PowerPoint プレゼンテーション

発光絶対光量測定法の開発と
生物発光の量子収率測定
安東頼子A,B、山田展之C
入江勉C、榎本敏照C
久保田英博B,C、秋山英文A,B
東大物性研A、科技機構B、アトーC
絶対値発光量測定の必要性
●発光マーカーを用いた定量計測
発光標識技術を用いた生体反応等の定量測定
●発光新材料開発
生体分子や半導体ナノ材料等の発光新材料
開発時にその発光効率を定量的に知りたい
今回の研究目的
ホタル “King of Flash Light !”
量子収率は “88％ !!”
とされてきた。
しかし、
疑問： 1959年当時の検出器の精度や、
サンプルの純度はどうだったのだろう？
追試しよう！
生物発光の量子収率測定
生物発光の量子収率文献値
ホタル
88％
クラゲ（イクオリン） 23%
（ 40 years ago…）
（ 30 years ago…）
※ただし両方とも天然もの
発光基質に対し、大過剰のトリ
ガーと十分に反応に与る環境
発光が終わるまで測定する
ホタル
クラゲ
5～100分
数秒
ホタルルシフェリンの発光過程
Ｍｇ2+，ルシフェラーゼ
ルシフェリン＋ＡＴＰ--------------------
ルシフェリン-ＡＭＰ-ルシフェラーゼ + Ｐ-Ｐ
Ｏ２
ルシフェリン-ＡＭＰ-ルシフェラーゼ------------
生成物-ルシフェラーゼ +
発光
遺伝子発現検出系 --レポーターアッセイ
ＡＴＰ量測定系
--ATPの定量
微生物の定量
細胞の定量
＜標準な組み合わせとする＞濃度（Ｍ）液量（μｌ）
①ルシフェリン
1.65×10-7
5
②ルシフェラーゼ (和光)
2×10-5
5
③Mg2+
0.1
5
④グリシルグリシン(pH7.6)
0.25
100
⑤ATP
1×10-3
5
※遺伝子組換え体ルシフェラーゼ
イクオリンの発光過程
Ｃａ2+
イクオリン---------
アポイクオリン + セレンテラミド + ＣＯ2 + 発光
(図：下村脩,バイオサイエンス最前線vol.22,1998)
カルシウムの動的イメージプローブ
⇒細胞内生体機能の解析
⇒環境汚染物質の検出
濃度（Ｍ）液量（μｌ）
① イクオリン (チッソ)
4.5e-9
5～20
② Ca(NO3)2
0.1
100～110
※遺伝子組換え体イクオリン
測定法
lens(f=50,43Φ)
mirror
↑
トリガー溶液
分光器
80mm
133mm
冷却
ＣＣＤ
ＰＣ
↑
Long cut filter
←発光基質溶液
PS白色セル（3.5×3.5×11mm3）
full 120μｌ
●レンズの立体角
η=1/2{1-(1-sin2θ)1/2}
=1/2{1-(1-NA2)1/2}
白色セルを用いており、溶液からの発光
がほぼ100％セルの外に出てくるとする
η＝3.4％（∵ＮＡ=0.26）
total 1.0％
絶対値発光量測定系
●測定系の反射・透過率
ミラー ×1枚, レンズ ×1枚
long cut filter ×1枚
分光器内
ミラー×3枚+グレーティング1枚
or ミラー×4枚
透過率 30.1％
●分光器及び冷却ＣＣＤの感度校正
波長感度校正 with 白色ランプ
量子効率+プリアンプのゲインとＡＤ変換換算値
with He-Neレーザー 7.3（photon/count）
ホタルルシフェリンの発光測定
発光スペクトル
Photon数 8.41×1011
分子数
3.24×1012
ＰＬ
量子収率
ｐＨ7.6
サンプル
標準
標準
標準
分光器測定時間(min)
分光
60
全光
60
全光
90
90
90
90
ATPが10倍濃い全光
10
10
10
10
24.5％
Peak at 570(nm)
⊿t=60(min)
量子収率(%)
24.5
24.47
23.01
22.48
20.06
19.45
17.48
16.15
17.19
26.67
平均　21.1±3.5
補足
ルシフェリン：SIGMA
ルシフェリン：SIGMA
ルシフェリン：Promega
ルシフェリン：Promega
標準
ATPが10倍濃い
全光
全光
90
10
10
15.75
18.27
16.10
ルシフェリン：SIGMA
※家庭用冷蔵庫で1,2ヶ月
保管後
天然ルシフェラーゼ
全光
10
12.84
全光
10
10.54
ルシフェリン：Promega
※未追試
ルシフェリン：同仁化学
※未追試
ATPが10倍濃い
天然ルシフェラーゼ
ATPが10倍濃い
イクオリンの発光測定
発光スペクトル
Photon数 1.45×109
分子数
1.34×1010
量子収率
10.86％
Peak at 470(nm)
⊿t=30(sec)
サンプル
標準
分光器
分光
全光
希釈溶液が違う
全光
量子収率(%)
補足
10.86
イクオリン：チッソ
12.18
測定時間は全て30秒
10.86
※希釈溶液が硫安
とＥＤＴＡ
10.86
7.22
8.25
8.87
5.71
9.22
10.56
8.32
平均　9.1±1.6
4.99
5.28
4.53
イクオリン：チッソ
※希釈溶液が水
測定精度の見積もり
確率誤差
Ｃount数（ショットノイズ）
立体角
分子数
（％）
<<±1
±4.7
±6
+)________________________
±7.6
系統誤差
ＣＣＤ感度校正
光学系反射・透過率
白色セルの校正
±8
±2
±40
+)________________________
ワーストケース…
±50％
考察
ホタルルシフェリン
量子収率 21.1 ± 3.5 （％）
イクオリン
量子収率 9.1 ± 1.6 （％）
ホタルの量子収率が８８％に
なるには、測定結果に約４倍の
誤差が生じなければならない・・・
ワーストケース．．．で
見積もっても、3,40％を超える
事は無いのでは？
サンプルが天然ものか
遺伝子組換えものである
という違いは？
●ホタルに関して天然ものの方が
量子収率が高いという感じは無い（要追試）
●イクオリンの方は精製品の方が安定で
高純度だとうたっている
まとめと今後
ホタルとクラゲの発光量子収率を求めた。
両者共に、文献値よりも小さい値となっ
たが、我々の測定誤差を考慮した範囲で
も、それぞれ８８％、23％という値は高い
感じがしている。
本測定系では特に白色セルに関しての
工夫と校正を確立する事により、より
正確な絶対値発光量測定が可能になる。
ホタルルシフェリンの発光測定
発光スペクトル
Photon数 8.41×1011
分子数
3.24×1012
量子収率
25.9％
ＰＬ
Peak at 570(nm)
⊿t=60(min)
発光時間測定
ＡＴＰ濃度（Ｍ）量子収率（％）
1×10-2
20.0
1×10-3
23.2

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