English summary

English summary
Acidic lambic beers are the products of a spontaneous fermentation process that lasts
for one to three years. The fermentation process is not initiated through the inoculation
of yeasts or bacteria as starter cultures. Rather, microbial growth starts during the
overnight cooling of the cooked wort in a shallow open vessel, called the cooling tun or
coolship. Lambic beers are traditionally brewed in or near the Senne river valley, an area
near Brussels, Belgium. However, also breweries outside the Senne river valley, i.e., in
West-Flanders, have introduced the lambic beer brewing process. Brewing for the
production of lambic beer traditionally takes place only during the colder months of the
year (October to March), since cold nights are needed to lower the wort temperature to
about 20°C in one night. The morning following the wort cooking, the cooled wort is
assumed to be inoculated with a specific air microbiota of the Senne river valley and is
transferred into wooden casks, which are stored at cellar or ambient temperatures, i.e.,
typically between 15 and 25°C. Subsequently, the wort ferments and the lambic beer
matures in thesame casks. The end-product is a noncarbonated sour beer. The sour
character of the beer originates from the metabolic activities of various yeasts, lactic
acid bacteria (LAB), and acetic acid bacteria (AAB).
The present study mainly aimed to update the knowledge on the microbial diversity
during the lambic beer fermentation process. Two traditional lambic beer fermentation
batches were monitored over a period of two years, using cultivation and cultureindependent polymerase chain reaction – denaturing gradient gel electrophoresis (PCRDGGE) techniques. More than 2000 bacterial and yeast isolates from 14 samples per
batch were obtained and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight
(MALDI-TOF) mass spectrometry was used as a fast dereplication tool to decrease this
high number of isolates to a non-redundant set of different strains. Three fermentation
phases were identified during the traditional lambic beer fermentation process: an
Enterobacteriaceae phase, which started from the cooling of the wort in the cooling tun
onwards and lasted for one month. Several Enterobacteriaceae species were isolated,
among which Hafnia paralvei was the most isolated species at the end of this phase in
both batches. After one month, the main fermentation or alcoholic fermentation phase
started and was characterized by an increase in number of Saccharomyces cerevisiae and
Saccharomyces pastorianus yeasts. The latter species was the most isolated yeast species
at the end of the main fermentation phase after 3 months. In contrast to previous
studies, the present investigations were unable to distinguish an acidification and
maturation phase. Rather, the acidification phase appeared to be part of a long
maturation phase. During the maturation phase, which was initiated after six months,
Pediococcus damnosus was the only isolated LAB species. Dekkera bruxellensis was the
most predominant yeast species, although the dominance of this yeast species was
highly dependent of the place where the casks were located, and thus dependent of the
ambient temperature of the cask room. New AAB species, named Acetobacter lambici
and Gluconobacter cerevisiae, were isolated from lambic beer samples in the course of
the present study.
A second objective of the present study was to compare the lambic beer fermentation
process in an industrial brewery located outside the Senne river valley to the traditional
lambic beer fermentation process described above. Some technical aspects of the lambic
beer brewing process differed between the traditional and industrial breweries, which
may impact on the lambic beer fermentation process. The main difference was that the
industrial lambic beer brewery acidified the lambic beer wort to a pH of 4, using lactic
acid, at the end of the boiling process. The lambic beer wort was not inoculated after
overnight cooling in the cooling tun, but bacteria and yeasts could be isolated from the
wort as soon as it was transferred into the casks. No Enterobacteriaceae were isolated
from the industrial lambic beer nor was Enterobacteriaceae DNA detected using PCRDGGE analysis. This may have been caused by the addition of lactic acid. Hence, only two
fermentation phases were found during the industrial lambic beer fermentation process,
i.e., the main fermentation phase and the long maturation phase. The same species as in
the traditional lambic beer fermentation process were found, although more AAB were
isolated during the industrial lambic beer fermentation process. Lambic beer
fermentation has long been considered only to be possible in the Senne river valley,
since the air in this region is assumed to contain the microorganisms specific for gueuze
fermentation. However, microorganisms inoculating lambic beer wort could have other
sources than the brewery air. Since the wort in the cooling tun yielded no growth, and
because the cask samples were readily inoculated, the source of inoculation in the
industrial lambic beer brewery seems to be restricted to the cask wood.
Lambic beers are mostly used for the production of other beers, such as gueuze beers
and fruit lambic beers. Gueuze beers are the spontaneous bottle-refermented products
of the mixtures of lambic beers of different ages. These beers are commonly aged for
several years in the breweries or by the consumers. However, the microbial and
metabolite changes were not known and nor was it clear how long bottles should be
allowed to age before consumption. The third goal of this research aimed to determine
the microbial and metabolite changes in aged gueuze beers. The microbial profiles of the
beers simplified over the years. While several yeast species, including D. bruxellensis,
Dekkera anomala, Pichia membranifaciens and S. cerevisiae could be isolated from the
youngest gueuze beer sampled, only D. bruxellensis could be isolated from old gueuze
beers after an enrichment culture. Pediococcus damnosus could only be isolated from
beers that were aged for a maximum of three years. Aging of gueuze beers appeared to
be limited in time. No additional lactic acid was formed after 10 years and maltooligosaccharide concentrations were low in a nine-years old gueuze beer. Ethyl lactate
and ethyl decanoate were identified as potential positive and negative metabolite
markers for the aging process of gueuze beers, respectively.
In conclusion, the present study revealed that the lambic beer fermentation process
consists of three rather than four phases, when based on bacterial and yeast diversity.
Furthermore, the study showed that the microbiota present in both the traditional and
industrial lambic beer fermentation processes were comparable, with the exception of
an Enterobacteriaceae phase that was present in the former and absent in the latter. The
precise mode of microorganism inoculation in the traditional lambic beer fermentation
process was not elucidated and might therefore remain part of the mystery and tradition
of lambic beer.
Nederlandstalige samenvatting
Zure lambiekbieren zijn spontaan gefermenteerde bieren, waarvan de fermentatie één
tot drie jaar duurt. Het fermentatieproces start niet door de toevoeging van bacteriën of
gisten als starterculturen, maar de microbiële groei start reeds tijdens het overnacht
koelen van het wort in een ondiepe open kuip, het zogenaamde koelschip. Traditioneel
worden deze bieren geproduceerd in de omgeving van de Zennevallei, een regio rond
Brussel, België. Enkele brouwerijen in West-Vlaanderen, en dus buiten de Zennevallei
gelegen, passen hetzelfde productieproces toe voor de productie van lambiekbieren.
Lambiekbieren
worden
traditioneel
enkel
gebrouwen
tijdens
de
koudere
wintermaanden (van oktober tot maart), aangezien de koude nachten nodig zijn om het
wort overnacht te koelen tot ongeveer 20°C. Na het koelen wordt verondersteld dat het
wort geïnoculeerd is door de micro-organismen die specifiek in de lucht van de
Zennevallei aanwezig zijn. Hierna wordt het wort overgebracht in houten vaten, die
worden gestockeerd bij kelder- of kamertemperatuur, tussen 15 en 25°C. Vervolgens
fermenteert en rijpt het wort in deze vaten. Het eindproduct van dit proces is een nietkoolzuurhoudend zuur bier. De zure smaak van het bier komt voort uit de productie en
omzetting van metabolieten door verscheidene gisten, melkzuurbacteriën (MZB) en
azijnzuurbacteriën (AZB).
Deze studie had als voornaamste doelstelling om de kennis over de microbiologische
samenstelling van lambiekbieren tijdens het fermentatieproces op te frissen. Hierbij
werden twee lambiekbierbrouwsels gedurende twee jaar opgevolgd in een traditionele
lambiekbrouwerij. Hiervoor werden cultivatie en cultuuronafhankelijke polymerase
chain reaction – denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technieken
gebruikt. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF)
massaspectrometrie werd toegepast als snelle dereplicatietechniek om de meer dan
2000 bacteriële en gistisolaten te reduceren naar een lager aantal niet-redundante
isolaten. Drie fermentatiefasen werden onderscheiden tijdens het traditionele
lambiekbierfermentatieproces: een Enterobacteriaceae fase duurde ongeveer een maand
en startte vanaf het overnacht koelen van het wort in het koelschip. Verscheidene
Enterobacteriaceae species werden geïsoleerd, waaronder Hafnia paralvei het meest
geïsoleerde species was aan het einde van deze fase en dit voor beide brouwsels. Daarna
volgde de hoofdfermentatiefase (alcoholische fermentatiefase) die startte na één maand
en gekenmerkt was door een stijgend aantal Saccharomyces cerevisiae en Saccharomyces
pastorianus gisten. Isolaten van het laatstgenoemde species werden het meest
geïsoleerd aan het einde van de hoofdfermentatiefase (na drie maand). In tegenstelling
tot vorige studies was het niet mogelijk om een aparte verzurings- en rijpingsfase waar
te nemen. De verzuring leek eerder onderdeel te zijn van een lange rijpingsfase. Tijdens
de rijpingsfase (na 6 maand) was Pediococcus damnosus het enige aanwezige MZBspecies. Dekkera bruxellensis was het voornaamste gistspecies, alhoewel de dominantie
van dit gistspecies zeer afhankelijk was van de plaats waar de vaten gestockeerd
werden, en dus ook van de omgevingstemperatuur van deze vatenzalen. Nieuwe AZBspecies, namelijk Acetobacter lambici en Gluconobacter cerevisiae, werden geïsoleerd uit
lambiekbier tijdens deze diversiteitsstudies.
Een
tweede
doelstelling
van
dit
doctoraatsonderzoek
was
om
het
lambiekbierfermentatieproces in een industriële lambiekbrouwerij, gelegen buiten de
Zennevallei, te vergelijken met de hoger beschreven resultaten van een traditionele
lambiekbrouwerij. De productieprocessen in beide lambiekbrouwerijen vertoonden
verschillen in enkele technische aspecten, die een invloed hadden op het
lambiekbierfermentatieproces.
Het
grootste
verschil
in
de
industriële
lambiekbierbrouwerij was het aanzuren van het wort met melkzuur tot pH 4 aan het
einde van het kookproces. Hoewel het lambiekwort in het koelschip niet geïnoculeerd
werd na overnacht koelen, werden wel bacteriën en gisten geïsoleerd uit het wortstaal
uit het vat, direct nadat het wort hierin was overgebracht. Er werden geen
Enterobacteriaceae geïsoleerd uit het industrieel geproduceerde lambiekbier noch werd
DNA
afkomstig
van
Enterobacteriaceae
gedetecteerd
tijdens
de
PCR-DGGE-
experimenten. De afwezigheid van deze bacteriën kon veroorzaakt zijn door het
aanzuren van het wort. Bijgevolg werden slechts twee fermentatiefasen waargenomen
in het industriële lambiekbierfermentatieproces, namelijk de hoofdfermentatiefase en
een
lange
rijpingsfase.
Dezelfde
species
als
in
het
traditionele
lambiekbierfermentatieproces werden gevonden, hoewel meer verschillende AZBspecies werden geïsoleerd tijdens het industriële lambiekbierfermentatieproces.
Lambiekbierfermentatie is lange tijd enkel mogelijk geacht in de omgeving van de
Zennevallei, aangezien hier de nodige micro-organismen in de lucht aanwezig zijn.
Micro-organismen aanwezig tijdens het lambiekbierfermentatieproces kunnen echter
nog afkomstig zijn van andere bronnen, naast de omgevingslucht. Vermits het wort van
de industriële brouwerij niet geïnoculeerd werd in het koelschip, maar wel isolaten
bekomen werden direct nadat het wort in het vat was overgebracht, lijkt het hout van
het vat bijgevolg de enige mogelijke bron van micro-organismen voor de inoculatie van
het wort in het industriële lambiekbierfermentatieproces te zijn.
Lambiekbieren worden meestal gebruikt voor de productie van andere bieren, zoals
geuzebieren en fruit-lambiekbieren. Geuzebieren worden verkregen door de spontane
hergisting op fles van een mengsel van jonge en oude lambiek. Deze bieren worden
veelal bewaard om te rijpen, zowel door de brouwerijen als door de consumenten.
Zowel de veranderingen in microbiologische samenstelling als in de aanwezige
metabolieten werden nog niet in detail bestudeerd. Meer nog, er was geen exacte
informatie beschikbaar over hoelang deze bieren het best rijpen. Om deze reden werden
in een derde doelstelling de veranderingen in gerijpte geuzebieren onderzocht, zowel op
het vlak van microbiologische eigenschappen als op het vlak van aanwezige
metabolieten. De microbiologische samenstelling van deze bieren vereenvoudigde
naarmate de gueuzebieren langer werden gestockeerd. Verscheidene species, namelijk
D. bruxellensis, Dekkera anomala, Pichia membranifaciens en S. cerevisiae, werden direct
geïsoleerd uit het jongste geteste geuzebier. Uit oudere geuzebieren werd enkel D.
bruxellensis geïsoleerd na een aanrijkingsstap. Isolaten van P. damnosus werden enkel
bekomen uit geuzebieren van maximum drie jaar oud. De rijping van de bieren leek ook
beperkt in de tijd. Er werd geen additioneel melkzuur aangemaakt na tien jaar rijping en
de malto-oligosaccharideconcentraties waren reeds laag in een negenjarig geuzebier. Er
werd aangetoond dat ethyllactaat en ethyldecanoaat kunnen worden gebruikt als een
potentiële respectievelijk positieve en negatieve metabolietmerker voor de rijping van
geuzebieren.
De huidige studie heeft aangetoond dat, gebaseerd op de bacteriële en gistdiversiteit,
een traditioneel lambiekbierfermentatieproces uit drie fasen bestaat, in plaats van de
eerder gerapporteerde vier fasen. Verder heeft deze studie aangetoond dat de
microbiële
samenstelling
van
zowel
traditionele
als
industriële
lambiekbierfermentatieprocessen gelijkaardig zijn, met uitzondering van de afwezigheid
van een Enterobacteriaceae fase in het industriële lambiekbierfermentatieproces. De
precieze herkomst van de micro-organismen die verantwoordelijk zijn voor de
inoculatie van het lambiekwort werden niet ontrafeld, waardoor dit bijgevolg een deel
blijft van het mysterie en de traditie van de productie van lambiekbieren.

Download Report