Synthetic Biology of Cyanobacterial Cell Factories S.A. Angermayr

Synthetic Biology of Cyanobacterial Cell Factories
S.A. Angermayr
Synthetic biology of cyanobacterial cell factories
S. Andreas Angermayr
Copyright © 2014 S. Andreas Angermayr
Samenvatting
Cyanobacteriën, prokaryote organismen die oxygene fotosynthese uit kunnen voeren,
vormen een belangrijk phylum binnen het Domein van de Bacteria. In het evolutionaire
proces van het ontstaan van leven op aarde hebben zij de elementaire bouwstenen
aangeleverd waardoor nu ook algen en planten dit proces kunnen uitvoeren. Gedurende de
afgelopen paar jaar heeft de toepassing van ‘metabole engineering’ en synthetische biologie
in deze organismen een grote vlucht genomen, met als doel het toepassen van hun vermogen
om lichtenergie om te zetten in biomoleculen. Echter, niet alleen de moderne microbiële
biotechnologie, maar ook het fundamentele onderzoek in de levenswetenschappen, heeft veel
profijt van de doorbraken op het gebied van de ‘genetische engineering’ en de synthetische
biologie. Dankzij toepassing van deze methoden is ook ons inzicht in de moleculaire werking
van de essentiële levensprocessen (i.e. adaptatie, reproductie en evolutie) sterk toegenomen.
Het primaire doel van het werk gepresenteerd in dit proefschrift is om te leren
begrijpen hoe de metabole omzettingen die uitgevoerd worden door cyanobacteriën benut
kunnen worden voor de synthese van nuttige (koolstof-bevattende) verbindingen. Dit doel
wordt nagestreefd door het eindproduct van een belangrijke metabole flux van zo’n
organismen te koppelen aan een soort-vreemde metabole route, die dat intermediair van de
cyanobacterie om kan zetten in een gewenst product. Hiermee wordt de energie uit zonlicht
uiteindelijk vastgelegd in de chemische bindingen van het gevormde product. Essentieel voor
het slagen van deze aanpak is het optimaliseren van de (eventueel kunstmatig samengestelde)
syntheseroutes voor productvorming, die langs genetische weg in een cyanobacterie worden
ingebracht. En omgekeerd levert het verder karakteriseren van deze metabole routes weer een
bijdrage aan de ontwikkeling van nieuwe inzichten en hulpmiddelen (zoals bijvoorbeeld
genetische expressiesystemen) voor de synthetische biologie van o.a. cyanobacteriën.
Uiteindelijk wordt het langs deze weg misschien zelfs mogelijk om volledig nieuwe
cyanobacteriën, die geoptimaliseerd zijn voor dit soort toepassingen, te ontwerpen.
Hoofdstuk 1 van dit proefschrift stipt kort een aantal hoogtepunten uit de
geschiedenis van de microbiële biotechnologie aan, waaruit duidelijk wordt dat de mensheid
al heel lang micro-organismen - inclusief cyanobacteriën - toepast om diverse producten te
kunnen maken. Met het beschikbaar komen van ‘recombinant DNA technologie’ werd het
mogelijk dit scala van producten sterk uit te breiden. Het is ook dankzij de recombinant DNA
technologie dat we tegenwoordig in staat zijn om biologische functionaliteiten, die uit heel
verschillende organismen afkomstig kunnen zijn, in één en hetzelfde organisme te
combineren. Hierdoor kunnen we fototrofe cyanobacteriën gebruiken als gastheer om met
behulp van fermentatieroutes uit chemotrofe organismen, via ‘directe conversie’, koolstofbevattende energiedragers te laten synthetiseren. Het gebruik van CO2 maakt het op deze
manier mogelijk om ‘koolstof-neutrale’ biobrandstoffen te maken.
In hoofdstuk 2 wordt beschreven hoe Synechocystis genetisch aangepast kan worden,
via het inbrengen van een gen coderend voor L-melkzuur dehydrogenase (L-LDH) uit de
bodembacterie Bacillus subtilis, om het organisme L-melkzuur te laten produceren. Melkzuur
wordt traditioneel gewonnen met behulp van melkzuurbacteriën uit (melk)suiker. Het kan
gebruikt worden in een groot aantal toepassingen, waaronder de productie van bioplastics, als
conserveringsmiddel en in de farmaceutische industrie. Verdere optimalisatie van de
melkzuurproductie kan bereikt worden door een beter gebruik van de redox-equivalenten die
door de oxygene fotosynthese beschikbaar komen in de vorm van NADPH. De co-expressie
van het L-LDH met het oplosbare transhydrogenase gen uit Pseudomonas aeruginosa maakt
dit mogelijk. Dit transhydrogenase enzym kan NADPH omzetten in NADH, het substraat
waaraan L-LDH de voorkeur geeft.
Het tot expressie brengen van verschillende niveaus van het L-LDH uit Lactococcus
lactis in Synechocystis is beschreven in hoofdstuk 3. Dit kan bewerkstelligd worden door
gebruik te maken van een set promotors met verschillende sterkte, zoals PrnpB, PpsbA2, and
Ptrc. Hiermee worden stammen gecreëerd die elk een verschillende snelheid van
melkzuurproductie laten zien. Door deze gegevens te combineren met metingen van de
activiteit van het L-LDH enzym in cel-vrije extracten van deze set van stammen kan een
zogenaamde ‘gevoeligheidsanalyse’ uitgevoerd worden. Deze analyse laat zien dat de
controle op de snelheid van melkzuurproductie in deze stammen volledig ligt in de
hoeveelheid van het heteroloog tot expressie gebrachte L-LDH.
In hoofdstuk 4 wordt een aantal ‘ontwerpprincipes’ voor de constructie van een
melkzuur over-producerende Synechocystis stam uitgetest. Verdere over-expressie (t.o.v. de
resultaten beschreven in hoofdstuk 3) van het L-LDH bleek mogelijk tot een niveau waarop
de relatieve toename in de snelheid van melkzuur productie niet meer proportioneel was met
de relatieve hoeveelheid tot expressie gebrachte L-LDH enzymactiviteit in het cytoplasma
van Synechocystis. Onder deze condities neemt de bijdrage van het L-LDH op de controle van
de snelheid van melkzuurproductie af en wordt deze controle overgenomen door andere
enzymen uit het metabole netwerk dat tot melkzuur productie leidt. Precies op dat punt wordt
het mogelijk om een bijdrage waar te nemen van het ook tot expressie gebrachte enzym
pyruvaat kinase, aan de snelheid van melkzuurproductie. Herverdeling van de koolstof-flux
in de richting van melkzuur in het metabole netwerk van de cyanobacterie, via het
uitschakelen van een stroom-opwaartse vertakkingsroute, bleek ook mogelijk, hoewel dat wel
sterk ten koste ging van de maximale groeisnelheid van het recombinante organisme.
Voortbouwend op het inzicht verkregen uit de experimenten die in hoofdstuk 2 zijn
beschreven, is vervolgens geprobeerd direct gebruik te maken van de reductie-equivalenten
van NADPH (wat aan de thylakoide membraan gesynthetiseerd wordt), door een melkzuur
dehydrogenase enzym genetisch aan te passen zodat dit enzym een voorkeur heeft voor
NADPH boven NADH (via zgn. plaats-gerichte mutagenese). Deze aanpassing van de
specificiteit van het enzym leidde inderdaad tot verhoging van de productiesnelheid van
melkzuur.
Het uitschakelen van concurrerende reacties is één van de centrale concepten uit de
metabole engineering. Metabole routes in de cel die aanleiding geven tot omzetting van
gefixeerd CO2 in zgn. reservestoffen zoals glycogeen en poly-β-hydroxyboterzuur zijn
voorbeelden van zulke concurrerende routes. Hoofdstuk 5 beschrijft de expressie van een
melkzuur dehydrogenase in een stam die geen glycogeen meer kan maken. Onder
omstandigheden waaronder het wild type organisme normaliter veel glycogeen maakt, leidt
het gebruik van ingebracht gen inderdaad tot een verhoging van de snelheid van
melkzuurproductie.
In hoofdstuk 6 wordt de productie van de complementaire optische enantiomeer van
L-melkzuur, i.e. D-melkzuur, door Synechocystis mogelijk gemaakt door een melkzuur
dehydrogenase coderend gen in te brengen uit Leuconostoc mesenteroides. Opvallend is dat
een dergelijk organisme tijdens zijn groei een tijdelijke fase laat zien waarin melkzuur netto
opgenomen wordt, i.p.v. uitgescheiden. Dit komt doordat Synechocystis in staat is Dmelkzuur wel, en L-melkzuur niet, in het metabolisme in te sluizen.
Hoofdstuk 7 geeft een overzicht van alle gepubliceerde data over productvorming uit
CO2 in genetisch gemodificeerde cyanobacteriën. De hoogste productieniveaus zijn tot nu toe
beschreven in zgn. batch-cultuur experimenten, voor de productie van korte-keten alcoholen
en organische zuren die direct zijn afgeleid van centrale verbindingen uit het intermediair
metabolisme van cyanobacteriën. Omdat meerdere producten kunnen worden gesynthetiseerd
vanuit één en hetzelfde metabole intermediair, worden in dit hoofdstuk ook
combinatiemogelijkheden van verschillende optimalisatiestrategieën besproken.
Hoofdstuk 8 presenteert een optimalisatiestudie van 2,3-butaandiol productie met
recombinante Synechocystis stammen. Heterologe expressie van combinaties van genen
afkomstig uit melkzuur bacteriën, enterobacteriën en bacilli geeft aanleiding tot de vorming
van een kunstmatig metabool pad dat aanleiding kan geven tot de vorming van een mengsel
van acetoïne en 2,3-butaandiol. Deze laatstgenoemde verbinding is een korte-keten alcohol
die zeer goed bruikbaar is als ‘drop-in’ brandstof. Ook kan deze verbinding omgezet worden
in butanon, wat daarnaast bruikbaar is als oplosmiddel, en in butadieen (wat samen met
styreen omgezet kan worden in synthetisch rubber). Het toevoegen van een gen dat codeert
voor een oplosbaar transhydrogenase, alsook het gebruik van NADPH-specifieke reductases,
leidt ook voor deze pathway tot hogere productiesnelheden, waarmee de resultaten uit de
hoofdstukken 2 en 4 verder bevestigd worden.
Door gebruik te maken van geminiaturiseerde reactoren (zgn.’ microfluidic devices’)
kan de performance van individuele cellen met betrekking tot hun productiviteit van
melkzuur geanalyseerd worden, en kunnen hoog-producerende stammen uit een mengsel van
cellen geïsoleerd worden. Het gebruik van zo’n device, dat picoliter druppels kan vormen
waarin maar één cel aanwezig is, is beschreven in hoofdstuk 9. De verkregen resultaten laten
zien dat dit inderdaad mogelijk is met recombinante stammen met verschillende melkzuurproductie niveaus. Dezelfde techniek kan daarom in de toekomst mogelijk gebruikt worden
om uit een collectie van mutanten de hoogst-producerende cellen te isoleren. Dit betekent een
belangrijke uitbreiding van het arsenaal van methoden waarover een metabole engineer in de
toekomst kan beschikken.
Hoofdstuk 10 ‘duikt’ in de details van de fysiologie van Synechocystis. Hiervoor
werd het organisme gekweekt in een geavanceerde foto-bioreactor, onder omstandigheden
die relevant zijn voor de grootschalige toepassing van deze organismen voor
biobrandstofproductie, i.e. onder een dag/nacht ritme, en met anaerobe condities in het
donker. Uit de verkregen resultaten blijkt verrassenderwijs dat de hoeveelheid glycogeen die
in de cel wordt opgeslagen suggereert dat de cel zich actief voorbereidt op de volgende
daglicht periode. Uit de parallel gemeten gegevens over eiwit- en metabolietniveaus in de cel
komt het beeld naar voren van een heel sterk gebalanceerde fysiologie in cellen van dit
organisme, die sterk modererend werkt op de externe fluctuaties die door het (circa)diane
ritme worden opgelegd.
In hoofdstuk 11 worden de conclusies uit de afzonderlijke hoofdstukken van het
proefschrift besproken in het licht van de algemene stand van zaken van de kennis uit de
wetenschappelijke literatuur. Dat leidt tot de conclusie dat specifieke metabole engineeringsprincipes die in dit proefschrift besproken worden waarschijnlijk gebruikt kunnen worden om
een nog veel groter palet aan waardevolle verbindingen met behulp van recombinante
cyanobacteriën uit CO2 en (zon)licht te kunnen synthetiseren. Hiermee kan deze aanpak
mogelijk haar economische levensvatbaarheid bewijzen. We mogen verwachten dat het
beschikbaar komen van steeds meer, en nog efficiëntere, methoden binnen de synthetische
biologie hierop nog een verder positief effect zal hebben.

Download Report