Effect rogge vleeskuikens

7‐10‐2014
Rogge vleeskuikens; een dosis-respons proef
Effect rogge op immuun competentie
vleeskuikens
Bijeenkomst 30 september 2014
30 september 2014, Marinus van Krimpen
Doel experiment (uitgevoerd in 2013)
Hypothese
 Vaststellen effect wateroplosbare, viskeuze
koolhydraten (arabinoxylanen) via opname van rogge
in het voer van vleeskuikens na de neonatale fase
(d14 – d28) op:
● de samenstelling van de microflora
● functionele en immuun status van het dunne
darmweefsel via meting van genexpressie en
darmmorfologie
Viscositeit chymus
Samenstelling microflora
Passagesnelheid chymus
Morfologie darmwand
Absorptie nutriënten
Respons immuunsysteem darm
● de groeiprestaties van deze kuikens.
Dierprestaties
Materiaal en methode
 Uitvoering op proefbedrijf De Heus
 Standaard startvoer d1 – d14
 Standaard eindvoer d29 – d35
 0%, 5% en 10% rogge in
groeivoer (d15 – d28)
 24 grondkooien (1.5 m2)
 40 haankuikens/kooi
 Sectie van 10 kuikens/kooi op
d14, d21 en d28
 Laatste 10 kuikens afgeleverd op
d35
Samenstelling groeivoeders
 Iso-calorisch (2950 kcal)
 Gelijk niveau darmverteerbare
aminozuren, vitaminen,
mineralen
Mais
Rogge
Controle
5%
Rogge
10%
Rogge
59.9%
54.0%
48.0%
0.0%
5.0%
10.0%
Varkensvet
3.1%
3.8%
4.5%
Sojaschroot
26.3%
26.6%
26.8%
1
7‐10‐2014
Waarnemingen
Resultaten: analyse groeivoeders
 Karakterisering voeders
 Performance dieren
 Mestconsistentie
 In middelste deel jejunum:
Aandeel rogge
● Microflora
● Genexpressie immunologisch
gerelateerde pathways
● Darmwand morfologie
 Gewicht bursa en milt
 Effect rogge op IPEC-j2 darmcellen
0%
5%
As
g/kg
57.2
57.0
10%
57.2
Ruw eiwit
g/kg
195.6
197.0
196.9
Ruw vet
g/kg
82.0
85.5
90.1
Ruwe celstof
g/kg
29.5
29.1
27.0
Zetmeel
g/kg
380.1
367.2
363.7
Suikers
g/kg
44.2
43.2
49.6
NDF
g/kg
79.6
79.0
83.1
Viscositeit
CP
2.0
4.4
8.3
(In vitro onderzoek)
Resultaten: Voeropname (g/d)
Resultaten: Gewichtstoename periode (g)
Aandeel rogge
Leeftijd (d)
Aandeel rogge
0%
5%
10%
43
44
43
15 - 21 (Proef)
108
110
108
15 - 21 (Proef)
22 - 28 (Proef)
161
161
161
22 - 28 (Proef)
29 - 35 (Controle)
212
212
211
29 - 35 (Controle)
Eindgewicht (g)
2538
0 - 14 (Controle)
 Geen effect rogge op voeropname
Leeftijd (d)
0 - 14 (Controle)
0%
5%
503
511
501
569ab
577a
556b
756a
749a
720b
710b
699b
736a
2536
2513
 10% rogge verlaagt de groei tijdens de proefperiode
 Compensatoire groei na overschakeling op controlevoer
 Geen verschil in gewicht bij afleveren
Resultaten: Voederconversie periode
Resultaten: Villus hoogte (µm) jejunum
Aandeel rogge
Leeftijd (d)
10%
Aandeel rogge
0%
5%
10%
Leeftijd (d)
0%
5%
1.200
1.199
1.200
14 (Controle)
1059
981
999
15 - 21 (Proef)
1.333
1.338
1.366
21 (Proef)
1327b
1408ab
1447a
22 - 28 (Proef)
1.493b 1.507ab
1.562a
28 (Proef)
1463b
1548a
1484ab
0 - 14 (Controle)
b
29 - 35 (Controle) 2.104
b
2.008a
2.128
 10% rogge verhoogt de VC tijdens week proefperiode
 Kuikens met 10% rogge efficiëntere voederbenutting na
2e
overschakeling op controlevoer
10%
 Dag 21: voer met 10% rogge resulteert in 9% langere
villi t.o.v. het controlevoer; voer met 5% rogge verschilt
niet van beide behandelingen (6% langere villi)
 Dag 28: voer met 5% rogge resulteert in 6% langere villi
t.o.v. het controlevoer; voer met 10% rogge verschilt
niet van beide behandelingen
2
7‐10‐2014
Resultaten: Crypte diepte (µm) jejunum
Resultaten: Villus:Crypte ratio jejunum
Aandeel rogge
Leeftijd (d)
0%
5%
10%
14 (Controle)
244
227
21 (Proef)
189b
28 (Proef)
196
Aandeel rogge
Leeftijd (d)
0%
5%
10%
230
14 (Controle)
4.8
4.7
4.7
191b
219a
21 (Proef)
7.5
7.7
7.4
201
192
28 (Proef)
7.8
8.0
8.1
 Dag 21: voer met 10% rogge resulteert in 16% diepere
crypten t.o.v. het controlevoer en voer met 5% rogge
 Geen aantoonbaar effect van behandelingen op de
villus : crypte ratio
 Dag 28: geen effect van behandelingen op crypte diepte.
Resultaten: Gobletcellen (aantal/villi)
Resultaten: strooisel score
Aandeel rogge
Aandeel rogge
Leeftijd (d)
0%
5%
10%
Leeftijd (d)
0%
5%
10%
14 (Controle)
261
248
247
22 (Proef)
7.0a
6.5b
5.6c
21 (Proef)
366
359
378
29 (Proef)
6.8a
6.4b
3.0c
28 (Proef)
333
369
335
35 (Controle)
6.8
6.6
6.6
 Geen effect van rogge verstrekking op:
● Aantal gobletcellen
● % villi bedekt door gobletcellen
● Oppervlakte gobletcellen
 Score loopt van 10 (droog/rul) naar 0 (nat/100% koek)
 Strooisel score verslechtert exponentieel met toenemend
aandeel rogge in voer
 Op dag 30 zijn hokken weer opnieuw ingestrooid (ca. 1
kg/hok)
Uitval, gewicht bursa, gewicht milt
Microbiota; diversiteitsindex (Shannon)
 Geen effect van aandeel rogge op:
● Uitval (%) Overall 1.25%
● Relatief gewicht bursa (g/kg dier)
● Relatief gewicht milt (g/kg dier)
3
7‐10‐2014
Diversiteitsindex: dag x rogge niveau
Microbiota samenstelling
 495 species gespecificeerd
 31 species vormen in totaal 99% van de microflora
 11 species vormen in totaal 94% van de microflora
 De grootste familiegroepen zijn:
● Lactobacillaceae 75.5%
● Planococcaceae
5.7%
● Stapylococcaceae 5.4%
● Enterococcaceae
4.2%
● Aerococcaceae
3.8%
 Geen significante effecten van rogge niveau op
diversiteitsindex dag 21 en 28
Microbiota samenstelling dag 21
f
f__Lactobacillaceae
f__Lactobacillaceae
f__Lactobacillaceae
f__Planococcaceae
f__Enterococcaceae
f__Corynebacteriaceae
f__Streptococcaceae
f__Aerococcaceae
f__Staphylococcaceae
f__Aerococcaceae
Other
Totaal
g
g__Lactobacillus
g__Lactobacillus
g__Lactobacillus
g__Staphylococcus
Other
g__Corynebacterium
g__Streptococcus
g__Aerococcus
g__Jeotgalicoccus
g__Facklamia
Other
Species
0% Rogge 5% Rogge 10% Rogge P-waarde
s__reuteri
27.98
34.96
38.99
< 0.001
s__
33.23
38.92
17.82
< 0.001
s__salivarius
16.84
11.68
21.98
< 0.001
s__saprophyticus
4.50
1.73
5.11
0.002
Other
2.64
1.51
2.05
0.006
s__stationis
2.73
1.79
3.06
0.261
s__luteciae
0.96
0.40
0.86
< 0.001
s__
1.45
0.95
1.18
< 0.001
s__psychrophilus
1.89
1.32
1.77
0.641
s__
1.64
1.72
1.53
0.110
Other
1.14
0.74
0.56
0.004
95.02
95.72
94.92
 Samenstelling microbiota verschilt tussen proefgroepen
 Meer Lactobacillus Reuteri bij hoger aandeel rogge;
Totaal aandeel Lactobacilli redelijk vergelijkbaar tussen
behandelingen
 Bij overige species is beeld diffuus
Gen-expressie: Principal Component Analysis
Microbiota samenstelling dag 28
Family
f__Lactobacillaceae
f__Lactobacillaceae
f__Lactobacillaceae
f__Planococcaceae
f__Enterococcaceae
f__Corynebacteriaceae
f__Streptococcaceae
f__Aerococcaceae
f__Staphylococcaceae
f__Aerococcaceae
Other
Totaal
Genus
g__Lactobacillus
g__Lactobacillus
g__Lactobacillus
g__Staphylococcus
Other
g__Corynebacterium
g__Streptococcus
g__Aerococcus
g__Jeotgalicoccus
g__Facklamia
Other
Species
0% Rogge 5% Rogge 10% Rogge P-waarde
s__reuteri
45.81
40.97
40.33
< 0.001
s__
16.19
19.71
22.33
< 0.001
s__salivarius
11.77
19.46
13.46
< 0.001
s__saprophyticus
6.07
3.75
4.01
0.002
Other
2.20
3.24
3.31
0.006
s__stationis
2.99
2.21
3.33
0.261
s__luteciae
1.77
1.22
1.75
< 0.001
s__
2.00
1.03
1.43
< 0.001
s__psychrophilus
2.54
1.42
1.82
0.641
s__
1.73
0.97
1.69
0.110
Other
1.01
0.61
0.61
0.004
94.10
94.59
94.08
 Samenstelling microbiota verschilt tussen proefgroepen
 Minder Lactobacillus Reuteri, L. Saprophyticus en
Aerococcaceae bij hoger aandeel rogge
 Meer Lactobacillus S en L. Salivarius bij hoger aandeel
rogge
Genexpressie: Beschrijvende statistiek
Contrast
Up
Genen1
Down
Dag 21
10% vs. 0% rogge
5% vs. 0% rogge
10% vs. 5% rogge
3
16
8
103
103
12
Dag 28
10% vs. 0% rogge
5% vs. 0% rogge
10% vs. 5% rogge
7
4
2
89
6
94
1
logFC>|1.3| and adjusted p-value < 0.05
 Rogge toevoeging vooral effect op down regulatie genen
 Dag 21: contrast m.n. tussen 0%  5 en 10% rogge
 Dag 28: contrast m.n. tussen 0% en 5%  10% rogge
4
7‐10‐2014
Effect rogge op biologische processen d21
Regulation
# of genes ES1
Clusters Generalized term
10% vs. 0% UP
0
5%
2
vs. 0% UP
10% vs. 5% UP
0
10% vs. 0% DOWN
2
5%
4
vs. 0% DOWN
10% vs. 5% DOWN
Steroid, Lipid, Mitochondrial
Extracellular region part, plasma
membrane
3
2.07
3
1.04
Blood coagulation, hemostasis
M phase, meiosis
meiosis, M phase
Cell process, M phase
Regulation of -ase activity
Extracellular region
3
4
5
6
3
9
1.08
1.08
1.36
1.21
1.03
1.02
Effect rogge op biologische processen d28
Regulation
10% vs. 0% UP
5% vs. 0% UP
10% vs. 5% UP
Clusters Generalized term
0
0
2
Regulation of cell migration
Neg. regulation cell
migration
10% vs. 0% DOWN
0
 Rogge (5 en 10%) heeft met name effect op celcyclus
5% vs. 0% DOWN
10% vs. 0%DOWN
3
Regulation of cell migration
Neg. regulation cell
migration
Pos. Regulation of -ase
activity
# of genes ES1
5
2.24
2
1.56
5
2.36
3
1.62
3
1.12
0
0
 Rogge (10%) reguleert celcyclus processen, zowel up als
down regulatie
processen van de darmwand, voornamelijk down
regulatie
Biologische processen down gereguleerd
Biologische processen up gereguleerd
 Proliferatie
 Apoptosis
 Differentiatie
 Migratie
 Eiwitsynthese
 Vetsynthese
 Energie
 Proliferatie
 Differentiatie
 Cel motiliteit
 Cel overleving
 Complement- en
stollingscascade
metabolisme
 Cel overleving
 Cel metabolisme
Rogge IPEC-J2; met en zonder Salmonella
Conclusies 1 (effect van rogge v.a. 14 dgn)
“Varkensenterocyten cellijn IPEC-J2” met en zonder Salmonella-challenge
Compound [concentratie
range] Performance
2, 6, uur groei
RNA / QRT-PCR / Microarray
‐Effect Rogge op ontstekings‐genen in varkens‐darmepitheel cellen.
VDI-4; Voer met Rogge 0% . 5%, 10%
Rogge 5% en 10%; weinig invloed op de Salmonella respons (-genen) 2 en 6 uur.
Rogge 10 % (voornamelijk bij 2 uur); dominant proces >>Cell-cycle progression
Bioinformatica analyse
(opm; DNA‐repair en DNA‐damage processen zijn
onderdeel van checkpoints in de cell‐cycle )
 Voeropname gelijk
 Groei en voederconversie verslechtert bij 10% rogge
 Strooiselscore aantoonbaar slechter (dosis-respons
effect)
Darmintegriteit
 Villus lengte en crypte diepte na 1 week toegenomen
 Verschillen nemen af na 2 weken rogge verstrekking
 Geen effect op villus:crypte ratio
 Geen effect op gobletcellen
 Geen effect op relatieve gewicht bursa en milt
5
7‐10‐2014
Conclusies (2)
 Genexpressie
 Aantoonbare dag-effecten op genexpressie (vooral d21)
 Effecten op celcyclus processen
 Bevestiging celcyclus processen in in-vitro test (IPEC)
Hypothese
Viscositeit chymus
Samenstelling microflora
 Microbiota
 Geen effect van dag en roggeniveau op diversiteitsindex
 Uitwisseling tussen lactobacillus species (ca. 75%
Passagesnelheid chymus
Morfologie darmwand
Absorptie nutriënten
Respons immuunsysteem darm
 Minder Aerococcaceae bij hoger aandeel rogge
Dierprestaties
populatie)
Overall conclusie
Hoe verder?
 Verstrekking van 5% of 10% rogge vanaf 14 dagen
 Literatuurstudie uitgevoerd binnen VDI-1
leeftijd had in dit experiment een beperkt effect op
microbiota samenstelling en immuun-gerelateerde
parameters. Wel was er een effect op celcyclus
processen van de darmwandcellen.
‘Nutritional intervention in animals: benchmarking of
strategies, monitoring biomarkers and immuno
competence’
 Gekozen voedingsinterventies in vervolg onderzoek
vleeskuikens:
● Prebioticum (betaglucanen)
● Bioactieve plantenstof (Quercitine)
● Structuurrijk voer (haverdoppen)
● Antimicrobieel eiwit (Lysozyme)
● Omega-3 vetzuren (visolie)
6

Download Report