Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-103 I-MET-FLVVT-103 BEPALING VAN DIOXINE EN DIOXINE-LIKE VERBINDINGEN (PCDD’s EN PCDF’s) BEPALING VAN NON-ORTHO- EN MONO-ORTHO-PCB’S OP BASIS VAN EEN TOTALE BIOASSAY BEQ-WAARDE BEREKENING Versie 06 Datum van toepassing 2014-04-25 Opgesteld door : Huig Vanderperren, sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; 2014-04-18 Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; 2014-04-22 Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Dioxines LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 1/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) Overzicht wijzigingen Herziening * door/datum H. Vanderperren 10/2008 H. Vanderperren 25/03/10 H.Vanderperren, 28/05/2010 H. Vanderperren, 14/01/2011 H. Vanderperren, 03/2012 H. Vanderperren, 03/2014 Reden van de herziening Opsteller van initiële versie Aanpassing volgens opmerking audit Tekstdeel/draagwijdte van de herziening Volledige tekst Aanpassing volgens opmerking audit Punt 8, 9, 10, 11, 12, 13 Punt 10.4 Verwijzing naar LAB 25-F61 en LAB 25-D 06 Punt 10 en 13 toevoegen 10.5 en 10.6 (verduidelijking) + Volledig document update documentbeheer Aanpassing TEQ-waarde naar BEQ waarde Volledig document Reagentia: verwijderen verwijzing naar producentspecificaties Toevoeging werkwijze zuivelproducten, lever en mager vlees Aanpassing werkwijze (vermindering gebruik solventen) Verduidelijking rapportering Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 06. * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 2/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) INHOUDSTABEL 1 DOEL .................................................................................................................................. 4 2 TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4 3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN........................................................... 4 4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 5 5 PRINCIPE........................................................................................................................... 5 6 PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 5 7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 5 8 REAGENTIA EN HULPSTOFFEN..................................................................................... 6 9 8.1 REAGENTIA..................................................................................................................... 6 8.2 HULPSTOFFEN ................................................................................................................ 7 TOESTELLEN .................................................................................................................... 9 9.1 ALGEMEEN ..................................................................................................................... 9 9.2 SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE .............................................................................. 9 10 WERKWIJZE...................................................................................................................... 9 10.1 AANMAAK EN BEHANDELING CELCULTUUR .................................................................... 9 10.2 EXTRACTIE ............................................................................................................... 11 10.3 OPZUIVERING ........................................................................................................... 13 10.4 BEHANDELING OPGEZUIVERDE EXTRACTEN ................................................................ 15 10.5 LEZEN LUMINOMETER................................................................................................ 16 10.6 RESULTAATVERWERKING .......................................................................................... 17 11 KWALITEITSCONTROLE ............................................................................................... 18 12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................. 19 13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN ................................................................................................ 21 LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 3/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 1 Doel Bepalen van de BEQ van dioxine en dioxinegelijkende verbindingen (PCDD’s en PCDF’s) en van non-ortho en de mono-ortho PCB’s in matrices betrokken in de voedselketen. 2 Toepassingsgebied Deze methode beschrijft de bepaling van de BEQ, welke een indicatie is voor de verwachte TEQ in dierenvoeders, mineralen en levensmiddelen. In onderstaande tabel wordt een overzicht gegeven van de verschillende matrices die kunnen worden geanalyseerd met deze methode. Per matrix is aangegeven in welke eenheid het resultaat wordt gerapporteerd en of de matrix onder accreditatie wordt uitgevoerd. Matrix Eenheid ng BEQ/kg product Diervoeders en grondstoffen (B) Mineralen (B) Vismeel (B) pg BEQ/g vers Vis (B) gewicht pg BEQ/g vet Vet 1 g (visolie) (B) Vet 4 g (dieren) (B) Plantaardige olie (NB) Melk (B) Zuivel (NB) Kaas (B) Ei (B) pg BEQ/g vers Lever( NB) gewicht Schapenlever (NB) OR DIO 0,25 BR DIO 1,80 OR PCB 0,25 BR PCB 2,40 1,00 9,30 2,00 18,60 1,00 0,50 0,25 1,00 8,90 4,80 1,80 8,90 2,00 0,25 0,25 1,00 18,60 6,00 2,40 11,60 0,50 0,50 0,05 0,40 4,80 4,80 0,60 2,50 0,25 0,50 0,05 0,40 6,00 11,60 0,60 2,50 OR: Onderste rapporteringsgrens; BR: Bovenste rapporteringrens 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 4/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 4 Definities en afkortingen Term TEQ BEQ (N)B AL Definitie Toxic Equivalent Bioassay Equivalent (Niet) Belac/ (niet) geaccrediteerd Actielimiet 5 Principe Het monster wordt geëxtraheerd met het gepaste solvent. Na opzuivering op een zure silicagel kolom en een actieve kool kolom, wordt de cellijn blootgesteld aan het extract. Uit de calibratiecurve wordt de BEQ-waarde bepaald. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25- L22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaaheid (RSDR%) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Om de week dient het niveau van vloeibare stikstof (opslag cellen) gecontroleerd te worden. Teneinde contaminaties bij de cellen te beperken dient extra aandacht besteed te worden aan hygiënische maatregelen. De werkvlakken in het celcultuurlabo dienen voor en na ieder gebruik ontsmet te worden met Pursept-A en/of Dettol. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 5/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Labonr. n-hexaan voor multiresiduanalyse R1092 zwavelzuur 95-97% R0308 natriumsulfaat watervrij R0121 silicagel 60 (0,063-0,200 mm) R0385 tolueen voor dioxineanalyses R0409 aceton pestigrade of equivalent R0024 methanol R0359 ethylacetaat voor gaschromatografie of equivalent R0341 DMSO dimethyl sulfoxide R0589 actieve kool R2019 celite R0356 celcultuur : genetisch gemodifieerde muizenlevercellen aangeleverd door Snixoid PBS-buffer Phosphate buffered saline S0024 R0301 medium RPMI 1640 met L-glutamine of equivalent R0331 trypsine 0.25% R0365 cell culture lysis reagent 5 x R0561 luciferine - Luciferase Assay System R0196 foetaalkalfsserum triple filtered R0046 streptomycine 5000IU en Penicilline 500 µg/ml R0231 standaard dioxine 2, 3, 7, 8 TCDD (50 pg/µl) S0261 PCB126 (10 ng/µl) in iso-octaan S0055 isopropanol R0416 chloroform R0104 milli Q-water R1003 PCB eluens: tolueen/ethylacetaat/hexaan 10/10/80 (V/V/V) W1552 aceton/ hexaan 10/90 (V/V) W1550 pakking koolkolom: actieve kool/celite 0.6/99.4 (g/g) actieve kool W1551 zure silica 33%: zwavelzuur/silica 33/67 (g/g) W1199 LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 6/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 8.2 Hulpstoffen 8.2.1 Standaardoplossing en celcultuur 8.2.1.1 Oerstandaardoplossing 8.2.1.2 2,3,7,8 TCDD 50 ng/ml in DMSO (S0023): zie certificaat PCB126 (S0055): zie certificaat Werkstandaardoplossingen opstellen kalibratiecurve Iedere concentratie wordt in tweevoud op de plaat gebracht. Dioxine en Dioxine-like verbindingen (PCDD’s en PCDF’s) : Meng 200 µl DMSO met 200 µl TCDD-standaard 50 ng/ml (S1) Vertrekkend van deze oplossing (S1) wordt een verdunningsreeks aangemaakt door steeds 200 µl uit de vorige verdunning te mengen met 200 µl DMSO (S2, S3, S4…,S10). Non-ortho- en mono-ortho-PCB’s: Damp 50 µl S0055 droog onder stikstof. Voeg vervolgens 1 ml DMSO toe en vortex (S1). Vertrekkend van deze oplossing (S1) wordt een verdunningsreeks aangemaakt door steeds 500 µl uit de vorige verdunning te mengen met 500 µl DMSO (S2, S3, S4…,S10). Neem 4 µl van elk van deze oplossingen (S1 tot S10) en zet deze af tegen de bodem van een 10 ml centrifuge tube. De verdunningsreeks omvat S1 tot S10 met een dioxinegehalte van 100 pg/buis tot 195 ftg/buis. Voeg aan elke buis 3 ml hexaan toe. Centrifugeer tot de standaarden droog zijn. Dit gebeurt samen met de stalen (cfr 10.3). Voeg bij iedere buis 400 µl medium RPMI toe, vortex 10 seconden. Neem hieruit 2 x 188 µl en breng en breng dit in 2 wells van een op voorhand klaargemaakte plaat. Incubeer de plaat 20-24 uur bij 37°C (± 3°C) en 5% ( 1%) CO2. 8.2.1.3 De oplossingen (S1 tot S10) worden gebruikt tot deze op zijn. Celcultuur + medium Voeg 50 ml foetaal kalfserum en 5 ml streptomycine + penicilline-oplossing toe aan 500 ml medium RPMI en meng. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 7/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 8.2.2 8.2.2.1 Controlemonsters Blanco monster De procedure wordt helemaal doorlopen met een blanco plantaardige olie. 0,5 ml van deze olie volgt de chromatografische opzuivering (cfr. 4.3) en wordt mee op plaat gezet (cfr. 10.4). Deze wordt gebruikt tot deze op is. 8.2.2.2 Gespikte olie (10 pg/ml olie) Dioxine en Dioxine-like verbindingen (PCDD’s en PCDF’s) : Neem een gewenste hoeveelheid olie en rijk deze aan teneinde een waarde van 10 pg TEQ/ml te krijgen. 0,25 ml van deze olie volgt de chromatografische opzuivering (cfr. 4.3) en wordt mee op plaat gezet (cfr. 10.4). De recovery van de aangerijkte olie moet 30-130 % bedragen. Deze wordt gebruikt tot deze op is. Non-ortho- en mono-ortho-PCB’s : Neem 100 µl van standaard S0055 (10 ng/µl) en leng aan met n-hexaan tot 10 ml. Neem 100 µl van deze oplossing en voeg toe aan 100 ml olie. 0,5 ml van deze olie volgt de chromatografische opzuivering (cfr. 4. 3.) en wordt mee op plaat gezet (cfr. 4.4.). De recovery van de aangerijkte olie moet tussen 30 en 130 % liggen. Deze wordt gebruikt tot deze op is. 8.2.2.3 Controlestandaard (3 pg TEQ/4 l) W1553 Voeg 9 µl van de standaardoplossing (50 ng/ml 2,3,7,8 TCDD in DMSO) aan 591µl DMSO toe en vortex. Breng 4 µl van de standaard in een 10 ml centrifuge tube en voeg er 3 ml hexaan aan toe. Werk in tweevoud. Laat droogdampen in de vacuümcentrifuge bij 40 °C. Voeg 400 µl medium RPMI, toe vortex 10 seconden. Neem uit elke 10 ml centrifuge tube 2 x 188 µl en breng dit in 2 wells van een op voorhand klaargemaakte plaat. Incubeer de plaat 20-24 uur bij bij 37°C (± 3°C) en 5% ( 1%) CO2. Deze wordt gebruikt tot deze op is. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 8/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode Niet van toepassing 10 Werkwijze 10.1 Aanmaak en behandeling celcultuur 10.1.1 Opstarten celkweek De cellen worden uit de vloeibare stikstof genomen en opgewarmd bij kamertemperatuur. Neem 0.6 ml uit 40 ml opgewarmd RPMI medium (37°C 3°C) en voeg dit aan de cellen toe. Voeg de ontdooide cellen aan het medium RPMI toe. Herhaal deze stap tot alle cellen ontdooid en aan het medium toegevoegd zijn. Centrifugeren bij 1000 rpm/10’. Het supernatans wordt verwijderd. De pellet wordt gesuspendeerd in 2 ml medium. Voeg daarna nog 3 ml medium toe. Breng over in een 50 ml cultuurfles. Zet alles in een incubator bij 37°C (± 3°C) en 5% ( 1%) CO2 Controleer na ten vroegste 24 u en ten laatste 72 u de cellen op hun confluentie. De cultuurflessen worden onder microscoop bekeken en er wordt een schatting van de confluentie gemaakt, indien de cellen meer dan 70 % van de cultuurfles bedekken, wordt het medium RPMI met een pasteurpipet verwijderd en met 5 ml PBS buffer gespoeld. Vervolgens worden de cellen met behulp van 0.5 ml trypsine van de wand losgemaakt door tegen de wand van de fles te tikken. Breng de 0.5 ml trypsine over in een 5 ml medium bevattende falcontube. Spoel met 5 ml buffer en breng over in de falcontube. Centrifugeer 5’ bij 1000 rpm. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 5 ml medium RPMI. Breng 5 ml medium RPMI in een 250 ml cultuurfles en voeg er de 5 ml celsuspensie aan toe. Incubeer bij 37°C (± 3°C) en 5% ( 1%) CO2 tot ze opnieuw confluent zijn. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 9/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 10.1.2 Celkweek Verwijder het medium RPMI met een pasteurpipet Spoel met 10 ml PBS buffer en verwijder met pasteurpipet de buffer RPMI Voeg 1 ml trypsine aan 250 ml cultuurfles toe. Zwenk de cultuurfles om de trypsine over de cellen te verdelen Maak de cellen los door met de handpalm tegen de fles te tikken. Breng dit over in een 50 ml buis waarin 5 ml medium aanwezig is. Spoel de cultuurfles met 5 ml buffer en breng dit in dezelfde 50 ml buis. Centrifugeer bij 2000 rpm/5’ Verwijder het supernatans en suspendeer de pellet met 1 ml/fles medium Voeg 10 ml medium aan cultuurfles toe Voeg X ml celsupsensie aan de cultuurfles toe 0.11 ml 5 dagen 0,15 ml 4 dagen 0,17 ml 3 dagen 0,30 ml 2 dagen 0,65 ml 1 dag Zet in een incubator bij 37°C (± 3°C) en 5% ( 1%) CO2 Het aantal passages wordt bijgehouden in LAB 25-F 61 LOG CELKWEEK MET-FLVVT103 DIOXINE EN DIO-LIKE PCBS. 10.1.3 Klaarmaken plaat Wanneer de juiste celdensiteit (cfr. 10.1.4.) verkregen is, 200 µl per well aanbrengen. 10.1.4 Celtelling + bepaling juiste celdensiteit Na incubatie (10.1.2.) wordt het medium met een pasteurpipet verwijderd. Spoel met 10 ml PBS buffer en verwijder met pasteurpipet de PBS buffer. Voeg 1 ml trypsine aan cultuurfles toe. Schud even en maak de cellen los door met de handpalm tegen de fles te tikken. Breng dit over in een 50 ml buis waarin 5 ml medium RPMI aanwezig is. Spoel de cultuurfles met 5 ml PBS buffer en breng dit in dezelfde 50 ml buis. Centrifugeer bij 2000 rpm/5’ Verwijder het supernatans en suspendeer de pellet met 2 ml medium. Voeg 22 ml medium toe en homogeniseer. Met de hemacytometer worden de cellen in 4 kwadranten geteld en dit aantal wordt gedeeld door 4. –4 Dit geeft het aantal cellen per 10 ml. (x) LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 10/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 4 dus het aantal cellen/ml = (gemiddelde van 1 kwadrant) x 10 /ml x 1/verdunning voorbeeld : start 60 ml gemiddelde 1 kwadrant = 135 135/85 =1,59 1,59 x 60 ml = 95,4 ml 95, 4ml - 60 ml = 35,4 ml 4 De gewenste celdensiteit = 65-110 x 10 cellen/ml = Y 10.1.5 Invriezen van cellen voor bewaring Kies celcultuurflessen welke ongeveer 90 % confluent zijn. De cellen worden geoogst cfr. 10.1.2. Verdun of concentreer de cellen tot het dubbele (400.000 tot 1.200.00 cellen/ml) van de gewenste finale concentratie (200.000 tot 600.000 cellen/ml). Het bepalen van de celdensiteit gebeurd volgens de procedure beschreven in 10.1.4. 15 % DMSO wordt aan cultuurmedium toegevoegd. Het celcultuurmedium met 15 % DMSO wordt gesteriliseerd met behulp van een 0,22 µm spuitfilter en een steriele spuit. Het celcultuurmedium met 15 % DMSO en de celsuspensie worden gemengd in gelijke volumes (finaal 7,5 % DMSO). Cryovials worden gelabeld en gevuld met 1,6 ml van de celsuspensie met 7,5 % DMSO. Deze vials worden in een Nalgene cryo 1°C container met 250 ml isopropanol overnacht op -80± 15°C bewaard. Hierna worden de vials zo snel mogelijk in de voorziene houders in het vloeibare stikstof reservoir ondergedompeld. De levensvatbaarheid van de nieuwe cellen dient bepaald te worden. Hiervoor wordt 10.1.1 gevolgd. Indien na de handelingen beschreven in 10.1.1 de cellen niet levensvatbaar blijken, dient 10.1.5 herhaald te worden. 10.2 Extractie cfr. LAB 25-D 06 FLOWCHART MET-FLVVT-103 DIOXINE EN DIO-LIKE PCB'S 10.2.1 Dierenvoeders en grondstoffen; Vismeel; Mineralen Weeg 10 ± 0,1 g van het monster, 5 ± 0,1 g voor visvoer , af in een 250 ml Schottfles. Voeg 4 ml methanol en vervolgens 20 ml tolueen toe. Laat 1 uur schudden op 250 rpm op een schudtoestel. Breng de inhoud van de fles over in een 250 ml scheitrechter met glaswol plug. Laat de extractievloeistof in een 50 ml centrifugetube lopen. Voeg vervolgens 10 ml hexaan aan de scheitrechter toe en schud even. Vang op in een 50 ml centrifugetube. Herhaal deze laatste stap nog 2 maal. Laat de scheitrechter leeglopen in de centrifugetube en damp droog. 10.2.2 Eieren; Kaas Meng 6 dooiers, 50 ± 10 g voor kaas, 2 delen NaSO4 en 2 delen celite tot homogeen. Breng ongeveer ¼ hiervan in een 250 ml scheitrechter met glaswol plug en voeg 30 ml hexaan en30 LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 11/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) ml aceton toe, schudt hevig gedurende ongeveer 2 minuten. Laat de extractievloeistof in een 50 ml centrifugetube lopen. Voeg vervolgens 10 ml hexaan aan de scheitrechter toe en schud even. Herhaal deze laatste stap nog 2 maal. Damp droog in een stikstofindamper N EVAP 111. Weeg 4 g vet af. 10.2.3 Melk en zuivelproducten, uitgezonderd kaas Breng 100 ml (± 5 ml) melk en andere zuivelproducten met 240 ml aceton en enkele druppels azijnzuur in een 500 ml scheitrechter. schudden – 5 min wachten. Voeg vervolgens 40 ml hexaan toe, schudden – 5 min wachten. Vang de waterige fase op in Schottfles. Vang de organische fase op in 50 ml centrifugetube en droog deze met behulp van een vacuümcentrifuge. Giet de waterige fase terug in de scheitrechter en herhaal de procedure. Weeg 2,0 +/- 0,1 g vet af. 10.2.4 Vlees Het staal wordt gehomogeniseerd m.b.v. een mixer. Breng het staal in een bekerglas en zet op een kookplaat. Giet het gesmolten vet in een centrifugetube en voeg 0,5 deel NaSO 4 toe meng even en centrifugeer. Weeg 4 g vet af. 10.2.5 Vis Weeg 4 g ± 0,1 g van het monster af in een 50 ml centrifugetube. Voeg 5 ml CHCl3 en 10 ml MeOH 1:2 (v/v) toe en vortex. Voeg vervolgens 5 ml CHCl3 toe en vortex. Voeg vervolgens 5 ml milliQ water toe en vortex. De onderste fase wordt met behulp van een pasteurpipet overgebracht in een 50 ml centrifugetube en vervolgens gedroogd in een stikstofindamper N EVAP 111. 10.2.6 Schapenlever Weeg 10 g ± 0,1 g van het monster af in een 50 ml centrifugetube. Voeg 10 ml CHCl3 en 20 ml MeOH 1:2 (v/v) toe en vortex. Voeg vervolgens 10 ml CHCl 3 toe en vortex. Voeg vervolgens 10 ml milliQ water toe en vortex. De onderste fase wordt met behulp van een pasteurpipet overgebracht in een 50 ml centrifugetube en vervolgens gedroogd in een stikstofindamper N EVAP 111. 10.2.7 Lever en mager vlees Weeg 50 g ± 0,1 g van het monster af in een 250 ml fles. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 12/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) Voeg 40 ml CHCl3 en 80 ml MeOH 1:2 (v/v) toe en vortex. Voeg vervolgens 40 ml CHCl 3 toe en vortex. Voeg vervolgens 40 ml milliQ water toe en vortex. De onderste fase wordt met behulp van een pasteurpipet overgebracht in een 50 ml centrifugetube en vervolgens gedroogd in een stikstofindamper N EVAP 111. 10.2.8 Dierlijke en plantaardige vetten/olie (behalve visolie) Weeg 4 g ± 0,1 g van het monster af in een 50 ml centrifugetube. Na2SO4 toevoegen en laten uitzakken 10.2.9 Visolie Weeg 1 g ± 0,1 g van het monster af in een 50 ml centrifugetube. 10.3 Opzuivering 10.3.1 Voorbereiding silicagel Verwarm 134 +/- 1 g silicagel gedurende 48 4 uur bij een temperatuur > 150°C Breng 134 g silicagel in een Schott-fles Voeg in een zuurkast zeer voorzichtig 66 g geconcentreerd zwavelzuur toe, teneinde een 33 % zure silica te bekomen. Meng totdat de klonters verdwenen zijn Sluit na elk gebruik de flessen goed af Deze hoeveelheden kunnen in dezelfde verhouding aangepast worden Houdbaarheid : 1 maand op kamertemperatuur 10.3.2 Chromatografische opzuivering Silicagelkolom - Vul de 14 mm kolom achtereenvolgens met : - Glaswol plug 1,5 g natriumsulfaat (1,6 cc) 20 g zure silicagel (33 %) (4,3 cc x 5) 1.5 g natriumsulfaat (1,6 cc) (x 3 voor vis) spoelen met 50 ml n-hexaan Vermelde hoeveelheden laten toe maximaal 2 gram vet op te zuiveren. Voor de matrices waarbij 4 g vet afgewogen wordt wordt er een slurry gemaakt in een 50 ml tube. Er wordt dan 20 g (5 x 4.3 cc) zure silicagel (33%) aan het vet in een 50 ml tube toegevoegd en 20 ml hexaan en vervolgens wordt deze tube LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 13/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) gevortexd. De bovenstaande vloeistof wordt op de silicakolom gebracht. Deze 50 ml tube wordt 5 x met 10 ml hexaan gespoeld wat eveneens op de silicakolom aangebracht wordt. Actieve koolkolom - Vul de 8 mm kolommen achtereenvolgens met - Glaswol plug - - 0,5 g natriumsulfaat (0,5 cc) 1.2 g 1 % X-CARB (1 cc) 0,5 g natriumsulfaat (0,5 cc) Pre-elueer achtereenvolgens met : 5 ml aceton 20 ml tolueen 10 ml hexaan Tik tijdens het vullen regelmatig tegen de glaswand teneinde de aanwezigheid van luchtbellen te vermijden Plaats de silicagelkolom boven de actieve koolkolom. Voeg 5 ml n-hexaan toe aan de tubes welke de ingedampte extracten of het afgewogen vet/olie bevatten, vortex deze en breng ze vervolgens op de silicagelkolom. Voeg vervolgens 2.5 ml n-hexaan aan de tubes, vortex en breng dit eveneens aan op de silicagelkolom. Herhaal deze laatste stap. Spoel de kolom na met 5 x 10 ml hexaan. Dierlijke en plantaardige vetten/olie, ei: Weeg 4 g vet af in een glazen 50 ml centrifugebuis en voeg 5 scheppen 4,3 cc silica en 20 ml hexaan toe, vortex, laat ongeveer 10 minuten staan en giet het hexaan over een klaargemaakte silicakolom. Voeg opnieuw 10 ml C 6 toe, vortex en laat staan tot de kolom is doorgelopen, giet dan de hexaan opnieuw over de kolom, herhaal deze stap 4 keer. Nadat alle extractievloeistof doorgelopen is wordt de actieve koolkolom geëlueerd met 10 ml hexaan en vervolgens met 10 ml aceton/hexaan mengsel(10/90). Daarna wordt geëlueerd met 15 ml (10/10/80) ethylacetaat/tolueen/hexaan (V/V/V) mengsel. Vang deze (PCB) fractie op in een 50 ml centrifuge buis. Elueer vervolgens met 10 ml tolueen. Vang deze (dioxine) fractie op in een glazen 50 ml centrifugebuis. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 14/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 10.4 Behandeling opgezuiverde extracten 1) Staalnr noteren op tube en plaatsen volgens onderstaande template. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 po st3 st7 st11 verif ol st4 st8 st12 verif st1 st5 st9 st13 dmso st2 st6 st10 st14 dmso P0 = blanco monster cfr 8.2.2.1 Ol = recovery monster cfr 8.2.2.2 - Rekjes afdekken met aluminiumfolie (dio of PCB + begin en eind staalnummer noteren) - Aan iedere tube (staal, PO , OL en DMSO) 4µl DMSO toevoegen - Standaarden en verif vortexen voor gebruik - Standaardcurve 4µl toevoegen van de standaardoplossing 1-10 - Handschoenen wisselen na standaard curve - Verificatie 4µl toevoegen 2) Doseren - Laminaire flow en handen ontsmetten - Medium afgieten - 400 µl medium per tube toevoegen vortexen 188µl overbrengen op plaat met gegroeide cellen ( in duplo) volgens onderstaande template 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 po po st3 st3 st7 st7 st11 st11 verifi verif ol ol st4 st4 st8 st8 st12 st12 verif st1 st1 st5 st5 st9 st9 st13 st13 dmso dmso st2 st2 st6 st6 st10 st10 st14 st14 dmso dmso verif Verif= verificatie oplossing cfr 8.2.2.3. - Buitenste wells opvullen met 200 µl medium - Dio en PCB noteren op plaat samen met begin en einde staalnummer LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 15/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) - 1 nacht incuberen op 5% CO2 en temperatuur 37 3°C. 10.5 Lezen luminometer Luminometer aanzetten (±40 minuten op voorhand) Lysis en luciferase uit de diepvries halen Medium op plaat afgieten Wells spoelen met 75 µl buffer (voorzichtig) en platen lichtjes zwenken Buffer afgieten Platen bekijken onder microscoop; kijken of de cellen goed gegroeid zijn en niet los gekomen tijdens het spoelen met buffer Sticker plakken op de onderkant van de plaat 30 µl lysis toevoegen aan de wells en de eerste plaat op de schudder zetten, de andere platen in de ijskast bewaren Luminometer voorspoelen met luciferase (altijd eerst checken of de opvangplaat in het toestel zit!): Injectors → Priming → Pre-Position Inj.(1) aanvinken → Prime → vraagt nog eens of de opvangplaat er in zit → Yes Plaat zonder deksel met afgevlakte hoek rechtsboven in toestel plaatsen Starten met aflezen van de plaat: Programma ‘Simplicity 2.1’ openen → Raw Data selecteren → Protocol → Run and start Excel-file (template) openen: DIO: template DIO dPCB: template PCB126 Opslaan als… nieuwe map aanmaken: maand-dag, vb. 03-21 excel-file: maand-dag, deel x, dio of pcb vb. 03-21 deel A dio In Report staalnummer volledig invullen, wat en hoeveel vet (indien afwijkende hoeveelheid tov 10.2 vermelde hoeveelheden), verdunningsfactoren aanpassen De resultaten kopiëren vanuit de excel-file ‘test run’ naar Raw Data in het document van dezelfde plaat: linker muisknop → Paste special → Values → Ok Calculation → Tools → Solver → Solve LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 16/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) Naar Report Regelmatig wijzigingen opslaan Als alle platen afgelezen zijn, de map met de excel-files opslaan op de memorystick 10.6 Resultaatverwerking De map met excel-files kopiëren van de memorystick naar de M-schijf: M-schijf → Documenten → Dioxines → Dio ruwe data → jaar De excel-files openen De lijst ‘koppeling normen’ openen: M- schijf → Documenten → Dioxines → Dio ruwe data → koppeling normen Opslaan als… calux_datum vb. calux_21032011 Uitvoerder, controle, QC en datum invullen Staalnummers, staalinformatie en resultaten kopiëren en plakken in de lijst kopiëren → linker muisknop → Plakken speciaal → Waarden Matrix, fractie en bevestiging selecteren: Niet-conform: 1 Lijst opslaan als tekst-document: tekst (tab is scheidingsteken) De resultatenlijst uitprinten Positieve stalen BuitenSpec aanvinken en meldingsplicht aanduiden in Unilab: Infokaart → BuitenSpec; ondertussen Monsternummer controleur en PCE Controleur noteren Resultaten → Meldingsplicht → YES (Dio en/of dl-PCB’s); nagaan of de analyse van PCB’s nog moet gedaan worden, zo ja dan moet het positieve staal eerst naar die afdeling vóór dat het opgestuurd wordt De lijst in tekst-document verslepen naar Uniconnect (C-schijf). De resultaten worden automatisch ingegeven. Ze moeten enkel nog aanvaard worden. Unilab → Resultaat ingeven → Aanvaarden (F4) → Lijst vernieuwen (F5) Lijst niet-conforme monsters aanvullen: M-schijf → Documenten → Algemeen → Niet-conforme monsters → Niet-conform De analyseaanvraag opstellen: M-schijf → Documenten → QAM → Kwaliteitssysteem → Formulieren → LAB 25-F 11 Analyseaanvraag dioxines -Demande d'analyse dioxines (FAVV monsters) → Screening → invullen labonummer, inspectienummer, matrix en PCE LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 17/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) Analyseaanvraag opslaan Opslaan als → maand-dag-jaar (vb. 03-21-2011) → Documenten → Dioxines → Doorgestuurd → jaar → Opslaan De analyseaanvraag wordt samen met de niet-conforme stalen naar de monsterbereiders gebracht om op te sturen naar SGS of CART 11 Kwaliteitscontrole Bij iedere set analysen wordt het volgende meetprogramma toegepast : ste 11.1 1 - standaard ………………… …… 2 x - blanco DMSO……………… …..2 x - procedure blanco ……………….1 x - Olie gespiked op 10 pg/ml..........1 x - monster (n = maximaal 14) (cfr 8.4.2) – lijnscontrole Bij iedere reeks stalen worden volgende controles meegenomen: Een aangerijkte olie waarvan de terugvinding tussen 30–130% moet bedragen. Een blanco olie welke <0.40 pg BEQ/well moet zijn. Een verificatie-oplossing van 1.5 pg TEQ/well waarvoor de afwijking <25% dient te zijn – namelijk tussen 1.12 en 1.90 pg BEQ/well. Indien slechts één van de criteria niet voldoet wordt de plaat aanvaard. Indien meer dan één criterium niet voldoet wordt de plaat afgekeurd. Als de recovery niet voldoet, maar de andere criteria wel voldoen, wordt de berekening van de resultaten gedaan met het gemiddelde uit de controlekaarten. Indien een monster een respons geeft welke 30 % RLU (relative light units) onder die van e DMSO is, dan wordt het opnieuw geanalyseerd. Indien bij de 2 analyse de respons nog steeds meer dan 30 % onder de respons van DMSO is, wordt het monster doorgestuurd voor bevestigingsanalyse. 11.2 Feedback Ter verificatie wordt 2% van de geanalyseerde monsters bevestigd met GC/MS. 11.3 Bevestiging Alle monsters met een gehalte boven de actielimiet, dienen bevestigd te worden met GC-MS. Voor de geldende actielimieten zie rekenblad ‘koppeling normen. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 18/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 11.4 Werkgebied Zie rekenblad ‘koppeling normen 2014’ en punt 2 Toepassingsgebied 12 Berekening en rapportering 12.1 Berekening BEQ bepaling : Least squares – Best fit De Least Squares – Best Fit wordt gebruikt om de beste fit van de data te voorspellen op basis van de Hill vergelijking met 4 variabelen met het natuurlijk logaritme van de concentratie van 2,3,7,8,-TCDD in femtogram per tube uitgezet t.o.v. de RLU. ( RLU b) x k n Model: ( ) (v RLU b) Met : 1 n Ln (TCDD) Ln (TCDD) : het natuurlijk logaritme van de TCDD concentraties RLU : respons (Relative Light Units) v : de limiterende waarde van de RLU stijging van de TCDD concentratie k : dosis welke een respons van ½ van het maximum geeft n : parameter die de sigmoïdale vorm van de curve bepaalt b : intercept Uit de calibratiekurve wordt de corresponderende BEQ waarde afgeleid, rekening houdend met de verdunning. Dioxine en Dioxine-like verbindingen (PCDD’s en PCDF’s) en dl-PCB: A x F X R = concentratie in ng BEQ/kg of pg BEQ/g Waarbij : A = respons van het monster in pg BEQ/well F = verdunningsfactor R = recoveryfactor G = gewicht staal LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 19/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) F ng BEQ/kg product ng BEQ/kg product pg BEQ/g vers gewicht pg BEQ/g vet pg BEQ/g vet pg BEQ/g vet pg BEQ/g vet pg BEQ/g vers gewicht pg BEQ/g vet pg BEQ/g vers gewicht pg BEQ/g vers gewicht pg BEQ/g vers gewicht Product (diervoeder, mineralen, vismeel) G 1/5 visvoer vis V1 g (visolie) v4 g (dieren) plantaardige olie melk/zuivel melk/zuivel mager Ei Lever Schapenlever Mager vlees 10 2/5 1/2 2 1/2 1/2 1 5 4 1 4 4 2 2/100 1/2 2/50 1/5 2/50 100 4 50 10 50 12.2 Rapportering Zie rekenblad koppeling normen versie 3 eenheid Product (diervoeder, mineralen, vismeel) vis ng BEQ/kg product OR DIO 0,25 BR DIO 1,80 OR PCB 0,25 BR PCB 2,40 pg BEQ/g vers gewicht 1,00 9,30 2,00 18,60 V1 g (visolie) v4 g (dieren) pl. olie melk/zuivel ei lever pg BEQ/g vet pg BEQ/g vet pg BEQ/g vet pg BEQ/g vet pg BEQ/g vet pg BEQ/g vers gewicht 1,00 0,50 0,25 1,00 0,50 0,05 8,90 4,80 1,80 8,90 4,80 0,60 2,00 0,25 0,25 1,00 0,50 0,05 18,60 6,00 2,40 11,60 11,60 0,60 schapenlever Mager vlees/melk/zuivel pg BEQ/g vers gewicht pg BEQ/g vers gewicht 0,40 0,05 2,50 0,60 0,40 0,05 2,50 0,60 OR Onderste rapporteringsgrens; BR Bovenste rapporteringrens Resultaten onder de OR worden als < gerapporteerd Resultaten boven de BR worden als > gerapporteerd Indien gehaltes gevonden worden boven de AL dienen de instructies beschreven in LAB 25-I 21 MELDINGSPLICHT gevolgd te worden. LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 20/21 DIOXINES EN DIOXINE-LIKE PCB’S (BIOASSAY) 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-I 21 MELDINGSPLICHT LAB 25-F 61 LOG CELKWEEK MET-FLVVT-103 DIOXINE EN DIO-LIKE PCBS LAB 25-F 11 ANALYSEAANVRAAG DIOXINES -DEMANDE D'ANALYSE DIOXINES (FAVV MONSTERS) LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25-D 06 W ERKWIJZE EXTRACTIE EN OPZUIVERING I-MET-FLVVT-103 LAB 25 I-MET-FLVVT-103 – PCDD's en PCDF's; non ortho en mono-ortho PCB's (Bioassay) v.06 21/21
© Copyright 2024 ExpyDoc
