神奈川科学技術アカデミーバイオインフォマティクスコース蛋白質立体構造予測 I,II,演習阿久津達也東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センター講義内容 I ① ② ③ ④ ⑤ 蛋白質立体構造とその特徴立体構造データベース: PDB 立体構造の分類: SCOP 立体構造表示ソフト: RASMOL 構造予測法の分類講義内容 II ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 物理的原理に基づく方法格子モデル二次構造予測法スレッディング法スコア関数立体構造予測コンテスト CASP 実習内容 ① 立体構造の検索、表示、分類 (PDB,RASMOL,SCOP) ② ③ ④ ⑤ ⑥ 立体構造アライメント(DALI) 二次構造予測(PHD) フォールド予測（スレッディング） (GTOP,FUGUE,3DPSSM) ホモロジーモデリング(FAMS) CASP 遺伝子と蛋白質  遺伝情報の流れ   エキソン DNA DNA配列中で直接的に機能する部分転写・スプライシング mRNA GGU   GGU → Gly GCA → Ala 染色体全体（半数体）遺伝情報の総体タンパク質アミノ酸（２０種類）の鎖 GCA 翻訳ゲノム   エキソン遺伝子   DNA⇒RNA⇒タンパクエキソンタンパク質蛋白質立体構造予測    アミノ酸配列から、蛋白質の立体構造（３次元構造）をコンピュータにより推定実験よりは、はるかに精度が悪いだいたいの形がわかれば良いのであれば、５割近くの予測率アミノ酸配列 T C A V F G L G G V R L S D V コンピュータタンパク質立体構造アミノ酸と蛋白質   アミノ酸：２０種類蛋白質：アミノ酸の鎖（短いものはペプチドと呼ばれる）アミノ酸 R H 側鎖 OH C N アミノ基 C カルボシキル基 H H O 蛋白質 R N H C H H C O N H C R ペプチド結合 O C 側鎖の例 Ala アラニン Phe フェニルアラニン CH 3 CH HC Val バリン H3 C CH C CH 3 CH O CH HC Asp アスパラギン酸 CH ２ O C - His ヒスチジン Cys システイン HN SH + NH CH ２ CH 2 CH ２ Gly グリシン H アミノ酸コード表 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile A R N D C Q E G H I アラニンアルギニンアスパラギンアスパラギン酸システイングルタミングルタミン酸グリシンヒスチジンイソロイシン Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val L ロイシン K リシン M メチオニン F フェニルアラニン P プロリン S セリン T トレオニン W トリプトファン Y チロシン V バリンアミノ酸の分類  疎水性アミノ酸   荷電アミノ酸（親水性）   Asp, Glu, Lys, Arg 極性アミノ酸   Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Met Ser, Thr, Tyr, His, Cys, Asn, Glu, Trp グリシン(疎水性に分類されることもある）  Gly 蛋白質の種類と高次構造  蛋白質の分類        球状蛋白質繊維状蛋白質膜蛋白質一次構造（アミノ酸配列）二次構造（α、β、それ以外（ループ、コイル））三次構造（三次元構造、立体構造）四次構造（複数の鎖）蛋白質立体構造の決定  主にX線結晶解析かNMR解析による    アミノ酸配列決定より困難    一般にX線解析の方が精度が高いしかし、結晶中の構造しかわからない半年から１年くらいかかることも珍しく無い既知アミノ酸配列 > 10万既知立体構造 < 1万蛋白質立体構造の特徴   基本的には鎖（ひも）状二種類の特徴的な構造が頻繁に現れ、立体構造の骨格（コア）を作る   αへリックス（らせん状の部分） βシート（ひも状の部分が並んだ部分） α β ループ構造とアミノ酸の種類の関係  (球状）蛋白質   αへリックス   内側：疎水性外側：親水性 βストランド   内側：疎水性アミノ酸外側：親水性アミノ酸疎水性と親水性が交互に現れるループ領域  親水性が高い立体構造データベース  PDB(Protein Data Bank )    SCOP   蛋白質立体構造データベース現在約16000データ（ただし重複あり）立体構造分類データベース FSSP／DALI  立体構造アライメントデータベース／アライメントサーバー蛋白質立体構造の分類  構造分類の必要性    立体構造と機能の間には密接な関係配列が似ていなくても構造類似の蛋白質が多数存在 SCOPによる階層的クラス分け     Class: 二次構造の組成（α、β、α+βなど）に基づく分類 Fold: 構造の類似性 Superfamily: 進化的類縁性 Family: 明らかな進化的類縁性立体構造アライメント    立体構造の類似性判定のために有用どのように回転、平行移動すれば、最適な残基間の対応づけが得られるかを計算 DALI,VASTなどいくつかのアルゴリズム Rasmol     蛋白質立体構造表示ツール Windows版、UNIX版、LINUX版など（フリー）バックボーン表示、リボン形式など様々な形式での表示が可能マウスなどで、回転、拡大なども可能立体構造予測法の分類     力学的原理に基づく方法格子モデル２次構造予測スレッディング物理的原理に基づく方法       エネルギー最小化、もしくは、微分方程式を（数値的に）解く、などの物理的原理に基づく方法主として分子動力学法(Molecular Dynamics) 数十残基程度であれば、実際の蛋白質やペプチドと似た構造を推定可能（なことがある）構造の最適化や安定性の解析には実用的側鎖のパッキングの計算にも有効超並列計算機の利用 IBM BLUE GENEなど分子動力学法   エネルギーの極小化（Eを極小化）フォールディングのシミュレーション   mi d2ri/dt2 = -∇i E を差分化 E = Eb + Eθ + Eφ + Evdw + Eel      Eb = ΣKb(r-r0)2 結合長 Eθ = ΣKθ(θ-θ0)2 結合角 Eφ = ΣKφ[1+cos(nφ-δ)] 二面角 Evdw = Σ[Aij/(rij2)-Bij/(rij6)] ファンデルワールス力 Eel = Σqiqj/(εrij) 静電相互作用（クーロン力）格子モデル   各残基が格子点にあると仮定予測よりも、フォールディングの定性的な理解のために利用される格子モデルに基づく研究   折れ畳み経路のシミュレーションによる定性的理解 →フォールディングファンネルエネルギー最小の構造の計算法 →NP困難親水性アミノ酸疎水性アミノ酸スコア＝－９スコア＝－５配列二次構造予測     アミノ酸配列中の各残基が、α、β、それ以外のどれに属するかを予測でたらめに推定しても、 33.3%の的中率最も高精度なソフトを使えば、70%～80%の的中率ニューラルネット、HMM、サポートベクタマシンなどの利用 L A P I K α β それ以外ニューラルネットによる二次構造予測出力層中間層（隠れ層）入力層 Lys Val Leu Asn Ala Thr Gly 膜蛋白質の膜貫通領域予測  膜貫通領域    αへリックス 7～１７残基程度の疎水性指標の平均値をプロット平均値が高い部分が膜貫通領域と推定 D A G I 膜蛋白細胞膜 V L P V R K Q A 1.8 C: 2.5 D: -3.5 E: -3.5 F: 2.8 ... 疎水性指標フォールド予測（Fold Recognition)   精密な３次元構造ではなく、だいたいの形（fold)を予測立体構造は1000 種類程度の形に分類される、との予測(Chotia, 1992) に基づくアミノ酸配列 T C A V F G L G G V R L S D V 1000個のテンプレート構造蛋白質スレッディング立体構造（テンプレート）とアミノ酸配列の間のアライメント立体構造 T C A V F G L G K V R L S D V アミノ酸配列スレッディングとアライメント立体構造 A L G F G S L Y G A L G G V S L G A L G F G A L G T C A V F G L G K V R L S D V 入力アミノ酸配列 S L Y G G V S L G 蛋白質スレッディングによる構造予測 ① ② ③ 構造未知の配列と既知の立体構造（数百種類程度）の間のスレッディングを、それぞれ、計算スレッディング結果のスコア（適合度）が最も高い構造を採用（スレッディングにより対応づけられた座標にアミノ酸を配置）必要があれば、分子動力学法などを用いて構造を最適化スレディング法の分類  プロファイルによるスレッディング     PSI-BLAST 3D-1D法構造アライメント結果に基づくスレッディング残基間ポテンシャルによるスレッディング    コンタクトポテンシャル距離依存ポテンシャルその他のポテンシャル残基４プロファイル残基３立体構造   アライメントにおけるスコア行列と類似スレッディングの場合、残基位置ごとにスコア(位置依存スコア) 残基２残基1 残基1 残基2 残基3 残基4 A 3.8 -3.5 1.2 2.3 C 1.5 1.3 -0.3 -4.6 D -1.5 -2.9 4.2 3.1 E 0.2 2.1 3.7 -1.3 プロファイルによるアライメント   動的計画法 (DP)により最適解を計算スコア行列のかわりにプロファイルを使うアミノ酸配列： AED ...... プロファイル：残基1 残基2 残基3 残基4 A 3.8 -3.5 1.2 2.3 C D 1.5 1.3 -0.3 -4.6 -1.5 -2.9 4.2 3.1 E 0.2 -4.1 3.7 -1.3 アライメント 123 ..... AED ..... 1234 ..... A-ED ..... 1- 23 ..... AEDC ... スコア 3.8-4.1+4.2 =3.9 3.8-2.0+3.7+ 3.1=8.7 3.8-2.0-2.9+ -0.3=-1.4 3D-1Dプロファイル   最初のversion はEisenbergらが1991年に提 α 案構造中の残基（位置）を１８種 β 類の環境に分類   二次構造（３種類）内外性＋極性（６種類）主鎖側鎖内外性 E P2 P1 B3 B2 B1 極性残基1 3D-1Dプロファイル残基4 蛋白質立体構造残基2 残基3 環境クラス B 1α B 1β B 1 内外性 E P2 P1 B3 極 B2 性 B1 アミノ酸・・・・ A -0.66 -0.79 -0.91 ・・・・ A -0.79 -0.79 -0.91 ・・・・ R -1.67 -1.16 -2.16 ・・・・ R -1.16 -1.16 -2.16 ・・・・・・・・・・・・・・・・ Y 0.18 0.07 0.17 ・・・・ Y 0.07 0.07 0.17 ・・・・ W 1.00 1.17 1.05 ・・・・ W 1.17 1.17 1.05 ・・・・残基1 残基2 3D-1Dスコア残基3 3D-プロファイルその他のプロファイル  配列のマルチプルアライメントに基づくプロファイル    PSI-BLAST、HMM 立体構造のマルチプルアライメントに基づくプロファイル作成角度情報なども考慮したプロファイルアライメントプロファイルに基づくスレッディング構造未知配列 A H WA K GY LD アライメント結果 A D R Y P K W- D A- HF A- YVD A- KF THYL D スレッディング A - H WA K G Y L D A D R Y P K - W- D A - H F A- - Y V D A- KF TH- YL D ポテンシャル型スコア関数を用いたスレッディング  全体のポテンシャルエネルギーを最小化（Σfd(X,Y)が最小となるようなスレッディングを計算）立体構造 f d (T, F) d T C A V F G L G K V R L S D V アミノ酸配列プロファイル型スコア関数とポテンシャル型スコア関数   Pos1 Pos2 Pos3 Pos4 プロファイル型スコア関数 A 3.8 -3.5 1.2 2.3 C 1.5 1.3 -0.3 -4.6 (Eisenberg et al. 1991) D E -1.5 -2.9 4.2 3.1 0.2 2.1 3.7 -1.3 ポテンシャル型スコア関数 (Miyazawa, Sippl, . . .) score A d L d コンタクトポテンシャルと距離依存ポテンシャル  コンタクトポテンシャル (Miyazawa... 1985)  score A d 比較的少ないデータからスコア関数を導出可能 L d  距離依存ポテンシャル (Sippl, . . .)  精度の高いスコア関数を得るには多くのデータが必要 score A d L d ポテンシャル型関数を用いた場合の最適解の計算   厳密な最適解の計算は困難(NP完全) 様々なアルゴリズムの提案  分枝限定法 (Lathrop & Smith 94,96)    Frozen Approximation (Godzik & Skolnick 92)   多くの場合に現実的な時間で最適解を計算可能コア領域内でのギャップは許されない通常のDPと同様のアルゴリズムが利用可能 Double DP (Jones, Taylor & Thornton 92)   DPを二重に用いる立体構造アライメントなどにも応用可能最適解がDPで計算できない理由と Frozen Approximation   ○にFをアラインする際のスコアの正確な計算には、○に何がアラインされているかを知ることが必要 Frozen Approximation もとの構造中で○に割り当てられている残基の情報を利用（図の例ではFとDのコンタクトポテンシャル）立体構造 D T C A V F G L G K V R L S D V アミノ酸配列スコア関数の導出  残基の出現頻度の対数をとる   統計力学のボルツマン分布などが根拠 3D-1Dスコア    環境eのもとでの残基aの出現頻度：fe(a) 環境eの出現確率  score(e,a)=log (fe(a)/ fe) ポテンシャル型スコア（Quasichemical Approximation (Miyazawa 85)）  距離dにおける残基ペアa,bの出現頻度：fd(a,b)  scored(a,b) =-log fd(a,b) 他のスコア関数導出法  学習データ（既知構造データ）より以下を満たすスコア（エネルギー）を導出      正しい構造のエネルギー＜誤った構造のエネルギ or Max( 誤った構造のエネルギー－正しい構造のエネルギー ) ニューラルネット (Goldstein et al. 92) モンテカルロ法 (Mirny,Shakhnovich 96) 線形計画法 (Maiorov,Crippen 92) スレッディングに関するまとめ  プロファイル型   DPによりスレッディングが計算可能ポテンシャル型  DPは（直接は）適用不可     Frozen Approximation, Double DP, … コンタクトポテンシャル距離依存ポテンシャルスコア関数の導出  対数頻度立体構造予測コンテスト：CASP   CASP (Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction) ブラインドテストにより予測法を評価 ① ② ③ 半年以内に立体構造が実験により決定する見込みの配列（数十種類）をインターネット上で公開参加者は予測結果を送付構造決定後、正解とのずれなどを評価、順位づけ CASPの経過と結果の公表   CASP1 (1994), CASP2(1996), CASP3(1998), CASP4(2000) CAFASP(1998,2000)   完全自動予測法の評価結果の公表   会議ホームページ   http://predictioncenter.llnl.gov/ 学術専門誌(Proteins) 予測カテゴリー  ３D coordinate   Alignments to PDB structure   スレッディング Residue-residue contacts   具体的な座標値まで計算→MDなど残基間距離の推定 Secondary structure assignments  二次構造予測各種サイト      PDB（立体構造データベース） RASMOL（立体構造表示プログラム） PHD（二次構造予測システム） GTOP(PSI-BLASTベースの予測システム） CAFASP2 servers(各種スレッディングプログラムへのリンク）まとめ  立体構造予測     実用的な予測法   正確な座標は予測できないだいたいの形の予測であれば５割程度二次構造予測であれば、70%-80%程度 PSI-BLASTに基づく方法が有力進行中のプロジェクト  立体構造の網羅的決定→ 残りの構造はアライメントでほぼ確実に推定演習１  立体構造の検索、表示、分類     PDB(http://www.rcsb.org/pdb/) RASMOL(http://www.umass.edu/microbio/rasmol/i ndex2.htm) SCOP(http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/) 実際の作業  PDBにてキーワード入力    (例：myoglobin, 1bov) RASMOLで表示 SCOPにて分類を確認演習２  立体構造アライメント、表示   DALI/FSSP(http://www.ebi.ac.uk/dali/) 実際の作業    FSSPにてmyoglobinと入力 1a6mをチェック 1a6m,1ash,1cpcAをチェック→アライメント結果の表示(narrow)→アライメント結果をセーブし、RASMOLで表示演習３  二次構造予測   PHD(http://www.emblheidelberg.de/predictprotein/predictprotein .html) 実際の作業  DBGETでSwissprotをセレクトし、キーワード入力（例：prion,lectin）→配列データをコピーし、 PHDに入力演習４  フォールド予測（PSI-BLASTベース）   GTOP(http://spock.genes.nig.ac.jp/~geno me/) 実際の作業  演習３のデータをGTOPにコピー→結果を見る演習５  構造プロファイルなどに基づくスレッディング   FUGUE(http://wwwcryst.bioc.cam.ac.uk/~fugue/prfsearch.htm l) 3DPSSM(http://www.bmm.icnet.uk/servers /3dpssm/) 演習６、７  ホモロジーモデリング   FAMS(http://physchem.pharm.kitasatou.ac.jp/FAMS/fams.html) CASP結果の閲覧  http://predictioncenter.llnl.gov/