土壌中有機塩素系農薬の逐次抽出 ○清家伸康・大谷卓（農業環境技術研究所） Q. なぜ逐次抽出なのか？吸着強度 A. 化学物質（有機塩素系農薬）と土壌との吸着強度別の存在量を評価することが出来る溶媒 A 強溶媒 B 溶媒 C 溶媒の極性溶媒 D 無 A. 土壌中の化学物質（有機塩素系農薬等）のBioavailabilityを評価することが出来る PAHsの微生物分解：水・メタノールでは過小，ブタノールでは過大評価 ★Macleod and Semple, Soil Biology & Biochemistry （2003）方法（逐次抽出） ★Macleod and Semple, Soil Biology & Biochemistry （2003）の方法に準拠土壌試料（8g 乾重）水・メタノール（1：1）40mL （固液比1：5）遠心分離（3000rpm，10分）上澄み： n-ブタノール画分振とう抽出（24時間）残土ジクロロメタン100mL 遠心分離（3000rpm，10分）上澄み：水・メタノール画分ソックスレー抽出（24時間）ジクロロメタン画分残土 n-ブタノール40mL （固液比1：5）振とう抽出（24時間）残土 0.1M Na2P2O7：0.1M NaOH（1：1）100mL 振とう抽出（24時間）クリーンアップ＆GC/MS測定 GC/MS 抽出液クリーアップスパイクヘキサン転溶フロリジルカラム Hex 25%DCM/Hex グラファイトカーボンカラム Hex シリンジスパイク HRGC/HRMS HP6890(Hewlett-Packard) / AutoSpec Ultima(Micromass) ・・・GC Conditions・・・ Column Oven Temp. Inlet Temp. Carrier Gas ・・・MS Conditions・・・ Resolution Ionizing Current Ionizing Voltage Ion Source Temp. Accel. Voltage Monitor Ions (m/z) ENV-8MS (0.25 mm i.d. × 30 m, 0.25 µm) 120 ℃(0 min) – 10℃/min  180℃  4℃/min  210℃  10℃/min  300 ℃ (10min ) 260℃ He（1mL/min） 10000 500 µA 35-40 eV 250 °C 8 kV HCHs DDTs DDDs DDEs Aldrin Dieldrin Endrin Heptachlor Mirex HCBz TeCB Heptachlor Epoxide HxCB Chlorldanes Oxy-Chlorldane Nonachlors 12C 216.9145, 218.9116 235.0081, 237.0052 235.0081, 237.0052 246.0003, 247.9974 262.8570, 264.8540 262.8570, 264.8540 262.8570, 264.8540 271.8102, 273.8072 271.8102, 273.8072 283.8102, 285.8072 352.8442, 357.8413 372.8260, 374.8230 386.8052, 388.8023 406.7870, 408.7840 13C 222.9347, 224.9317 247.0484, 249.0454 243.0583, 245.0553 (D8) 258.0406, 260.0473 269.8804, 271.8775 269.8804, 271.8775 269.8804, 271.8775 276.8269, 278.8240 276.8269, 278.8240 289.8303, 291.8273 301.9626, 303.9597 362.8778, 364.8748 371.8817, 373.8788 382.8595, 384.8566 396.8388, 398.8358 416.8205, 418.8176 検討項目供試土壌：・黒ボク土；T-C=9.9% ・褐色低地土；T-C=1.9% ※添加試験ではなく，現地（農家）圃場の土壌 1. 全量抽出と逐次抽出・アセトンによるソックスレー抽出と逐次抽出（合計）の結果を比較 2. 逐次抽出での各種溶媒の抽出率と炭素含量との関係・抽出率の特徴・物理化学的性質（Kow，Koc）からの解析 3. 応用例・土壌中の可吸態ディルドリンの評価：キュウリによる吸収アセトン（ソックスレー） 1000 100 (n=3) 全量抽出逐次抽出 H α CB -H β CH -H γ CH -H δ CH He pt He -HC ac pt H tra hlor ach ns Ep lor -C o x cis Hlo ide r t r a C da ns hlo ne -N rd cis on ane -N ach Ox o na lor yc ch hlo lor rd o,p an '- e p,p DD '- E o,p DD '- E p,p DDD 'o,p DDD 'p,p DDT '-D D Ar T dr Di in eld r En in dr in Mi re x H α CB -H β CH -H γ CH -H δ CH He pt He -HC ac pt H tra hlor ach ns Ep lor -C o x cis Hlo ide tra -C rda ns hlo ne -N rd cis on ane -N ach Ox o na lor yc ch hlo lor rd o,p an '-D e p,p D '- E o,p DD '- E p,p DDD 'o,p DDD 'p,p DDT '-D D Ar T dr Di in eld r En in dr in Mi re x 濃度（ng/g-dry）全量と逐次（合計）の抽出効率水・メタノール（振とう）+ n-ブタノール（振とう）+ ジクロロメタン（ソックスレー）・黒ボク土；T-C=9.9% ・褐色低地土；T-C=1.9% 1000 100 10 10 1 1 0.1 0.1 0.01 0.01 ● 全量抽出＝逐次抽出（合計） (n=3) 全量抽出逐次抽出 60% 40% H α CB -H β CH -H γ CH -H δ CH He H pt ac ep HCH t h a tra lo ch ns r E lor -C po cis Hlo xide tra -C rda ns hlo ne -N r d cis on ane -N a c Ox o n hlor yc ach hlo lo r r o,p dan ' -D e p,p D '- E o,p DD '- E p,p DD '- D o,p DD '- D p,p DD ' -D T D Ar T dr Di in eld r En in dr i Mi n re x H α CB -H β CH -H γ CH -H δ CH He pt He -H ac p CH tra hlo tach ns r E lor -C po cis Hlo xide tra -C rda ns hlo ne -N rd cis on ane -N ac Ox o n hlor yc ach hlo lo r r o,p dan '- e p,p DD '- E o,p DD '- E p,p DD '- D o,p DD '- D p,p DD '-D T D Ar T dr Di in eld r En in dr i Mi n re x 逐次抽出（各抽出画分の割合）・黒ボク土；T-C=9.9% ・褐色低地土；T-C=1.9% 100% 100% 80% 80% NaＯＨ 60% ジクロロブタノール 40% 水/メタ 20% 20% 0% 0% NaＯＨジクロロブタノール水/メタ ● 両土壌とも，水・メタノール + n-ブタノールで60～80% ● 水・メタノールによる抽出量：黒ボク土＜褐色低地土（5～20%）（10～60%） ○ NaOHで抽出される量は，全量に対し5%以下 ※ただし，NaOH存在下では分解されている可能性有り抽出率とKow*との関係 *Suntio et al.(1988) Rev..Environ. Contam. Toxcol. 水・メタノール水・メタノール + n-ブタノール 100% 100% 褐色低地土黒ボク土 r=-0.63 (p<0.05) Y=-0.078X+0.66 80% 抽出率抽出率 80% 60% 40% r=-0.71 (p<0.01) Y=-0.040X+0.27 60% 40% 20% 20% 0% 0% 2 3 4 5 6 7 褐色低地土黒ボク土 HCHs 2 Log Kow* 3 5 4 6 Log Kow* ●水・メタノール抽出率とKowの関連有り。+ブタノールは無し。 ●水・メタノール抽出の場合，黒ボク土と褐色低地土で回帰直線の傾きが異なる → 抽出率と炭素含量との関係 7 土壌吸着平衡定数 Koc= Kowとの関係炭素含量との関係 ※Kocの推定値：金澤（1992 ） logKoc = 0.402 logKow +1.071 水・メタノール（1：1） 4 5 Log Koc（褐色低地土）黒ボク土褐色低地土推定値埼玉新潟 4 Log Koc Kd×100 T-C（％）水・メタノール 3 2 +ブタノール 3 p,p'-DDD p,p'-DDT HCB p,p'-DDE α-HCH Heptachlor δ-HCH Ardrin o,p'-DDT o,p'-DDE transcis-Nonachlor γ-HCHEndrin o,p'-DDD cis-Chlordane transNonachlor Heptachlor β-HCH CHlordane Oxychlordane Epoxide Dieldrin 2 1 1 0 0 2 3 4 5 6 7 Log Kow ● Kowとの関係：水・メタノール ◎ +ブタノール △～× 8 0 1 2 3 4 Log Koc（黒ボク土） ● 炭素含量が異なる土壌間でKocは同じ値 → 平衡状態が成立土壌における有機塩素系農薬の物性に応じた“動き“を表現できる抽出法応用例1：可吸態ディルドリンの評価【背景：従来は全量抽出による土壌中濃度×0.3が目安とされていた】キュウリ土壌：ディルドリン濃度が同等で，炭素含量が異なる 100 400 濃度(ng/g-wet) 300 200 100 60 40 20 0 黒ボク土 0 土土ク地ボ低黒色褐土土ク地ボ低黒色褐土土ク地ボ低黒色褐土土ク地ボ低黒色褐アセトンソックスレー水・メタノール（1：1）水・メタノール + ブタノール水・メタノール + ブタノール +ジクロロメタンソックスレー全量逐次抽出 ※水・メタノール（1:1）抽出が，キュウリによるディルドリンの吸収を表現していそう褐色低地土汚染土の予測（判定）キュウリ中濃度濃度(ng/g-dry) 80 0.02ppm 土壌中濃度（水・メタノール）土壌中残留性有機化合物の光学異性体選択的な分解（1）水田土壌中α-HCH光学異性体比の経年変化 ○清家伸康・大谷卓独立行政法人農業環境技術研究所仮説製剤濃度 (+) (-) 1960～70年 (+) (-) (+)+(-)濃度 1980～90年 (+) (-) 濃度全消失量時間 (+) 濃度生物による消失量 (-) 濃度 0 時間（+）（-）比より生物による消失量分析方法 ◎分析フロー土壌（5g）ソックスレー抽出アセトン300mL，16時間ヘキサン転溶フロリジルカラム 1.ヘキサン 30mL 2.ヘキサン/DCM 80mL グラファイトカーボンカラムヘキサン 10mL 高分解能GC/MS測定 ◎高分解能GC/MS測定条件 GC/MS HP6890(Hewlett-Packard) / AutoSpec Ultima(Micromass) ・・・GC Conditions・・・ β-DEX120 (0.25 mm i.d. × 30 m, 0.25 µm) Column Oven Temp. 120 ℃(0 min) – 5℃/min  200 ℃ (60min ) Inlet Temp. 250℃ Carrier Gas He（1mL/min）・・・MS Conditions・・・ Resolution 10000 Ionizing Current 500 µA Ionizing Voltage 35-40 eV Ion Source Temp. 250 °C Accel. Voltage 8 kV Monitor Ions (m/z) 216.9145, 218.9116 試料； 5g 定量下限値：最終濃縮量； 200ul 注入量； 1ul 0.0056 ng/g クロマトグラム（β-DEX120）標準物質 (+) (-) HCHs 12000000 10000000 Intensity 8000000 6000000 4000000 2000000 0 28.4 28.8 29.2 29.6 Retention Time (min) 30.0 30.4 30.8 30.0 30.4 30.8 水田土壌（Site3 1972年） (+) (-) HCHs 200000 Intensity 160000 120000 80000 40000 0 28.4 28.8 29.2 29.6 Retention Time (min) ②生物が関与する消失割合の推定・光学異性体比（ER）を指標とする・Site3 を例に Concentration （ ng g-1) 100 (+) (-) 生物が関与する消失量 10 全消失量に対する生物が関与する消失の割合 1 （少なくとも） 0.1 1963 1966 1969 Year 1972 3.5%