シンプラスト経路 Symplast アポプラスト経路 Apoplast 土壌水 Soil water 根 Root カスパリー線 Casparian stripe 道管 xylem 細胞間連絡 (plasmodesmata) 通常は分子量１０００以下 の物質が通過 Casparian Strip Symplast： Solutes MUST go into the cell 細胞（シンプラスト）に入るには問題が・・・・ • 細胞をつつむ「膜」の基本組成は脂質（油っぽい） • 「水と油」だから、水の透過性は、ほどほど・・・ H2O ドウヤッテ ハイロウカ？ 実際の細胞はとてもよく水 を透過させることが多い。 水ポテンシャル Water uptake（movement/flux）： 細胞レベルでは アクアポリンはここ に関係（後述） Water flux*＝(駆動力）×（水の動きやすさ：透過性） （*per unit time） Driving force 水ポテンシャル差 Water potential difference water permeability Molecular transport of water ・・・ depends on water potential deference “Water potential” mainly consists in “concentration” and “presser” 物理的圧力（静水圧）: 「Presser potential」ψp 押しとどめるため に必要な圧力（P) Water molecule M 膨張しようとする (Swelling) ・・・「osmotic presser」 （proposal to concentration） 「浸透圧」にマイナスをつけたもの ⇒ 「Osmotic potentail」ψosm 「Semi-permeable membrane」 半透膜 Water can pass but solute minus (osmotic pressure) (M) cannnot. Why minuis？ ψp＋ψosm＝０ （釣り合っている場合） ψ1 ψ2 ψ1 ψ2 ψ1 ψ2 P P P ψosm: -0.1 > -0.5 ψp: 0 < 0.4 (MPa) (MPa) Water movement Water moves from high ψw to low ψw Water potential ψw = ψosm + ψp 1 MPa ≈ 0.4 mol/litter ≈ 10 atm （気圧） ψosm -0.1 > -0.5 0 < 0.4 + ψp ψ -0.1 = -0.1 (ψ1 = ψ2) + ・・・ 植物細胞では、これが 「膨圧」Turgor (View from water potential) 動物細胞 Animal cells 植物細胞 Plant cells 細胞膜 Plasma-membrane 細胞壁 Cell wall Inner ψosm = Outer ψosm Inner ψw = Outer ψw Inner ψosm ≠ Outer ψosm Presser at call wall Inner ψw = Outer ψw 土壌水分が足りない場合（乾燥地、塩ストレス） At low water potential of soil (drought/ salt stress) 水 ポ テ ン シ ャ ル ψw － 0 純水 Soil soil Root Weak drought/salt stress Wet 細胞液の水ポテン シャルを下げる （浸透圧を上げる） Root 水 ポ テ ン シ ャ ル ψw soil Root soil Root Strong drought/salt stress Soil root 細胞の水ポテンシャルを下げる（浸透圧を上げる）には・・・ 細 胞 外 （ 土 壌 ） 水 環 境 細胞質：糖、アミノ酸、有機物質 核 乾燥 塩ストレス 液胞：無機イオン K+ (Na+ 塩生植物） Clその他 （細胞質には、ほぼ一定量（150mMくらい）のK+あり） 細胞質に蓄積される 特殊な有機物質 → 適合溶質（compatible solute）とよばれる 浸透圧を上げる シャペロン活性 スカベンジャー活性 ベタインとは、本来はアミノ酸のアミノ基 に3つのメチル基が付いた化合物の総称。 H3N+- → (CH3)3N+- もっとも存在量の多いグリシンベタイン （＝トリメチルグリシン）を、単にベタインと 呼ぶことも多い。 タバコ葉の例 （プロリン蓄積） グリシンベタインの合成系 塩ストレス誘導性 イネでは通常は基質不足 左： 150 mM NaCl 右： 150 mM NaCl + 5mM betaine aldelyde アクアポリンの機能・構造 水ポテンシャル差 Water potential difference Water flux*＝(駆動力）×（水の動きやすさ：透過性） （*per unit time） Driving force water permeability 表面積×面積当たりの水透過性 Surface area water permeability per unit area Aquaporin determins this Before discovery of aquaporins （アクアポリン発見前）？ H 2O 液胞膜 Tonoplast 原形質膜（細胞膜） Plasma-membraene After all, the message that appeared in textbooks was that water simply diffused "somehow'' across plants membrane and proteins were not involved in these processes. Biophysicists continued to use pore models to explain membrane permeations without seeking a molecular explanation. A.R.Schaffner Planta 204:131-139 (1998) Prof. Peter Agre Novel prize (Chemistry) "for the discovery of water channels" （機能） 細胞の水透過性 脂質二重層より 高い 「水チャネル」の存在 が示唆される (water channels suggested) （タンパク） 生体膜に多量に 存在する機能不 明の膜タンパク CHIP28 PM28 （遺伝子） Major Intrinsic Protein (MIP) 水晶体のレンズ 大腸菌のグリセ ロール輸送体 （GlpF) Aquaporin（アクアポリン） 植物の生育期間を通じて水の吸収と蒸散量は生重量の１００倍 代謝と成長に使われるのは、約５％ 水輸送は、もっとも大量の膜輸送である。 → その分子基盤がアクアポリン Aquaporins as molecular basis H2O H2O 生体膜 membranes 水チャネル アクアポリン Aquaporin 10～100-hold higher water permeabiliyu with aqauporins Structure in the membrane アクアポリンの機能（水透過）の活性調節に 関わるアミノ酸残基（植物の場合） Regulatory regions 細胞がアクアポリンを持つことは、単に水透過性を高くするということでは なく、透過性を制御できる、という点で大きな意味がある。 Aquaporins ; 1) increase membrane water permeability 2) make it possible to regulate water permeability Structural features • 2 NPA motives • 6 Trans-membrane helixes (TMHs) and 5 inter-TMH loops • Phosphorylation targets Top view of AQP1 (a) Ribbon diagram (b)Space-filled one Side view of AQP1 (c) Ribbon diagram (d)Space-filled one Murata at al. (2000) Nature 407:599 ＮＨＫ ２００７年５月９日放送 ヒトアクアポリン １３個のアクアポリン（AQP)遺伝子がある 皮膚のみずみずしさ → AQP3 カネボウ化粧品スキンケアブランド「suisai（スイサイ）」 の高保湿クリーム「ヒアロインクリームAP」 原尿からの水の再吸収（腎臓） → AQP2 同社の「アクアポリン（肌における“水の通り 道”）研究」の成果を応用し、配合成分を強化 した・・・ EtOH → AVP↓ → Exocytosis ↓ → AQP in PM ↓ 涙 → AQP5 （壊れるとドライアイ） 唾液 → AQP5 （壊れると口腔乾燥症） 植物のアクアポリン (Plant aquaporins) Aquaporin = MIP (membrane intrinsic protein) PIP(plasm-membrane…) （原形質膜型） TIP(tonoplast….) （液胞膜型） NIP(Nodulin26-like…) SIP(small …) ER signaling? XIP(x …) シロイヌナズでは３５個のMIP (35 Major Intrinsic Protein in Arabidopsis) (ヒトでは１３個(human)、微生物は１から２個(bacteria)) XIPs are found in some plants (tomato, cotton, moss) but functions are not yet known Why many in plants? 生育ステージ：発芽、成長、生殖、結実 環境変化：乾燥←→湿潤 Regulation by; humiditiy、salt stress、light、temeperature、others 構造(structure) >30 genes 機能(function) substrates （H2O、CO2、B、Si・・・） aquaporin 生体膜 局在(localization) 細胞膜（ＰＩＰ） 液胞膜（ＴＩＰ） 根粒菌包膜(NIP) ER膜(SIP?) Stress tolerance、growth regulation、Post-harvesting そもそも植物の膜輸送系遺伝子は多い シロイヌナズナでは ポンプ 208種類 トランスポーター 559種類 チャネル 101種類 動けない(no move) 環境適応性が高い (high adaptability) 再分化／再生能力 (regeneration) （すべての膜系あわせて） 「植物の膜輸送システム」（秀潤社）より 細胞の水透過性をきめる 細 Determining cell water permeability 胞 外 （ 土 壌 ） 水 環 境 水透過性高い：細胞質の体積を維持 High permeability: maintain cytolasm •Wet 核 •Dry •Salt stress (variable) 液胞 Vacuole （細胞体積の９０％以上） (More than 90% volume) 細胞質（cytoplasm） Plasma-mambrane Cell wall 窒素固定にも関係？ 空中窒素 (air N2) (Tyerman et al.） Leguminos root cells マ メ 科 植 物 の 根 の 細 胞 Peribacteroid membrane ペリバクテロイド膜 Nutrition 栄養 N2 → NH3 N-fixing bacteria 窒素固定菌 H2O NOD26 （NIP-type aqauporin） Other susbstrate for other NIPs Si(OH)4 /As(OH)4 ［OsNIP2;1］， B(OH)3 ［ AtNIP5;1 ］ Rice aquaporins To be elucidated NIP Nodulin 26-like Intrinsic OsNIP2;2 Protein OsNIP3;1 OsNIP3;2 OsSIP2;1 OsNIP3;3 SIP 個々の OsSIP1;1 機能 Small basic Intrinsic OsTIP4;3 Protein OsTIP4;2 OsPIP2;7 OsTIP4;1 TIP 形質? OsTIP3;2 Tonoplast Intrinsic Protein OsTIP3;1 0.1 PIP Plasma membrane Intrinsic Protein 11OsPIPs (3OsPIP1s and 8OsPIP2s) in rice plants (PCP 46:568 (2005)) 重複 Individual function Redundancy Phenotype 水輸送活性測定 アフリカツメガエル卵母細胞による Swelling assay マイクロピペット アフリカツメガエル 卵母細胞 (oocyte) cRNA タンパク発現 膜ターゲティング アクアポリン 外液を低張液に交換 H2O 卵に水を吸わせる・・・ 吸水が早くなるか？ なぜアフリカツメガエルの卵を使うの？ • アフリカツメガエルの卵に植物の遺伝子など外 からRNAを注入すると、卵でRNAからタンパク質 が合成される。内在性のタンパク質はほとんど発 現していない。 • 卵は本来水の輸送活性が低いので、RNA注入 で多くの水を吸収した場合、合成されたタンパク 質に水を運ぶ働きがあることになる。 • アフリカツメガエルは生命力が強く、飼育しやす い。また広く研究に使われており、入手が容易。 ←20秒毎の写真を高速（実際の約200倍の早さ）で再生したもの 多量の水が入り込んだため、卵が破裂し内容物が溶出している オオムギアクアポリン 遺伝子の一つ 破裂→ HvPIP2;1-injected 水輸送活性あり！ Negative control (water-injected) アフリカツメガエル卵母細胞を使った異種遺伝子発現／機能解析系 Water permeability (in oocyte system) (Barley PIPs) (Rice PIPs) OsPIP2 isoforms HvPIP2;1 HvPIP1;1 ～ 2;5 HvPIP1;2 1.2 HvPIP1;3 HvPIP1;4 HvPIP1;5 HvPIP2;1 HvPIP2;2 HvPIP2;3 HvPIP1;1 HvPIP2;4 ～HvPIP2;5 1;5 and Water neg. cont. 1.15 1.1 1.05 1 0 （透過性） Relative volume 1.25 OsPIP1 isoforms 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (sec) (Horie et al. et al. PCP 52:663 (2011)) (Matsumoto et al. PCP 50:216 (2009)) Low water transport activity of PIP1s in oocytes (apprentice) ┏ Immunofluoresence ┓ 抗HvPIP2;4抗体 抗HvPIP1s抗体 HvPIP2;4 単独発現 HvPIP1;2 単独発現 HvPIP2;4-injection HvPIP1;2-injection PIP1は単独で膜へ移行しない No membrane localization PIP1s alone 2 膜に行っていても 活性のない場合も 1.8 （透過性） HvNIPs and OsNIPs Pf (x 10-2 cm sec-1) 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 (Katsuhara in preparation) 0 EGFP-OsNIP2;2 injection Bright field GFP fluorescence 構造・機能改変 Molecular engendering Amino acid sequence alignment of the region containing E-loop and the 6th TMH of barley PIPs. いずれも 水輸送活性あり 254M in HvPIP2;4 254I in HvPIP2;3 NC HvPIP2;3 Wt(2ng) HvPIP2;3 I254M(2ng) 254M can transport water HvPIP2;3 I254Y(2ng) 254Y cannot transport water 0 1 Pf (10-2m/s) 2 HvPIP2;4M254I enhanced water transport activity Water transport activity can be artificially modulated
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