTCGGTGGGCCTAAACCATATGAGAGCCC
TAGCGAAACC
Enterococcus
CGGGGTGTCTATACATGCAGTCGAACGCATTTTCTTTCACCGTAGCTTGCTACACCGAAAGAAAATGA
afkomstig uit de
GTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGCGGGGGATAACACTTGGAAACAGG
cardia van P67
TGCTAATACCGCATAATTC(T)CATTTACCGCATGGTAA(G)ATGGATGAAAGGCGCTTTTGCGTCACTG
ATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCTGCGATGCATAG
CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
CAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGCAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTT
TCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTGGAAAGTTCATCCCTTGACGGT
ATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGGTT
TGTCCGGATTTATTGGGCGGTAAAGCGAGCCGGCAGGCGGTCTTTTAAGGTCTGATGTGAAAAGCCCC
CGGGCTTAACCGGGGGAGGGGTCATTGGGAAACTGGGGAGACTTGAAGTGCAAAAAGAAGGAAAGCG
GGAAATTCCCATGCTGTAAGAGCGGTGAAAATGCGTTAGAAGATATATGGAGGAAAAACACCAGGTGG
CCGGAAGGGCCGGGCTTTCCTTGGGTCTTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAAC
AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTT
CAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGA
ATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA
GGTCTTGACATCCTTTGACCATCCTAGAGATAGGATTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCA
TGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAG
TTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGCAGACAATGCGGAGGAAGGTGGGGATGAC
GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAGAGTACAACGAGTCGCAA
AGCCGCGAGGCTAAGCCAATCTCTTAAAGCTCTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACAT
GAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACA
CCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGAACACCCAAAGCCGGTGCGGTAACCGCAAGAGCCAGCCTCAA
AGGGGA
Fusobacterium
CAGAATGCTTAACACATGCAAGTCTACTTGAACTTCGGTTTGGGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTA
OTU4
AAGAACTTGCCTCACAGACTGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGGATATTATGAGATATGC
afkomstig uit
GCATGCATAACTTATGAAAGCTATATGCGCTGTGAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGAGAGG
52
H. suis-
TAACGGCTCACCAAGGCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGA
positieve magen
CACGGCCCTTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCAAGAGTCTGATCCAG
CAATTCTGTGTGCACGATGAAGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTTGGGAAGAAGAAAGTGACGG
TACCAACAGAAGAAGCGACGGCTAAATAC
De nucleotidensequenties van het geamplificeerd 16S rRNA gen zijn weergegeven in de 5’-3’ richting.
Bij Enterococcus sp. is de overlap met Enterococcus DQ057377 in het vet weergegeven. In de
overlap vertonen beide species dezelfde nucleotidensequentie met uitzondering van 2 nucleotiden
(geel gemarkeerd en onderstreept), waarbij de nucleotide van Enterococcus DQ057377 tussen
haakjes wordt vermeld. P = varken.
Fig. 26: Gram-kleuring van een Fusobacterium sp. verdachte reincultuur afkomstig uit een nieuwe
varkensmaag. De bacteriën zijn filamenteus en roze aangekleurd (vergroting: x1000). De lengte van
de balk is 50 µm.
Tabel 11: Species identificatie na sequenering en BLAST analyse van de geamplificeerde 16S rRNA
fragmenten, afkomstig van de verdachte Fusobacterium spp. verdachte reinculturen.
Nieuwe
magen
Identificatie
%
Coverage
Evalue
%
Identity
Accession
number
1
Bacteroides heparinolyticus strain SEQ 209 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
Lactobacillus agilis strain DSPV 013C 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Lactobacillus agilis strain JCM 7701 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Lactobacillus agilis strain JCM 7701 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
Lactobacillus agilis strain DSPV 013C 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
99%
0.0
99%
JN867284.1
99%
0.0
99%
GQ231446.1
100%
0.0
99%
AB911458.1
100%
0.0
99%
AB911458.1
99%
0.0
99%
GQ231446.1
2
3
4
5
Identificatie = de bacterie waarmee na BLAST analyse de grootste overeenkomst wordt
waargenomen, E-value = maat voor significantie van het resultaat, % coverage = maat voor de lengte
van een nucleotidensequentie waarvoor een overeenkomstig fragment gedetecteerd werd, % identity
= maat voor de exacte overeenkomst tussen de nucleotidensequentie van het aangetoonde DNA en
een gekende DNA sequentie, accession number = unieke code die in de NCBI databank gelinkt is aan
een welbepaalde sequentie.
53
4. Interacties tussen H. suis en de gastrale microbiota
Op basis van de microbiota samenstelling bij H. suis-negatieve en -positieve varkensmagen bekomen
na metagenomics analyse, werden een aantal bacteriën geselecteerd om een mogelijke (in)directe
interactie tussen H. suis en de maagmicrobiota na te gaan. Initieel werd getest of de geselecteerde
bacteriële species in staat zijn te overleven en groeien in een vloeibaar milieu met zure pH, typisch
voor de maag. Daarna werden in vitro (co-)cultivatie experimenten uitgevoerd.
Vooraleer (co-)cultivatie experimenten mogelijk waren, werd nagegaan of de geselecteerde
species een goede groei vertonen in het cultuurmedium van H. suis. Analyse van de Brucella bouillon
geïnoculeerd met een motiele cultuur van H. suis vertoonde goede groei met aanwezigheid van
motiele, spiraalvormige bacteriën. Zowel E. coli, C. jejuni als Lactobacillus sp. vertoonden een
progressieve stijging in groei naarmate langer geïncubeerd werd in Brucella bouillon met pH 7
(figuur 27-29). In vergelijking met E. coli vertoonden C. jejuni en de nieuwe Lactobacillus soort een
minder uitgesproken groei, waarbij een zeer laag aantal kve opgemerkt werd bij deze laatste.
Hoe lager de pH en hoe korter geïncubeerd werd in Brucella bouillon, des te minder aantal
kve opgemerkt werden, zowel voor E. coli als C. jejuni (figuur 30-31). Toch werd een exponentiële
groei van E. coli bij pH 5 waargenomen gedurende gans de incubatieperiode. Overleving en bacteriële
groei was eveneens mogelijk in een sterk zuur milieu, zij het in beperkte mate. Campylobacter jejuni
bleek meer gevoelig te zijn aan het vloeibare en, voornamelijk, aan het zure milieu: de exponentiële
fase werd immers gevolgd door een sterke daling. Wanneer deze bacteriën gecultiveerd worden in
Brucella bouillon samen met H. suis en pH 5, kan aldus groei verwacht worden. Van elk geselecteerd
bacterieel species werd immers een aanvaardbaar aantal kve gedetecteerd na 30 h incubatie bij pH 5.
Het aantal kve van E. coli bekomen na co-cultivatie bleek sterk gestimuleerd te worden door
aanwezigheid van H. suis (figuur 32). De groei van E. coli na 6 h, 24 h en 30 h was bij co-cultivatie
7
met H. suis (2,5x10 bacteriën per ml als startconcentratie voor zowel E. coli als H. suis) significant
hoger (P-waarde < 0,05) dan deze bij pH 5. Beide condities zijn identiek, namelijk eenzelfde E. coli
7
startconcentratie van 2,5x10 bacteriën per ml en een pH van 5, waardoor statistische analyse
mogelijk was. Opmerkelijk was dat het supernatans van H. suis de groei van E. coli lijkt te inhiberen
(P-waarde < 0,05).
De groei van C. jejuni werd eveneens sterk gestimuleerd in aanwezigheid van H. suis (figuur
7
33). Net zoals voor E. coli waren de condities van de co-cultivatie (2,5x10 bacteriën per ml als
startconcentratie voor zowel C. jejuni als H. suis) en groei bij pH 5 gelijkaardig, waardoor statistische
analyse mogelijk was. De groei van C. jejuni in aanwezigheid van H. suis was significant hoger (Pwaarde < 0,05) na 24 h en 30 h co-cultivatie dan de groei van C. jejuni alleen bij pH 5. Daarnaast was
de groei van C. jejuni in het supernatans van H. suis significant hoger (P-waarde < 0,05) na 24 h dan
de groei bij pH 5.
Escherichia coli en het supernatans ervan remden de groei van H. suis in vitro (figuur 34). Dit
was ook het geval voor C. jejuni, waarbij de inhibitie sterker uitgesproken was bij een hogere
concentratie van C. jejuni (figuur 35). Het nieuwe Lactobacillus sp. had geen remmende invloed op de
groei van H. suis en bleek zelfs een licht stimulerende invloed te bezitten (figuur 36).
Statistische analyse toonde aan dat bij de volgende (co-)cultivatie condities de groei van
H. suis significant (P-waarde < 0,05) werd geremd in vergelijking met de groei van H. suis in een
7
monocultuur (startconcentratie van 2,5x10 H. suis per ml voor zowel (co-)cultivatie als monocultuur):
7
- na 24 h co-cultivatie met 2,5x10 E. coli per ml
7
- na 24 h co-cultivatie met 10 E. coli per ml
7
- na 30 h co-cultivatie met 2,5x10 E. coli per ml
54
7
- na 30 h co-cultivatie met 10 E. coli per ml
7
- na 30 h co-cultivatie met 2,5x10 C. jejuni per ml
7
- na 30 h co-cultivatie met 10 C. jejuni per ml
- na 30 h cultivatie in het supernatans van E. coli en C. jejuni
100000000
87500000,00
90000000
80000000
aantal E. coli (kve/ml)
70000000
60000000
50000000
E. coli
40000000
30000000
20000000
10000000
6750000,00
729166,67
0
6h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 27: Groeicurve van E. coli na 6 h, 24 h en 30 h incubatie in Brucella bouillon met pH 7. Het aantal
kolonievormende eenheden (kve) is weergegeven bij de 3 tijdstippen, dit aantal moet vermenigvuldigd
6
worden met 10 en wordt uitgedrukt per ml Brucella bouillon. Een sterke stijging in aantal kve kan
opgemerkt worden bij een langere incubatie.
55
6000
5145,83
aantal C. jejuni (kve/ml)
5000
4000
3000
C. jejuni
2000
1000
633,33
3,00
0
6h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 28: Groeicurve van C. jejuni na 6 h, 24 h en 30 h incubatie in Brucella bouillon zonder toegevoegd
HCl. Het aantal kolonievormende eenheden (kve) is weergegeven bij de 3 tijdstippen, dit aantal moet
6
vermenigvuldigd worden met 10 en wordt uitgedrukt per ml Brucella bouillon. Een sterke stijging in
aantal kve kan opgemerkt worden bij een langere incubatie.
70
65,17
aantal Lactobacillus sp. (kve/ml)
60
50
40
Lactobacillus sp.
30
20
10
1,06
0,47
0
6h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 29: Groeicurve van Lactobacillus sp. na 6 h, 24 h en 30 h incubatie in Brucella bouillon zonder
toegevoegd HCl. Het aantal kolonievormende eenheden (kve) is weergegeven bij de 3 tijdstippen, dit
6
aantal moet vermenigvuldigd worden met 10 en wordt uitgedrukt per ml Brucella bouillon. Een sterke
stijging in aantal kve kan opgemerkt worden bij een langere incubatie, hoewel het aantal kve zelf wel
laag was.
56
80000
68020,83
70000
aantal E. coli (kve/ml)
60000
52405,56
50000
pH 7
39292,71
40000
pH 5
pH 2,5
30000
20000
10000
16286,11
6883,89
25,00
4250,00
25,00
0
43,95
393,65
25,00
0h
6h
24 h
9,81
30 h
Incubatieperiode
Fig. 30: Groeicurves van E. coli na 6 h, 24 h en 30 h incubatie in Brucella bouillon met pH 7, 5 en 2,5.
Het aantal kolonievormende eenheden (kve) is weergegeven bij de 3 verschillende pH’s na een
6
bepaalde incubatietijd, dit aantal moet vermenigvuldigd worden met 10 en wordt uitgedrukt per ml
Brucella bouillon. Hoe lager de pH en hoe korter de incubatie, des te minder kve opgemerkt worden.
80000
70166,67
aantal C. jejuni (kve/ml)
70000
60000
50000
pH 7
40000
pH 5
pH 2,5
30000
20000
16710,42
14010,42
10000
12337,50
25,00
1105,00
25,00
0
950,00
90,42
25,00
0h
6h
0,08
24 h
7,08
30 h
Incubatieperiode
Fig. 31: Groeicurves van C. jejuni na 6 h, 24 h en 30 h incubatie in Brucella bouillon met pH 7, 5 en
2,5. Het aantal kolonievormende eenheden (kve) is weergegeven bij de 3 verschillende pH’s na een
6
bepaalde incubatietijd, dit aantal moet vermenigvuldigd worden met 10 en wordt uitgedrukt per ml
Brucella bouillon. Hoe lager de pH, des te minder kve opgemerkt worden.
57
3000000
2724444,44
aantal E. coli (kve/ml)
2500000
2000000
H. suis
1500000
H. suis supernatans
1286291,67
pH 5
1187500,00
1000000
500000
25,00
25,00
0
25,00
4250,00
6883,89
39292,71
2900,69
2916,67
4350,00
0h
6h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 32: Groeicurves van E. coli na 6 h, 24 h en 30 h incubatie in Brucella bouillon met H. suis,
supernatans en bij pH 5 (controle). Het aantal kolonievormende eenheden (kve) is weergegeven bij de
6
verschillende condities na een bepaald tijdstip, dit aantal moet vermenigvuldigd worden met 10 en
7
7
wordt uitgedrukt per ml Brucella bouillon. De startconcentraties zijn: 2,5x10 H. suis en 2,5x10 E. coli
per ml. Aanwezigheid van H. suis stimuleert de groei van E. coli.
120000
98750,00
100000
aantal C. jejuni (kve/ml)
89250,00
80375,00
80000
H. suis
60000
H. suis supernatans
pH 5
40000
25727,08
19197,64
20000
14010,42
25,00
0
1210,00
16710,42
25,00
1105,00
25,00
0h
6h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 33: Groeicurves van C. jejuni na 6 h, 24 h en 30 h incubatie in Brucella bouillon met supernatans,
H. suis en bij pH 5 (controle). Het aantal kolonievormende eenheden (kve) is weergegeven bij de
6
verschillende condities na een bepaald tijdstip, dit aantal moet vermenigvuldigd worden met 10 en
7
7
wordt uitgedrukt per ml Brucella bouillon. De startconcentraties zijn: 2,5x10 H. suis en 2,5x10
C. jejuni per ml. Supernatans en H. suis stimuleren de groei van C. jejuni.
58
9,00E+08
7,97E+08
8,00E+08
7,00E+08
H. suis (aantal/ml)
E. coli conditie a
6,00E+08
E. coli conditie b
E. coli supernatans
5,00E+08
4,44E+08
H. suis alleen
4,00E+08
3,50E+08
2,83E+08
3,00E+08
2,78E+08
2,18E+08
2,16E+08
2,00E+08
2,50E+07
1,00E+08
1,90E+08
2,50E+07
2,50E+07
0,00E+00
2,50E+07
0h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 34: Groeicurves van H. suis na 24 h en 30 h incubatie met E. coli, in supernatans en als
monocultuur. De concentratie van H. suis is weergegeven bij de verschillende (co-)cultivaties per
7
tijdstip en wordt uitgedrukt als aantal H. suis bacteriën per ml Brucella bouillon. Conditie a = 2,5x10 E.
7
7
7
coli en 2,5x10 H. suis per ml als startconcentraties, conditie b = 10 E. coli en 2,5x10 H. suis per ml
als startconcentraties. Escherichia coli remt de groei van H. suis.
9,00E+08
7,97E+08
8,00E+08
C. jejuni conditie a
7,00E+08
H. suis (aantal/ml)
C. jejuni conditie b
6,00E+08
C. jejuni supernatans
5,00E+08
H. suis alleen
4,44E+08
4,00E+08
3,50E+08
3,26E+08
3,49E+08
3,00E+08
3,13E+08
2,30E+08
2,00E+08
2,37E+08
2,50E+07
2,50E+07
1,00E+08
0,00E+00
2,50E+07
2,50E+07
0h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 35: Groeicurves van H. suis na 24 h en 30 h incubatie met C. jejuni, in supernatans en als
monocultuur. De concentratie van H. suis is weergegeven bij de verschillende (co-)cultivaties per
7
tijdstip en wordt uitgedrukt als aantal H. suis bacteriën per ml Brucella bouillon. Conditie a = 2,5x10 C.
7
7
7
jejuni en 2,5x10 H. suis per ml als startconcentraties, conditie b = 10 C. jejuni en 2,5x10 H. suis per
ml als startconcentraties. Campylobacter jejuni remt de groei van H. suis.
59
9,00E+08
7,97E+08
8,00E+08
6,95E+08
H. suis (aantal/ml)
7,00E+08
5,81E+08
6,00E+08
5,00E+08
Lactobacillus sp.
4,44E+08
H. suis alleen
4,00E+08
3,00E+08
2,00E+08
1,00E+08
2,50E+07
0,00E+00
2,50E+07
0h
24 h
30 h
Incubatieperiode
Fig. 36: Groeicurve van H. suis na 24 h en 30 h incubatie met Lactobacillus sp. en als monocultuur.
De concentratie van H. suis is weergegeven bij de verschillende (co-)cultivaties per tijdstip en wordt
7
uitgedrukt als aantal H. suis bacteriën per ml Brucella bouillon. De startconcentraties zijn: 2,5x10
7
Lactobacillus sp. en 2,5x10 H. suis per ml. Lactobacillus sp. stimuleert de groei van H. suis.
60
BESPREKING
In het kader van deze masterproef werden 68 magen van slachtvarkens bemonsterd en onderzocht. In
90,77% van de magen werd H. suis gedetecteerd, wat vrij hoog is in vergelijking met de gegevens uit
de literatuur (21-22,42). Er werden telkens ad random 4 magen van slachtvarkens opgehaald uit het
slachthuis, waarna de volgende ophaal pas enkele dagen later plaats vond. Op die manier werden
magen verzameld van meerdere bedrijven. De resultaten uit het eerste deel van dit onderzoek zijn
aldus extrapoleerbaar naar alle slachtvarkens in Vlaanderen. De detectie van de aanwezigheid van
H. suis gebeurde op zowel mucus als biopten van de 4 maagregio’s. Door deze beperkte staalgrootte
is de prevalentie van H. suis bij slachtvarkens mogelijks nog hoger dan aangetoond in dit onderzoek.
Verscheidene studies hebben eveneens onderzoek verricht naar de prevalentie van H. suis infecties,
hoewel de bekomen percentages meestal lager liggen in vergelijking met de bevindingen uit deze
studie (21-22,42). De hogere prevalentie kan eventueel te wijten zijn aan het beperkt aantal
onderzochte varkensmagen, namelijk 68, in vergelijking met studies die 160 of 457 varkensmagen
onderzocht hebben (22,42). Een andere mogelijke verklaring zou zijn dat in voorafgaande studies
geen gebruik gemaakt werd van de qPCR techniek om H. suis te detecteren. In deze studie werd deze
techniek wel gebruikt omwille van de hoge sensitiviteit, wat aldus de hogere prevalentie kan verklaren.
Een bepaalde studie toonde een lagere prevalentie aan van 65%: hierbij was het echter niet mogelijk
te achterhalen of de magen verzameld werden van slachtvarkens en/of fokzeugen (42). De prevalentie
van H. suis bij varkens stijgt immers naarmate de dieren ouder worden, met een prevalentie van meer
dan 90% bij het volwassen worden (22). Of deze studie nu een aanwijzing is dat de prevalentie van
H. suis de voorbije jaren gestegen is, zou bevestigd of weerlegd moeten worden in een toekomstige
studie waarin meer varkensmagen ad random verzameld worden.
Een merkwaardige bevinding was dat de fundus meer frequent de hoogste kolonisatiegraad
van de maag toegekend kreeg dan het antrum. Deze bevinding is tegenstrijdig met sommige andere
studies die aantonen dat H. suis eerst het antrum koloniseert en pas bij het volwassen worden van de
varkens ook de fundus in hoge aantallen gaat koloniseren. In deze studie werden enkel magen van
slachtvarkens verzameld en niet van volwassen fokzeugen, waardoor men zou verwachten dat het
antrum meer frequent de hoogste kolonisatiegraad vertoont (22). Mogelijks beïnvloedt de manier van
infectie de kolonisatie in de maag. Bij een experimentele H. suis infectie kan voornamelijk het antrum
gekoloniseerd worden en pas bij het volwassen worden de fundus, terwijl bij natuurlijk geïnfecteerde
varkens na het bereiken van slachtleeftijd de fundus reeds in meer of mindere mate gekoloniseerd kan
zijn, uitgaande van het antrum als primaire kolonisatieplaats. Een toekomstige studie waarbij natuurlijk
en experimenteel geïnfecteerde varkens vergeleken worden, kan meer duidelijkheid scheppen over
het verloop van een H. suis kolonisatie.
De keuze om na DNA extractie een qPCR uit te voeren voor detectie en kwantificatie van
H. suis, is gebaseerd op de hoge sensitiviteit en specificiteit van deze techniek. Uit andere studies is
immers gebleken dat PCR een hogere sensitiviteit bezit dan andere testen, zoals Giemsa kleuring of
snelle urease test (22,149). In deze studie werd gebruik gemaakt van primerparen die een deel van
het ureA gen detecteren. De sequentie van dit gen is immers sterk geconserveerd binnen de soort
H. suis, waardoor alle stammen kunnen worden gedetecteerd (93). De verschillende resultaten
bekomen met beide primerparen kunnen wellicht verklaard worden door een verschil in sensitiviteit en
specificiteit. Geen van beide primerparen bleek perfect te zijn: primerpaar 1 vertoonde immers een
lagere sensitiviteit en primerpaar 2 een afwijkende smeltpiek. Gezien de verschillen in opbrengst van
DNA extractie tussen maagmucosa en mucus en aangezien per dier niet kan voorspeld worden waar
de kiemen zich voornamelijk bevinden, werd besloten de DNA extractie van beide te analyseren in de
61
qPCR en op basis van beide testen de varkens te selecteren. De resultaten van beide primerparen
werden hierbij in rekening gebracht omwille van de reeds hoger vermelde reden.
Uit analyse van de qPCR resultaten bleek dat analyse van biopten van de maagmucosa het
meest gevoelig is voor detectie van H. suis. Analyse van de mucus stalen leverde in feite geen extra
bijdrage in detectie van in varkensmagen, aangezien geen enkel dier vals negatief bleek te zijn op
basis van de resultaten na analyse van de mucosale biopten. Voor toekomstige experimenten is het
dus wellicht voldoende zich te beperken tot analyse van de maagmucosa, indien een onderscheid
gemaakt moet worden tussen H. suis-negatieve en –positieve dieren. De reden voor verschil in
sensitiviteit tussen analyse van beide monstertypes kan mogelijks gezocht worden in de manier
waarop H. suis de maag koloniseert. Helicobacter suis kan zich namelijk op het epitheel van de maag,
in het lumen van de klieren en/of in de gastrale foveolae bevinden (36,38,43). Een afschraapsel van
mucus heeft een hogere kans tot detectie van deze kiem wanneer deze zich nog enkel heel
oppervlakkig bevindt in de mucus. Dit is hoogstwaarschijnlijk enkel zo in de beginfase van de infectie.
De biopten geven een hogere kans op detectie wanneer H. suis zich reeds in de crypten van het
maagepitheel bevindt. Aangezien varkens reeds geïnfecteerd kunnen worden vanaf hun geboorte en
vooral in de periode na het spenen (22), is een infectie met H. suis bij de overgrote meerderheid van
slachtvarkens wellicht reeds lange tijd aanwezig, waardoor deze gastrale kiem zich reeds diep heeft
kunnen vestigen in de maag. Een opmerkelijke bevinding was dat de kleine biopten een hogere kans
tot detectie van H. suis bezitten dan de mucus. Men zou echter verwachten dat de mucus de kans op
detectie verhoogt, aangezien deze verzameld werd over het gehele maagoppervlak in tegenstelling tot
de kleine biopten. Omwille van de hogere sensitiviteit werden enkel de DNA extracties van de
maagmucosae opgestuurd voor verdere analyse.
In deze studie vertoonden de meeste slachtvarkens (77,94%) een milde tot erge
hyperkeratose (score 1-2) en slechts een minderheid (20,59%) erosies en/of ulcera (minstens score 3)
ter hoogte van de pars oesophagea. Andere studies toonden voor het voorkomen van erosies en
ulcera bij varkens prevalenties aan die variëren tussen 5 en 100%, met een gemiddelde van 63,2%
(43,47-64). Aanwezigheid van erosies en/of ulcera ter hoogte van de pars oesophagea kreeg, in deze
studie, een score van minstens 3 toegekend. Op basis van de bekomen prevalenties uit voorafgaande
studies en de hypothese dat ulcera alsmaar meer frequent voorkomen (43,37,58,63,146), zouden de
meeste slachtvarkens een score 3 vertonen, wat echter niet overeenstemt met de bevindingen uit
deze studie. De ontwikkeling van maagulcera is echter multifactorieel (38,46), naast een infectie met
H. suis (25) kunnen andere factoren een rol spelen, zoals onvoldoende hygiëne op het bedrijf,
stresserende omgeving, verkeerde voeding,
verkeerd management,... Mogelijks waren de
slachtvarkens in deze studie afkomstig van bedrijven met een minimale aanwezigheid van nefaste
factoren. Geen gegevens werden echter verzameld over het bedrijf van herkomst, soort voeding,
stress,… waardoor geen causaal verband aangetoond kon worden. Door de hoge prevalentie van
H. suis in de onderzochte varkensmagen, kon weinig geconcludeerd over een mogelijk verband
tussen een H. suis infectie en de ontwikkeling van laesies ter hoogte van de pars oesophagea. Toch
hebben verscheidene studies reeds een duidelijk verband kunnen aantonen tussen H. suis infecties
en de ontwikkeling van erosies en ulcera bij varkens (22,25,37,41-43), waardoor het belang van
H. suis infecties niet onderschat mag worden. De helft van het aantal varkens met ernstige laesies ter
hoogte van de pars oesophagea waren afkomstig van dezelfde ophaalbeurt en dus mogelijks van
hetzelfde bedrijf. Er werden immers 4 magen per keer opgehaald en een varkensbedrijf laat meerdere
varkens tegelijk slachten, waardoor de kans groot is dat de magen van 1 ophaalbeurt afkomstig waren
uit hetzelfde bedrijf. Dit werkt de hypothese in de hand dat ontwikkeling van erosies en/of ulcera deels
beïnvloedt wordt door het bedrijf van afkomst. Het zou dus interessant zijn om in een toekomstig
62
onderzoek een groot aantal varkens van verschillende varkensbedrijven op te volgen tot en met
slachting, de laesies ter hoogte van de pars oesophagea te scoren en vervolgens al dan niet een
causaal verband aan te tonen tussen nefaste factoren en de ontwikkeling van erge laesies. Daarbij
kan de prevalentie van H. suis infecties bij slachtvarkens eveneens bepaald worden. Op deze manier
kan meer duidelijkheid verkregen worden over de H. suis prevalentie en het voorkomen van
erosies/ulcera bij slachtvarkens.
Oorspronkelijk was het de bedoeling slachtvarkens voor de negatieve controlegroep te
selecteren op basis van afwezigheid van H. suis én gastritis. Aangezien elke maag in meer of mindere
mate gastritis vertoonde, werden slachtvarkens geselecteerd die H. suis negatief waren en slechts
een lichte vorm van gastritis vertoonden ter hoogte van fundus en antrum. Dat geen enkel
slachtvarken gedetecteerd kon worden zonder gastritis ter hoogte van zowel fundus als antrum, is niet
zo verwonderlijk. Uit een studie is immers gebleken dat lymfoïde aggregaten en diffuse infiltratie met
lymfoïde cellen in de lamina propria van voornamelijk de cardia en het antrum reeds voorkomen bij
pasgeboren biggen (147). Een bepaalde studie toonde echter afwezigheid van gastritis aan bij alle
H. suis-negatieve varkens, hier werd echter enkel rekening gehouden met de infiltratie met lymfoïde
ontstekingscellen voor het scoren van gastritis. Diezelfde negatieve varkens vertoonden ook, hoewel
minder frequent dan de positieve, vorming van lymfoïde aggregaten en follikels in de maagmucosa
(54). Hoe ouder het dier wordt, des te meer uitgesproken de aggregaten en infiltraties zijn,
voornamelijk ter hoogte van het cardiale gedeelte van de maag en in mindere mate het antrale deel.
Een lymfoïde follikel met germinaal centrum wordt hoogstwaarschijnlijk pas gevormd na contact met
antigenen, bijvoorbeeld tijdens een H. suis infectie (147-148). Om deze reden werden de
slachtvarkens voor de positieve groep geselecteerd op aanwezigheid van een hoog aantal
Helicobacter suis bacteriën, een of meerdere lymfoïde follikels en een diffuse infiltratie met lymfoïde
ontstekingscellen.
Bij selectie op graad van gastritis werd enkel rekening gehouden met de scores toegekend
aan antrum en fundus. In de cardia werd immers steeds een hoog aantal lymfoïde follikels
waargenomen, met name bij 53 van de 67 onderzochte magen. Dit is in lijn met de verwachtingen,
aangezien deze follikels, volgens de bevindingen in bepaalde studies, deel uitmaken van het mucosageassocieerd lymfoïd weefsel (MALT) (55,148). Aangezien de in deze studie waargenomen follikels in
de cardia een duidelijk germinaal centrum vertoonden en dikwijls gegroepeerd voorkwamen, is dit een
bevestiging dat cardiale follikels deel uitmaken van MALT. Mogelijks zijn de enkele lage toegekende
scores (0-2) voor aanwezigheid van lymfoïde follikels ter hoogte van de cardia te wijten aan de
beperkte grootte van het biopt voor histologie. Wanneer meerdere delen van de cardia bemonsterd
zouden worden, hebben mogelijks alle magen een score 3 voor de vorming van lymfoïde follikels met
germinale centra. Er was geen verschil op te merken tussen H. suis-positieve en –negatieve magen bij
het scoren van gastritis in de cardia, wat overeenstemt met een andere studie waarin geen significant
verband aangetoond kon worden (36).
Aan het antrale gedeelte van de maag werd over het algemeen een hogere score voor
gastritis toegekend dan de fundus. Dit is in overeenstemming met andere studies waar gastritis
voornamelijk in het antrale gedeelte van de maag gedetecteerd werd (25,34-38,147-148). Deze
bevinding kan mogelijks verklaard worden door de specifieke kolonisatie van H. suis in het antrum bij
slachtvarkens, wat reeds aangetoond is in meerdere studies (22,25) alhoewel in deze studie de
fundus de hoogste kolonisatiegraad vertoonde. In deze studie werd over het algemeen een matige
gastritis waargenomen in de fundus, wat in overeenstemming is met andere studies (36,38). In een
enkele studie wordt echter vermeld dat de cardia een sterkere inflammatie vertoont dan het antrum.
Gebaseerd op wat reeds vermeld werd in de vorige paragraaf, werd hier hoogstwaarschijnlijk geen
63
rekening gehouden met de functie van dit deel als onderdeel van MALT (43). Hoewel statistisch
relevante correlaties aangetoond werden tussen de graad van gastritis in de verschillende
maagregio’s, was het moeilijk hieruit conclusies te trekken, zoals eveneens besloten werd in een
andere studie (43). In de toekomst kan nagegaan worden of de gastritis in het antrum de inflammatie
in de fundus kan beïnvloeden en/of de lokalisatie van H. suis kolonisatie een rol speelt in het
voorkomen van gastritis in fundus en/of antrum. Twee leeftijdscategorieën moeten hierin betrokken
worden, gezien bij slachtvarkens H. suis voornamelijk in het antrum voorkomt, terwijl bij volwassen
varkens vaak in de fundus de hoogste kiemaantallen worden aangetroffen (22). Mogelijks is de fundus
bij volwassen varkens de regio waar gastritis het meest uitgesproken, zoals dit het geval is voor het
antrum bij slachtvarkens.
De H. suis-negatieve magen die onderzocht werden in de huidige studie vertoonden minder
ernstige laesies ter hoogte van de pars oesophagea en mildere gastritis ter hoogte van het antrum
dan de H. suis-positieve varkens. Dit is in overeenstemming met andere studies waarbij H. suispositieve en –negatieve varkens werden vergeleken wat betreft het voorkomen van erosies/ulcera
en/of gastritis (25,35-37,42-43). Statistische analyse toonde echter een significant omgekeerd verband
aan tussen laesies en gastritis, wat tegenstrijdig is met de voorgaande bevinding. Mogelijks is dit het
gevolg van het frequent voorkomen van score 2 voor laesies ter hoogte van de pars oesophagea,
zowel voor H. suis-negatieve als –positieve dieren. Aangezien slechts enkele varkensmagen duidelijke
ulceraties vertoonden, kan geen duidelijk verband aangetoond worden met de ernst van gastritis.
Deze varkensmagen met ernstige laesies kunnen bijvoorbeeld door toeval een milde gastritis vertonen
en zijn dus niet representatief voor de volledige populatie.
Het scoren van de hierboven besproken laesies en gastritis werd uitgevoerd door 2 personen
die onafhankelijk van elkaar werkten. Tijdens het histopathologisch onderzoek was de onderzoeker
zich niet bewust welk staal reeds, al dan niet sterk, positief bevonden was op H. suis na de
uitgevoerde qPCR. Op deze manier werd detectie bias vermeden en geen hogere score toegekend
aan positieve varkensmagen. Het eerste deel van dit onderzoek is echter een observationele studie,
waarbij slechts een verband vermoed kan worden. Het vermoeden moet daarna nog bevestigd of
weerlegd worden in een georganiseerd experiment, waarbij de risicofactoren gekend en ad random
toegekend zijn.
Een eerste indruk van de gastrale microbiota bij slachtvarkens werd bekomen na incubatie
van agarplaten waarop swabs van het maagoppervlak waren uitgeënt. Bepaalde studies stellen de
hypothese naar voor van een compartimentering in de maag ten gevolge van de pH gradiënt, met
name een hoge pH in de pars oesophagea en cardia en een lage pH in fundus en antrum door
productie van HCl. Op deze manier ontstaat er een soort van scheiding tussen de delen van de maag
(1,150). Deze scheiding mag vanzelfsprekend niet al te letterlijk geïnterpreteerd worden, gezien het
aflezen van de agarplaten aantoonde dat bacteriën in min of meer dezelfde mate voorkomen ter
hoogte van de 4 delen in eenzelfde maag. Mogelijks is dit het gevolg van vermenging van voedsel
door de maagcontracties, waardoor bacteriën in contact komen met het volledige maagoppervlak, zich
eventueel vasthechten aan gastraal epitheel om daarna de mucosa van verschillende regio’s te
koloniseren. Een andere mogelijke hypothese zou zijn dat bacteriën na het inslikken het nietverhoornde deel van de pars oesophagea koloniseren, waarna ze migreren over het maagoppervlak
tot in het darmstelsel van de gastheer. Dit laatste is in overeenstemming met hypotheses opgesteld in
andere studies (107,109). Een PBS spoeling veroorzaakte geen merkbaar visueel verschil in
kolonisatie op de agarplaten. Er kan dus verondersteld worden dat de gecultiveerde bacteriën, al dan
niet als passant of deel van de gastrale microbiota, zich in meerdere of mindere mate kunnen
vasthechten aan het gastrale epitheel en/of mucus. Een interessant experiment zou kunnen zijn om
64
de mate van adhesie van verschillende bacteriële species, gedetecteerd in de maagmicrobiota, aan
het gastrale epitheel en/of mucus na te gaan, aangezien hierover weinig gekend is bij het varken.
Tussen de agarplaten van verschillende varkens kon heel wat variatie opgemerkt worden, wat een
indirecte bevestiging is dat de gastrale microbiota bestaat uit een verzameling van vele, verschillende
bacteriële species. Dit is in overeenstemming met studies die een brede waaier aan micro-organismen
aantoonden in de maag van humane patiënten (107-108). Soms konden kolonies uitgaande van
schimmels of gisten opgemerkt worden op de agarplaten, maar aangezien dit telkens 1 enkele kolonie
betrof, werd besloten hier niet verder op in te gaan.
Na sequenering van de reinculturen en de gepoolde stalen (ingesloten in de metagenomics
analyse) werden verschillende bacteriële species geïdentificeerd als meest dominante kiem in de
maagmicrobiota. De reinculturen waren echter afkomstig van 1 specifiek deel van de maag, terwijl het
beeld van de gastrale microbiota bekomen werd na sequenering van de microbiële populatie van alle
delen van de maag samen. Mogelijks waren de bacteriën van de reincultuur het meest dominant ter
hoogte van dat specifiek deel van de maag. Door het poolen van de verschillende regio’s werd deze
dominantie mogelijks afgevlakt. Daarnaast groeit niet elk bacterieel species in dezelfde mate op een
bloedagarplaat en/of in een micro-aërofiele omgeving, waardoor bepaalde bacteriële species niet
gedetecteerd kunnen worden op de agarplaten. Het staat immers vast dat sommige bacteriële species
zelfs helemaal geen groei vertonen onder de omstandigheden die in de huidige studie werden
toegepast. Het zou dus interessant zijn om in een toekomstig onderzoek de gastrale microbiota te
laten bepalen voor elke regio van de maag afzonderlijk. Op deze manier kan nagegaan worden of de
bacteriële samenstelling in de verschillende regio’s duidelijke verschillen vertoont, bijvoorbeeld ten
gevolge van aan- of afwezigheid van zuurproductie en/of mucus. Bepaalde bacteriële species,
afkomstig van de reinculturen, konden niet teruggevonden worden na sequenering van de gepoolde
stalen. Dit kan te wijten aan het samenvoegen van verschillende sequenties van dezelfde bacteriële
cultuur (bekomen na sequenering met de forward en de reverse primer) met Kodon®. Tijdens het
assembleren van de beide sequenties tot contigs, worden complementaire nucleotiden die geen
correcte baseparing vertonen artificieel omgezet naar een mogelijke baseparing. Deze interpretatie is
mogelijks niet altijd correct, wat kan leiden tot het verkrijgen van een sequentie die niet 100% de
werkelijke 16S rRNA sequentie weerspiegelt Bij het aligneren van de aangepaste sequentie in de
centrale database kan op die manier een link met een verkeerd bacterieel species gelegd worden.
Daarnaast zijn de gebruikte technieken (amplificatie en sequenering van het 16S rRNA gen) en de
software gebruikt in de metagenomics analyse (van een grote hoeveelheid korte 16S rRNA
sequenties) wellicht niet 100% onfeilbaar, waardoor kleine variaties kunnen ontstaan tussen
experimenten. De mogelijkheid bestaat dus zeker dat 16S rRNA metagenomics analyse in een aantal
gevallen wel een juist bacterieel genus identificeert, maar niet het juiste species. Bovendien is analyse
van (korte) 16S rRNA gensequenties van sommige bacteriële genera niet geschikt voor species
identificatie (152).
In de literatuur wordt weinig informatie gevonden omtrent de samenstelling van de gastrale
microbiota over de verschillende maagregio’s heen bij varkens. Deze studie toont voor het eerst aan
dat deze zeer divers is, met grote variaties tussen varkens onderling. Heel wat gedetecteerde
bacteriën konden niet geïdentificeerd worden tot op species niveau na analyse in BLAST®, wat de
microbiële rijkdom benadrukt. In een bepaalde studie werd onderzoek verricht naar de samenstelling
van de microbiota ter hoogte van de pars oesophagea bij varkens, waarbij volgende genera werden
gedetecteerd:
Actinomyces,
Bifidobacterium,
Clostridium,
Lactobacillus,
Peptostreptococcus,
Streptococcus, Escherichia, Klebsiella, Staphylococcus en Streptococcus (153). Een andere recente
studie onderzocht eveneens de microbiota samenstelling ter hoogte van de pars oesophagea bij
65
gespeende biggen, waarbij een hoge diversiteit werd waargenomen met detectie van volgende
genera:
Lactobacillus,
Prevotella,
Escherichia,
Bacteroides,
Pseudomonas,
Acinetobacter,
Clostridium,... (154). Al deze werden eveneens gedetecteerd in de onderzochte varkensmagen die in
het kader van deze masterproef werden geanalyseerd. Bij varken 49 werd een hoog gehalte aan
L. amylovorus gedetecteerd. Mogelijks is dit het gevolg van resterende voedselpartikels in het biopt,
waardoor deze bacterie sterk kon prolifereren. Lactobacillus amyolovorus is immers een bacterie die
normaal het intestinaal stelsel van varkens koloniseert (155). Bij 3 H. suis-negatieve varkens werden
andere Helicobacter sp. gedetecteerd, namelijk Helicobacter HM124320 bij P12 en Helicobacter
rappini bij P18 en P19. Het is mogelijk dat een infectie met deze species de kolonisatie van H. suis
verhindert naar analogie met een omgekeerd evenredig verband tussen H. suis en H. pylori
kolonisatie bij rhesus apen (141). Een interessante bevinding was het frequenter voorkomen van
E. coli, F. necrophorum en een mogelijks nieuw Fusobacterium sp. (OTU4) in H. suis-positieve
magen. Mogelijks is dit het gevolg van een verminderde zuurproductie tijdens een H. suis infectie naar
analogie met atrofische gastritis veroorzaakt door H. pylori (117,120). De gedaalde zuurproductie
heeft immers een pH verhogend effect tot gevolg, waardoor andere, meer zuurgevoelige, pathogene
bacteriën de maag zouden kunnen koloniseren. Daarnaast worden bij minder zure condities oraal
opgenomen, pathogene bacteriën minder snel vernietigd in de maag, waarna deze wellicht vlotter de
meer distaal gelegen delen van het gastro-intestinaal stelsel kunnen koloniseren. Op deze manier is er
een verhoogd risico op de ontwikkeling van andere pathologieën, zoals bijvoorbeeld diarree ten
gevolge van een E. coli infestatie (156). Een toekomstig onderzoek kan dus uitgevoerd worden naar
de invloed van H. suis op de zuurproducerende cellen in de maag, waarbij er al dan niet gerelateerde
pathologieën kunnen ontstaan. Naast de ontwikkeling van pathologieën in het intestinaal stelsel,
kunnen de pathologieën in de maag ook beïnvloed worden. Aangezien deze 3 pathogene bacteriën
meer frequent voorkomen in H. suis-positieve magen met meer ernstige laesies en gastritis, kan hun
directe of indirecte rol in de ontwikkeling van deze gastrale pathologieën niet uitgesloten worden.
Een hogere graad van H. suis kolonisatie was niet gerelateerd met meer ernstige laesies of
gastritis in vergelijking met de positieve magen die een lager aandeel van H. suis vertoonden.
Daarnaast werd gastritis ook opgemerkt in H. suis-negatieve magen, waarbij in de maagmicrobiota
van deze andere pathogene bacteriën, zoals Actinobacillus porcinus en Campylobacter jejuni werden
gedetecteerd. Dit kan een aanwijzing zijn dat de ontwikkeling van gastrale pathologieën multifactorieel
is en dat andere agentia, naast H. suis, eveneens een rol kunnen spelen (36,38-39,46). Er werden
mogelijks ook te weinig varkensmagen onderzocht om een duidelijk verband aan te kunnen tonen
tussen de samenstelling van de maagmicrobiota en de ontwikkeling van gastrale pathologieën.
De groeicurves van E. coli, C. jejuni en Lactobacillus sp. vertoonden een sterke stijging na
24 h incubatie in Brucella bouillon met pH 7. Dit wijst op een exponentiële groei na een voorafgaande
aanpassing- of lag fase van de bacteriën aan het milieu. Indien langer geïncubeerd zou worden, wordt
de exponentiële fase hoogstwaarschijnlijk gevolgd door een stationaire fase en vervolgens een daling
ten gevolge van bacteriën die afsterven (157). Campylobacter jejuni en Lactobacillus sp. zijn moeilijke
groeiers (145), wat een mogelijke verklaring geeft voor het lager aantal kve in vergelijking met E. coli.
Na het testen van de zuurgevoeligheid vertoonden de groeicurves van E. coli en C. jejuni eveneens
een aanpassingsfase gevolgd door een exponentiële groei, hoewel een langere lag fase en een lager
aantal kve gedetecteerd werden bij pH 5 en 2,5. Dit is een mogelijk gevolg van een meer extreem
milieu, waardoor de groei niet optimaal kon doorgaan. Na een exponentiële fase, werd een daling
opgemerkt bij langere incubatie in een vloeibaar milieu met pH 2,5 voor E. coli en met pH 7, 5 en 2,5
voor C. jejuni, hoogstwaarschijnlijk is dit het gevolg van het afsterven van de bacteriën ten gevolge
van een nefaste omgeving. Na 30 h bij pH 5 werd toch een aanvaardbaar hoog aantal kve bekomen.
66
Dit is een mogelijke aanwijzing dat deze bacteriën zich aangepast hebben aan de zure omgeving van
de maag. Metagenomics van de maagmicrobiota toonde reeds aan dat de bacteriën kunnen
voorkomen in de maag, er werd echter geen informatie bekomen over de overleving of groei. Na de in
vitro zuurgevoeligheidstesten werd wel aangetoond dat overleving en groei mogelijk is bij pH 5. Dit is
in overeenstemming met een studie waarbij aangetoond werd dat E. coli verschillende systemen bezit
om te overleven en groeien bij pH 2,5 (158). Voor C. jejuni is daarnaast aangetoond dat de
zuurgevoeligheid varieert tussen verschillende stammen (159).
Gezien E. coli meer frequent voorkwam bij de H. suis-positieve magen en Campylobacter
jejuni meer bij de H. suis- negatieve magen, werden deze geselecteerd voor de in vitro interactietesten
met H. suis. Als laatste werd Lactobacillus sp. geselecteerd, verschillende studies hebben immers
reeds een inhiberende werking kunnen aantonen van dit genus op de groei van H. pylori (122-128).
Meer specifiek werd een nieuw species van Lactobacillus, afkomstig uit de reincultuur van de H. suisnegatieve varkensmaag P20, geselecteerd. De andere gedetecteerde Lactobacillus spp. na
metagenomics op de gepoolde stalen kwamen niet in aanmerking, de meeste werden immers meer
frequent gedetecteerd in de H. suis-positieve magen.
Een verklaring voor de hogere groei van C. jejuni in aanwezigheid van H. suis kan gezocht
worden in verschillende, mogelijke hypotheses. Het is reeds aangetoond dat H. pylori een pHverhogend effect bezit (117,120), wat resulteert in een minder nefaste omgeving voor meer
zuurgevoelige bacteriën, waardoor deze beter kunnen groeien. Naar analogie met H. pylori, bezit
H. suis een gelijkaardig pH verhogend effect in vitro (nog niet gepubliceerde data). Aangezien de groei
in aanwezigheid van H. suis en pH 5 hoger was dan bij pH 7, moet nog een andere verklaring, buiten
het pH-verhogend effect, gezocht worden. Mogelijks produceert H. suis metabolieten die een
stimulerend effect hebben op de groei van andere bacteriën. Aangezien het supernatans van H. suis
eveneens de groei van C. jejuni sterk stimuleerde, is dit een extra aanwijzing voor de aanwezigheid
van metabolieten, geproduceerd door H. suis. Als gevolg van de sterk gestimuleerde groei van C.
jejuni, is het mogelijk dat deze bacterie de overhand krijgt in de maag, waardoor H. suis op zijn beurt
onderdrukt wordt. Dit kan een mogelijke verklaring bieden voor de bevinding dat C. jejuni meer
frequent werd gedetecteerd in H. suis-negatieve magen. Deze hypothese wordt mogelijks bevestigd
door de bevinding dat een hogere concentratie van C. jejuni de groei van H. suis meer kon inhiberen.
De groei van E. coli werd eveneens bevorderd door H. suis, het stimulerend effect kan mogelijks,
zoals voor C. jejuni, te wijten zijn aan een pH-verhogend effect en de productie van metabolieten. Het
effect van H. suis op E. coli lijkt aldus een verklaring te bieden voor de resultaten na metagenomics
analyse. In H. suis-positieve magen werd immers frequent E. coli gedetecteerd, wat wijst op een
mogelijke wederzijdse interactie tussen beide species. Het supernatans van H. suis inhibeerde echter
de groei van E. coli, mogelijks worden er andere metabolieten, naast de groeibevorderende,
geproduceerd. Voor H. pylori is reeds aangetoond dat deze gastrale kiem cecropins produceert die de
groei van andere pathogene bacteriën, zoals E. coli kan remmen (113-114). Mogelijks produceert
H. suis gelijkaardige metabolieten. Een andere mogelijkheid zou zijn dat de geproduceerde
metabolieten reeds opgebruikt waren door H. suis zelf, aangezien het supernatans afkomstig was van
een 90 h oude H. suis cultuur, terwijl de interactie-experimenten van een kortere duur waren.
Escherichia coli kon op zijn beurt echter de groei van H. suis remmen. De in vitro (co-)cultivatie
condities zijn echter verschillend van de werkelijke in vivo situatie. In de maag kunnen bijvoorbeeld
E. coli en H. suis, ten gevolge van verschillende kolonisatieplaatsen, toch naast elkaar voorkomen in
tegenstelling tot het beperkt volume aan Brucella bouillon waarin beide species werden gecultiveerd.
Het zou interessant zijn om in een toekomstig onderzoek na te gaan of deze waargenomen
inhibitie/stimulatie gelijkaardig is bij een verschillende verhouding in concentraties tussen H. suis en
67
E. coli of C. jejuni. Daarbij kan eventueel nagegaan worden welke metabolieten er geproduceerd
worden en/of deze een invloed hebben op bacteriële groei.
Co-cultivatie toonde aan dat E. coli en C. jejuni de groei van de gastrale Helicobacter
significant konden remmen. In theorie zouden deze dus mogelijke probiotica kunnen zijn, het zijn
echter eveneens frequent voorkomende (voedsel)pathogenen voor mens en dier, waarbij per orale
opname ervan aanleiding kan geven tot ernstige gastro-enteritis (160, 161). Het gebruik van deze
bacteriële species als probioticum wordt dus sterk afgeraden. Daarnaast kon het supernatans van
deze bacteriën eveneens de groei van H. suis remmen, wat wijst op aanwezigheid van
geproduceerde, inhiberende metabolieten door E. coli en C. jejuni. Het is echter niet uitgesloten dat
een bestaande C. jejuni infectie wel bescherming kan bieden tegen de pathogene effecten van
gastrale Helicobacter infecties. In deze studie werden immers bij H. suis-negatieve varkensmagen
minder ernstige laesies en gastritis opgemerkt, waarbij Campylobacter jejuni frequenter gedetecteerd
werd in de maagmicrobiota. Daarentegen werden bij H. suis-positieve magen meer frequent E. coli,
ernstigere letsels en ontsteking aangetroffen. Mogelijks leidt deze laatste co-infectie tot meer ernstige
gastrale pathologieën. In een toekomstig onderzoek kan op grote schaal gescreend worden naar aanof afwezigheid van H. suis en E. coli of C. jejuni in het gastro-intestinaal stelsel van varkens om een
relatie tussen beide infecties aan te kunnen duiden. Daarnaast kan een in vivo experiment opgestart
worden waarbij gastrale pathologieën vergeleken worden tussen een enkele H. suis-, E. coli- en
C. jejuni infectie en een co-infectie met H. suis en E. coli en met H. suis en C. jejuni. Op welke
specifieke manier E. coli en C. jejuni de groei van H. suis beïnvloeden, moet eveneens verder
onderzocht worden. Mogelijks worden er inhiberende stoffen geproduceerd, ontstaat er competitie
voor nutriënten of bindingsplaatsen,...
De concentratie van H. suis na 24 h en 30 h (co-)cultivatie werd bepaald door middel van
qPCR. Met deze techniek wordt echter enkel het DNA gedetecteerd zonder verdere informatie over de
viabiliteit. Er kan echter vanuit gegaan worden dat levende H. suis bacteriën aanwezig waren tijdens
het experiment, aangezien de groeicurves van H. suis immers een stijgende trend vertoonden. Om
eventueel meer zekerheid te verkrijgen over zowel de levensvatbaarheid als concentratie van H. suis,
kan in toekomstig onderzoek gebruik gemaakt worden van EMA RT-PCR, zoals beschreven in een
recente studie (162).
Het nieuwe Lactobacillus sp. kon de groei van H. suis niet remmen, integendeel. Deze
bevinding staat in contrast met andere studies die wel een inhiberende werking van Lactobacillus sp.
op de groei van H. pylori in vitro aantoonden (122-124,126,128-129). Een belangrijke opmerking
hierbij is dat slechts enkele Lactobacillus species dergelijke inhiberende werking vertonen (122-128),
wat een mogelijke verklaring kan bieden voor de bevinding dat deze geselecteerde Lactobacillus sp.
geen remmende werking bezat op H. suis. Daarnaast groeide het nieuwe Lactobacillus sp. slecht in
vloeibare Brucella bouillon, waardoor deze mogelijks geen effect kon uitoefenen op de groei van
H. suis. De vloeibare cultivatiecondities werden toch aangehouden voor verdere (co-)cultivatie
experimenten, H. suis is immers moeilijk cultiveerbaar en de groei gaat pas optimaal door in een
vloeibaar milieu met pH 5 (12). Daarnaast moet een potentieel probioticum tevens in staat zijn te
overleven en groeien in de maag, wat eveneens een vloeibaar milieu is met aanwezigheid van een
zure pH. Dit nieuwe Lactobacillus sp. heeft dus weinig potentieel als mogelijk probioticum. Daarnaast
werd in deze studie het grootste deel van de Lactobacillus sp. meer frequent gedetecteerd in H. suispositieve varkensmagen. Dit duidt nogmaals aan dat niet elk species geschikt is als probioticum en dat
resultaten niet zomaar geëxtrapoleerd mogen worden naar andere species behorende tot hetzelfde
genus. Een bepaalde studie heeft zelfs aangetoond dat een Lactobacillus sp., geïsoleerd uit
faryngeale swabs van varkens zonder verdere species identificatie, een rol speelde in de ontwikkeling
68
van ulcera ter hoogte van de pars oesophagea (45). Mogelijks kwamen er frequent Lactobacillus sp.
voor in H. suis-positieve magen ten gevolge van apoptose en primaire necrose veroorzaakt door H.
suis infectie. Een bepaalde studie heeft immers aangetoond dat het afsterven van gastrale
epitheelcellen een ideale voedingsbodem vormt voor andere bacteriën, zoals Lactobacillus sp. (100105). In de toekomst kan er verder onderzoek verricht worden naar de inhiberende werking van
verschillende soorten Lactobacillus sp. om na te gaan of de groei van H. suis eveneens wordt geremd
naar analogie met de bevindingen voor H. pylori.
69
REFERENTIELIJST
1. Haesebrouck F., Pasmans F., Flahou B., Chiers K., Baele M., Meyns T., Decostere M., Ducatelle R.
(2009). Gastric Helicobacters in domestic animals and nonhuman primates and their significance for
human health. Clinical Microbiology Reviews 22, 202-223.
2. Euzéby J.P. (2011). List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature - Genus Helicobacter.
Internetreferentie: http://www.bacterio.cict.fr/h/helicobacter.html (geconsulteerd op 25 juli 2013).
3. Flahou B. (2011). Experimental studies on Helicobacter suis virulence and control. Doctoraatsthesis
Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p. 8-11.
4. Happonen I., Saari S., Castren L., Tyni O., Hänninen M.L., Westermarch E. (1996). Occurrence and
topographical mapping of gastric Helicobacter-like organisms and their association with histological
changes in apparently healthy dogs and cats. Zentralblatt für Veterinärmedizin Reihe A 43, 305-315.
5. Van den Bulck K., Decostere A., Baele M., Driessen A., Debongnie J.C., Burette A., Stolte M.,
Ducatelle R., Haesebrouck F. (2005). Identification of non-Helicobacter pylori spiral organisms in
gastric samples from humans, dogs and cats. Journal of Clinical Microbiology 43, 2256.
6. Smet A., Flahou B., Mukhopadhya I., Ducatelle R., Pasmans F., Haesebrouck F., Hold G.L. (2011).
The other Helicobacters. Blackwell Publishing ltd Helicobacter 16, 70-75.
7. Queiroz D.M.M., Rocha G.A., Mendes E.N., Lage A.P., Carvalho A.C.T., Barbosa A.J.A. (1990). A
spiral micro-organism in the stomach of pigs. Veterinary Microbiology 24, 199-204.
8. Trebesius K., Adler K., Vieth M., Stolte M., Haas R. (2001). Specific detection and prevalence of
Helicobacter heilmannii like organisms in the human gastric mucosa by fluorescent in situ hybridization
and partial 16S ribosomal DNA sequencing. Journal of Clinical Microbiology 39, 1510-1516.
9. Van den Bulck K., Decostere A., Baele M., Driessen A., Debongnie J.C., Burette A., Stolte M.,
Ducatelle R., Haesebrouck F. (2005). Identification of Non-Helicobacter pylori spiral organisms in
gastric samples from humans, dogs, and cats. Journal of Clinical Microbiology 43, 2256-2260.
10. De Groote D., Van Doorn L.J., Van den Bulck K., Vandamme P., Vieth M., Stolte M., Debongnie
J.C., Burette A., Haesebrouck F., Ducatelle R. (2005). Detection of Non-Pylori Helicobacters species
in Helicobacter heilmannii infected humans. Blackwell Publishing Ltd, Helicobacter 10, 398-406.
11. Mendes E.N., Queiroz D.M.M., Rocha G.A., Moura S.B., Leite V.H.R., Fonseca M.E.F. (1990).
Ultrastructure of a spiral micro-organism in the stomach of pigs. Journal of Medical Microbiology 33,
61-66.
12. Baele M., Decostere A., Vandamme P., Ceelen L., Hellemans A., Mast J., Chiers K., Ducatelle R.,
Haesebrouck F. (2008). Isolation and characterization of Helicobacter suis sp. nov. from pig stomachs.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58, 1350-1358.
13. Dewhirst F.E., Shen Z., Scimeca M.S., Stokes L.N., Boumenna T., Chen T., Paster B.J., Fox J.G.
(2005). Discordant 16S and 23S rRNA gene phylogenies for the genus Helicobacter: implications for
phylogenetic inference and systematics. Journal of Bacteriology 187, 6106-6118.
14. O’Rourke J.L., Solnick J.V., Neilan B.A., Seidel K., Hayter R., Hansen L.M., Lee A. (2004).
Description of Candidatus Helicobacter heilmannii based on DNA sequence analysis of 16S rRNA and
urease genes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54, 2203-2211.
15. Van den Bulck K., Decostere A., Baele M., Vandamme P., Mast J., Ducatelle R., Haesebrouck F.
(2006). Helicobacter cynogastricus sp. nov. a Helicobacter species isolated from the canine gastric
mucosa. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56, 1559-1564.
16. Baele M., Haesebrouck F., Vandamme P., Van den Bulck K., Gruntar I., Mehle J., Mast J.,
Ducatelle R., Decostere A. (2008). Helicobacter baculiformis sp. nov. isolated from feline stomach
mucosa. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58, 357-364.
70
17. Hannula M., Hänninen M.L. (2007). Phylogenetic analysis of Helicobacter species based on partial
gyrB gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57, 444-449.
18. Mikkonen T.P., Karenlampi R.I., Hänninen M.L. (2004). Phylogenetic analysis of gastric and
enterohepatic Helicobacter species based on partial HSP60 gene sequences. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology 54, 753-758.
19. Neiger R., Dieterich C., Burnens A., Waldvogel A., Corthesy-Theulas I., Halter F., Lauterburg B.,
Schmassmann A. (1998). Detection and prevalence of Helicobacter infection in pet cats. Journal of
Clinical Microbiology 36, 634-637.
20. Vandamme P., Harrington C.S., Jalava K., On S.L.W. (2000). Misidentifying helicobacters: the
Helicobacter cinaedi example. Journal of Clinical Microbiology 38, 2261-2266.
21. Park J.H., Seok S.H., Cho S.A., Baek M.W., Lee H.Y., Kim D.J., Park J.H (2004). The high
prevalence of Helicobacter sp. in porcine pyloric mucosa and its histopathological and molecular
characteristics. Veterinary Microbiology 104, 219-225.
22. Hellemans A., Chiers K., Maes D., De Bock M., Decostere A., Haesebrouck F., Ducatelle R.
(2007). Prevalence of Candidatus Helicobacter suis in pigs of different ages. Veterinary record 161,
189-192.
23. Cantet F., Magras C., Marais A., Federighi M., Mégraud F. (1999). Helicobacter species colonizing
the pig stomach: molecular characterization and determination of prevalence. Applied and
Environmental Microbiology 65, 4672.
24. Melnichouk S.L., Friendship R.M., Dewey C.E., Bildfell R.J., Smart N.L. (1999). Helicobacter-like
organisms in the stomach of pigs with and without gastric ulceration. Swine Health and Production 7,
201-205.
25. De Bruyne E., Flahou B., Chiers K., Meyns T., Kumar S., Vermoote M., Pasmans F., Millet S.,
Dewulf J., Haesebrouck F., Ducatelle R. (2012). An experimental Helicobacter suis infection causes
gastritis and reduced daily weight gain in pigs. Veterinary Microbiology 160, 449-454.
26. Liang J., Ducatelle R., Pasmans F., Smet A., Haesebrouck F., Flahou B. (2013). Multilocus
sequence typing of the porcine and human gastric pathogen Helicobacter suis. Journal of Clinical
Microbiology 51, 920-926.
27. Joosten M., Flahou B., Meyns T., Smet A., Arts J., De Cooman L., Pasmans F., Ducatelle R.,
Haesebrouck F. (2013). Case report: Helicobacter suis in a pig veterinarian. Helicobacter 18, 392-396.
28. McNulty C.A.M., Dent J.C., Curry T.A., Uff J.S., Ford G.A., Gear M.W.L., Wilkinson S.P. (1989).
New spiral bacterium in gastric mucosa. Journal of Clinical Pathology 42, 585-591.
29. De Cooman L.M., Pasmans F., Flahou B., Smet A., Houf K., Ducatelle R., Haesebrouck F. (2011).
Detection of viable Helicobacter suis in pork by a combination of ethidium monoazide (EMA) and
realtime-PCR. Helicobacter 16, 142.
30. Hänninen M.L., Happonen I., Jalava K. (1998). Transmission of canine gastric Helicobacter
salomonis infection from dam to offspring and between puppies. Veterinary Microbiology 62, 47-58.
31. Fox J.G., Paster B.J., Dewhirst F.E., Taylor N.S., Yan L.L., Macuch P.J., Chmura L.M. (1992).
Helicobacter mustelae isolation from feces of ferrets: evidence to support fecal-oral transmission of a
gastric Helicobacter. Infection and Immunity 60, 606-611.
32. Recordati C., Gualdi V., Tosi S., Facchini V., Pengo G., Luini M., Simpson K.W., Scanziani E.
(2007). Detection of Helicobacter spp. DNA in the oral cavity of dogs. Veterinary Microbiology 119,
346-351.
33. Lee A., Fox J.G., Otto G., Dick-Hegedus E., Krakowka S. (1991). Transmission of Helicobacter
species: a challenge to the dogma of fecal oral spread. Epidemiology and Infection 107, 99-109.
71
34. Mendes E.N., Queiroz D.M.M., Rocha G.A., Nogueira A.M.M.F., Carvalho A.C.T., Lage A.P.,
Barbosa A.J.A. (1991). Histopathological of porcine gastric mucosa with and without a spiral bacterium
(Gastrospirillum suis). Journal of Medicical Microbiology 35, 345-348.
35. Grasso G.M., Ripabelli G., Sammarco M.L., Ruberto A., Iannitto G. (1996). Prevalence of
Helicobacter-like organisms in porcine gastric mucosa: a study of swine slaughtered in Italy.
Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Disease 3, 213-217.
36. Park J.H., Lee B.J., Lee Y.S., Park J. (2000). Association of tightly spiraled bacterial infection and
gastritis in pigs. Journal of Veterinary Medical Science 62, 725-729.
37. Queiroz D.M.M., Rocha G.A., Mendes E.N., De Moura S. B., De Oliveira A.M.R., Dairton M.
(1996). Association between Helicobacter and gastric ulcer disease of the pars esophagea in swine.
Gastroenterology 111, 19-27.
38. Hellemans A., Chiers K., Decostere A., De Bock M., Haesebrouck F., Ducatelle R. (2007).
Experimental
infection
of
pigs
with
Candidatus
Helicobacter
suis.
Veterinary
Research
Communications 31, 385-395.
39. Jubb K.V.F., Kennedy P.C., Palmer N. (1985). The lower alimentary system. In: Pathology of
domestic animals, 3rd edition, volume 2, Academic Press, London, p. 42-49.
40. Guizzardi F., Cabassi E., Freddi M. (1981). Gastrite da alimentazione con insilato di mais nel
maiale. Suinicoltura 22, 47-52.
41. Roosendaal R., Vos J.H., Roumen T., van Vugt R., Cattoli G., Aldert B., Klaasen H.L.B.M., Kuipers
E.J., Vandenbroucke-Grauls C.M.J.E., Kusters J.G. (2000). Slaughter pigs are commonly infected by
closely related but distinct gastric ulcerative lesion inducing Gastrospirilla. Journal of Clinical
Microbiology 38, 2661.
42. Choi Y.K., Han J.H., Joo H.S. (2001). Identification of novel Helicobacter species in pig stomachs
by PCR and partial sequencing. Journal of Clinical Microbiology 39, 3311-3315.
43. Barbosa A.J.A., Silva J.C.P., Nogueira A.M.M.F., Paulino E., Miranda Jr., Miranda C.R. (1995).
Higher incidence of Gastrospirillum sp. in swine with gastric ulcer of the pars oesophagea. Veterinary
Pathology 32, 134.
44. Szeredi L., Palkovics G., Solymosi N., Tekes L., Méhesfavi J. (2005). Study on the role of gastric
Helicobacter infection in gross pathological and histological lesions of the stomach in finishing pigs.
Acta Veterinaria Hungarica 53, 371-383.
45. Krakowka S., Eaton K.A., Rings D.M., Argenzio R.A. (1998). Production of gastroesophageal
erosions and ulcers (GEU) in gnotobiotic swine monoinfected with fermentative commensal bacteria
and fed high-carbohydrate diet. Veterinary Pathology 35, 274.
46. Frienship R.M. (2003). Gastric ulcera. Pig News and Information 24, 5-48.
47. Frienship R. (1999). Gastric ulcera. In : Straw B.E., D’Allaire S., Mengeling W.L., Taylor D.J.
(Editors) Diseases of swine, 8th edition, Iowa State University Press, Ames, Iowa, p. 685-694.
48. Muggenburg B.A., Mc Nutt S.H., Kowalczyk T. (1964). Pathology of gastric ulcera in swine.
American Journal of Veterinary Research 25, 1354-1365.
49. Kowalczyk T., Hoekstra W.G., Puestow K.L., Smith I.D., Grummer R.H. (1960). Stomach ulcers in
swine. Journal of the American Veterinary Medical Association 137, 339-344.
50. Curtin T.M., Goetsch G.D., Hollandbeck R. (1963). Clinical and pathologic characterization of
esophagogastric ulcera in swine. Journal of the American Veterinary Medical Association 143, 854860.
51. Cappai M.G., Picciau M., Pinna W. (2013). Ulcerogenic risk assessment of diets for pigs in
relation to gastric lesion prevalence. BioMed Central Veterinary Research 9, 1-10.
72
52. Reed J.H., Kidder D.E. (1970). A post mortem survey of relationships between bile staining and
ulceration of oesophageal portion of pig’s stomach. Research in Veterinary Science 11, 438-440.
53. Sabec K., Schroder J. (1970). Feed quality and the incidence of gastric ulcer in pigs. Deutsche
Tierärztliche Wochenschrift 77, 532-534.
54. O’Brien J.J. (1969). Gastric ulceration of the pars oesophagea in the pig - a review. Veterinary Bull
39, 75-82.
55. Christensen N., Cullinane L. (1990). Monitoring the health of New Zealand abattoirs. New Zealand
Veterinary Journal 38, 136-141.
56. Straw B., Henry S., Nelssen J., Doster A., Moxley R., Rogers D., Webb D., Hogg A. (1992).
Prevalence of lesions in the pars esophagea of normal and sick pigs. 12th edition. IPVS Cong, The
Netherlands, The Hague, p. 386.
57. Penny R.H.C., Guise H.J., Abbott T.A., Kerr D.H. (1993). Can ground wheat form dough balls in
pigs stomachs. Veterinary Record 133, 297-298.
58. Guise H.J., Carlyle W.W.H., Penny R.H.C., Abbott T.A., Riches H.L., Hunter E.J. (1997). Gastric
ulcera in finishing pigs: their prevalence and failure to influence growth rate. Veterinary Record 141,
563-566.
59. Elbers A.R.W., Hessing M.J.C., Tielen M.J.M, Vos J.H. (1995). Growth and oesophagogastric
lesions in finishing pigs offered finely pelleted feed ad libitum. Veterinary Record 136, 588-590.
60. Hessing M.J.C., Geudeke M.J., Scheepens C.J.M., Tielen M.J.M., Schouten W.G.P., Wiepkema
P.R. (1992). Slijmvliesveranderingen in de pars oesophagea bij varkens: prevalentie en de invloed van
stress. Tijdschrift Diergeneeskunde 117, 445-450.
61. Marco E. (1995). Sudden deaths in sows. Pig Journal 35, 157-163.
62. Makinde M.O., Gous T.A. (1998). Prevalence of gastro-oesophageal ulcera in grower-finisher pigs
in the northern province of South Africa. Journal South Africa of Veterinary Medical Association 69, 5960.
63. Robertson I.D., Accioly J.M., Moore K.M., Driesen S.J., Pethick D.W., Hampson D.J. (2002). Risk
factors for gastric ulcera in Australian pigs at slaughter. Preventive Veterinary Medicine 53, 293-303.
64. Friendship R.M. (1999). Gastric ulcera. In: Straw B.E., Zimmerman J.J., D’Allaire S., Taylor D.J.
(editors) Diseases of swine, 8th edition, Iowa State University Press, Ames, Iowa, p. 685-694.
65. Krakowka S., Ellis J. (2006). Reproduction of severe gastroesophageal ulcera in gnotobiotic swine
infected with porcine Helicobacter pylori like bacteria. Veterinary Pathology 43, 956-962.
66. Proeitti P.C., Bietta A., Brachelente C., Lepri E., Davidson I., Franciosini M.P. (2010). Detection of
Helicobacter spp. in gastric, fecal and saliva samples from swine affected by gastric ulceration.
Journal of Veterinary Science 11, 221-225.
67. Sapierzynski R., Fabisiak M., Kizerwetter-Swida M., Cywinska A. (2007). Effect of Helicobacter sp.
infection on the number of antral gastric endocrine cells in swine. Polish Journal of Veterinary Science
10, 65-70.
68. Ducatelle R. (2012). Orgaan pathologie – Het spijsverteringskanaal, de lever en de exocriene
pancreas. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p. 21-22.
69. Gautron L., Layé S. (2010). Neurobiology of inflammation-associated anorexia. Frontiers in
Neuroscience 3, 59.
70. Roubenoff R. (2008). Molecular basis of inflammation: relationship between catabolic cytokines,
hormones, energy balance and muscle. Journal of Parental and Internal Nutrition 32, 630-632.
71. Nielsen N.O. (1995). Rolled wheat as an aid to avoiding stomach problems in pigs. Pigs 10 (718),
25-26.
73
72. Deen J. (1993). The problem of gastroesophageal uclers: a field description. In: Anonymous
(editors) The evolution of the swine veterinary profession: Allen D. Leman swine conference,
Minnesota Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota, p. 137-138.
73. Chagnon M., D’Allaire S., Drolet R. (1991). A prospective study of sow mortality in breeding herds.
Canadian Journal of Veterinary Research 55, 180-185.
74. Ciacci J.R., Mores N., Sobestiansky J., Liebhold M.M. (1991). Gastric ulcera as the cause of death
and as necropsy findings in three swine herds. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia
43, 525-533.
75. Markinde M.O., Obwolo M.J. (1990). Abattoir survey of gastric ulcer in pigs in Zimbabwe.
Zimbabwe Veterinary Journal 21, 116-123.
76. Tamas J., Bokori J., Hegedus M. (1983). Oesophagogastric ulcer in swine and vitamin U.I. relative
incidence of the syndrome in Hungary. Acta Veterinaria Hungarica 31, 145-153.
77. Driesen S.J., Fahy V.A., Spicer E.M. (1987). Oesophago-gastric ulcera. In: Anonymous (editors)
78. Vermoote M., Vandekerckhove T.T.M., Flahou B., Pasmans F., Smet A., De Groote D., Van
Criekinge W., Ducatelle R., Haesebrouck F. (2011). Genome sequence of Helicobacter suis supports
its role in gastric pathology. Veterinary Research 42, 51.
79. Heilmann K.L., Borchard F. (1991). Gastritis due to spiral shaped bacteria other than Helicobacter
pylori, clinical, histological and ultrastructural findings. Gut 32, 137-140.
80. Mazzucchelli L., Wilder-Smith C.H., Ruchti C., Meyer-Wyss B., Merki H.S. (1993). Gastrospirillum
hominis in asymptomatic, healthy individuals. Digestive Diseases and Sciences 38(11), 2087-2090.
81. Yang H., Goliger J.A., Song M. (1998). High prevalence of Helicobacter heilmannii infection in
China. Digestive Diseases and Sciences 43, 1493.
82. Singhal A.V., Sepulveda A.R. (2005). Helicobacter heilmannii gastritis: a case study with review of
literature. American Journal of Surgery and Pathology 29, 1537-1539.
83. Yoshimura M., Isomoto H., Shikuwa S., Osabe M., Matsunaga K., Omagari K., Mizuta Y., Murase
K., Murata I., Kohno S. (2002). A case of acute gastric mucosal lesions associated with Helicobacter
heilmannii infection. Helicobacter 7, 322-326.
84. Al-Himyary A.J.S., Zabaneh R.I., Zabaneh S.S., Barnett S. (1994). Gastrospirillum hominis in
acute gastric erosion. Southern Medical Journal 87, 1147-1150.
85. Dieterich C., Wiesel P., Neiger R., Blum A., Corthésy-Theulaz I. (1998). Presence of multiple
Helicobacter heilmannii strains in an individual suffering from ulcera and in his two cats. Journal of
Clinical Microbiology 36, 1366-1370.
86. Van Loon S., Bart A., den Hertog E.J., Nikkels P.G.J., Houwen R.H.J., De Schryver J.E.A.R.,
Oudshoorn J.H. (2003). Helicobacter heilmannii gastritis caused by cat to child transmission. Journal
of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 36, 407-409.
87. Morgner A., Bayerdörffer E., Meining A., Stolte M., Kroher G. (1995). Helicobacter heilmannii and
gastric cancer. Lancet 346, 511-512.
88. Debongnie J.C., Donnay M., Mairesse J., Lamy V., Dekoninck X., Ramdani B. (1998). Gastric
ulcera and Helicobacter heilmannii. European Journal of Gastroenterology and Hepatology 10, 251254.
89. Stolte M., Kroher G., Meining A., Morgner A., Bayerdörffer, Bethke B. (1997). A comparison of
Helicobacter pylori and H. heilmannii gastritis. Scandinavian Journal of Gastroenterology 32, 28-33.
90. Morgner A., Lehn N., Andersen L.P., Thiede C., Bennedsen M., Trebesius K., Neubauer B.,
Neubauer A., Stolte M., Bayerdörffer E. (2000). Helicobacter heilmannii associated primary gastric
low-grade MALT lymphoma: complete remission after curing the infection. Gastroenterology 118, 821828.
74
91. The European Helicobacter Pylori Study Group. (1997). Current European concepts in the
management of Helicobacter pylori infection. The Maastricht consensus report. Gut 41, 8-13.
92. Haesebrouck F., Pasmans F., Chiers K., Maes D., Ducatelle R., Decostere A. (2004). Efficacy of
vaccines against bacterial diseases in swine: what can we expect. Veterinary Microbiology 100, 255268.
93. Ferrero R.L., Labigne A. (1993). Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease
genes. Molecular Microbiology 9, 323-333.
94. Ferrero R.L., Thiberge J.M., Huerre M., Labigne A. (1994). Recombinant antigens prepared from
the urease subunits of Helicobacter spp: evidence of protection in a mouse model of gastric infection.
Infection and Immunity 62, 4981-4990.
95. Davin C., Blum A.L., Corthésy-Theulaz I., Saraga E., Kraehenbuhl J.P., Haas R., Michetti P.
(1993). Helicobacter pylori urease elicits protection against H. felis infection in mice. Abstract
American Gastroenterology Association Meeting 1213, A-304.
96. Dieterich C., Bouzourène H., Blum A.L., Corthésy-Theulaz I.E. (1999). Urease-based mucosal
immunization against Helicobacter heilmannii infection induces corpus atrophy in mice. Infection and
Immunity 67, 6206-6209.
97. Hellemans A., Decostere A., Duchateau L., De Bock M., Haesebrouck F., Ducatelle R. (2006).
Protective immunization against Candidatus Helicobacter suis with heterologous antigens of H. pylori
and H. felis. Vaccine 24, 2469-2476.
98. Flahou B., Hellemans A., Meyns T., Duchateau L., Chiers K., Baele M., Pasmans F., Haesebrouck
F., Ducatelle R. (2009). Protective immunization with homologous and heterologous antigens against
Helicobacter suis challenge in a mouse model. Vaccine 27, 1416-1421.
99. Flahou B., Haesebrouck F., Chiers K., Van Deun K., De Smet L., Devreese B., Vandenberghe I.,
Favoreel H., Smet A., Pasmans F., D’Herde K., Ducatelle R. (2011). Gastric epithelial cell death
caused by Helicobacter suis and Helicobacter pylori γ-glutamyl transpeptidase is mainly gluthathione
degradation-dependent. Cellular Microbiology 13, 1933-1955.
100. Krakowka S., Ellis J. (2006). Reproduction of severe gastroesophageal ulcera in gnotobiotic
swine infected with porcine Helicobacter pylori like bacteria. Veterinary Pathology 43, 956-962.
101. Claus D., Berkley R.C.W. (1995). Genus Bacillus. In: Sheath P.H.A. (editors) Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology, Springer, New York, NY, USA, p. 1104-1139.
102. Henriksson A., Conway P.L. (1992). Adhesion to porcine squamous epithelium of saccharide and
protein moieties of Lactobacillus fermentum strain 104-S. Journal of Genetic Microbiology 138, 26572661.
103. Henriksson A., Conway P.L. (1996). Adhesion of Lactobacillus fermentum 104-S to porcine
stomach mucus. Current Microbiology 33, 31-40.
104. Kandler O., Weiss N. (1995). Genus Lactobacillus. In: Kandler O., Weiss N. (editors) Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology, Springer, New York, NY, USA, p. 1209-1234.
105. Sherman L.A., Savage D.C. (1986). Lipoteichoic acid in Lactobacillus strains that colonize mouse
gastric epithelium. Applied Environmental Microbiology 52, 302-304.
106. Flahou B., De Baere T., Chiers K., Pasmans F., Haesebrouck F., Ducatelle R. (2010). Gastric
infection with Kazachstania heterogenica influences the outcome of a Helicobacter suis infection in
Mongolian gerbils. Helicobacter 15, 67-75.
107. Monstein H.J., Tiveljung A., Kraft C.H., Borch K., Jonasson J. (2000). Profiling of bacterial flora in
gastric biopsies from patients with Helicobacter pylori-associated gastritis and histologically normal
control individuals by temperature gradient gel electrophoresis and 16S rDNA sequence analysis.
Journal of Medical Microbiology 49, 817-822.
75
108. Tiveljung A., Borch K., Jonasson J., Mardh S., Petersson F., Monstein H.J. (1998). Identification
of Helicobacter in gastric biopsies by PCR based on 16S rDNA sequences: a matter of little
significance for the prediction of H. pylori-associated gastritis. Journal of Medical Microbiology 47, 695704.
109. Adamsson I., Nord C.E., Lundquist P., Sjöstedt S., Edlund C. (1999). Comparative effects of
omeprazole, amoxycillin plus metronidazole versus omeprazole, clarithromycin plus metronidazole on
the oral, gastric and intestinal microflora in Helicobacter pylori-infected patients. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy 44, 629-640.
110. Blaser M.J. (1997). Not all Helicobacter pylori strains are created equal: should all be eliminated.
The Lancet 349, 1020-1022.
111. Blaser M.J. (1998). Helicobacters are indigenous to the human stomach: duodenal ulceration is
due to changes in gastric microecology in the modern era. Gut 43, 721-727.
112. Blaser M.J. (1999). Hypothesis: the changing relationships of Helicobacter pylori and humans:
implications for health and disease. Journal of Infectious Diseases 179, 1523-1530.
113. Pütsep K., Bränden C-I., Boman H.G. (1999). Antibacterial peptide from Helicobacter pylori.
Nature 398, 671-672.
114. Pütsep K., Normark S., Boman H.G. (1999). The origin of cecropins, implications from synthetic
peptides derived from ribosomal protein L1. FEBS Letters 451, 249-252.
115. Meshkinpour H., Thrupp L.D., Shiffler P., Kitts D., Fisher J. (1981). Reflux gastritis syndrome,
Role of upper gastrointestinal microflora. Archives of Surgery 116, 1148-1152.
116. Isogai H., Isogai E., Hayashi S., Kimura K., Kubota T., Fujii N., Oguma K. (1997). Experimental
Helicobacter pylori infection in association with other bacteria. Microbiology and Immunology 41, 361365.
117. Sanduleanu S., Jonkers D., De Bruïne A., Hameeteman W., Stockbrügger R.W. (2001). NonHelicobacter pylori bacterial flora during acid-suppressive therapy: differential findings in gastric juice
and gastric mucosa. Alimentary Pharmacology and Therapeutics 15, 379-388.
118. Verdu E.F., Armstrong D., Fraser R., Viani F., Idström J-P., Cederberg C., Blum A.L. (1995).
Effect of Helicobacter pylori status on intragastric pH during treatment with omeprazole. Gut 36, 539543.
119. Labenz J., Tillenburg B., Peitz U., Idström J-P., Verdu E.F., Stolte M., Börsch G., Blum A.L.
(1996). Helicobacter pylori augments the pH-increasing effect of omeprazole in patients with duodenal
ulcer. Gastroenterology 42, 725-732.
120. Sanduleanu S., Jonkers D., De Bruïne A., Hameeteman W., Stockbrügger R.W. (2001). Double
gastric infection with Helicobacter pylori and non-Helicobacter pylori bacteria during acid-suppressive
therapy: increase of pro-inflammatory cytokines and development of atrophic gastritis. Alimentary
Pharmacology and Therapeutics 15, 1163-1175.
121. Ansorg R., Schmid E.N. (1998). Adhesion of Helicobacter pylori to yeast cells. Zentralblatt für
Bakteriologie 288, 501-508.
122. Rokka S., Pihlanto A., Korhonen H., Joutsjoki V. (2006). In vitro growth inhibition of Helicobacter
pylori by lactobacilli belonging to the Lactobacillus plantarum group. The society for Applied
Microbiology Letters in Applied Microbiology 43, 508-513.
123. Aiba Y., Suzuki N., Kabir A.M.A., Takagi A., Koga Y. (1998). Lactic acid-mediated suppression of
Helicobacter pylori by the oral administration of Lactobacillus salivarius as a probiotic in a gnotobiotic
murine model. The American Journal of Gastroenterology 93, 2097-2101.
124. Lorca G.L., Wadström T., Font de Valdez G., Ljungh A. (2001). Lactobacillus acidophilus
autolysins inhibit Helicobacter pylori in vitro. Current Microbiology 42, 39-44.
76
125. Kabir A.M.A., Aiba Y., Takagi A., Kamiya S., Miwa T., Koga Y. (1997). Prevention of Helicobacter
pylori infection by lactobacilli in a gnotobiotic murine model. Gut 41, 49-55.
126. Michetti P., Dorta G., Wiesel P.H., Brassart D., Verdu E., Herranz M., Felley C., Porta N., Rouvet
M., Blum A.L., Corthésy-Theulaz I. (1999). Effect of whey-based culture supernatant of Lactobacillus
acidophilus (johnsonii) La1 on Helicobacter pylori infection in humans. Digestion 60, 203-209.
127. Felley C.P., Corthésy-Theulaz I., Rivero J-L.B., Sipponen P., Kaufmann M., Bauerfeind P.,
Wiesel P.H., Brassart D., Pfeifer A., Blum A.L., Michetti P. (2001). Favourable effect of an acidified
milk (LC-1) on Helicobacter pylori gastritis in man. European Journal of Gastroenterology and
Hepatology 13, 25-29.
128. Midolo P.D., Lambert J.R., Hull R., Luo F., Grayson M.L. (1995). In vitro inhibition of Helicobacter
pylori NCTC 11637 by organic acids and lactic acid bacteria. Journal of Applied Microbiology 79, 475479.
129. Coconnier M-H., Lievin V., Hemery E., Servin A.L. (1998). Antagonistic activity against
Helicobacter infection in vitro and in vivo by the human Lactobacillus acidophilus strain LB. Applied
and Environmental Microbiology 64, 4753-4580.
130. Johnson-Henry K.C., Mitchell D.J., Avitzur Y., Galindo-Mata E., Jones N.L., Sherman P.M.
(2004). Probiotics reduce bacterial colonization and gastric inflammation in Helicobacter pylori-infected
mice. Digestive Diseases and Sciences 49, 1095-1102.
131. Bernet-Camard M.F., Liévin V., Brassart D., Neeser J.R., Servin A.L., Hudault S. (1997). The
human Lactobacillus acidophilus strain LA1 secretes a nonbacteriocin antibacterial substance(s)
active in vitro and in vivo. Applied and Environmental Microbiology 63, 2274-2753.
132. Silva M., Jacobus N.V., Deneke C., Gorbach S.L. (1987). Antimicrobial substance from a human
Lactobacillus strain. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 1231-1233.
133. Mukai T., Asasaka T., Sato E., Mori K., Matsumoto M., Ohori H. (2002). Inhibition of binding of
Helicobacter pylori to the glycolipid receptors by probiotic Lactobacillus reuteri. FEMS Immunology
and Medical Microbiology 32, 105-110.
134. Bernet M.F., Brassart D., Neeser J.R., Servin A.L. (1994). Lactobacillus acidophilus LA1 binds to
cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent
bacteria. Gut 35, 483-489.
135. Wasimuddin, Cizkova D., Bryja J., Albrechtova J., Hauffe H.C., Pialek J. (2012). High prevalence
and species diversity of Helicobacter spp. detected in wild house mice. Applied and Environmental
Microbiology 78, 8158-8160.
136. Ierardi E., Monno R.A., Gentile A., Francavilla R., Burattini O., Marangi S., Pollice L., Francavilla
A. (2001). Helicobacter heilmannii gastritis: a histological and immunohistochemical trait. Journal of
Clinical Pathology 54, 774-777.
137. Ge Z., Feng Y., Muthupalani S., Eurell L.L., Taylor N.S., Whary M.T., Fox J.G. (2011).
Coinfection with enterohepatic helicobacter species can ameliorate or promote Helicobacter pyloriinduced gastric pathology in C57BL/6 mice. Infection and Immunity 79, 3861-3871.
138. Lekunze Fritz E., Slavik T., Delport W., Olivier B., Van der Merwe S.W. (2006). Incidence of
Helicobacter felis and the effect of coinfection with Helicobacter pylori on the gastric mucosa in the
African population. Journal of Clinical Microbiology 44, 1692-1696.
139. Louw J.A., Kidd M.S.G., Kummer A.F., Taylor K., Kotze U., Hanslo D. (2001). The relationship
between Helicobacter pylori infection, the virulence genotypes of the infecting strain and gastric cancer
in the African setting. Helicobacter 6, 268–273.
140. Blaecher C., Smet A., Flahou B., Pasmans F., Ducatelle R., Taylor D., Weller C., Bjarnason I.,
Charlett A., Lawson A.J., Dobbs R.J., Dobbs S.M., Haesebrouck F. (2013). Significantly higher
77
frequency of Helicobacter suis in patients with idiopathic parkinsonism than in control patients.
Alimentary Pharmacology and Therapeutics 38, 1347-1353.
141. Martin M.E., Bhatnagar S., George M.D., Paster B.J., Canfield D.R., Eisen J.A., Solnick J.V.
(2013). The impact of Helicobacter pylori infection on the gastric microbiota of the rhesus macaque.
PloS One 8, e76375, doi:10.1371.
142. Hessing, J.J.C., Geudeke, M.J., Scheepens, C.J.M., Tielen, M.J.M., Schouten, W.G.P.,
Wiepkema, P.R. (1992). Changes in the mucous membrane of the pars oesophageal part of the
stomach – prevalence and relations to stress. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 117, 445-450.
143. Dixon M.F., Genta R.M., Yardley J.H., Correa P. (1996). Classification and grading of gastritis:
the updated Sydney system. American Journal of Surgical Pathology 20, 1161-1181.
144. Wang Y., Qian P-Y. (2009). Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer
design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One 4, e7401, doi:10.1371.
145. Davis L., DiRita V. (2008). Growth and laboratory maintenance of Campylobacter jejuni. Current
Protocols in Microbiology 10, 8A.1.1–8A.1.7.
146. Reese N.A., Muggenburg B.A., Kowalczyk T., Grummer R.H., Hoekstra W.G. (1966). Nutritional
and environmental factors influencing gastric ulcera in swine. Journal of Animal Science 25, 14-20.
147. Driessen A., Van Ginneken C., Creemers J., Lambrichts I., Weyns A., Geboes K., Ectors N.
(2002). Histological and immunohistochemical study of the lymphoid tissue in the normal stomach of
the gnotobiotic pig. Virchows Archiv 441, 589-598.
148. Mazzoni M., Bosi P., De Sordi N., Lalatta-Costerbosa G. (2011). Distribution, organization and
innervation of gastric MALT in conventional piglet. Journal of Anatomy 219, 611-621.
149. De Groote D., Ducatelle R., van Doorn L.J., Tilmant K., Verschuuren A., Haesebrouck F. (2000).
Detection of Candidatus Helicobacter suis in gastric samples of pigs by PCR: comparison with other
invasive diagnostic techniques. Journal of Clinical Microbiology 38, 1131-1135.
150. Dufresne L. (1998). Alimentary tract disorders of growing pigs. Proceedings of the 15th IPVS
Congress, Birmingham, England, p. 71-77.
151. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. (1991). 16S ribosomal DNA amplification
for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173, 697-703.
152. Vandamme P., Harrington C.S., Jalava K., On S.L. (2000). Misidentifying helicobacters: the
Helicobacter cinaedi example. Journal of Clinical Microbiology 38, 2261-2266.
153. McGillivery D.J., Cranwell P.D. (1992). Anaerobic microflora associated with the pars
oesophagea of the pig. Research in Veterinary Science 53, 110-115.
154. Mann E., Schmitz-Esser S., Zebeli Q., Wagner M., Ritzmann M., Metzler-Zebeli B.U. (2013).
Mucosa-associated bacterial microbiome of the gastrointestinal tract of weaned pigs and dynamics
linked to dietary calcium-phosphorus. PLoS One 9, e86950, doi: 10.1371.
155. Kant R., Paulin L., Alatalo E., De Vos W.M., Palva M. (2011). Genome sequence of Lactobacillus
amylovorus GRL1118, isolated from pig ileum. Journal of Bacteriology 193, 3147-3148.
156. Chang A.H., Haggerty T.D., de Martel C., Leung C.W., Parsonnet J. (2011). Effect of
Helicobacter pylori infection on symptoms of gastroenteritis due to enteropathogenic Escherichia coli
in adults. Digestive Diseases and Sciences 56, 457-464.
157. Baranyi J. and Roberts T.A. (2000). Principles and application of predictive modelling of the
effects of preservative factors on microorganisms. In: Lund B., Baird-Parker T.C., Gould G. (Editors)
The microbiological safety and quality of food, Aspen Publishers Inc., Gaithersburg, Maryland, p. 342358.
158. Castanie-Cornet M-P., Penfound T.A., Smith D., Elliott J.F., Foster J.W. (1999). Control of acid
resistance in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 181, 3525-3535.
78
159. Birk T., Takamiya Wik M., Lametsch R., Knochel S. (2012). Acid stress response and protein
induction in Campylobacter jejuni isolates with different acid tolerance. BMC Microbiology 12, 174-186.
160. Nachamkin I. (2002). Chronic effects of Campylobacter jejuni infection. Microbes and Infection 4,
399-403.
161. Croxen M.A., Law R.J., Scholz R., Keeney K.M., Wlodarska M., Finlay B.B. (2013). Recent
advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews 26, 822880.
162. De Cooman L., Flahou B., Houf K., Smet A., Ducatelle R., Pasmans F., Haesebrouck F. (2013).
Survival of Helicobacter suis in bacteria in retail pig meat. International Journal of Food microbiology
16, 164-167.
79

Literatuurstudie en in vitro onderzoek naar

View online - Universiteit Gent

Samenvatting proefschrift l.L. Holster, juni 2014

tbg_thema_duits_april2014_proefbier_02_berliner_weisse

deze pdf

De beestjes in ons

Pantomed

Download Sample pages 1 (pdf, 630 kB)

０２９〜１１２ Ｙ東洋文庫所蔵ブラウ 『大地図帳』 総目次.pwd

Effect rogge vleeskuikens