INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES
INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
PRÁCTICA 1
Determinación de actividad enzimática y efecto de la
concentración de enzima, pH, temperatura y fuerza
Iónica en la actividad enzimática (alfa-amilasa).
La Práctica 1 incluye 6 módulos de iniciación de técnicas analíticas y manejo
de equipo (1.1 a 1.6) necesarias para el curso y las tres últimas están
enfocadas tema central relativa actividad enzimática, parte fundamental del
desarrollo del curso.
Contenido
1.1 Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. ...... 2
1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas. ............ 7
1.3. Preparación de reactivos requeridos en el laboratorio de
bioconversiones. ................................................................................................. 13
1.4 Determinación de crecimiento celular por turbidimetría (D.O.), peso
seco, proteína y cuenta directa en cámara de Neubauer. ........................ 14
1.5 Determinación de azúcares reductores y azúcares totales. ................... 17
1.6 Determinación de la concentración de proteína de las enzimas
elegidas. ................................................................................................................. 20
1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas y/o de extractos crudos
enzimáticos: Amilasas. ...................................................................................... 23
1.8 Efecto de la concentración de enzima y fuerza iónica en la actividad de
la enzima elegida. ................................................................................................ 25
1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática. ...................... 27
Cada módulo se llevará a cabo en una o más sesiones, las cuales serán
determinadas por el profesor, requiriéndose para toda la práctica un máximo de
9 sesiones (cinco semanas)
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1.1 Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio.
USO DE MICROPIPETAS AUTOMÁTICAS
En las prácticas de Bioquímica los volúmenes de las soluciones que se
necesitan medir son del orden de microlitros (μL). Para tomar estas cantidades
con exactitud y reproducibilidad se emplean micropipetas, ya sean de volumen
fijo o variable. Los errores de medida que se pueden cometer dependen
principalmente del usuario y no de la micropipeta en sí, a menos que esta no
esté bien calibrada. Para que las medidas sean correctas se debe de tener en
cuenta las siguientes consideraciones:
La pipeta debe de mantenerse siempre en posición vertical durante todo el
proceso de pipeteo, nunca inclinada. También, cuando la pipeta no se utilice se
debe dejar siempre en posición vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje
horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga líquido
succionado.
Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo
miden solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se
puede seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado.
En éstas, no se deben ajustar volúmenes superiores o inferiores a los que se
recomiendan para cada pipeta.
Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200 μL usan puntas amarillas
(o blancas), y las micropipetas que toman volúmenes superiores a 200 μL
hasta 1 mL usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas
que manejan volúmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 μL, pueden usar otro tipo
de puntas específicas.
La pipeta se agarra como si se tomara una empuñadura. La parte superior
debe de reposar sobre su dedo índice (Fig. 1).
Todas las pipetas tienen dos topes:
1) Primer tope para tomar el volumen calibrado.
2) Segundo tope para expulsar de forma más eficiente el volumen tomado y
se usa solo cuando se está expulsando el contenido. .
Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomará un
volumen mayor al deseado, un volumen ERRONEO- El segundo tope es para
sacar de forma más eficiente el volumen establecido
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Posición Inicial
1 2
3
4
Primer Tope
Segundo Tope
Fig. 1 Manera de asir una pipeta automática y tomar una muestra (presión
del émbolo).
Tanto la presión como la liberación del émbolo de la pipeta se debe de realizar
lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar
burbujas dentro de la punta de la pipeta, que alterarían los volúmenes; así
mismo se podría ensuciar la parte interna de la pipeta.
También se pueden formar burbujas o tomar un menor volumen si la punta no
está bien ajustada a la pipeta.
Procedimientos
micropipeta
para
medir
correctamente
un
volumen
con
una
1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que
esté dentro del intervalo establecido para la pipeta).
2. El volumen requerido se fija girando el émbolo (Fig. 2). Se debe girar
suavemente (evitar estar cambiando constantemente los volúmenes,
para evitar descalibrar las pipetas).
Fig. 2 Manera de fijar el volumen deseado.
3. Colocar una punta desechable en el vástago de la pipeta (Fig. 3);
asegurando que esté bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de
torsión y presionando. Tener cuidado de no presionar mucho porque
esto hace que la punta quede atorada fuertemente dificultando retirarla.
3
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Figura 3
Figura 4
4. Tomar la muestra presionando suavemente el émbolo con el pulgar
hasta el primer tope.
5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no más de 3 mm de la
superficie de líquido, manteniendo la pipeta en posición vertical (Fig. 4).
6. Succionar el líquido, relajando suavemente y controlando la presión
con el dedo pulgar, sin permitir que el émbolo suba por sí solo. Se
espera un par de segundos con la punta introducida en el líquido.
7. Retirar la punta de la muestra.
8. Introducir la punta de la pipeta en el tubo o frasco donde se va a verter,
colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la
solución.
9. Presionar el émbolo lentamente, llevándolo hasta el primer tope.,
continuando inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la
totalidad del líquido que está en la punta.
10. Con el émbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la
pipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.
11. Llevar el émbolo a la posición inicial, controlando con el dedo (sin
permitir que el émbolo suba por sí solo).
12. Sacar la punta de la pipeta, presionandoel expulsor de puntas o tirando
de ella, (Fig. 5).
En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la mezcla,
una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja y
sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope.
El procedimiento completo se esquematiza en la Figura 6.
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Figura 5
Figura 6
http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropi
petas.htm
TRABAJO PRÁCTICO
Cada equipo realizará lo siguiente:
1. Elegir la micropipeta adecuada para 20, 200 o 1000 μL. Seleccionar el
volumen indicado en la tabla 1 y colocar la punta adecuada.
2. Tomarla muestra indicada como se indicó anteriormente.
3.
Transferir el líquido a un tubo Eppendorf, colocando la punta de la
micropipeta en la pared interna del tubo Eppendorf al cual se va a transferir
la muestra, depositar la muestra según el procedimiento ya indicado.
4. Eliminar la punta en un recipiente determinado para este fin, colocando
encima del recipiente la punta y presionando el pistón ubicado en la parte
inferior, atrás del pistón de succión. Cada vez que se agregue un volumen
seleccionado, se registrará su peso en la balanza (dependiendo de la
sensibilidad de la balanza), cada volumen se hará por duplicado.
IMPORTANTE
Cuando se vaya a pipetear solvente volátiles, como diclorometano, acetona,
cloroetileno, cloroformo, etc. Antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con
el solvente. Esto se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el
embolo repetidamente sin llegar al primer tope. Finalmente teniendo al punta en el
solvente bajar el embolo hasta el primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la
posición inicial.
Cuando no se satura, al sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se
volatiliza dentro de la misma.
Cuando se tomas muestras viscosas o densas como el glicerol, debe esperar a que
suba muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrará aire. Esto
indica que aún no se había tomado todo el volumen y se debe repetir todo el
procedimiento.
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Ensayar varias veces este procedimiento con las diferentes micropipetas así
como cambiar los volúmenes de acuerdo a las tablas 1 y 2:
Tabla 1. Volúmenes de agua a seleccionar para el uso de micropipetas.
1000 μL
600
200
100
200 μL
150
100
50
20 μL
16
12
8
4
1
Tabla 2. Volúmenes de glicerol a seleccionar para el uso de micropipetas.
1000 μL
600
200
200 μL
150
100
20 μL
20
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Practicar con el profesor la toma de muestras volátiles
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1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas.
Fotometría
La fotometría o "medida de la luz" es un método óptico de análisis dentro del cual
se encuentran la colorimetría y la espectrofotometría, que miden la cantidad
de luz absorbida por sustancias colorido o colorido e incoloras respectivamente.
La luz es una forma de energía electromagnética, igual que los ultravioletas, infrarrojos etc.
Que es irradiada a partir de una fuente energética en líneas o rayos virtualmente rectos. Se
propaga en el vacío sin necesitar sustancia transportadora. Dentro de su trayectoria
rectilínea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran perpendicularmente a su
dirección de desplazamiento y cuya longitud de onda se sitúa entre 380 y 780 nanómetros.
Longitud de onda: Es la distancia entre dos picos sucesivos de una onda. La luz
que percibe el ojo humano es la luz visible y comprende desde 400 a 700 nm.
Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama
infrarroja; entre 100 y 400 nm es radiación ultravioleta (UV).
Las medidas de absorción de luz se basan en dos leyes, la ley de Lambert y la
ley de Beer.
Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la
longitud del medio absorbente aumenta.
I0
I = I0 ⋅ 10 -K.L
log
= K⋅L
I
donde:
I = intensidad de luz transmitida
I0 = intensidad de luz incidente
K = coeficiente de extinción
L = espesor de capa
K es el coeficiente de extinción definen cuan fuertemente una substancia absorbe
la luz a una dada longitud de onda, por unidad de masa o por concentración
molar.
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio
absorbente (Fig 1), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que
aumenta la concentración de la sustancia absorbente en el medio.
I0
I = I0 ⋅ 10 –K’.C
log
= K’ ⋅ C
I
donde
C = concentración de la sustancia absorbente
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Sol.Absorbente
concentración C
Luz
Rayo incidente
monocromática
Intensidad I0
Rayo emergente
Intensidad I
L
Espesor de la solución
Figura 1. Diagrama del paso de luz monocromática a través de una solución
Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer:
I0
-ε⋅C⋅L
I = I0 ⋅ 10
log
= ε⋅c⋅L
I
donde ε = coeficiente de extinción molar
ε es el coeficiente de extinción cuando la solución contiene un mol por litro.
El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele
expresar como un porcentaje
I
T=
- ε⋅c⋅L
=10
I0
La expresión log
I
%T =
x 100
I0
I0
I0
A = D.O. = log
se conoce como absorbancia (A) o densidad óptica (DO)
= ε ⋅ c ⋅ L ; para L=1, A = ε⋅c
I
T y A quedan relacionados de la forma A = - log T = 2 - log %T
ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROFÓTOMETRO
Espectrofotómetros: Los métodos fotométricos de análisis utilizan los efectos de
la interacción de las radiaciones electromagnéticas con las moléculas. Los
aparatos de medición de la absorción de la radiación electromagnética se
denominan "espectrofotómetros" y están constituidos de forma general de (Fig 2):
Una fuente de luz, un monocromador, que desdobla la luz en haces
monocromáticos, de un colimador que tiene una rendija de ajuste variable,
pasando a través del mismo sólo luz de una determinada longitud de onda. La
utilización de la luz monocromática o de un intervalo pequeño de longitudes de
onda es importante, ya que la ley de Lambert-Beer solo se cumple en estas
condiciones.
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La luz que sale del colimador se hace pasar por la solución y luego incide sobre
el fototubo donde es detectada. La señal se envía a un registrador que
convierte la señal a un registro análogo, digital o gráfico.
En algunos colorímetros este registro consta de dos escalas, una mide
absorbancias (A) y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a ∞ ,
la de T va desde 0 a 100, en sentido contrario.
Colimador
Monocromador
Fototubo
Celda con
muestra
Registro
Fuente de luz
%T 0
A ∞
100
0
Figura 2. Esquema de las partes básicas de un espectrofotómetro
Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se
introduce una CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de
transmitancia y a cero de absorbancia. Posteriormente, se introduce una celda
con la muestra y se lee sea la transmitancia o la absorbancia a la longitud de
onda determinada.
Colorímetros: Los métodos colorimétricos son una aplicación de la
espectroscopía y se basan en la medida de la absorbancia de una solución
coloreada en la región visible del espectro (400-700 nm). La fuente de luz suele
ser una lámpara de wolframio. Los compuestos no coloreados se transforman
en otros con color, susceptibles de ser medidos colorimétricamente, mediante
reacción con compuestos adecuados, y de esta forma se puede analizar en la
región visible del espectro compuestos coloreados y sin color y ampliar sus
posibilidades de utilización.
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CAPACITACIÓN PARA EWL MANEJO DE ESPECTOFOTÓMETROS
Actividad en laboratorio:
Los maestros de laboratorio indicarán cómo operar y programar los equipos. El
alumno deberá anotar en su bitácora cada paso y realizar un diagrama de flujo
de los pasos, así como las consideraciones que hay que tener en el manejo,
mantenimiento y limpieza del equipo.
Existen diferentes modelos de espectrofotómetros en los laboratorios de
docencia, de investigación y una gran gama en el mercado. Para el laboratorio
se utilizarán dos o tres modelos, se debe aprender el manejo de cada uno.
Para la lectura de muestras se utiliza celdas o cubetas de cuarzo o
desechables de plástico, existen de diferentes volúmenes de operación 4, 2 y 1
mL.
Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo.
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CENTRÍFUGA BECKMAN J2-MC
Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo.
Rotores: JA-20 para 8 tubos de 45 mL
JA-14 para 6 tubos de 250 mL.
Asegúrese de equilibrar los tubos de centrífuga con la muestra en una
balanza.
Se puede hacer con la misma sustancia o puede usar un contrapeso de agua.
Para abrir:
•
Mueva el interruptor a la posición ON.
•
Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta)
Para programar:
•
Oprima ROTOR e introduzca el número 14 ó 20, dependiendo del tipo de
rotor a usar.
•
Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades
máximas para cada rotor, para esto existe una tabla)
•
Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min).
•
Oprima TEMP y teclee la temperatura (° C)
•
Al terminar la selección, oprima ENTER.
Para operar:
•
Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias
(encontradas).Los contrarios deben tener el mismo peso
•
Coloque la tapa del rotor.
•
Cierre la centrífuga.
•
Permita que el equipo enfríe a la temperatura indicada antes de comenzar
el programa.
•
Oprima el botón START para iniciar el programa.
•
Se puede abortar oprimiendo el botón STOP.
NOTAS:
•
La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido.
•
Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cámara
de la centrífuga se deshiele. Asegúrese de secar la cámara. Proceda a
cerrar el equipo.
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CENTRÍFUGA HERMLE Z300
Antes de usar, siempre regístrese en la libreta u hoja de control del equipo.
Cuenta con tres Rotores para:
24 tubos Eppendorf de
12 tubos Falcon de
6 Tubos Falcon de
1.5 mL
15 mL
50 mL
Para cambiar rotor:
•
Utilice la llave del equipo.
La rosca es izquierda.
Girar a la derecha
Girar a la izquierda
Para abrir: Oprima
el
botón
de
para aflojar,
para apretar.
apertura.
El equipo solo se abre cuando el LED (foco o luz verde) está encendido, señal
que el rotor se ha detenido y que es posible abrir.
Precaución al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla
lentamente.
Para programar:
Mantener oprimido el botón preset
•
Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla
•
Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla
•
Para operar:
•
Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en
posiciones encontrada (contrarias). Los tubos deben estar equilibrados por
par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que los tubos
encontrados tengas el mismo peso.
•
Coloque la tapa del rotor (si éste posee una).
•
Cierre la centrífuga.
•
Oprima el botón start para iniciar el programa.
•
Se puede parar oprimiendo el botón stop.
En caso de que, por alguna falla en el suministro eléctrico, la pantalla se
muestre intermitente, desconecte el equipo, espere unos segundos y conéctelo
nuevamente. Proceda con la programación.
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1.3. Preparación de reactivos requeridos en el
bioconversiones.
laboratorio de
Reactivo de Bradford
Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al
95%. A esta solución se le añaden 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). La
solución resultante se diluye a un volumen final de 1L. Las concentraciones
finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-250,
4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico.
Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser café. Si tiene
un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar
nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario.
Reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
1. Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada hasta
obtener un volumen final de máximo 50 mL.
2. Agregar 1.6 g de NAOH previamente disueltos en 10 mL de agua destilada.
3. Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en 20 mL de agua destilada.
4. Aforar a 100 mL con agua destilada.
5. Guardar en obscuridad y en frasco ámbar.
Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener
cuidado con los volúmenes que se manejan, por que el volumen final no debe
ser mayor a 100 mL. Para esto, se aconseja ir disolviendo el tartrato de sodio
agregando agua hasta lograr el volumen final de 50 mL (no agregar 50 mL de
agua a la sal por que dará un volumen mayor) .
Solución de Almidón 1% (p/v)
Suspender 1g de almidón en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, el
cual deberá estar tibio o caliente. Posteriormente desnaturalizar calentando en
baño de agua a 60 °C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidón.
Solución de alfa-amilasa
La concentración de enzima será indicada por el profesor y será en mg de proteína o
enzima por mL de regulador de fosfatos, 0.1 M, pH 7.0.
Solución de antrona
Disolver 0.2 g de antrona en 5 ml de etanol y aforar a 100 ml con H2SO4 al
75%.
Para preparar el ácido al 75%, se debe realizar en la campana de extracción,
en un baño de hielo, colocar el matraz o pobreta que contienen el agua en el
baño e ir agregando lentamente por las paredes el ácido. Usar material de
seguridad, lentes y guantes.
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1.4 Determinación de biomasa microbiana por turbidimetría o Densidad
Óptica (D.O.), peso seco y cuenta directa en cámara de Neubauer.
La determinación biomasa microbiana puede realizarse por varios métodos
tanto directos como indirectos, tres de estos son:
1. Densidad óptica (D.O.) o turbidimetría
2. Peso seco
4. Cuenta en cámara de Neubauer
PARTE EXPERIMENTAL
1) Densidad óptica
A partir de muestras obtenidas de una cinética de crecimiento, es decir del
medio de cultivo a través del tiempo, (o a partir de diluciones de un cultivo
concentrado), obtener la densidad óptica de las muestras leyendo a 600 nm.
Las lecturas no deben ser mayores a 1 de absorbancia, es ese caso es
necesario realizar diluciones, para obtener el intervalo de lectura menor a 1. El
blanco es el medio de cultivo fresco utilizado; así mismo, éste se debe usar
para las diluciones en muestras que den lecturas mayores a 1.
Se entregará un cultivo microbiano, el cual se leerá la DO a 600 nm y a partir
de la lectura se establecerán 5 diluciones para leer. Con las lecturas graficar la
densidad óptica vs. dilución.
La DO se puede graficar vs concentración de proteína extracelular, peso seco,
numero de células, proteína celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas
2) Peso seco
a) Etiquetar charolas de aluminio y ponerlas a peso constante a 60ºC por 24
horas en una estufa, enfriar en desecador y pesar.
b) Tomar una alícuota de 10 a 15 mL de la suspensión celular (de cada dilución
hecha para DO) y colocarlo en un tubo de centrífuga.
c) Centrifugar las muestras a una velocidad de 6000 rpm durante 5 min.
Recuerde equilibrar los tubos antes de centrifugar.
d) Eliminar el sobrenadante y resupender la pastilla celular en un poco de agua
destilada y pasarla a una charola a peso constante y previamente pesada.
e) Dejar las charolas en una estufa a 60ºC por 24 h o hasta que la pastilla este
completamente seca, enfriar en desecador y pesar cada charola.
f) El peso seco se obtiene de la diferencia entre el peso final y el inicial de cada
charola.
g) Graficar peso seco vs DO y vs no de de células/mL.
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3) Cuenta directa en Cámara de Neubauer
La cámara de Neubauer es una cámara adaptada para ser utilizada en un
microscopio de campo claro o de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresión en el centro, con el fondo marcado con una
una cuadrícula (Fig 1). Es un cuadrado de 3 x 3 mm, subdividido en 9 áreas de
1mm2 cada una. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm
respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos
éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido
entre la superficie de cada área y el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1
microlitros).
Las diferencia entre las áreas 1,3,7 y 9; 4,2,6,8 y la 5 son las subdivisiones, lo
que permite en ese orden contar células de mayor a menor tamaño, contando
bacterias y levaduras en el área 5, que cuenta con 25 subdivisiones y se
observa en 40 o 100X
Se deben contar el número de células de cuatro o cinco cuadros de un área, la
concentración en la suspensión celular será:
Cél/mL = N X 104 X F
(ecuación 1)
Donde:
N: La media de las células contadas (suma de células contadas por
subdivisión/Número de subdivisiones contadas)
25: es el número de cuadrados en cada grilla.
104: factor para pasar el número de células en el cuadrado central (volumen =
0.1mm3 = 0,1μL) a número de células por mL (1000mm3 = 1000μL=1 mL)
F: factor de dilución
Figura 1. Grilla de conteo de la cámara de Neubauer (Fugelsang and Edwards,
2007).
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El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma:
a) Limpiar cuidadosamente con papel de arroz la cámara de Neubauer.
b) Colocar el cubreobjetos sobre los canales, tal como se indica en la figura
1.
c) Agitar la suspensión celular para tener una muestra homogénea.
d) Con ayuda de una pipeta serológica de 1 mL o con una pipeta
automática de 100 µL, tomar 0.1 mL de la suspensión y colocar la punta
de la pipeta en el borde del cubreobjetos; dejar que la solución ingrese a
la cámara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Si se
forman burbujas se debe repetir la operación, lavando y secando la
cámara previamente.
e) Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con
el objetivo 10x.
f) Localizar el cuadro central de la rejilla (ubicando la cuadrícula de 25
cuadros de 0.04 mm2), hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y
contar el número de células de 4 o más subdivisiones. Evitar contar dos
veces la misma célula u omitir alguna.
g) En caso de que el número de células sea muy elevado y se dificulte su
conteo, será necesario diluir la suspensión en una proporción conocida,
la que deberá ser tenida en cuenta en la estimación final.
h) Calcular el número de células con la ecuación 1
Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications
and procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).
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1.5 Determinación de azúcares reductores y azúcares totales.
1) Azúcares reductores
• Colocar 0.1mL mL de reactivo de DNS en un tubo Eppendorf,
posteriormente adicionar 0.1, de la solución problema. Se puede
homogeneizar con la punta.
• Se puede sellar la tapa del tubo con Egapack, para evitar que se abran
durante la ebullición.
• Poner a baño maría (ebullición) por 5 min.
• Llevarlo después a hielo por 10 min.
• Añadir a 1mL de agua destilada.
• Agitar en el vortex y dejar hasta que esté a temperatura ambiente,
posteriormente:
• Leer la absorbencia a 540nm.
1.1 Curva tipo de maltosa.
La curva patrón se realiza con maltosa en un rango de concentración de 0 a 2.0
g/L
Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1 y tratarla de
acuerdo a la técnica de azúcares reductores.
Tabla 1. Diluciones para la curva patrón de maltosa.
Tubo
1. (Blanco)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Concentración de
maltosa en la
muestra
(g/L)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Volumen de la
solución de
maltosa de 2 g/L
(mL)
0.00
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Volumen de
agua destilada
(mL)
1.00
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro.
17
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Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje de las ordenas (eje“y”)
promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las
abscisas (eje”x”) el promedio de la concentración de maltosa determinada en
g/L.
Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:
y = mx + b
En donde “y” representa la absorbancia determinada a 540 nm.
“x” representa la concentración de maltosa determinada en g/L.
La curva patrón será correcta cuando se obtenga una r mayor o igual a 0.98,
con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.
18
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2) Azúcares Totales por el método de Antrona
Solución de antrona: 0.2 g de antrona disuelta en 5 ml de etanol, y aforar a 100
Ml con H2SO4 al 75%. (ver práctica 1.3)
•
Adicionar 0.2 mL de muestra en un tubo Eppendorf, posteriormente
adicionar lentamente 1 mL de solución de antrona, agregar la antrona
lentamente, es una reacción exotérmica. Cuando este método se realiza
con volúmenes mayores ej 1 mL de muestra y 5 de antrona debe realizarse en
frio (en baño de hielo porque es muy exotérmica)
• Agitar en Vortex y luego llevar a ebullición en baño Maria durante 10 min
(cuidado de que no se abras los tubos, es muy ácido, se recomienda
sellar las tapas con una tira de “Egapack”).
• Enfriar en hielo (para detener la reacción). Posteriormente sacar del
hielo y dejar a temperatura ambiente
• Leer a 650 nm (cuando la muestra ya esté a temperatura ambiente).
2.2 Curva tipo de sacarosa.
La curva patrón se realiza con sacarosa en un rango de concentración de 0 a
100 mg/L
Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 2 y tratarla de
acuerdo a la técnica de antrona.
Tabla 2. Diluciones para la curva patrón de sacarosa.
Tubo
1. (Blanco)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Concentración de
sacarosa en la
muestra
(mg/L)
0.0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Volumen de la
solución de sacarosa
100 m g/L
(mL)
Volumen de
agua destilada
(mL)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro.
Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:
y = mx + b
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1.6 Determinación de proteína.
Objetivo
Determinar la concentración de proteína de una solución enzimática con el
método de Bradford.
Introducción
La determinación de la concentración de proteínas puede realizarse por varios
métodos, entre ellos:
1. Leyendo la absorbancia a 280 nm, si se conoce el valor de su ∈280 [g-1L
cm-1], por ejemplo para la albúmina de suero bovino (BSA) su ∈280 [g-1L cm-1]
es de 0.667.
*∈280: coeficiente de extinción a 280 nm (en la región Ultravioleta del
espectro de luz)
Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con la albúmina de
suero bovino (BSA), como se indica en la tabla 3:
Tabla 3. Curva patrón de BSA para lectura en 280 nm.
Sol. de BSA
1000 μg/mL
(mL)
Agua destilada
(mL)
Concentración
de BSA
( μg/mL)
0.0 0.10
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90
1.0
1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10
0.0
0
100
0.2
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se lee la absorbancia a
280 nm ajustando el equipo con un “blanco de reactivos” (el que no contiene
proteína). Con los datos graficar, realizar una regresión lineal y obtener la
ecuación de la recta, con la que se calculará la concentración de la proteína
“problema”.
20
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2. Método de Bradford: El método de Bradford involucra la unión del azul
brillante de Coomassie G-250 a la proteína. Esta unión provoca un cambio en
el máximo de absorción de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es lo que
permite la cuantificación. Dicha unión es independiente de la composición de
aminoácidos de las proteínas. La concentración de proteína se determina por
medio de una curva tipo con Seroalbúmina Bovina (BSA) y el reactivo de
Bradford.
Desarrollo experimental
Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 µg/mL, a
partir de una solución de 200 µg/mL, (Tabla 4). Agregando en un tibo eppendorf
limpio las cantidad de solucions de BSA y agua como se indica en la tabla 4
para obtener un volumen final de .02 mL de muetra
Tabla 4. Curva Tipo de albúmina de suero bovino (BSA), para determinación de
proteína por Bradford
(BSA) 200
0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25
μg/mL (mL)
Agua destilada
0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0
(mL)
Concentración
de BSA
0
20
40
60
80
100 120 140 160 180 200
(μg/mL)
Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar
EXACTAMENTE 5 min y lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con
el “blanco de reactivos” o agua (el que no contiene proteína)
La cantidad de proteína contenida en la muestra se determina interpolando en
la ecuación obtenida con la curva tipo de seroalbúmina bovina a diferentes
concentraciones.
PROBLEMA: Determinar la concentración de una solución de tripsina por
espectrofotometría a 280 nm. .
A partir de una solución que contenga X mg/mL de tripsina (en agua destilada)
hacer por triplicado 7 diluciones adicionando 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5
mL de la solución de tripsina y agregar a cada uno agua destilada para llevar a
un volumen final de 1.0 mL (0.99, 0.98, .095, 0.9, 0.8, 0.75 y .05 mL), de agua
respectivamente) y leerlas a 280 nm.
Posteriormente de estas diluciones que tengan lecturas dentro de la curva,
tomar tres de ellas para hacer la determinación de la concentración por el
método de Bradford, considerando la sensibilidad de este método.
21
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Informe
1. Establecer la curva patrón de proteína con Bradford y otra por
espectrofotometría a 280 nm.
2. Calcular la concentración de proteína de la solución de tripsina usando los
dos métodos de determinación de proteína.
2. Discutir los resultados obtenidos.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
¿En qué se basa el método de Bradford?
¿En qué tiempo hay que leer la muestra en el método Bradford y por qué?
¿Cuál es la ventaja del método de Bradford?
¿Qué otros métodos de determinación de proteína existen, en que se basan
y su intervalo de sensibilidad?
Referencia.
Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”.
Anal. Biochem. 72, 248-254.
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1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas y/o de
extractos crudos enzimáticos: Amilasas.
OBJETIVO
Determinar la actividad enzimática de la α-amilasa y calcular las unidades de
actividad enzimática.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.Preparar una solución de almidón: 1% (p/v): Se suspende 1g de almidón
en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, Posteriormente se
desnaturaliza por calor en un baño de agua a 60 °C durante 15 min, para pregelatinizar el almidón.
Reactivos:
Almidón 1.0 % (p/v)
Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M
Reactivo de DNS
α-amilasa
Reactivo de Bradford
2. Realizar curva tipo de maltosa por el método de azúcares reductores DNS.
Realizar la curva de maltosa de 0.0 a 2.0 g/L. y determinar por método de DNS
(práctica 1.5)
3. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6)
a la solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario.
Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar
5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida
en la práctica 1.6.
4. Cinética de hidrólisis del almidón:
Tener antes de iniciar un el baño de agua en ebullición y otro de hielo.
1) Para cada muestra a la que se determinará actividad, tener listo un tubo
eppeddorf de 1.5 mL con 0.1/mL del reactivo DNS (10 tubos).
2) Por separado poner en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.95 mL de la solución
de almidón 1% a 20°C..
3) Aadicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa (excepto al
testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener
la reacción en el tiempo exacto. Para el tiempo cero tomar inmediatamente
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0.1 mL de la mezcla de reacción (otra persona), transferirlo rápidamente a
un tubo conteniendo 0.1 mL de reactivo DNS (éste será el testigo). Realizar:
un el Blanco sin agregar la enzima, es decir a los 0.1 mL de DNS, adiciones
0.1 mL de solución de almidón.
4) Dejar que la reacción se desarrolle a tres tiempos y por triplicado (9 tubos)
0.0 (testigo), 3.0 y 6.0 minutos exactamente. Transcurrido el tiempo
EXACTO transferir 0.1 mL de la mezcla de reacción a uno de los tubo que ya
contiene 0.1 mL del reactivo DNS.
5) Tratar todos los tubos al mismo tiempo según la técnica de DNS: Poner en
baño de agua a ebullición durante 5 min, exactamente. Cuidar de que no
entre agua a los tubos.
6) Transcurrido el tiempo sacra y poner en hielo o un baño de agua fría durante
10 min.
7) Posteriormente añadir 1.0 mL de agua destilada a dicha solución.
8) Se homogeniza la solución invirtiendo con la mano los tubos.
9) Se determina la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero con el blanco,
determinando la absorbancia para cada tubo testigo y problema (tiempo 3 y
6 min). La absorbancia del tubo testigo se resta al tubo problema con la
finalidad de eliminar la absorbancia que no sea atribuible a la reacción
enzimática. .
10) Se utiliza la curva patrón de DNS realizada con maltosa para determinar la
concentración de azucares reductores expresados como mg maltosa/ mL
de la muestra.
11) Expresar la actividad enzimática en unidades de actividad de alfa
amilasa/mL. Considerar la siguiente definición de una unidad de actividad
alfa amilasa: cantidad de enzima que libera 1 mg de maltosa a partir de
almidón después de 1 min de reacción con la enzima a 20°C y pH 6.9
III. INFORME:
1. Elaborar la curva tipo Abs540nm vs concentración de maltosa y determinar
la ecuación de la regresión lineal.
2. Calcular la actividad enzimática en unidades de actividad enzimática (U)
y actividad específica (Uesp).
U =
[ producto ]t1 − [ producto ]t 0
t
U esp =
[ producto ]t1 − [ producto ]t 0
(t )[ proteína ]
3. Hacer la gráfica de unidades de actividad de amilasa vs tiempo de
reacción.
4. ¿Cuáles son los productos de esta reacción?
5. Recopilar y comparar los resultados de todos los equipos, discutir si hay
diferencias.
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1.8 Efecto de la concentración de enzima en la actividad
enzimática de una amilasa.
OBJETIVO
Determinar el efecto de la concentración de enzima en la actividad denzimática.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Preparación del sustrato: Almidón al 1.0 % en regulador de fosfatos pH 7.0,
0.1M preparado como se indicó anteriormente.
Reactivos:
Almidón 1.0 % (p/v)
Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M
Reactivo de DNS
α-amilasa
Reactivo de Bradford
1. Determinación de la concentración de proteína en la solución
enzimática.
Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a la
solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario.
Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5
min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la
práctica 1.6.
2. Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de la reacción
enzimática.
a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 6,
adicionando, por triplicado, 0.95 mL de sustrato a diferentes
concentraciones.
b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa
(excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos
para poder detener la reacción en el tiempo exacto a la reacción
c) Incubar los tubos por 5 min (tiempo de reacción) en un baño o
termomixer a 25°C.
d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reacción y
adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.
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e) Continuar la determinación de DNS de acuerdo a lo indicado en la
práctica 1.5 y 1.7.
La reacción se llevara cabo a pH (7.0), tiempo de reacción y tempertaura
constante, siendo la única variable la concentración de enzima .
Tabla 6. Soluciones para determinar el efecto de concentración de la
enzima en la actividad enzimática .
3P1
3P2
3P3
3P4
3P5
0.25
0.5
1.0
2.0
3.0
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
Tubo
Testigo*
Soluciones de
Amilasa
(mg/mL)
*
Volumen de Sol.
Sustrato
(mL)
Vol. de sol. de enzima
en PO4 pH 7.0, 0.1M
(mL)
* 3P, significa 3 tubos Problema
*Para cada concentración de enzima se hace un testigo, para lo cual
inmediatamente después de adicionar los 0.05 mL de enzima, de pasa al tubo
con DNS.
Realizar el blanco con sol de almidón
Procedimiento:
A
INFORME:
1. Hacer la gráfica de unidades de actividad de amilasa vs concentración de
enzima.
2. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos
los equipos del grupo.
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1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática.
OBJETIVO
Estudiar el efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática de una
enzima: α-amilasa.
1. Determinación de la concentración de proteína en la solución
enzimática.
Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a la
solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario.
Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5
min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la
práctica 1.6.
2. Efecto de la temperatura en la actividad catalítica de las enzimas.
a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 7,
adicionando, por triplicado para cada temperatura a ensayar, 0.95 mL de
sustrato (almidón al 1%) y llevarlos a la temperatura deseada
poniéndolos en un baño maría.
Tabla 7. Soluciones y temperaturas para la prueba de efecto de la
temperatura en la actividad enzimática .
Tubo
Temperatura
de reacción
(°C)
Sol. de
Almidón 1.0 %
(mL)
*Sol.
de
Enzima
en
regulador PO4
pH 7.0
(mL)
Testigo*
3P1
3P2
3P3
3P4
3P5
Uno
por
cada
temperatura
25
35
45
55
65
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
*α-Amilasa: 1.0 mg/mL
3P, significa 3 tubos Problema
27
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b)
c)
d)
e)
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Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa
(excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos
para poder detener la reacción en el tiempo exacto a la reacción
Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5
min (tiempo de reacción) en un baño a cada temperatura.
Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reacción y
adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.
Continuar la determinación de DNS de acuerdo a lo indicado en la
práctica 1.5 y 1.7.
La reacción se llevara cabo a tiempo constante de reacción y concentración de
enzima constante, siendo la única variable la temperatura de reacción.
3. Determinación de la concentración de proteína en la solución
enzimática.
Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a
cada solución de enzima proporcionada (cada pH). Hacer diluciones si es
necesario.
Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5
min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la
práctica 1.6.
4
Efecto del pH en la actividad catalítica de las Enzimas
Reactivos:
Almidón 1.0 % (p/v) en Reguladores a diferentes pH
Regulador de Acetatos pH 5.0
Regulador de Fosfatos pH 6.0, 7.0 y 7.5 0.1 M
Regulador de Boratos pH 8.0, 9.0 y 10.0
Preparar las soluciones de enzima con el regulador de pH indicado por el
profesor.
a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 8,
adicionando, por triplicado para cada pH a ensayar, 0.95 mL de sustrato
(almidón al 1%).
b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa
(excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos
para poder detener la reacción en el tiempo exacto a la reacción
c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5
min (tiempo de reacción).
d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reacción y
adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.
e) Continuar la determinación de DNS de acuerdo a lo indicado en la
práctica 1.5 y 1.7.
28
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Tabla 8. Soluciones de enzima a diferentes pH para determinar el efecto
del pH en la actividad enzimática.
Tubo
Testigo*
pH
3P1
3P2
3P3
3P4
3P5
3P6
3P7
5.0
6.0
7.0
7.5
8.0
9.0
10.0
Sol. de
almidón al 1.0
% (mL)
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
Enzima +
regulador al
pH indicado
(mL)
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
3P, significa 3 tubos Problema.
* Para cada pH se hace un testigo.
Seguir el mismo procedimiento indicado en el experimento del efecto de la
concentración de enzima.
INFORME:
1. Hacer la gráfica de Unidades de actividad de amilasa vs temperatura de
reacción.
2. Hacer la gráfica de Unidades de actividad de amilasa vs pH de la
reacción.
3. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por
todos los equipos del grupo.
29
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
Academia de Biotecnología.
Asignaturas:
Profesores: Luis C. Fernández Linares, María del Carmen Oliver Salvador,
Determinación de constantes cinéticas, Km y V max y medición de la actividad
enzimática de la invertasa
El objetivo de la práctica es determinar el efecto de la concentración del sustrato en la
velocidad las reacciones enzimáticas, determinando las constantes cinéticas, Km y Vmax, de
la invertasa.
Las invertasa hidroliza la unión glicosídica de la sacarosa. La sacarosa es un disacárido
compuesto de una molécula de α-D-glucosa y una molécula de β-D-fructosa, ligadas por un
enlace α-1,4-glicosídico. Cuando este enlace es roto en una reacción de hidrólisis, se
genera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa.
Sacarosa + H2O ---> glucosa + fructosa
El nombre oficial de la invertasa es beta-fructofuranosidasa (EC3.2.1.26), lo que implica que
la reacción catalizada por esta enzima es la hidrólisis del grupo terminal no reductor de la
sacarosa. La invertasa es utilizada principalmente en confitería, donde la industria de
alimentos prefiere más a la fructosa que a la sacarosa, debido a que es mucho más dulce y
no cristaliza tan fácilmente.
La invertasa es producida por una amplia gama de microorganismos que pueden utilizar la
sacarosa como nutriente. Comercialmente, la invertasa es biosintetizada principalmente por
cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis. Incluso
dentro del mismo cultivo de levadura, la invertasa existe en más de una forma. Por ejemplo,
la invertasa intracelular tiene un peso molecular de 135,000 Da, mientras que la variedad
extracelular tiene un peso molecular de 270,000 Da.
A diferencia de la mayoría de otras enzimas, la invertasa exhibe una actividad relativamente
alta en un amplio intervalo de pH (3.5-5.5), con el óptimo cercano a pH 5.0; por otro lado la
temperatura óptima es de aproximadamente 55 ºC.
Parte experimental:
Preparación de reactivos:
Sustrato: preparar sacarosa (30.0 g/L), disolver el sustrato en agua, la mitad del volumen
que se vaya a preparar y se afora con regulador de acetatos 0.05M pH 5.0. Preparar 50 mL
de sustrato.
Enzima: invertasa 0.4 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0.
Diluciones de sutrato:
Obtención de concentraciones de sacarosa: Realizar diluciones con regulador de acetatos
0.025 M de 0 a 30 g/L
1
Tabla 1. Preparación de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones
Sacarosa (30 g/L)
(mL)
0
1
3
4
5
8
10
Acetatos 0.025M
(pH 5.0)(mL)
10
9
7
6
5
2
0
Concentración final
de sacarosa (g/L)
0.0
3.0
9.0
12.0
15.0
24.0
30.0
Preparar 10 ml de cada concentración por grupo, dividir las soluciones por equipos.
Procedimiento:
La prueba se realizará por triplicado con un blanco para toda la prueba y un testigo para
cada concentración.
1. Colocar 0.95 mL de sustrato, para cada concentración y de acuerdo a la tabla 2, en un
tubo eppendorfd, se deja equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.
2. Agregar 0.05 mL de la enzima y agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder la
reacción durante 5 min.
Condiciones de la reacción: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en °C
(temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar el
experimento).
3. Inmediatamente después de terminada la reacción (5 min), tomar un alícuota de 0.1 mL y
transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrólisis enzimática).
*testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reacción e inmediatamente el reactivo
de DNS
4. Los tubos se calientan a ebullición en baño María durante 5 min. Se enfrían en baño de
hielo, adiciona 1.0 mL de agua y se leen a 540 nm en un espectrofotómetro, contra un
blanco de reactivos (0.1 mL de regulador de acetatos 0.25 M pH 5.0 + 0.1 de DNS + 1 mL
de agua).
5. Tomar la lecturas de Abs (tabla 2) del método de azucares reductores y determinar la
concentración de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se hará en laboratorio o se
proporcionará en función del tiempo).
6. Determinar la concentración de proteína de la solución de invertasa por el Método de
Bradford
Tabla 2. Efecto de la concentración de la sacarosa en la velocidad de reacción de la
invertasa.
Sacarosa
Sacarosa
Invertasa
Acetatos
Absorbancia
(g/L)
(g/L)
(0.6 mg/mL)
0.025M, pH
(540 nm)
(mL)
(mL)
5.0
(mL)
0.0
(blanco) 0.0
0
1.0
3.0
0.95
0.05
-9.0
0.95
0.05
-12.0
0.95
0.05
-15.0
0.95
0.05
-24.0
0.95
0.05
-30.0
0.95
0.05
--
2
Los valores de A540nm netos son: (A540nm Problema)- (A540nm Testigo) = A540nm Neto
La velocidad se determinará para cada concentración de sustrato, serán reportadas
en mmoles o moles de producto formado / min; así mismo determinar la actividad
específica de la enzima para concentración de sustrato.
Determinación de las constantes cinéticas de una enzima.
La magnitud de Km y Vmax varía según el tipo de enzima y la naturaleza del sustrato. Es
también una función de la temperatura y del pH. Se determinarán las constantes cinéticas
Km y kcat de la invertasa utilizando como sustrato sacarosa con las velocidades iniciales de
las reacciones a cada concentración de sustrato, determinadas con los datos de sus
experimentos antes descritos. El cálculo de las constantes se hará en forma comparativa
usando tres métodos gráficos que están basados en las formas lineales de la ecuación
Michaelis-Menten. Estos son:
Lineaweaver-Burk: 1/vo versus 1/[S] o
1
Km
1
1



V V max [ S ] V max
Agustinsson: [S]/vo versus [S] o
S
1
Km

S 
V Vmax
Vmax
Eadie Hofstee: vo versus v/ [S] o
V   Km 
V
 Vmax
S
Nota: Considerar la concentración real o final de la sacarosa que se utiliza en la reacción.
INFORME:
1. Hacer la gráfica de velocidad vs concentración de sustrato.
2. Hacer las gráficas de 1/vo vs 1/[So], [So]/vo vs [So] y vo vs vo/ [S] o y Calcule Km y
Vmax,
3. Determinar la constantes catalíticas de la invertasa para estas condiciones de
reacción
4. Discutir los resultados obtenidos por todos los equipos del grupo.
Referencia.
3
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PRÁCTICA 3
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS.
OBJETIVOS
1. Inmovilizar una enzima por atrapamiento en alginato.
2. Determinar la actividad enzimática y cinéticas enzimáticas de la invertasa
libre e inmovilizada.
3. Determinar el rendimiento o porciento de inmovilización
INTRODUCCIÓN.
Técnicas de inmovilización.
La inmovilización se define como el proceso por el cual el movimiento en el
espacio de las células, enzimas, orgánulos, etc. se ve restringido total o
parcialmente por medio de un soporte o una matriz. En la industria se usan
frecuentemente enzimas o células inmovilizadas debido a que éstas se pueden
rehusar o usar en procesos continuos.
Algunas ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas son:
1. El aumento de la estabilidad de la enzima;
2. La reutilización de la enzima, por lo que disminuyen los costos del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control,
adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son:
1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
2. No hay heterogeneidad en la distribución de la enzima en el soporte.
3. Pérdida de actividad de la enzima inmovilizada.
4. Mayor costo en relación a la enzima libre.
En general, los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos grandes
categorías: Retención física y Unión química.
Métodos de inmovilización de enzimas por retención física
Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una
matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros entrucruzables
o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de
poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la
suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se
inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de
un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen
1
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ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada
en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se
encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El
atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización,
así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera
los grupos reactivos de la proteína.
Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos:
Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de
membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y
producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser
permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no permanentes
(generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las
microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos
entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular
simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas,
permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en
múltiples pasos
Reactores de membrana: Estos reactores emplean membranas permeables al
producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a
la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que
atraviesa el reactor.
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA
Unión a soportes
Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de
una mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan
determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe
procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya
la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles
contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener resistencia
mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente
separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado
una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de
numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad
y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas,
fibras y más corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden
clasificarse en dos grandes grupos:
1. Soportes inorgánicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de
soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez,
sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño
de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)
2
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2. Soportes orgánicos. Se pueden clasificar en:
Polímeros naturales: a su vez divididos en: polisacáridos (celulosa, almidón,
dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc) proteínas
fibrosas (colágeno, queratina, etc).
Polímeros sintéticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polímeros
acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).
Adsorción
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante
interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno.
Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de
inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La
metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos
del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De entre los
20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas,
los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son
principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida
la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico.
Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha
sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas (7). El
método del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan
uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos
bifuncionales se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos,
sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida.
El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas
Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden
clasificar en:
1. Aplicaciones analíticas: biosensores
2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y
de tratamiento de residuos.
3
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MATERIAL Y EQUIPO.
Materiales:
Agitadores magnéticos
Coladores de acero inoxidable
Cristalizador
Espátula
Matraces Erlenmeyer
Vasos de precipitados
Agitador magnético
Jeringa desechable de 20 mL
Equipos:
Balanza
Espectrofotómetro
Potenciómetro
Vórtex
Soporte universal
Parrilla
Sección experimental.
Inmovilización de enzimas por atrapamiento con alginato de sodio.
Soluciones (Preparar soluciones por grupo):
1) 5 mL de solución de invertasa de levadura (X mg/mL) en amortiguador de
acetatos 0.025M pH 5.0
2) 15 mL de alginato de sodio al 2% (p/v) en amortiguador de acetatos 0.025M
pH 5.0
3) 100 mL Cloruro de calcio 1.0%
4) 20 mL Citrato de sodio 0.5 M o fosfato de sodio sodio monobásico 0.5 M
5) Sacarosa al 3% en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0
Parte experimental
Se debe trabajar en condiciones limpias (no es necesario trabajar en
condiciones de esterilidad).
1. En un vaso de precipitado de 50 ml mezclar 5 mL de enzima concentrada
con 15 mL de sol. de alginato 2% que se encuentre a 40 ºC. Agita la mezcla
alginato-enzima para homogenizar y lograr una temperatura homogénea, de
unos 40ºC.
2. Montar un sistema de inmovilización (Fig.1), que tenga con una jeringa con
aguja con punta roma (sujeta al soporte universal para mantener la altura, entre
la aguja y la sol de CaCl2, constante) y un vaso con solución de CaCl2, 1%; a
temperatura ambiente; con agitación constante y suave, por medio de una
barra magnética.
3. Llenar la jeringa (quitar la aguja y succionar la solución alginato-enzima
tirando del émbolo y poner de nuevo la aguja), fijarla al sistema, a un
centímetro de distancia del CaCl2, e ir descendiendo, de forma constante, el
embolo para obtener gotas homogéneas, las cuales se irán depositando en la
solución e CaCl2. Contar el número de perlas de alginato formadas por cada
mL y sacar un promedio final.
4
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El goteo debe realizarse a la altura precisa (alrededor de 1cm), de lo contrario se
formará “lentejas” al golpear con la superficie líquida (con un goteo desde una
distancia mayor) o se formarán esferas con una protuberancia (con un goteo desde una
distancia muy corta que no permita que se logre la esfericidad)
5. Dejar estabilizar el gel durante 20 min, sin agitación y a temperatura
ambiente.
6. Pasar las perlas y un poco de CaCl2 a un tubo falcon, etiquetar y conservar
en refrigeración.
Figura 1. Sistema para inmovilización de enzimas por atrapamiento.
NOTA IMPORTANTE. Se debe contar con la suficiente enzima libre e
inmovilizada para realizar esta práctica y la práctica 4: Determinación de Vmax
y Km de una enzima libre e inmovilizada.
Liberación de la enzima del soporte de inmovilización, para determinar
concentración de la misma.
Tomando en consideración la cantidad de esferas que se obtuvieron por mL, se
toma ese número de esferas, entre 50 y 60 esferas que correspondan al
mililitro. Se homogenizan las esferas en 4 mL de una solución de citrato de
sodio 0.5 M, durante 1 min con ayuda de un agitador vórtex (Durán, 1997). A la
solución resultante se le determinará proteína por Bradfor, realizar el blanco
con la solución que se utilizó para disolver las esferas de alginato. (Si en la
5
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determinación de Bradford se solidifica el alginato se puede retirar cuidadosamente
con una aguja).
NOTA: Se requiere conocer la actividad (y la concentración de proteína) de la
solución enzimática, por lo que se necesita preparar una cantidad extra.
Se debe de la concentración de proteína de la solución de cloruro de calcio, para
poder saber la cantidad de enzima que no quedó inmovilizada por diferencia.
Posteriormente, se debe determinar la Actividad enzimática y Actividad
enzimática específica y constantes cinéticas, de la enzima libre e inmovilizada
(práctica 2) y comparar los resultados de enzima libre y enzima inmovilizada.
Consideración: Esta segunda parte, que es inicio de la Práctica 4, puede dejarse
pendiente, si no es posible realizarlo en las 3 horas que dura la sesión.
Determinación de Actividad enzimática y constantes cinéticas (tiempo cero
de estabilidad, parte inicial de la práctica 4):
Actividad enzimática de la invertasa libre con sacarosa al 3.0 %, a temperatura
Ambiente, tiempo 5 min, por triplicado y testigos. (0.05 mL de enzima + 0.95 mL de
solución de sacarosa)
Actividad enzimática de la invertasa inmovilizada sacarosa al 3.0 %, a
temperatura ambiente, tiempo 5 min, Para la enzima inmovilizada seguir el mismo
protocolo de la libre y sustituir los 0.05 mL de enzima por lo equivalente en número
de perlas (de acuerdo a los resultados de número de perlas formadas por mL).
Determinar la concentración de proteína, por el método de Bradford y por
triplicado. de:
a) invertasa libre,
b) enzima inmovilizada (la enzima liberada) y
c) de la solución de cloruro de calcio residual,
Usar como blanco buffer, sol de citratos y sol. de cloruro de calcio,
respectivamente
Guardar la enzima libre e inmovilizada en refrigeración, con éstas se determinará
nuevamente la actividad a diferentes tiempos, y se compararán los tiempos el
inicial (primera sesión) y los otros tiempos, para determinar el efecto de la
inmovilización en la estabilidad de la enzima (Práctica 4).
Procedimiento para determinar la actividad enzimática y constantes
cinéticas:
Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las
diferentes concentraciones de sustrato.
6
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Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e
inmovilizada (número de perlas necesarias para igualar la concentración de
invertasa libre)
Diluciones de sustrato:
Tabla 1. Preparación de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones
Sacarosa (30 g/L) Acetatos 0.025 M, Concentración de sacarosa
(mL)
pH 5.0 (mL)
(g/L)
0
1
3
4
5
8
10
10
9
7
6
5
2
0
0.0
3.0
9.0
12.0
15.0
24.0
30.0
La prueba se realizará por triplicado con un blanco y un testigo para cada
concentración de sustrato.
1. Colocar en 4 tubos eppendorf el número de perlas correspondiente a 0.05mL
de enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un
blanco por concentración de sustrato (Tabla 1).
2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentración (tabla 1), agitar el
tubo para homogenizar y dejar proceder la reacción durante 5 min. Excepto el
testigo que es tiempo cero.
Condiciones de la reacción: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura
de en °C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al
momento de realizar el experimento).
3. Inmediatamente después de terminada la reacción (0 o 5 min), tomar un
alícuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para
detener la hidrólisis enzimática).
*testigo se adiciona la enzima e inmediatamente se transfiere 0.1 mL al reactivo de
DNS
4. Los tubos sellados con película plástica, se calientan a ebullición en baño
María durante 5 min. Se enfrían en baño de hielo, y posteriormente de adiciona
1.0 mL de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se
leen a 540 nm en un espectrofotómetro, contra cada blanco (solución de
sacarosa en buffer de acetatos)
7
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5. Tomar las lecturas de Abs del método de azúcares reductores y determinar
la concentración de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se hará en
laboratorio o se proporcionará en función del tiempo).
Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes
tiempos con gráficos y cuadros adecuados.
Informe:
1) Calcular la actividad enzimática de la enzima libre y de la enzima inmovilizada
en el día 1.
2) Determinar el % de inmovilización de la enzima (la enzima que no se inmoviliza
se queda en la solución de cloruro de potasio).
3) Determinar la estabilidad de la enzima libre e inmovilizada a los dos tiempos en
días.
4) Calcular las constantes cinéticas de la enzima libre e inmovilizada.
5) Incluir en el informe una Introducción, el fundamento y el objetivo de esta
práctica.
6) Comparar los parámetros cinéticos de la enzima inmovilizada contra la
libre.
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PRÁCTICA 4
Estabilidad de una enzima inmovilizada y libre, determinación de
Vmax y Km.
OBJETIVOS
1. Establecer el efecto de la inmovilización en la estabilidad de una enzima.
2. Determinar el efecto de la inmovilización en la constante de MichaelisMenten (Km) y la velocidad máxima (Vmax.) y su relación con la
estabilidad.
INTRODUCCIÓN
La inmovilización puede altera significativamente el comportamiento de las
enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo
lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los
componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos,
inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio
de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como
consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional,
estérico y del microentorno.
Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después
de su inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes razones:
1. Una estabilización conformacional de la enzima debido a la existencia de
uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima
adquiere mayor rigidez y se hace más resistente a la desactivación térmica o
química. Este tipo de estabilización se obtiene únicamente en aquellos métodos
en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unión a
soportes activados. La inmovilización covalente multipuntual se puede combinar
con la adición de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de
la enzima.
2. Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unión de
proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis.
3. Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima
retenidas en una determinada región del espacio.
4. Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la
enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como las
nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado,
la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, como
consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en esa
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zona que en el medio de reacción. En otros casos el soporte tiene un efecto
tampón o buffer de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su
microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH.
Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en
presencia de disolventes orgánicos, la “hidrofilia” del soporte o su capacidad para
retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la hidrofilia del
soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en
su microentorno para mantener su conformación activa.
Efectos en la actividad enzimática
Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso
perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede
ser debido a que:
1. La unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al sitio
activo está impedido,
2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que
forme parte del sitio activo o que sea esencial para la actividad catalítica de
la enzima,
3. La inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a
una forma inactiva, las condiciones experimentales del proceso causan la
desnaturalización de la enzima.
Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los cambios
(disminución o aumento de la actividad enzimática) se deberán principalmente a
efectos difusionales, electrostáticos, estéricos y/o del microentorno.
1) Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los
sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por
resistencias de tipo externo e interno.
a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio
de reacción, el sustrato deberá atravesar la película líquida estacionaria
(capa de Nernst o de disfusión) que rodea el soporte. En las proximidades
de un soporte no cargado, la concentración de sustrato es menor que en el
resto de la disolución, puesto que existe un gradiente de concentración a
través de la zona de difusión. Por tanto, los valores de km para las enzimas
inmovilizadas son siempre aparentes (km’);
b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que
atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se
encuentra la enzima inmovilizada.
2) Efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si
tienen la misma carga existe una repulsión mutua, mientras que si las cargas son
opuestas hay atracción. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el
valor de km’ aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del
obtenido en disolución.
2
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3) Impedimentos estéricos o de tamaño de sustrato. En un principio, cualquier
enzima puede ser inmovilizada sin que haya una pérdida apreciable de su
actividad. Este hecho suele ser válido en el caso de que el sustrato sea de bajo
peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la
actividad de la enzima inmovilizada disminuye drásticamente. Por ejemplo,
muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes sólidos, a pesar de que son
muy activas frente a sustratos pequeños, muestran una actividad muy baja hacia
proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. Este “efecto estérico” se puede evitar
mediante una inmovilización covalente a través de un brazo espaciador enzimasoporte más largo
4) Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno
diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados
eléctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del
pH óptimo de la catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el
intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida
a un soporte cargado negativamente tendrá en su microentorno una concentración
mayor de iones hidrógeno que en el medio de reacción. Como resultado, la
enzima inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más
activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente.
MATERIALES
Materiales:
o Espátulas de acero inoxidable.
o Matraces Erlenmeyer.
o Flotadores
o Gradillas para microtubos
o Termómetro
o Tubos eppendorf 1.5 mL
Equipos:
o Espectrofotómetro.
o Refrigerador comercial.
o Vórtex.
o Parrillas con agitación
o Pipetas de 100, 200 y 1000 μL
PARTE EXPERIMENTAL:
Se realizará en las siguientes 3 o 4 sesiones, posteriores a la práctica 3, en al cual
se inmovilizó y se conservó la enzima libre y las perlas de alginato con la enzima
inmovilizada.
Determinación de Actividad enzimática y constantes cinéticas:
Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las
diferentes concentraciones de sustrato.
Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e inmovilizada
(número de perlas necesarias para igualar la concentración de invertasa libre)
3
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Diluciones de sustrato:
Tabla 1. Preparación de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones
Sacarosa (30 g/L)
Acetatos 0.025 M, Concentración de sacarosa
(mL)
pH 5.0 (mL)
(g/L)
1
3
4
5
8
10
9
7
6
5
2
0
3.0
9.0
12.0
15.0
24.0
30.0
La prueba se realizará por triplicado con un blanco y un testigo para cada
concentración de sustrato.
1. Colocar en 4 tubos eppendorf el número de perlas correspondiente a 0.05mL de
enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un blanco
por concentración de sustrato (Tabla 1).
2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentración (tabla 1), agitar el tubo
para homogenizar y dejar proceder la reacción durante 5 min. Excepto el testigo
que es tiempo cero.
Condiciones de la reacción: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de
en °C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al
momento de realizar el experimento).
3. Inmediatamente después de terminada la reacción (0 o 5 min), tomar un
alícuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para
detener la hidrólisis enzimática).
*testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reacción e inmediatamente
el reactivo de DNS
4. Los tubos sellados con película plástica, se calientan a ebullición en baño María
durante 5 min. Se enfrían en baño de hielo, y posteriormente de adiciona 1.0 mL
de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se leen a
540 nm en un espectrofotómetro, contra cada blanco (solución de sacarosa en
buffer de acetatos)
5. Tomar las lecturas de Abs del método de azúcares reductores y determinar la
concentración de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se hará en
laboratorio o se proporcionará en función del tiempo).
Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes
tiempos con gráficos y cuadros adecuados.
4
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ANÁLISIS DE RESULTADOS
a) Calcular la actividad enzimática de la enzima libre y de la enzima
inmovilizada en el día 2 y 10.
b) Determinar los parámetros cinéticos de la enzima inmovilizada y la enzima
libre dos y diez días después de la inmovilización.
c) Determinar la actividad enzimática de la enzima inmovilizada contra la libre
dos y diez días después de la inmovilización
d) Comparar los parámetros cinéticos y actividad enzimática de la enzima
inmovilizada contra la libre el primer día (practica 3), a las 48 horas y a los
10 días.
5
5. Adiestramiento en la operación de un biorreactor de laboratorio.
5.1 Manejo de un biorreactor
5.2 Preparación y esterilización de medio de cultivo en el biorreactor.
5.3 Preparación de de Inóculo e inoculación del medio en biorreactor.
5.1. Manejo de un Biorreactor
OBJETIVO.
Adquirir los conocimientos prácticos para reconocer las partes de un biorreactor de
laboratorio, las funciones de cada parte constituyente del biorreactor, así como el
montaje de éstas y el funcionamiento del biorreactor y su módulo de control.
MARCO TEÓRICO.
1) CLASIFICACIÓN DE LOS BIORREACTORES.
La mayoría de las compañías industriales de fermentación tienen al menos una
sección dedicada a los laboratorios de fermentación, los cuales usan para
investigación pura de nuevos productos, selección de nuevos cultivos de
fermentación, desarrollo de nuevas materias primas, condiciones de proceso y
escalamiento, por ejemplo: en la industria farmacéutica se aplica para el desarrollo
de nuevos antibióticos. En la industria de la cervecería y de los alimentos donde
continuamente se desarrollan sustitutos de proteína.
En estas áreas de investigación y desarrollo el tipo de biorreactor puede variar
desde un matraz de 10 0mL, hasta un fermentador de acero inoxidable de 100
litros (L). En un área grande de desarrollo se pueden encontrar varios tamaños de
biorreactores, desde uno de 5 L. pasando por uno de escala de entre 20 y 50 L, y
finalmente uno de escala piloto que podría ser de 100 a 1000 L. El número de
biorreactores generalmente lo rigen los costos y la disponibilidad de mano de obra.
Un biorreactor es un contenedor físico en donde se efectúan reacciones biológicas
catalizadas por microorganismos o partes de ellos. Las fronteras del biorreactor
están bien delimitadas. El biorreactor cuenta con espacios físicos que permiten por
una parte controlar las condiciones de reacción y por otra parte el monitoreo de la
reacción biológica por medio de electrodos especiales.
Los nombres que se le han adjudicado a los biorreactores de laboratorio son
variables a saber: biorreactores de mesa, propiamente de laboratorio, los
biorreactores de planta piloto y los biorreactores industriales.
Una definición aceptable de los tipos anteriores de biorreactores podría quedar
como sigue:
1
Biorreactores de Mesa o “Bench-Top” (Biorreactores de laboratorio): Poseen
volúmenes de trabajo de 0.5 a 10 L, el vaso puede ser de acero inoxidable, vidrio
o una combinación de ambos y no son esterilizables in situ, su esterilización
requiere la introducción del biorreactor dentro de una autoclave.
Biorreactores de planta piloto: Su desarrollo ha permitido encontrar formas
sofisticadas capaces de esterilizarse en diferentes tipos de fermentación; los
cuales incluyen biorreactores de tanque agitado, air-lift, tipo torre, de cama
fluidificada y de disco rotario. Por lo general el material utilizado en su
construcción es el acero inoxidable. Los volúmenes utilizados varían de 15 hasta
100 L
Biorreactores industriales: Se construyen invariablemente con acero inoxidable. El
volumen del biorreactor puede variar de 150 hasta 10000 L. Los biorreactores
industriales se esterilizan forzosamente in situ.
2) VARIABLES DE CONTROL EN BIORREACTORES.
Por lo general, cualquier tipo de biorreactor posee características de diseño que
permiten, por medio de un módulo de control y electrodos, controlar al menos seis
variables básicas que definen el medio ambiente en donde los microorganismos
se desarrollan, éstas son: la agitación, la temperatura, el pH del cultivo, la
aireación del medio, la concentración de oxígeno disuelto, y el nivel de espuma
existente en el biorreactor.
2.1) Agitación.
La agitación del medio de cultivo permite mantener condiciones homogéneas
dentro del biorreactor. La agitación se realiza, por lo general, por medio de un
motor acoplado a un eje que contiene impulsores de diversos tipos (de paleta tipo
Rushton, turbina hélice marina, etc.) Los impulsores definirán el patrón de flujo y la
hidrodinámica que existirá en el reactor. La elección del tipo de impulsor depende
de la reología del cultivo y del tipo de microorganismo que se utiliza en la
fermentación teniendo especial cuidado en no dañar a las células que se están
cultivando. La agitación vigorosa en un biorreactor provoca la creación de un
vórtice que no permite una completa homogenización del medio de cultivo; así los
biorreactores cuentan con bafles que impiden la formación del vórtice.
Los reactores tipo “air-lift“son agitados mediante la inyección de aire; el flujo de
aire permite una adecuada agitación y aumenta la transferencia de oxígeno al
medio de cultivo.
2.2) Temperatura
La temperatura representa una variable importante de control de una
fermentación. La temperatura afecta el crecimiento microbiano de manera notable,
debido a que los microorganismos de una especie determinada sólo pueden
2
crecer en un rango restringido de temperaturas. Así los microorganismos se
pueden clasificar en función de la temperatura de crecimiento: los
microorganismos psicrófilos presentan un rango de temperatura de crecimiento de
5 a 15°C; los mesófilos de 25 a 40°C y los termófilos de 45 a 60 °C, sin mebargo
se han reportado casos de crecimiento de hasta 94°C.
Para el control de la temperatura en los biorreactores, éstos a menudo cuentan
con chaquetas por donde fluye agua fría o caliente y que funcionan como
intercambiadores de calor. También los biorreactores cuentan con termopares
adaptados al cuerpo del biorreactor que de forma continua determina la
temperatura del cultivo, con la ayuda del módulo de control. Así, continuamente el
módulo de control determina si hay que aumentar o disminuir la temperatura del
cultivo de acuerdo a un valor de temperatura de fermentación preestablecido.
2.3) pH
El pH de una fermentación expresa la concentración de iones hidrógeno presentes
en el medio de cultivo. Al igual que la temperatura de fermentación, el pH
determina de forma importante la velocidad de crecimiento de los
microorganismos y el rendimiento de bioconversión. El pH de crecimiento para una
especie de microorganismo representa generalmente un máximo denominado pH
óptimo. Debido a que durante las bioconversiones que se presentan, causadas por
el desarrollo microbiano, el pH del medio de cultivo varía continuamente durante el
transcurso de una fermentación. Así, es necesario compensar dichas variaciones
del pH mediante la adición de soluciones ácidas o básicas que permiten mantener
un pH óptimo de crecimiento. Para ello, es necesario contar con un electrodo de
pH adaptado al biorreactor que provea continamente de lecturas instantáneas de
la concentración de iones hidrógeno en el medio de cultivo. Los electrodos de pH
utilizados en los biorreactores deben soportar temperaturas de esterilización ya
que éstos deben estar sumergidos dentro del caldo de fermentación.
2.4) Oxigenación o aireación.
El oxígeno merece especial mención pues su ausencia o abundancia permite una
selección tanto de microorganismos como de productos del metabolismo. Cuando
el cultivo se produce en presencia de oxígeno molecular la fermentación se
denomina aeróbica, y cuando éste carece de oxígeno la fermentación se
denomina anaeróbica. La mayoría de los cultivos microbianos son de tipo aeróbico
por lo que es necesario proveer oxígeno al cultivo. Para ello, se inyecta aire u
oxígeno de forma estéril al medio o caldo de cultivo por medio de un compresor. El
aire es inyectado desde la parte inferior del biorreactor, justo debajo de los
impulsores y distribuido en forma de burbujas con la ayuda de un difusor.
Las burbujas son fracturadas por los impulsores en burbujas más pequeñas, lo
que provoca el aumento del área superficial de las burbujas; así la transferencia
de oxígeno resulta efectiva.
3
Para la determinación de la concentración de oxígeno disuelto en el caldo de
cultivo se utilizan electrodos galvanométricos y polarográficos que permiten
realizar lecturas de forma continua. Los impulsos eléctricos generados por el
electrodo son convertidos en el módulo de control del biorreactor en lecturas de
porcentaje de oxígeno disuelto. El mismo módulo de control del biorreactor puede
justamente controlar la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de cultivo por
medio de la inyección de aire u oxígeno o en su caso de nitrógeno gaseoso, todo
ello con la ayuda de un conjunto de electro-válvulas. La adición de nitrógeno
gaseoso al medio de cultivo permite disminuir la concentración de oxígeno disuelto
ya que el nitrógeno desplaza al oxígeno disuelto. Así con base a una
concentración de oxígeno disuelto predeterminada, el módulo de control puede
ajustar la inyección de aire o de nitrógeno.
2.5) Nivel de espuma
La mayoría de los medio de cultivo utilizados para el crecimiento de
microorganismos contienen proteínas y péptidos que promueven la formación de
espuma. La agitación vigorosa del medio de cultivo y la inyección de aire al
biorreactor provocan aún más la formación de grandes cantidades de espuma;
ésta puede incluso ser tan importante que puede ocupar todo el espacio vacío del
biorreactor (espacio de cabeza) y hasta salir por cualquier orificio de entrada de
flujo al biorreactor que no ésta siendo empleado. La formación de espuma en el
biorreactor conlleva el incremento del riesgo de contaminación de la fermentación.
Por ello es necesario controlar el nivel de espuma formada dentro del biorreactor.
Para ello se emplea un electrodo instalado dentro del biorreactor cuya altura, con
respecto al nivel del líquido, puede ser modulada para permitir solo una pequeña
capa superficial de espuma. El electrodo está conectado al módulo de control del
biorreactor por donde transita una corriente eléctrica. La espuma al aumentar su
nivel y ponerse en contacto con el electrodo cierra un circuito eléctrico, lo que
provoca la acción de una bomba peristáltica que inyecta antiespumante al
biorreactor. Los antiespumantes algunos de origen mineral, tienen una rápida
acción contra la espuma presente, cortándola de forma inmediata.
Por otra parte, la formación de espuma dentro del biorreactor promueve la
adhesión de microorganismos sobre las paredes del biorreactor, lo que provoca
que el cultivo microbiano pierda su homogeneidad. Por ello es imperioso evitar la
formación de espuma dentro del biorreactor y en su caso controlar el nivel de ésta.
EQUIPO.
-Biorreactor de laboratorio con su módulo de control, partes y electrodos
(ya sea un biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra
de 5 litros o un biorreactor marca Applikon de jarra de 3 litros).
DESARROLLO EXPERIMENTAL.
a) El profesor describirá y mencionará los nombres de las partes que
constituyen el biorreactor y explicará las funciones de cada una de ellas.
4
b) El profesor explicará el funcionamiento del módulo de control del
biorreactor.
c) El profesor desmontará todas las partes del Biorreactor indicando las
medidas de cuidado que deberá tenerse al manipular el biorreactor y sus
partes.
d) Los estudiantes tendrán que armar de nuevo el biorreactor y sus partes.
REPORTE DE RESULTADOS.
1. Elaborar un diagrama del biorreactor utilizado en la práctica señalando y
nombrando cada una de las partes que constituyen el equipo.
2. Describir las funciones de cada una de las partes que constituyen el
biorreactor.
3. Describir las variables físicas y químicas que se controlan en el biorreactor
y que definen el medio ambiente en donde se desarrollan los
microorganismos.
4. Describir as funciones del módulo de control del biorreactor.
BIBLIOGRAFÍA.
Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,
McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San
Diego, 439p.
Lydersen, B.K. , D’elia, N.A. and Nleson, K.L. Bioprocess Engineering Systems,
equipment and facilities, John Wiley & Sons, 1994, New York, 805p.
Schûgerl, K, Bioreactor engineering, volume 2; characteristics features of
bioreactors, John Wiley & Sons, 1981, Chichester, 393p.
5
5.2 Preparación y esterilización de medio de cultivo y biorreactor
OBJETIVO.
Adquirir conocimientos prácticos relacionados con el proceso de esterilización de
medio de cultivo contenido en un biorreactor.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Formulación de un medio de cultivo para el crecimiento de
microorganismos.
2. Conocimiento de una autoclave de laboratorio y su funcionamiento.
3. Monitoreo del proceso de esterilización por calor húmedo
4. Determinación cualitativa de la eficacia del proceso de esterilización por
calor húmedo.
MARCO TEÓRICO
La fermentación en general se debe llevar a cabo en un medio ambiente
controlado, independientemente de que el propósito sea de investigación
académica, desarrollo de producto o proceso. Esto implica que debe garantizarse
el crecimiento del microorganismo, microorganismos u obtención del producto
deseado libre de contaminantes. De ahí que la esterilización sea una parte del
proceso de fermentación que permite alcanzar este objetivo.
Si se tiene que llevar a cabo una fermentación usando un microorganismo definido
para un producto o conjunto de productos, la invasión por microorganismos
contaminantes afectará adversamente de una u otra manera la producción. Así el
contaminante competirá con el microorganismo deseado por los nutrientes
afectando finalmente el rendimiento. Los microorganismos contaminantes pueden
incluso degradarlo en pasos subsecuentes. Por otro lado la contaminación
microbiana, sobre todo por bacilos y cocos afectará negativamente la recuperación
y purificación del producto final, sobre todo en las operaciones de filtrado y
ultrafiltrado. Por lo tanto, la contaminación debe evitarse, lo cual se logra:
Usando un cultivo puro, esterilizando el biorreactor y el medio de cultivo, así como
los recipientes adicionales y todo material y superficie que esté en contacto con el
cultivo o el medio de cultivo. Se deben así mantener condiciones asépticas
durante toda la fermentación.
6
La esterilización y el mantenimiento de las condiciones asépticas a veces
conducen a la pérdida o degradación de los cultivos. El diseño del procedimiento
de esterilización depende de:
1. La naturaleza del medio de cultivo y el contenido de los recipientes
adicionales utilizados en la fermentación.
2. El tamaño y tipo de biorreactor, de los recipientes adicionales y el material
de construcción de éstos.
3. Los servicios generales disponibles en el laboratorio.
4. Si los recipientes a ser esterilizados están vacíos o contienen medio de
cultivo u otras soluciones.
a) CRITERIOS PARA LA ESTERILIZACIÓN.
Es importante y aún vital evitar la contaminación de un sistema de fermentación.
Sin embargo, en general, las medidas utilizadas son mas bien necesarias que
severas, con el fin de evitar daño al medio de cultivo y reducir los costos, por lo
tanto, el procedimiento de esterilización adoptado y el grado de remoción del
contaminante necesita ser relacionado a la naturaleza de la fermentación y su
propósito.
Así en trabajos de escala menor como el tratamiento de desechos, durante la
oxidación de lodos activados, se utilizan microorganismos presentes en forma
natural. El equipo para dicho proceso probablemente no necesita ser esterilizado,
excepto, tal vez, los recipientes y líneas que albergan los nutrientes.
Algunas fermentaciones en donde interviene un único microorganismo se
describen como protegidas ya sea porque el medio de cultivo permitirá solamente
el crecimiento de un rango limitado de microorganismos (ejemplo: medio de cultivo
basado en un solo hidrocarburo), o microorganismos que producen un medio
ambiente hostil que inhibe el desarrollo de otros organismos (ejemplo: etanol
producido por levaduras). En tales casos, el régimen empleado deberá ser no tan
estricto, lo cual implica solo la limpieza de recipientes y líneas y el uso de
desinfectantes y/o hirviendo o pasteurizando el medio de cultivo, lo cual destruye
la mayoria de microorganismos no esporulados aunque no a todas las esporas
eventualmente presentes.
Sin embargo la mayoría de las fermentaciones en el laboratorio consideran
fermentaciones de cultivo no protegidos, en cuyo caso, esencialmente todos los
contaminantes microbianos deben excluirse.
El caso ideal de la remoción total de microorganismos contaminantes está sin
embargo lejos de alcanzarse. Por lo tanto, el criterio de probabilidad de
contaminación es frecuentemente utilizado como objetivo más práctico.
Una probabilidad comúnmente aceptada en fermentaciones industriales es de
1x10-3; esto es la probabilidad de que 1 en 1000 lotes se contaminen después de
la esterilización. Se pueden imponer mayor o menores criterios estrictos
7
dependiendo de la consecuencia de una falla. Un ejemplo es la de enlatado de
alimentos, donde el criterio de esterilización se apoya en la típica probabilidad de
sobrevivencia de 1x10-12 de esporas de Clostridium botulinum. Un criterio
semejante aplicado a la fermentación se aplica para el caso de patógenos
peligrosos o ciertos productos peligrosos involucrados en tecnología del DNA
recombinante.
La selección del método de esterilización y el régimen a usarse debe por lo tanto
ser hecho a la luz de un criterio apropiado de esterilización.
b) MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
1.
2.
3.
4.
5.
Calor húmedo
Calor seco
Filtración
Compuestos químicos
Radiación
El método de esterilización más común para recipientes es el de calor húmedo.
Los factores importantes a considerar en determinar el método mas adecuado de
esterilización son: La naturaleza del organismo empleado, la fermentación y el
nivel de seguridad requerido.
MATERIALES, EQUIPO Y MÉTODO
a) Materiales
-Cajas de Petri
-Tubos de ensayo
-Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
-Barras magnéticas para agitación (mosca)
-Guantes de asbesto
-Solución de Cloruro de Sodio al 0.09%
-Pipetas de 1 y 10 mL
-Pipetas automáticas de 1 y 10 mL
-Portaobjetos y cubreobjetos.
-Medio de cultivo (ver anerxo)
b) Equipo
-Biorreactor de laboratorio (ya sea un biorreactor New Brunswick Scientific
modelo Bioflo II de jarra de 5 litros o un biorreactor marca Applikon de jarra de 3
litros).
- Balanza analítica
-Incubadora con control de temperatura
-Autoclave eléctrica de 50 L de volumen
-Campana de flujo laminar vertical
-Microscopio óptico
8
-Agitador y Vortex
-Placa de agitación magnética
-Contador de Colonias
C) Método
a) Verificar que la autoclave eléctrica contenga agua hasta el nivel marcado por
el tubo de vidrio que se encuentra a su costado (nivel de agua).
b) El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave. Verificar que
la salida de aire del biorreactor esté abierta, de lo contrario se corre el riesgo
de que el biorreactor o alguna de sus partes se rompan durante el proceso
de esterilización.
c) Cerrar la puerta de la autoclave
d) Encender la autoclave para provocar la generación de vapor.
e) verificar que la salida de aire de la autoclave se encuentre totalmente abierta,
de esta forma, el aire contenido en la autoclave será excluido por el vapor
que se genera.
f) Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por la válvula
de salida de la autoclave, es posible cerrar ésta.
g) Esperar que la presión dentro de la autoclave sea de 1.5Kg/cm 2 (indicado por
el medidor de presión)y que a la vez la temperatura sea de 121°C (indicado
por el medidor de temperatura).
h) Una vez alcanzadas las condiciones de esterilización (1.5 kg/cm 2 y 121 °C)
mantenerlas durante 15 minutos, por medio del apagado y encendido de la
autoclave.
i) Posterior al proceso de esterilización, esperar a que la presión y la temperatura
de la autoclave disminuyan.
j) Una vez que el medidor de presión indique una presión de 0.1Kg/cm 2 abrir
lentamente la válvula de salida y dejar escapar el vapor que aún no se ha
condensado. Evitar que la presión caiga por debajo de cero (Bajo vacío), ya
que ello provoca riesgos de contaminación del material ya esterilizado.
k) Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de asbesto sacar el
biorreactor esterilizado. Dejar enfriar el biorreactor hasta temperatura
ambiente antes de utilizarlo.
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Preparación del medio de cultivo (clado nutritivo 2L) para el biorreactor.
b) Preparar 14 cajas de Petri conteniendo Agar nutritivo sólido
c) Verter en la jarra del biorreactor el medio de cultivo.
d) Esterilizar el biorreactor en la autoclave durante 15 min. A 120°C, de acuerdo
al método de esterilización por calor húmedo” descrito en el apartado de
Materiales equipo y métodos.
e) Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar.
f) Asépticamente tomar una muestra de 1 mL del medio de cultivo esterilizado
y realizar diluciones hasta un factor de 10-3, Sembrar por extensión en placa
9
y duplicado en cajas de petri conteniendo agar nutritivo sólido con las
diluciones 10-1 a 10-3
g) Realizar una preparación en fresco del medio de cultivo esterilizado y
observarlo al microscopio visible.
h) Incubar las placas durante 24 -48 h a 37°C
BIBLIOGRAFÍA
-Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,
McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
-Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San
Diego, 439p.
-Quintero Ramírez, R. Ingeniería Bioquímica, teoría y aplicaciones, Alambra
mexicana, 1981, México, 332p.
5.3.
Preparación de de Inóculo e inoculación del medio en biorreactor.
Preparación del inóculo
Para la preparación del inóculo, se puede partir de un cultivo en tubo o en placa, o
también podría ser de un preinoculo o precultivo líquido de la cepa deseada. En el
caso de levaduras puede ser de alguna presentación comercial como pasta o
polvo. Se toma una asada del cultivo y se transfiere a 100 mL de medio de cultivo
nuevo y estéril, que se encuentra e un matraz de 250 mL. Se incuba a 30ºC
durante 18 h a 120 rpm.
Inoculación del Biorreactor.
Antes de inocular el medio cultivo (ya estéril), se toman 5 mL del medio del
biorreactor; para control de esterilidad; observando al microscopio y por cuenta en
placa.
Posteriormente se adiciona el inóculo (100 mL) en el biorrecator, cuidando las
condiciones de esterilidad.
10
ANEXO
Medio de Cultivo para Levaduras
Glucosa
Extracto de levadura
KH2PO4
(NH4)2SO4
.
MgSO4 7H2O
pH
g/L
50
1
5
2
0.4
Ajustar a 5
Medio sólido para preservación de levaduras.
Glucosa
Extracto de levadura
Agar agar
g/L
20
10
20
11
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PRÁCTICA 6
PRODUCCIÓN DE UNA ENZIMA EN UN BIORREACTOR DE
LABORATORIO CON CÉLULAS LIBRES
La práctica se divide en dos secciones, la preparación del medio y la
esterilización del biorrecator con el medio, 6.1; y el segundo, el seguimiento
del cultivo y de la producción de enzima por Saccharomyces cerevisiae, 6.2.
6.1 Preparación y esterilización de Medio de Cultivo en el
Biorreactor.
OBJETIVO GENERAL
Adquirir conocimientos prácticos para establecer un birreactor con medio de
cultivo para un bioporoceso.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.
2.
3.
4.
Formular un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos.
Conocer el funcionamiento de una autoclave.
Esterilizar el biorrector y medio por calor húmedo.
Determinar cualitativamente la eficacia del proceso de esterilización por
calor húmedo.
5. Conocer la manera de preparar el inóculo para una fermentación.
6. Conocer la manera de inocular un biorreactor de laboratorio.
MARCO TEÓRICO
Medios de Cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones
adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en las fermentaciones por lo
que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la
exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
1
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Esterilización de Medios de Cultivo
Una fermentación se debe llevar a cabo, en general, en un medio ambiente
controlado, independientemente de que el propósito sea de investigación
académica, desarrollo de producto o proceso. Esto implica que debe
garantizarse el crecimiento del microorganismo, microorganismos u obtención
del producto deseado libre de contaminación biológica. De ahí que la
esterilización sea una parte del proceso de fermentación que permite alcanzar
este objetivo.
La esterilización y el mantenimiento de las condiciones asépticas a veces
conducen a la pérdida o degradación de los nutrientes de los cultivos. El
diseño del procedimiento de esterilización depende de:
a) La naturaleza del medio de cultivo y el contenido de los recipientes
adicionales utilizados en la fermentación.
b) El tamaño y tipo de biorreactor, de los recipientes adicionales y el
material de construcción de éstos.
c) Los servicios generales disponibles en el laboratorio.
d) Si los recipientes a ser esterilizados están vacíos o contienen medio
de cultivo u otras soluciones.
e) De la carga microbiana del medio.
Criterios para la Esterilización
Una probabilidad comúnmente aceptada en fermentaciones industriales es de
1x10-3; esto es la probabilidad de que 1 en 1000 lotes se contaminen después
de la esterilización. Se pueden imponer criterios más estrictos, dependiendo
de la consecuencia de una falla o el riesgo que se quiera asumir. Un ejemplo
es la de enlatado de alimentos, donde el criterio de esterilización se apoya en
la típica probabilidad de sobrevivencia de 1x10 -12 de esporas de Clostridium
botulinum. Un criterio semejante aplicado a la fermentación se aplica para el
caso de patógenos o microorganismos genéticamente modificados. La
determinación de bacterias viables es un método sensible para determinar el
número de bacterias que sobrevivieron en el sistema.
Métodos de Esterilización
La selección del método de esterilización y el régimen a usarse deben ser
hechos de acuerdo a criterios apropiados de esterilización; los métodos
pueden ser:Calor húmedo
1.
2.
3.
4.
Calor seco
Filtración
Compuestos químicos
Radiación
2
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El método de esterilización más común para recipientes es el de calor
húmedo. Al monitorear el proceso de esterilización por calor húmedo se
puede observar que el ciclo de esterilización está formado por tres períodos:
a) Elevación de temperatura o calentamiento.
b) Mantenimiento de temperatura.
c) Descenso de temperatura o enfriamiento.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Materiales
- Cajas de Petri
- Tubos de ensayo
- Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
- Barras magnéticas para agitación (mosca)
- Guantes de asbesto
- Solución de Cloruro de Sodio al 0.85%
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Pipetas automáticas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Medio de cultivo para levaduras
- Matraces de 250 mL
- Medio de cultivo para levaduras
Equipo
- Biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra de 5 L
- Balanza analítica
- Incubadora con control de temperatura
- Autoclave eléctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar vertical
- Microscopio óptico
- Agitador Vortex
- Placa de agitación magnética
Procedimiento
a) Preparar de 2.5 L de medio de cultivo para levadura, composición por
litro de medio: Sacarosa, 30 g; Extracto de Levadura, 5 g; KH2PO4, 5 g;
(NH4)2SO4, 2 g; MgSO4 . 7H2O, 0.4 g. Ajustar a pH 5
b) Preparar 14 cajas Petri con medio de cultivo sólido para levaduras
adicionado al medio 15 g/L de agar.
c) Antes de esterilizar el medio tomar muestra de 1 mL del medio de
cultivo, para realizar cuenta en placa. Sembrar por duplicado en las
cajas con medio sólido con las diluciones 100 (directo) a 10-2.
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d) Realizar una preparación en fresco del medio de cultivo sin esterilizar y
una tinción de Gram y observarlo al microscopio.
e) Preparar el Biorreactor como se estableció en la práctica 5.
f) Verter en la jarra del biorreactor el medio de cultivo sin esterilizar.
g) Esterilizar el biorreactor en la autoclave:
1. Verificar que la autoclave contenga agua hasta el nivel marcado
por el tubo de vidrio que se encuentra a su costado (nivel de agua).
2. El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave.
Verificar que la salida de aire del biorreactor esté abierta, de lo
contrario se corre el riesgo de que el biorreactor o alguna de sus
partes se rompan durante el proceso de esterilización.
3. Cerrar la puerta de la autoclave
4. Encender la autoclave para provocar la generación de vapor.
5. Verificar que la salida de la válvula de purga se encuentre
totalmente abierta, de esta forma, el aire contenido en la autoclave
será excluido por el vapor que se genera.
6. Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por
la válvula de salida de la autoclave, se cierra.
7. Esperar que la presión dentro de la autoclave sea de 1.05 Kg/cm2 o
15 lbs (indicado por el medidor de presión) que equivale a 121°C
(indicado por el medidor de temperatura) y mantener (por medio del
apagado y encendido de la autoclave o controlando la flama)
durante 15 minutos.
8. Posterior al proceso de esterilización apagar o cerrar el gas y
esperar a que la presión llegue a 0.1Kg/cm2 abrir lentamente la
válvula de salida y dejar escapar el vapor que aún no se ha
condensado. Evitar que la presión caiga por debajo de cero (bajo
vacío), ya que ello provoca riesgos de contaminación del material
ya esterilizado.
9. Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de
asbesto sacar el biorreactor esterilizado.
h) Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar hasta temperatura
ambiente antes de utilizarlo.
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i) Asépticamente tomar una muestra de 1.5 mL del medio de cultivo
esterilizado y determinar no de células por cuenta en placa con la
muestra directa y dos diluciones, hasta 10-2; cada dilución por
triplicado.
j) Realizar una preparación en fresco del medio de cultivo esterilizado y
observarlo al microscopio visible y otra en tinción de Gram.
Preparación del inóculo
Para la preparación del inóculo, se puede partir de un cultivo en tubo inclinado
o en placa, o también podría ser de un preinóculo o precultivo líquido de la
cepa deseada. En el caso de levaduras puede ser de alguna presentación
comercial como pasta o polvo.
Inóculo A: tomar una asada del cultivo de Saccharomyces cerevisiae y se
transfiere a un matraz de 500 mL con 300 mL de medio de cultivo nuevo y
estéril. Se incuba a 30ºC durante 12 h a 18 h con una agitación de 120 rpm.
Antes de inocular el biorreactor con el medio de cultivo ya estéril, se prepara
un frotis de cada inóculo y tiñe con la técnica de Gram para corroborar la
pureza del inóculo.
REPORTE DE RESULTADOS
a) Elaborar una tabla de resultados en donde se reporten los resultados
del conteo de microorganismos en cada una de las cajas Petri
sembradas con las diluciones del medio de cultivo, antes y después del
proceso de esterilización. Comparar los resultados.
b) Calcular la concentración de contaminantes (UFC/mL) en el medio de
cultivo sin esterilizar.
c) En caso de que exista contaminación en el medio de cultivo ya
esterilizado, calcular la concentración de contaminantes (UFC/mL).
d) Elaborar sus conclusiones sobre el papel que juega la esterilización en
las bioconversiones, así como de la eficacia del método de
esterilización por calor húmedo en autoclave eléctrica.
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BIBLIOGRAFÍA
Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd
Edition, McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
Deindoerfer, F. H. y Humphrey, A. E., 1959. Appl. Microbiol. 7 : 256-264
Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San
Diego, 439p.
Lydersen, B.K. , D’elia, N.A. and Nleson, K.L. Bioprocess Engineering
Systems, equipment and facilities, John Wiley & Sons, 1994, New York,
805p.
Quintero Ramírez, R. Ingeniería Bioquímica, teoría y aplicaciones, Alambra
mexicana, 1981, México, 332p.
Schûgerl, K, Bioreactor engineering, volume 2; characteristics features of
bioreactors, John Wiley & Sons, 1981, Chichester, 393p.
6.2. Producción de enzima en un biorreactor con células
libres.
OBJETIVO GENERAL
Adquirir los conocimientos prácticos para producir una enzima extracelular por
medio de una fermentación con células libres.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.
2.
3.
4.
5.
Producir invertasa con células libres de levaduras en cultivo sumergido.
Monitorear y obtener la cinética de crecimiento de biomasa.
Monitorear y obtener la cinética de producción de enzima.
Determinar la actividad catalítica de la invertasa.
Establecer las constantes cinéticas (Km, Vmax) de la invertasa
MARCO TEÓRICO
Las Enzimas como Metabolitos
Los metabolitos primarios producidos durante un proceso de fermentación
representan productos finales de bajo peso molecular usados para la
producción de macromoléculas o son convertidos en coenzimas. Así también,
los metabolitos primarios pueden ser productos intermediarios en vías
metabólicas relacionadas con los productos finales. Los aminoácidos,
vitaminas, los nucleótidos y ciertas enzimas son considerados productos
primarios.
6
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En el caso de las enzimas, éstas son consideradas metabolitos primarios
cuando la evolución de su producción guarda una relación estrecha con el
crecimiento microbiano. Existen diversos tipos de enzimas y pueden ser
obtenidas de diferentes fuentes.
Tipos de Enzimas y sus Fuentes
Al menos 75% de todas las enzimas industriales son de acción hidrolítica y
son usadas para la despolimerización de sustancias naturales. Las proteasas
representan el tipo de enzimas industriales predominantes (40%) utilizadas en
la industria lechera y detergentes. Las carbohidratasas utilizadas en las
industrias de panificación, cervecería, destilación, almidón y textiles
representan el segundo grupo más grande de enzimas industriales.
Las enzimas pueden ser obtenidas de diversas fuentes como tejidos
animales, plantas, hongos y bacterias. Las enzimas microbianas representan
90% de las enzimas industriales. Las enzimas de de origen vegetal más
importantes son la papaína, la bromelina, algunas enzimas amilolíticas de
cereales, lipoxigenasas de soya y enzimas de frutas cítricas. En cuanto a las
enzimas de origen animal, estas incluyen a las lipasas y proteinasas
pancreáticas, pepsinas y esterasas.
Levadura
Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, es decir, un tipo de
levadura que ha servido como uno de los modelos más adecuados para el
estudio de problemas biológicos, por ser un sistema eucariota, con una
complejidad sólo ligeramente superior a la de las bacterias pero compartiendo
con ella muchas de sus ventajas técnicas.
Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la
producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido
de carbono y etanol durante el proceso de fermentación. En condiciones de
escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le
permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la
fermentación. Básicamente el proceso de fermentación se lleva a cabo
cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares, como
la sacarosa, y es por ello que en su metabolismo necesita sintetizar una
enzima que catalice la hidrólisis de sacarosa en glucosa y fructosa, siendo
una fuente productora de invertasa.
Invertasa
La invertasa, también conocida como sacarasa, es una enzima de interés
industrial utilizada en la hidrólisis de sacarosa para la obtención de jarabes
fructosados, los cuales son empleados ampliamente en la industria de los
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alimentos como en la industria refresquera, la de conservas, lácteos,
pastelería y confitería.
La invertasa desdobla la sacarosa en fructosa y glucosa, donde a la mezcla
resultante de estos se le denomina “azúcar invertido” debido a la inversión de
sus propiedades ópticas de una rotación positiva a una negativa. También se
cambian las propiedades químicas, por ejemplo, en el caso de la sacarosa, el
tipo de enlace que subsiste entre sus moléculas entrelazadas (α para la
glucosa y β para la fructosa) impide que dicha molécula contenga terminales
reductores, por lo que al hidrolizarse, estas moléculas que quedan libres
recuperan su poder reductor.
MATERIALES
- Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
- Barras magnéticas para agitación (mosca)
- Guantes de asbesto
- Agar nutritivo
- Medio de cultivo para levaduras
- Solución del reactivo DNS
- Solución de glucosa, 2 g/L
- Solución del reactivo de Bradford
- Solución de anthrona
- Solución de sacarosa, 30 g/L
- Solución buffer fosfatos 0.1 M a pH 6.9
- Solución estéril de cloruro de sodio, 0.09%
- Colorantes y soluciones para tinción de Gram
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos
- Charolas de aluminio de 5 cm de diámetro
- Tiras de pH
EQUIPO
- Biorreactor de laboratorio New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra
de 5 L con su módulo de control, partes y electrodos.
- Centrífuga para tubos falcón de 30 mL
- Balanza analítica
- Espectrofotómetro visible
- Incubadora orbital con control de agitación y temperatura
- Autoclave eléctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar
- Microscopio óptico
- Agitador Vortex
- Baño de agua con control de temperatura
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MÉTODOLOGÍA
Inoculación del Biorreactor.
Posteriormente de confirmar la pureza del inóculo y la esterilidad del medio,
con ayuda del profesor se procederá a inocular, con 250 mL del inóculo, el
biorreactor. Antes de inocular se verifica que el medio de cultivo del
biorreactor esté libre de contaminantes. Después de inocular el biorreactor se
toman muestras de 20 mL para cada tiempo en base al siguiente programa de
muestreo:
Tabla 1. Programa de Muestreo
Tiempo
Hora*
Horas
T0
8:00
0
T1
10:00
2
T2
12:00
4
T3
14:00
6
T4
16:00
8
T5
18:00
10
T6
20:00
12
T7
8:00
24
T8
10:00
26
T9
12:00
28
*Las horas no deben ser forzosamente exactas pero si apuntar la hora
exacta y el tiempo exacto de la muestra (Horas)
La muestra del tiempo cero (T0) se toma justo después de inocular el
biorreactor. Si en los tiempos T7, T8 y T9, no hay cambios significativos en la
evolución del crecimiento celular y en la producción de invertasa, se procede
a detener la fermentación.
* NOTA: El programa de muestreo anterior es una propuesta susceptible a
modificación.
Condiciones de fermentación: aireación de 1 VVM, temperatura de 35ºC,
pH inicial de 7.0 y agitación de 180 rpm.
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De acuerdo al programa de muestreo, se irá llenando la “Hoja de control de
la cinética de producción de enzima con células libres” (se anexa al final
de la práctica), con los datos de los parámetros establecidos.
Se evaluarán los siguientes parámetros para cada una de las muestras:
1. Realizar un frotis de cultivo del biorrecator para realizar tinción de Gram y
observar al microscopio, para comprobar pureza.
2. Leer la temperatura que marca el módulo de control del biorreactor.
3. Determinar el pH del caldo de cultivo.
4. Establecer la biomasa por densidad óptica.
5. Establecer la concentración de biomasa por peso seco.
6. Establecer no de células por cuenta en cámara de Neubauer
7. Determinación de la producción de proteína extracelular (invertasa) por
medio del método de Bradford, utilizando al sobrenadante como muestra
problema y agua como blanco
8. Azúcares reductores del sobrenadante libre de células.
9. Determinación de la actividad enzimática (a los 5 minutos) de la invertasa
presente en el caldo de cultivo. De cada muestra centrifugada, tomar
0.05 mL del sobrenadante y se transferir a un microtubo. Adicionar 0.95
mL de solución de sacarosa 30 g/L y mezclar. Inmediatamente (testigo) y
a los 5 min. (triplicado), tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo
con 0.1 mL de reactivo de DNS. Los tubos se colocan en agua hirviente
durante 5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL de agua destilada al
tubo eppendorf, posteriormente pasar a una celda y medir absorbancia a
540 nm.
Metodologías
Azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS9, seguir
el protocolo descrito en la práctica No. 1. Realizar previamente una curva tipo
con soluciones de glucosa.
a) pH: Medir el pH del caldo de cultivo a partir de una muestra (3 a 5 mL)
extraída del biorreactor. Utilizar tiras o papel indicador de pH, o con un
potenciómetro. La lectura de pH es continua por lo que se necesita
únicamente anotar el valor de la lectura.
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b) Biomasa por peso seco:
1. Poner 10 mL de muestra en un tubo falcon de 30 mL de volumen y
centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos. (recuperar
sobrenadante para análisis: azúcares reductores, pH, AE, etc.))
2. Decantar el sobrenadante y mezclar la biomasa precipitada en el
tubo falcon con 1 mL de solución salina isotónica.
3. Homogeneizar utilizando el Vortex.
4. Verter la suspensión celular en una charola de aluminio de peso
conocido. Enjuagar el tubo, para recuperar toda la biomasa, con 1
mL de solución salina isotónica.
5. Meter la charola conteniendo la suspensión celular dentro del horno
a 80ºC y durante 24 horas o hasta peso constante.
6. Determinar el peso de la biomasa seca por diferencia de pesos. El
peso de la muestra seca y el de la charola menos el peso de la
charola, resulta en el peso seco de la biomasa contenida en los 10
mL de muestra.
7. Reportar la concentración de biomasa en mg de biomasa seca/mL
de caldo de cultivo.
c) Biomasa por densidad óptica
1. Poner aproximadamente 1 mL de muestra homogénea en una celda
2. Ajustar el espectrofotómetro a absorbancia de cero utilizando el
sobrenadante de centrifugación como blanco (caldo de cultivo sin
biomasa) obtenido en la técnica anterior de estimación de biomasa
por peso seco.
3. Introducir la celda con la muestra problema en el espectrofotómetro
y determinar la densidad óptica a 600 nm.
d) Proteína extracelular: Para determinar la concentración de la invertasa
producida, tomada en cuenta como proteína extracelular, se empleará
el método de Bradford descrito en la práctica No. 1. Determinando
proteína en el cultivo celular libre de células.
Al final de la fermentación:
a) Detener la fermentación apagando la agitación y el módulo de control.
Cerrar el flujo de agua de enfriamiento.
b) Desmontar el biorreactor de su módulo y esterilizarlo junto con su
contenido utilizando la autoclave eléctrica, no olvidando dejar la salida
de aire del biorreactor abierta.
c) Después de la esterilización, desmontar el biorreactor y sus partes y
efectuar su limpieza.
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REPORTE DE RESULTADOS
a) Elaborar una tabla de los datos obtenidos.
b) Elaborar una gráfica de los resultados del crecimiento de la biomasa
(mg de biomasa seca/mL de caldo de cultivo), y de la densidad óptica a
600 nm contra tiempo (h).
c) Elaborar una gráfica de los resultados de la producción de invertasa
(mg de proteína) contra tiempo (h).
d) Elaborar una gráfica de los resultados del consumo de sustrato (mg de
sacarosa) contra tiempo (h).
e) Elaborar una gráfica de los resultados de la actividad enzimática
(U/mL) contra tiempo (h).
f) Elaborar una gráfica del monitoreo de pH.
g) Elaborar una gráfica del monitoreo de la temperatura.
h) Discutir sobre el comportamiento de las cinéticas, explicando lo que
ocurrió en cada fase de la fermentación.
i) Calcular las constantes cinéticas Vmax y Km mediante algún método
señalado en la práctica No. 2, “Determinación de Vmax y Km de
enzimas”.
j) Anexar la “Hoja de control de la cinética de producción de enzima con
células libres” utilizada durante el desarrollo de la práctica.
k) Si se realizaron las cuatro fermentaciones diferentes marcadas en la
práctica No. 5, “Adiestramiento en la operación de un biorreactor de
laboratorio”, comparar los resultados obtenidos entre ellas.
BIBLIOGRAFÍA
Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2 nd
Edition, McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
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Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San
Diego, 439p.
López, Agustín; QUINTERO, Rodolfo. Tecnología Enzimática. UNAM. México,
1987.
Scragg, Alan. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en procesos
tecnológicos. Editorial Limusa. México, 1999.
Segel H. Irwin, Biochemical Calculations (How to solve mathematical
problems in general biochemestry). Editorial John Wiley & Sons, Segunda
edición, Estados Unidos de América 1976
Stanbury, P.F. and Whitaker, A. Principles of fermentation technology.
Pergamon Press, 1984. Oxford, 255p.
Vogel, H.C. and Todaro, C.L. Fermentation and biochemical engineering
handbook. 2nd edition, Noyes Publications, 1997. New Jersey, 801p.
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HOJA DE CONTROL DE CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMA POR CÉLULAS LIBRES
CONDICIONES
Aireación (vvm)
Agitación (rpm)
Fecha y hora de inicio:
Fecha y hora de término:
Muestra
Tiempo
T ( °C)
(h)
pH
Pureza de
Cultivo (+,-)
Charola
(g)
Charola
con
Muestra PS
(g)
DO
(600 nm)
No de
Cel/mL
DNS (DO) se
sobrenadante
Bradford
(DO) de
Observaciones
sobrenadante
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
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PRÁCTICA 7
PRODUCCIÓN DE ENZIMA (INVERTASA) A PARTIR DE
Saccharomyces cerevisiae LIBRE E INMOVILIZADA EN UN
BIORREACTOR A NIVEL LABORATORIO.
OBJETIVOS:
El alumno determinará la actividad enzimática de la invertasa producida por
Saccharomyces cerevisiae en estado libre e inmovilizado en esferas de
alginato de sodio, durante una fermentación en un biorreactor a nivel
laboratorio.
Específicos:
- El alumno diseñará y construirá un biorreactor nivel laboratorio para la
producción de enzimas a partir de levadura en estado libre e
inmovilizado.
- El alumno inmovilizará células de S. cerevisiae en alginato de sodio.
- El alumno preparará el medio de cultivo para el crecimiento de la
levadura y la producción de la enzima.
- El alumno llevará a cabo el seguimiento de la cinética de crecimiento de
la levadura en estado libre e inmovilizado.
- El alumno monitoreará la producción de proteína en las células (en
estado libre e inmovilizado) durante el tiempo de proceso.
- El alumno determinará la actividad enzimática y la actividad enzimática
especifica de la invertasa producida por las células en estado libre e
inmovilizado.
MARCO TEÓRICO
Inmovilización de células: La inmovilización celular se define como la
localización de células en una región definida en el espacio con la preservación
de las funciones celulares. Esta región de inmovilización debe ser una fase
sólida que permita el intercambio de sustratos y productos con el medio
exterior, no debe ser tóxica para las células y debo ser fácilmente manipulable.
La inmovilización en soportes naturales y sintéticos ha mostrado por un
lado, estabilidad en las funciones celulares, por otro lado, permite alcanzar altas
concentraciones de microorganismos en volúmenes reducidos y permite la
reutilización del biocatalizador y la implantación de sistemas continuos da
producción, facilitando las etapas de separación.
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Los procesos biotecnológicos pueden ser sustancialmente optimizados
utilizando microorganismos inmovilizados en comparación con los procesos
que utilizan células libres.
La utilización de la inmovilización celular permite:





Facilitar las etapas de separación de biomasa y producto.
La reutilización del biocatalizador microorganismos o
células vegetales o animales.
Facilitar la implantación de sistemas continuos de
producción.
Prolongar la actividad metabólica de los
microorganismos o células vegetales o animales.
Prolonga el ciclo de vida de los microorganismos o células vegetales
o animales.
Aumentar la tolerancia de las células a sustancias tóxicas.
Métodos de inmovilización: Las diferentes técnicas que se utilizan para la
inmovilización celular pueden ser clasificadas de la siguiente manera: adsorción
física y enlaces covalentes, micro encapsulación, agregación, y atrapamiento o
inclusión celular.
- Adsorción y enlaces covalentes.
Las técnicas de adsorción y por enlaces covalentes se llevan acabo en los
espacios libres de los poros del soporte, en donde existen grandes
superficies. En este tipo de inmovilización, una gran parte de la superficie de la
célula está en contacto directo con el medio, en contraste con la encapsulación
o técnicas de atrapamiento, en donde un fragmento grande de las células es
capturado y las limitaciones de transferencia de masa pueden estar presentes.
- Adsorción.
Las células pueden anclarse naturalmente a una superficie, las células se
anclan al soporte por atracciones electrostáticas (fuerzas de Van der Walls,
iónicas y de puentes de hidrógeno). El crecimiento produce una biopelícula en
la superficie del soporte y las limitaciones de transferencia de masa tienen
lugar dentro de esta biopelícula.
Los soportes incluyen trozos de madera, arena, resinas de intercambio
iónico y materiales orgánicos corno la celulosa y carbón activado.
- Enlace covalente.
En este tipo de inmovilización el fuerte enlace de la célula-soporte reduce la
pérdida celular. La unión directa de las células a un soporte activado es posible
por la modificación química de la matriz por medio de la utilización de sustancias
que sirvan de puente de unión química. El glutaraldehído es usado para tal fin, sin
embargo, el riesgo del daño celular, debido a los enlaces covalentes alrededor de
la membrana celular, puede ser una limitante.
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- Micro-encapsulación.
La micro-encapsulación se usa en el área farmacéutica o en el campo de ¡ü
medicina para producción de fármacos e inmovilización de enzimas. Una
microcápsula consiste en una semi-membrana permeable, esférica, delgada y
fuerte que rodea un centro liquido, con un diámetro que varia de unas mieras a
1mm. La membrana sin/e como una barrera semipermeable permitiendo la
entrada cíe sustrato y la salida de metabolitos, pero no permite el paso de células.
- Atrapamiento o inclusión.
De entre los métodos de inmovilización de células, el método de inclusión celular
ha mostrado ser el que permite un mejor control de la inmovilización y es el que
preserva mejor las funciones celulares. Este método consiste en atrapar las
células en una red tridimensional rígida de hidrogel; los soportes de
inmovilización pueden ser sintéticos (por ejemplo la poliacrilamida, el
poliuretano) o naturales, (por ejemplo el agar, la gelatina, el alginato y la
carragenina). Una de las características particulares del método de inclusión
o atrapamiento celular está
relacionada
con
las
condiciones
de
gelificación del soporte y la reversibilidad del proceso de gelificación. La
gelificación se realiza por cambios en la temperatura o por la presencia de
iones. Además, la gelificación es reversible, así, bajo ciertas condiciones
físicas se cuenta con una suspensión celular que puede ser gelificada,
quedando las células atrapadas; posteriormente se puede volver a liberar las
células aumentando la temperatura o retirando los iones. Uno de ios materiales
más empleados para realizar la inmovilización por inclusión celular es la Kcarragenina.
a) Kapa-carragenina.
La K-carragenina es un polisacárido no tóxico, de fácil adquisición, aislado a partir
de algas marinas. Es ampliamente usado en las industrias cosmética y alimentaria
como agente gelificante, espesante y estabilizante. Es un polímero, el cual esta
constituido por una estructura unitaria de sulfato de β-D galactosa y 3,6-anhidro-α-Dgalactosa.
La K-carragenina gelifica al enfriarse o al contacto con una solución de algún
agente inductor del gel, tales corno iones potasio o calcio.
Una ventaja al emplear K-carragenina es, que la inmovilización puede efectuarse
bajo condiciones muy suaves, sin el uso de químicos que puedan inhibir la
actividad enzimática de las células.
Invertasa: la invertasa (β-D-fructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa,
EC 3.2.1.26), cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores β-Dfructofuranosídicos de fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más
significado es, sin duda, la sacarosa, de ahí que el enzima se designe con el nombre
de sacarasa. La denominación trivial de invertasa, con la que también se conoce, hace
referencia al hecho de que los productos de la reacción son conocidos desde antiguo
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como “azúcar invertido” ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla
equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrólisis es levorrotatoria, por lo
que en el proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de
rotación óptica.
Sacarosa ([α] = +66,5º) + H O → D-glucosa ([α] = +52,5º) + D-fructosa ([α] = -92º)
D
2
D
D
La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en
microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel importante en el
catabolismo de fructanos y más específicamente en el de la sacarosa, en especial en
aquellos organismos en los que dichos azúcares son utilizados como fuente de
carbono y energía. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto
desde un punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de los
enzimas más conocidos.
La invertasa es una enzima de interés industrial utilizada en la hidrólisis de sacarosa
para la obtención de jarabes fructosados (JF), los cuales son empleados ampliamente
en la industria de alimentos como la industria refresquera, la de conservas, lácteos,
pastelería y confitería.
Aplicación biotecnológica y biorreactores con células inmovilizadas.
Los biorreactores más comunes usados con células inmovilizadas son: tanque
agitado, lecho fluidizado, columna empacada, y reactor air-lift (Fig. 1). El tipo de
biorreactor a utilizar depende del método de inmovilización empleado, del
metabolismo las células y del requerimiento de transferencia de masa
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Salida de aire
Alimentación
Células
inmovilizadas
Aspersor de aire
Productos
A
B
Productos
Productos
Células
inmovilizadas
Alimentación
Alimentación
D
C
Figura 1. Biorreactores con células inmovilizadas A, Tanque agitado; B, air lift; C,
Columna empacada; y D, Lecho fluidizado.
Material, Equipo y Reactivos
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Probetas.
Termómetro
Autoclave
Baño María
Potenciómetro.
Microscopio óptico
Centrífuga
Balanza analítica
Espectrofotómetro UV-VIS
Campana de flujo laminar
Tubos Falcón
Tubos Eppendorf estériles (150
aprox.)
Portaobjetos
Asa bacteriológica
Lámpara de alcohol
Mechero de Bunsen
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Micropipetas
Encendedor
Portaobjetos
Puntas para micropipetas
Tiras de medición de pH
Charolas de aluminio secas
Soluciones para realizar tinción de
Gram
o Cristal Violeta
o Lugol
o Alcohol-cetona
o Safranina
Reactivo DNS
Reactivo de Bradford
Solución de sacarosa al 30%
Agua destilada
Buffer pH 4
Buffer pH 7
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Aceite de inmersión
Solución de anthrona
Alcohol al 70 %
Solución de sacarosa
Pinzas
Charolas de aluminio
Baño de hielo
Sacarosa
Extracto de levadura
Vasos de precipitado de diferentes
volúmenes
Barras magnéticas para agitación
(mosca)
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Jeringa de 10 ml con punta roma
Manguera de silicón de 2 mm de
diámetro para bomba peristáltica
Agar nutritivo.
Parrilla de agitación y
calentamiento
Soporte Universal
Solución estéril de cloruro de calcio
al 1%.
Solución de alginato al 2%
Pipetas de 1 y 10 mL
1 colador de cocina metálico
Primera parte:
Cada equipo debe diseñar un reactor, considerando material que sea factible de
conseguir, que esté en el laboratorio o bien matraces, frascos de vidrio, probetas,
tubería etc. El reactor diseñado deberá garantizar la esterilidad del cultivo, además de
proveer un sistema de agitación homogéneo, ya sea por medio de inyección de aire o
con barras magnéticas. El volumen total de operación del reactor no deberá ser mayor
a 1 L.
Prueba de del biorrecator diseñado, funcionamiento y esterilidad:
Preparar medio de cultivo agar nutritivo (el volumen dependerá del tamaño del reactor
diseñado) y colocarlo en el reactor. Cerrar el reactor y someterlo a esterilización en
autoclave, a 125 °C por 15 minutos. Posteriormente verificar que no se halla dañado el
rector o sus partes durante el proceso y dejar funcionando durante 24 h. Al día
siguiente, comprobar por medio de turbidez y cuenta en placa que no haya crecimiento
en el reactor.
Segunda parte
Medio a utilizar en toda la práctica, composición por L de medio: sacarosa, 20 g;
KH2PO4, 5 g; (NH4)2SO4, 7 g; NaCl, 0.5 g; MgSO4 7H2O, 0.5 g, CaCl2 2H2O, 0.25 g;
extracto de levadura, 5.0 g
Ajustar el pH a 5 con H2SO4 y NaOH 0.1 N, esterilizar a 120 oC y 1.5 Kg/cm2 durante
15 minutos.
Preparar, un día antes de iniciar el experimento en el birreactor, un inóculo de S.
cerevisiae en cuatro matraces de 500 mL con 250mL de medio estéril, pH 5. El
profesor proporcionará un cultivo en caja de petri de la cepa Saccharomyces
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cerevisiae. De forma aséptica, tomar con el asa una porción de una colonia del cultivo
sólido proporcionado e introducirla en el medio de cultivo estéril del matraz. Incubar a
35°C, con agitación de 120 rpm y durante 14 a 16 horas (toda la noche). Verificar la
pureza del cultivo por tinción de gram
Inmovilización de células.
TODO el material donde se trabajará debe estar estéril, y manipular en la
campana hasta que esté montado en reactor. Prever tener todo el material estéril,
pipetas, coladores, matraces, mangueras, etc.
Centrifigar 500 mL de medio a 5000 rpm, 15 min en tubos estériles y recuperar la
pastilla celular, (eliminar sobrenadante), posteriormente resuspender la biomasa
en 100 mL de solución isotónica estéril.
1. Contar el No de células por mL del inóculo, por cuenta en cámara de
Neubauer.
2. Adicionar a un matraz de 500 0 1000 mL que contiene 400 mL de alginato
de calcio al 2.5% a 40-45 ºC, la biomasa contenida en los 100 ml del
inóculo (biomasa resuspendida).
3. Agita con una barra magnética para homogenizar la suspensión.
4. La suspensión se bombea por medio de una bomba peristáltica que
opera a 12 rpm y a través de una aguja hacia una solución de cloruro de
calcio al 1% (estéril) en forma de gotas.
5. Las gotas al ponerse en contacto con la solución de cloruro de calcio
solidifican instantáneamente formándose así esferas de aproximadamente
3 mm de diámetro.
6. La solución debe estar con agitación mínima (60 rpm), para evitar que las
esferas se peguen entre ellas al momento de caer. Las esferas formadas
permanecen en la solución de cloruro de calcio con agitación durante
30 min.
7. Posteriormente son retiradas de forma estéril (con un colador de
cocina metálico estéril) e introducidas al biorreactor diseñado. Todo ello
se realiza dentro de la campana de flujo laminar en condiciones de
esterilidad.
8. Tomar una muestra de esferas para determinar el volumen y peso de
la misma y establecer el número de células por esfera.
9. Tomar una muestra del cloruro de calcio para determinar las células
no inmovilizadas, por cuenta en cámara de Neubauer.
Una vez obtenidas la células inmovilizadas montar los dos reactores diseñados, uno
para células libres (inocularlo al 10 %) y otro para inmovilizadas. Tener listo la cantidad
de medio de cultivo estéril necesario para los reactores, tener preparado más de lo
necesario para el caso de cualquier contingencia y los blancos.
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La cinética se seguirá por 24 h, tomando 5 o 6 mL de medio en cada tiempo para
análisis; Monitoreando los siguientes parámetros en el sobrenadante:
1.
2.
3.
4.
Densidad óptica (biomasa)
(Volumen de muestra 1 mL máximo)
Cuenta en placa*
(Volumen de muestra 0.1 mL)
Cuneta directa en cámara de Neubauer
(Volumen de muestra 0.1 mL)
Tinción de Gram
(Volumen de muestra 0.1 mL)
*Cuenta en placa se realizará al inicio, tiempo cero, un tiempo intermedio y tiempo final,
por triplicado y tres diluciones, en medio para levaduras con 15 g/L de agar, inoculando
con 0.1 mL de la dilución correspondiente (10 0 a 10-9 y extendiendo con varilla en “L”.
(Se requieren de 54 cajas por equipo, puntas estériles de 1000 y 100 µL, para las
diluciones: 30 tubos eppendorf estériles, solución isotónica estéril)
En sobrenadante centrifugado a 5000 rpm 15 min determinar:
5.
6.
7.
8.
Proteína por Bradford
Azúcares reductores
Azúcares totales
pH
9. Actividad enzimática:
(Volumen de muestra 0.75 mL)
(Volumen de muestra 0.3 mL)
(Volumen de muestra 0.6 mL)
((Volumen de muestra 1 mL)
(Volumen de muestra 250 µL)
De cada muestra centrifugada, tomar 0.05 mL del sobrenadante y se transferir a
un microtubo. Adicionar 0.95 mL de solución de sacarosa 30 g/L y mezclar.
Inmediatamente y a los 5 min., tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo
con 0.1 mL de reactivo de DNS. Los tubos se colocan en agua hirviente durante
5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL de agua destilada y medir
absorbancia a 540 nm.
Notas:
IMPORTANTE, la única muestra que debe permanecer sin contaminar (tomada y
manipulada en condiciones de esterilidad) es la usada para cuenta en placa.
Tiempos recomendados: en función de los horarios de la clase, establecer el programa de
muestreo, la principal actividad se lleva a cabo en las primeras 12-18 horas, por lo que dejar
al inicio toda la noche el sistema puede hacer que se pierdan los puntos más interesantes.
Se recomienda dejar todo listo, enfriar e iniciar en la mañana.
Las muestras pueden ser tomadas y guardadas en refrigeración para el posterior análisis.
Se recomienda hacer de forma inmediata la cuanta en placa y Tinción de Gram (esta última
para asegurar que no hay contaminación).
Resultados y análisis de resultados
1.- Establecer el porcentaje de inmovilización de células
2.- Comparar la actividad y eficiencia de los dos reactores
3.- Establecer relaciones y correlaciones de los parámetros determinados. Curvas de
crecimiento, degradación, actividad enzimática, consumos de sustrato, etc.
4.- Discutir los resultados obtenidos
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9

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