Screeningsmethoden voor de bepaling van dierlijke eiwitten

Screeningsmethoden voor de bepaling
van dierlijke eiwitten
J. Vancutsem (FLVVT), L.W.D. van Raamsdonk (RIKILT), M.G.E.G. Bremer (RIKILT) en M. Evrard (LFSAL)
In 2013 werd de reïntroductie van verwerkte dierlijke eiwitten (VDE) van niet-herkauwers in voeders voor aquacultuurdieren mogelijk via EU-Verordening 56/2013 die op 1 juni van dat jaar van toepassing werd. Eveneens in 2013
is DNA identificatie (PCR) als officiële controlemethode ingevoerd (EU-Verordening 51/2013). Hiermee kan precies
de herkomst van de VDE worden vastgesteld (herkauwer tegenover andere diersoorten), echter zonder onderscheid naar weefsel. Dit laatste betekent dat toegestane ingrediënten zoals melk ook worden gevonden. Het is
daarom in voorkomende gevallen belangrijk om soort én type te kunnen aantonen.
Daarom is naast de officiële analysemethoden ook de mogelijkheid voor de detectie van VDE van herkauwers met
behulp van een ELISA-kit (Bremer et al., 2013; van Raamsdonk et al., 2012) en een lateral flow device (LFD) (van
Raamsdonk et al., 2012) geëvalueerd. Beide testen zijn gebaseerd op het aantonen van de herkauwervariant van
troponine I, een spiereiwit. Voor deze evaluatie is gebruik gemaakt van een risico-analyse van EFSA, die aangeeft
dat bij een contaminatie van 2% VDE van herkauwers in VDE van niet-herkauwers geen onaanvaardbaar risico optreedt (EFSA, 2011). Dit is met andere woorden een controle op de geschiktheid voor gebruik van de grondstoffen
als voer voor aquacultuurdieren.
MELISA-TEKTM ruminant kit
Voor de ELISA werd gebruik gemaakt van de MELISA-TEKTM ruminant kit. Dit is een sandwich immunoassay voor
de detectie van het thermisch stabiel herkauwer-specifiek spiereiwit troponine-I. Deze kit werd gebruikt in combinatie met de MELISA-TEK High Sensitivity Sample Extraction kit om het troponine-I te concentreren.
Hieronder is schematisch het extractieprotocol weergegeven:
- 5 g afwegen en 50 ml extractieoplossing toevoegen;
- 30 minuten incuberen;
- 15 minuten verwarmen bij 95-100°C;
- 8 ml van de bovenstaande vloeistof centrifugeren bij 10.000 g gedurende 10 minuten;
- 4 ml supernatans centrifugeren bij 7000 g in een proteïneconcentrator gedurende 30 minuten.
De monsters, met bijhorende controles, worden in duplo geanalyseerd en het resultaat werd afgelezen met
behulp van een plaatlezer bij 450 nm.
De gebruikte performantiecriteria zijn:
- specificiteit: het aandeel correct-positieve resultaten, als percentage
- sensitiviteit: het aandeel correct-negatieve resultaten, als percentage
Het optimaal resultaat is een score van 100%.
Als VDE van herkauwers werd materiaal van runderen en schapen gebruikt dat verwerkt was bij verschillende
temperaturen (tussen 133 en 145°C). Voor de interne validatie (Bremer et al., 2013) werden hiermee mengsels
bereid die tussen 0,1% en 2% VDE van herkauwers bevatten. Er werden 72 VDE van niet-herkauwers gebruikt,
waaronder varken, pluimvee, bloedplasma, vismeel en melkpoeder, om de specificiteit te toetsen. De resultaten
van de interne validatie waren goed (zie tabel 1).
14
Op basis van de resultaten van de interne validatie werd een interlaboratoriumstudie georganiseerd
(van Raamsdonk et al., 2012) waar het LFSAL aan deelnam. Na een eerste ronde met testmonsters (zie figuur 1)
werd de eigenlijke interlaboratoriumstudie georganiseerd. In deze studie werden 21 verschillende monsters
geanalyseerd bestaande uit 6 verschillende VDE van niet-herkauwers, VDE
van herkauwers bereid bij twee verschillende temperaturen (133°C en 137°C) en twee gehalten (1% en 2%).
Deze werden in tweevoud geëxtraheerd en in tweevoud uitgeplaat.
Figuur 1 (links): MELISA-TEK ELISA-plaat met testmonsters
Figuur 2 (rechts): Reveal test strips - Indien twee lijnen zichtbaar zijn is de test positief
Tabel1: In onderstaande tabel zijn de belangrijkste resultaten van de MELISA-TEK test samengevat
Interne validatie
Interlaboratoriumstudie
Verwerkingstemperatuur VDE
133°C-145°C
133°C en 137°C
133°C en 137°C
Specificiteit
99%
99%
99%
0,5% VDE
Sensitiviteit
100%
1,0% VDE
92%
100%
100%
2,0% VDE
100%
100%
100%
De test werkt dus heel goed op de geteste niveaus. De lagere sensitiviteit van 92% bij de gehele reeks van vier
temperaturen werd vooral veroorzaakt door een lagere gevoeligheid op de hoogste temperaturen.
Reveal for Ruminant in feed
Naast de MELISA-TEK werd in dezelfde studie een LFD geëvalueerd: Reveal for Ruminant in feed. Hieronder is
schematisch het extractieprotocol weergegeven:
- 10 g afwegen, extractie-additief toevoegen en 100 ml extractieoplossing toevoegen;
- 10 minuten verwarmen in kokend water;
- 0,5 ml extract overbrengen in een microcentrifugetube;
- de strip toevoegen en het resultaat aflezen na 15 minuten (zie figuur 2).
15
Tabel 2: In onderstaande tabel zijn de resultaten samengevat van de “Reveal for Ruminant in feed” test:
Specificiteit
Sensitiviteit
97%
0,5% VDE
99%
1% VDE
99%
2% VDE
100%
Ook bij de Reveal test werden goede resultaten bereikt.
Conclusie:
Immunoassays voor de detectie van VDE voor herkauwers, MELISA-TEK en Reveal, zijn gevalideerd op 0,5% en
hoger voor de detectie van VDE van herkauwers in een matrix van VDE van niet-herkauwers. Uitgaande van een
gewenste limiet van 2% aanwezigheid van VDE van herkauwers in niet-herkauwermateriaal, kan besloten worden
dat de methodes geschikt zijn voor het monitoren van VDE van niet-herkauwers bestemd voor voer voor aquacultuurdieren. Een voordeel van de MELISA-TEK Ruminant assay tegenover de PCR-methode is dat deze geen signaal
geeft voor toegelaten melkpoeder, terwijl PCR wel een positief signaal geeft. Hiertegenover staat dat het moeilijker is om VDE’s van herkauwers op te sporen bij een hoog aandeel beenderen en daarmee een laag aandeel
spiervezels.
Literatuur
-
Bremer, M.G.E.G., R.J.C.F. Margry, J.C.H. Vaessen, A.M.H. van Doremalen, J.G.P. van der Palen, R.G.C. Van Kaathoven, A.E.M. Kemmers-Vonken, L.W.D. van Raamsdonk (2013). Evaluation of a commercial ELISA for Detection of
Ruminant processed animal proteins in non-Ruminant processed animal proteins. J. AOAC. Intl. 96: 552-559.
-
European Food Safety Authority (2011). The EFSA journal 9, p. 1947
-
EU-Verordening N° 51/2013 (2013). Off J. Eur. Commun. L20, 33-43
-
EU-Verordening N° 56/2013 (2013). Off J. Eur. Commun. L21, 3-16
-
van Raamsdonk, L.W.D., R.J.C.F. Margry, R.G.C. van Kaathoven, M.G.E.G. Bremer (2012). Detection of animal
proteins in aqua feed. An inter-laboratory study of two immunochemical methods for detection of ruminant
PAPs in non-ruminant PAPs intended as ingredient in aquafeed. Report 2012.014, RIKILT, Wageningen, pp. 78.
-
van Raamsdonk, L.W.D., R.J.C.F. Margry, R.G.C. van Kaathoven, M.G.E.G. Bremer (2012). Detection of animal
proteins in aqua feed. An inter-laboratory study of two immunochemical methods for detection of ruminant
PAPs in non-ruminant PAPs intended as ingredient in aquafeed. Report 2012.014, RIKILT, Wageningen, pp. 78.
[email protected]
16

Download Report