ゲル内タンパクの染色 ～銀染色～ 原理 銀イオンはアンモニア性溶液中で銀ジアミン錯体を形成す る。銀イオンや銀ジアミン錯体イオンはタンパク質と結合(SH基に最も結合しやすい)し、これをクエン酸、ホルマリンの 作用により還元して金属銀を析出し、ゲル内タンパク質の黒 化像を得る。 [Ag２(NH3)2]+ 銀ジアミンイオン 銀染色を用いる利点・欠点 ○ 好感度である 特殊な装置は不要である ゲルを乾燥保存できる × 定量性がない 非特異的である 廃液中の銀イオンを処理する必要がある 他染色との比較 銀染色 蛍光染色 CBB染色 感度：＜1ng 定量性：× 検出方法：可視 感度：＜0．5ng 定量性：◎ 検出方法：蛍光イメージャーが必要 感度：50～100ng 定量性：○ 検出方法：可視 染色結果の比較 銀染色 CBB染色 蛍光染色 http://www.atto.co.jp/pdf/ez-silver-tech.pdf 試薬（２D-銀染色試薬Ⅱ-第一） ①固定化剤 チオ尿素 ②前処理剤 ジチオスライトール、グルタルアルデヒド、チオ尿 素 ③染色液A 硝酸銀 ④染色液B 水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム ⑤現像原液 クエン酸、ホルムアルデヒド、チオ硫酸ナトリウム ⑥停止液 クエン酸 手順 ①固定液Ⅰ（10分）：メタノールと酢酸 ②固定液Ⅱ（15分） ③前処理液（10分）：グルタールアルデヒドなどによる増感 ④洗浄（5分） ⑤銀染色液（15分）：銀ジアミン錯体などがタンパクと結合 ⑥洗浄（2分×3回）：余分な銀ジアミン錯体などを洗浄 ⑦現像液（5～10分）：ホルマリンの作用で銀を析出 ⑧停止液：酸性にする ※全ての工程は振蕩しながら行う。 ※ケラチンの混入を防ぐため手袋をして操作する。 染色結果（２D-PAGE） タンパクがスポットとし て染色されている 質量分析機 前処理剤（増感剤）に含まれるグルタールアルデヒドのアミノ基 を架橋する特性により質量分析前のゲル内消化の効率が悪く、 質量分析には向かない。 グルタールアルデヒドを用いていない試薬、キットを用いて染 色すると、質量分析が可能になる。 銀染色液の処理 使い終わった銀染色液は、操作完了後直ちに塩酸や塩化ナト リウムを加えて塩化銀の沈殿物にして処理します。 そのまま放置すると爆発性の銀アミドを生成する危険がありま す。
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