UNIVERSIDAD NACIONAL
INSTITUTO TECNÓLOGICO DE COSTA RICA
UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA
Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo
POTENCIAL SIMBIÓTICO Y CONTRIBUCIÓN DE LA MICORRIZA
ARBUSCULAR EN LA DISMINUCIÓN DE ALUMINIO EN PALMA
ACEITERA (Elaeis guineensis Jacq.) UTILIZANDO INÓCULOS
NATIVOS PROPAGADOS EN CONDICIONES DE ESTRÉS ÁCIDO.
Sustentante:
Beatriz Elena Guerra Sierra
Universidad Nacional
Heredia, Costa Rica
2014
UNIVERSIDAD NACIONAL
INSTITUTO TECNÓLOGICO DE COSTA RICA
UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA
Doctorado en Ciencias Naturales Para el Desarrollo
POTENCIAL SIMBIÓTICO Y CONTRIBUCIÓN DE LA MICORRIZA
ARBUSCULAR EN LA DISMINUCIÓN DE ALUMINIO EN PALMA
ACEITERA (Elaeis guineensis Jacq.) UTILIZANDO INÓCULOS
NATIVOS PROPAGADOS EN CONDICIONES DE ESTRÉS ÁCIDO.
Sustentante:
Beatriz Elena Guerra Sierra
Director de tesis:
Patrice Dion-Universidad Laval-Canadá
Trabajo sometido a consideración del tribunal evaluador como
requisito para optar al grado de Doctor en Ciencias Naturales para el
Desarrollo, con énfasis en Gestión de Recursos Naturales.
DEDICATORIA
A mi madre a quien dedico este triunfo y a mis hermanas por su inmenso amor y
apoyo
A mis ahijadas:
Laura Melissa, una cómplice en el trabajo del mundo microscópico
Emely, ejemplo de valentía y ánimo contagioso, que me impulso en todos los
momentos difíciles para seguir adelante
A mis amigos
que tuvieron una palabra de apoyo durante este largo camino
A todos aquellos
que han entendido el potencial de la micorriza arbuscular
A los nuevos lectores
que están por descubrir esta maravillosa simbiosis
Un camino de mil millas comienza con un paso…………
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Santander-UDES por los espacios físicos brindados para el
desarrollo de las pruebas de laboratorio e invernadero y por el soporte dado a
través de las convocatorias internas de proyectos de investigación para financiar
parte de los objetivos de este trabajo. A la Universidad Laval de Quebec (Canadá)
y a mi director, Patrice Dion por el valioso soporte científico brindado durante el
desarrollo de este trabajo, a Serge Sokolsky e Yves Piché del Instituto de Biología
Integrativa y de Sistemas de la Universidad Laval-Canadá, por todo su apoyo
incondicional durante mi estancia de entrenamiento en técnicas de identificación
molecular de micorriza, al Instituto de Agricultura y alimentos-Ottawa-Canadá, a
Yolanda Dalpé por sus valiosos aportes en la taxonomía de hongos micorrizicos,
a Silvye Séguin por su valioso apoyo en el entrenamiento durante mi estancia en
Ottawa. A Chris Walker y Edward Sieverding por su valiosa contribución y apoyo
en la identificación morfológica de las especies de micorriza arbuscular en palma,
por sus aportes y comentarios.
A la Unidad de Microscopia electrónica de la Universidad del Cauca- Colombia, a
Gerardo Andrés Torres y Lyda Patricia Mosquera por todas sus enseñanzas y
entrenamiento en el manejo de muestras y procesamientos en microscopia
electrónica de trasmisión, a la Unidad de Microscopia de barrido y a la Escuela de
Ciencias Básicas de la Facultad de Salud de la Universidad del Valle, a la
Unidad de Microscopia Confocal y en especial mis agradecimientos a la
profesora Martha Ceballos. Mis agradecimientos al Sr. José Barbudo y a la
Cooperativa de palmicultores de Colombia- COPALCOL, por todo el soporte
brindado con el material de semillas de palma aceitera y por los espacios
brindados en el invernadero del municipio el ocho en Puerto Wilches.
Al programa de Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo, a todos los
profesores, en especial a María de los Ángeles Álvarez y a Sayra Munguía por
sus valiosos acompañamientos durante el proceso de formación doctoral. Especial
agradecimiento a Martha Roció Chacón por su valiosa colaboración
en la
propagación de los hongos micorrizicos y a todos los estudiantes quienes me
colaboraron en los ensayos en invernadero. A Edgar Javier Rincón, amigo y
compañero en los momentos de alegría y desconsuelo en el proceso de
investigación, por su valioso apoyo en el entrenamiento en las técnicas para el
procesamiento de raíces
A mi familia quien me apoyo durante todo el proceso y a Emely quien
constantemente me recordó que los grandes trabajos no son hechos por la fuerza,
sino por la perseverancia.
Al gremio palmero que me acompaño en este trabajo de investigación, y me
brindaron soporte, en especial al palmero Manuel Gutiérrez (q.e.p.d), por el
acompañamiento incondicional en los largos viajes por el Magdalena medio y por
la zona central palmera de Colombia. Finalmente doy las gracias a todas las
personas que conocí durante el transcurso de este trabajo y que me brindaron,
toda su colaboración y amistad.
INDICE DE CONTENIDOS
Págs.
RESUMEN GENERAL DE LA INVESTIGACION ................................................... xi
GENERAL SUMMARY OF RESEARCH .............................................................. xvi
INTRODUCCIÓN AL TEMA DE INVESTIGACIÓN ..................................................1
HIPÓTESIS.............................................................................................................9
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................9
OBJETIVOS ESPECIFICOS ...................................................................................9
ALCANCES Y APORTES .....................................................................................10
LIMITACIONES ....................................................................................................12
CONCLUSIONES GENERALES ..........................................................................12
RECOMENDACIONES ........................................................................................15
CAPITULO I. LA PALMA ACEITERA Y SU RELACIÓN CON LA SIMBIOSIS
MICORRIZICA ......................................................................................................16
1.0 INTRODUCCIÓN ............................................................................................20
2.0 BOTÁNICA DE LA PALMA ACEITERA (ELAEIS GUINEENSIS JACQ) ...........22
3. SISTEMA RADICULAR DE LA PALMA ...........................................................24
4. IMPORTANCIA Y PRODUCCIÓN DE LA PALMA ACEITERA A NIVEL
MUNDIAL Y EN COLOMBIA .................................................................................26
5. ENFERMEDADES DE LA PALMA ACEITERA .................................................32
5.1 LA PUDRICIÓN DEL COGOLLO ....................................................................32
6. GENERALIDADES DE LA SIMBIOSIS MICORRÍZICA .....................................35
7. BENEFICIOS DE LA MICORRIZA ARBUSCULAR EN PLANTAS ..................39
8. MICORRIZAS Y PALMA ACEITERA................................................................44
9. EL ALUMINIO Y EL ROL DE LA MICORRIZA ..................................................46
10.CONCLUSIONES ............................................................................................50
11. REFERENCIAS ...............................................................................................51
i
CAPITULO II. DIVERSIDAD, DENSIDAD Y COLONIZACION MICORRIZICA
NATIVA EN PALMA ACEITERA.............................................................................65
RESUMEN ............................................................................................................66
ABSTRACT...........................................................................................................67
1.0 INTRODUCCION ............................................................................................68
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS ...........................................................................71
2.1 MUESTREO DE SUELOS Y RAÍCES PARA ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO,
COLONIZACIÓN, DENSIDAD Y DIVERSIDAD DE ESPORAS ............................71
2.2 TAMAÑO DE MUESTRA ................................................................................72
2.3 ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DEL SUELO .......................................................73
2.4 ANÁLISIS DE LA DENSIDAD Y COLONIZACIÓN NATIVA DE HONGOS
MICORRIZICOS ARBUSCULARES EN LA ZONA DE ESTUDIO .........................74
2.5 PORCENTAJE DE COLONIZACIÓN MICORRIZICA NATIVA.....................74
2.6 IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE ESPORAS DE HMA .........................74
2.7ANÁLISIS MOLECULAR DE HMA ...................................................................76
2.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................77
3.0 RESULTADOS ................................................................................................78
3.1 ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DE SUELOS ......................................................78
3.2 DENSIDAD DE ESPORAS .............................................................................79
3.3 COLONIZACIÓN MICORRÍZICA ....................................................................80
3.4 IDENTIFICACIÓN DE HMA-ÍNDICES DE DIVERSIDAD, Y FRECUENCIA ....82
3.5 DIVERSIDAD DE ESPECIES .........................................................................88
3.6 FRECUENCIA DE ESPECIES ........................................................................89
4. DISCUSIÓN ......................................................................................................93
4.1SUELOS ..........................................................................................................93
4.2 DENSIDAD, RIQUEZA Y FRECUENCIA DE ESPORAS DE HMA .................93
4.3 COLONIZACIÓN MICORRÍZICA ....................................................................95
4.4 IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE HMA ....................................................95
5. CONCLUSIONES .............................................................................................99
6. REFERENCIAS .............................................................................................. 100
ii
CAPITULO
III.
SELECCIÓN
DE
UN
INÓCULO
MICORRIZICO
POR
GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO EN MEDIOS CON ALUMINIO ...................... 105
RESUMEN .......................................................................................................... 106
ABSTRACT......................................................................................................... 108
1.0 INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 110
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 114
2.1 MATERIAL FÚNGICO................................................................................... 114
2.2 MEDIOS DE CULTIVO.................................................................................. 116
2.3 MONTAJE DEL EXPERIMENTO .................................................................. 116
2.4 EVALUACIÓN DE LA GERMINACIÓN Y EL CRECIMIENTO DE HIFAS ..... 118
2.5 ESTADÍSTICA Y ANÁLISIS DE DATOS ....................................................... 118
3. RESULTADOS ................................................................................................ 119
3.1 GERMINACIÓN ............................................................................................ 119
3.2 CRECIMIENTO HIFAL .................................................................................. 120
4. DISCUSIÓN .................................................................................................... 125
5. CONCLUSIONES ........................................................................................... 128
6. REFERENCIAS .............................................................................................. 129
CAPITULO IV. CONTRIBUCION DE LA MICORRIZA ARBUSCULAR PARA
REDUCIR FITOTOXICIDAD DEL AL EN SUELOS CULTIVADOS CON PALMA
ACEITERA .......................................................................................................... 132
RESUMEN .......................................................................................................... 133
ABSTRACT......................................................................................................... 135
1.0 INTRODUCCION .......................................................................................... 137
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................... 140
2.1 FASE EN INVERNADERO Y ESTABLECIMIENTO DE LA SIMBIOSIS
MICORRIZICA .................................................................................................... 140
2.2 EVALUACIÓN DE LA SIMBIOSIS MICORRIZICA ......................................... 141
2.3 EXPOSICIÓN DE PLÁNTULAS A DIFERENTES SOLUCIONES DE AL
BAJO CONDICIONES CONTROLADAS PERIODO DE ACLIMATIZACIÓN ...... 142
iii
2.4 EXPOSICIÓN A SOLUCIONES DE AL ......................................................... 142
2.5 PROCESAMIENTO DE RAÍCES DE PALMA ACEITERA Y COLORACIÓN
CON LUMOGALLION Y DAPI ............................................................................. 143
2.6 ANÁLISIS EN MICROSCOPIA CONFOCAL ................................................. 144
2.7 INTERPRETACIÓN Y TRATAMIENTO DE IMÁGENES MEDIANTE EL
APLICATIVO SOFTWARE-MATLAB® ................................................................ 145
2.8 DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADISTICO ............................... 146
3. RESULTADOS ................................................................................................ 147
3.1 ANÁLISIS Y VERIFICACIÓN PRELIMINAR DE LA SIMBIOSIS .................... 147
3.2 OBTENCIÓN DE IMÁGENES DE SECCIONES DE RAÍCES JÓVENES DE
PALMA ACEITERA POR MICROSCOPIA CONFOCAL ..................................... 148
3.3 DISTRIBUCIÓN E INTENSIDAD DE LA FLUORESCENCIA ........................ 150
3.4 COMPARACIÓN DE LA INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA .................... 152
4. DISCUSIÓN .................................................................................................... 158
4.1 VERIFICACIÓN DE LA SIMBIOSIS MICORRIZICA ...................................... 158
4.2 IMÁGENES DE RAÍCES JÓVENES DE PALMA ACEITERA OBTENIDAS POR
MICROSCOPIA CONFOCAL .............................................................................. 158
4.3 TRATAMIENTO DE LAS IMÁGENES E INTERPRETACIÓN DE LA
INTENSIDAD DE EMISIÓN DE FLUORESCENCIA ........................................... 161
5. CONCLUSIONES ........................................................................................... 165
6. REFERENCIAS .............................................................................................. 166
CAPITULO V. SIMBIOSIS EN PALMA ACEITERA (Elaeis guineensis Jacq.),CON
INÓCULOS MICORRÍZICOS TOLERANTES Y NO TOLERANTES AL ALUMINIO y
DETALLES DESCRIPTIVOS DE SUS RAÍCES .................................................. 171
RESUMEN .......................................................................................................... 172
ABSTRACT......................................................................................................... 174
1.0 INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 176
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 179
2.1 SITIO DE ESTUDIO Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ENSAYO ................ 179
iv
2.2 MATERIAL BIOLÓGICO Y SUSTRATOS ...................................................... 180
2.3 INÓCULOS MICORRÍZICOS UTILIZADOS .................................................. 181
2.4 DISEÑO DEL EXPERIMENTO Y TRATAMIENTOS ...................................... 181
2.5 PARTE DESCRIPTIVA DE LA MICORRIZACIÓN, ONTOGENIA Y MORFOANATOMÍA DE LAS RAÍCES DE PALMA ........................................................... 182
2.6 MONTAJE DEL EXPERIMENTO EN INVERNADERO .................................. 182
2.7 DESCRIPCIÓN MORFOANATÓMICA DE RAÍCES DE PALMA ACEITERA Y
SIMBIOSIS MICORRÍZICA. ................................................................................ 183
2.8 TINCIONES PARA ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS DE LA SIMBIOSIS Y
ANATOMÍA DE LAS RAÍCES DE PALMA ACEITERA ......................................... 183
2.9 ESTIMACIÓN DE LA BIOMASA SECA DE LA RAÍZ ..................................... 184
2.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................... 185
3. RESULTADOS ................................................................................................ 186
3.1DESCRIPCIÓN MORFOANATÓMICA Y ASPECTOS DE LA ONTOGENIA DE
LAS RAÍCES DE PALMA ACEITERA .................................................................. 186
3.2 MICORRIZACIÓN ......................................................................................... 190
3.3 RESULTADOS DE LA CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN DE LA
SIMBIOSIS MICORRÍZICA EN LOS TRATAMIENTOS MICORRIZACIÓN .......... 194
3.4 RESULTADOS DE LA BIOMASA EN LOS TRATAMIENTOS ........................ 196
4. DISCUSIÓN .................................................................................................... 198
4.1 ASPECTOS MORFO-ANATÓMICOS Y ONTOGENIA DE LAS RAÍCES DE
PALMA ACEITERA: ............................................................................................ 198
4.2 TIPO DE MICORRIZACIÓN Y SIGNIFICANCIA EN SUELOS ÁCIDOS ........ 198
4.3 RESULTADOS DE LA SIMBIOSIS MICORRÍZICA Y BIOMASA EN LOS
TRATAMIENTOS: ............................................................................................... 201
5. CONCLUSIONES ........................................................................................... 204
6. REFERENCIAS .............................................................................................. 206
v
LISTA DE FIGURAS
CAPITULO I.
Figura 1. Esquema de semilla comercial Tenéra mediante el cruce de las
variedades Dura y Pisífera. Se muestran los porcentajes de endospermo,
endocarpio y mesocarpio de los frutos ..................................................................23
Figura 2. Esquema del sistema radicular de la Palma de aceite ..........................24
Figura 3. Comparación de la eficiencia de la palma de aceite con otros cultivos
importantes de oleaginosas-(Fuente Oil World 2013) ...........................................27
Figura 4. Los cuarenta y seis países donde se cultiva palma aceitera ..................28
Figura 5. Principales países productores de palma aceitera (Fuente: USDA-2013)
.............................................................................................................................29
Figura 6. Zonas palmeras en Colombia- hectáreas de producción al año 2012 ....31
Figura 7. Árbol filogenético de los HMA (Glomeromycota) ....................................38
CAPITULO II.
Figura 1. Mapa de las cuatro zonas palmeras (región central-Puerto WilchesColombia ..............................................................................................................71
Figura 2. Densidad nativa de hongos micorrizicos arbusculares en suelos
palmeros (Puerto Wilches-Colombia). ..................................................................79
Figura 3. Colonización micorrizica nativa en 4 zonas de palma, en época seca
y lluviosa (Puerto Wilches-Colombia).(barras angostas son errores estándar) .....81
Figura 4 (A). Descripción morfológica de especies micorrízicas nativas de suelos
palmeros (Zona central-Puerto Wilches-Colombia) ...............................................84
Figura 5 (B). Descripción morfológica de especies micorrízicas nativas de suelos
palmeros (Zona central palmera, Puerto Wilches- Colombia.................................86
vi
Figura. 6 Ornamentación de la
pared externa de hongos
micorrizicos
arbusculares (Suelos palmeros Colombianos). .....................................................87
Figura.7 Ornamentación de la pared externa de hongos micorrizicos arbusculares
(Suelos palmeros Colombianos). ..........................................................................88
Figura 8. Frecuencia relativa de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en
cuatro zonas palmeras en época seca (A) a 10 cm y (B) a 20 cm del suelo. ........91
Figura 9.
Frecuencia relativa de hongos micorrízicos arbusculares(HMA) en
cuatro zonas palmeras en época lluviosa (A) a 10 cm y (B) a 20 cm del suelo. ...92
CAPITULO III.
Figura 1. Esquema del proceso de colonización micorrizica ............................... 111
Figura 2. “Modelo Sándwich con raíces para germinación de esporas de hongos
micorrizicos.” ....................................................................................................... 117
Figura 3. Porcentaje de Germinación promedio de micorrizas arbusculares nativas
de palma aceitera en sustratos modificados a los 30 días. ................................ 120
Figura 4. Crecimiento hifal de seis especies de hongos micorrizicos arbusculares
nativos de palma aceitera en medios modificados in vitro................................... 122
Figura 5. Gráfico-del crecimiento de
hongos micorrizicos (HMA) sustratos y
tiempo. ................................................................................................................ 124
CAPITULO IV.
Figura 1. Esquema general de la exposición de plántulas de palma aceitera de 60
días de edad en soluciones liquidas y a diferentes concentraciones de Al. ........ 143
Figura 2. Estructuras de colonización micorrizica en raíces de palma aceitera con
coloración Azul tripano ....................................................................................... 147
Figura 3-Raíces de palma aceitera con y sin micorrizas expuestas
a
concentraciones de Al, coloreadas con Dapi y Lumogallion. ............................ 149
vii
Figura 4. Intensidad de la fluorescencia, complejo Al-Lumogallion en secciones
longitudinales de raíces jóvenes de palma aceitera con y sin micorrizas,
(herramienta-RGB, Software MATLAB) .............................................................. 151
Figura 5. Captación de Al, por la intensidad de fluorescencia en raíces jóvenes de
palma aceitera micorrizadas y no micorrizadas -Software MATLAB®. ............... 153
Figura.6 Intensidad de Fluorescencia ( Lumogallion-Al ) en raíces de palma
aceitera con y sin micorrizadas , expuestas a diferentes concentraciones de Al. 154
Figura 7. Anova gráfico de la intensidad de fluorescencia en raíces micorrizadas y
no micorrizadas expuestas a concentraciones de Al . ......................................... 155
Figura 8. Auto fluorescencia emitida por los controles de raíces de palma aceitera
con y sin micorrizas. ........................................................................................... 157
CAPITULO V.
Figura 1. Detalles morfológicos de raíces de palma aceitera y simbiosis micorrízica
en secciones transversales ................................................................................. 187
Figura 2. Características del cilindro vascular y aspectos de la formación de raíces
laterales en palma aceitera. ................................................................................ 189
Figura 3 Colonización micorrízica en raíces terciarias y cuaternarias de palma
aceitera con inóculos tolerantes y y no tolerantes al Al. ...................................... 191
Figura 4. Detalles ultraestructurales del del tipo de micorrización Arum en palma
aceitera en suelos ácidos.................................................................................... 193
Figura 5 Porcentaje de colonización micorrízica en raíces terciarias y cuaternarias
en palma aceitera ,en suelos ácidos con inóculos tolerantes y no tolerantes al Al.
........................................................................................................................... 194
Figura 6. Evaluación de la biomasa seca radicular de palma aceitera de 240 dias
de edad, con inóculos tolerantes y no tolerantes al Al y sin micorrizas. .............. 196
viii
LISTA DE CUADROS
CAPITULO I.
Cuadro 1. Distribución del área sembrada, en producción y desarrollo de palma
aceitera en Colombia (año 2012). .........................................................................31
CAPITULO II.
Cuadro1. Parámetros Fisicoquímicos de suelos de palma ..................................78
Cuadro 2. Densidad de esporas/ 100 g de suelo seco de micorriza arbuscular
(n=20)±error estándar(ee) en suelos palmeros, a dos profundidades en época
seca (S) y lluviosa(L). ...........................................................................................80
Cuadro 3. Media de colonización micorrízica (n=50)±error estándar(ee) de suelos
de palma, en época seca y lluviosa (Puerto Wilches-Colombia). ..........................81
Cuadro 4.Especies micorrízicas identificadas mediante biología molecular (I.M.O)
y morfológicamente (I.M.R) en suelos de palma aceitera de la región de PuertoWilches (Colombia) ..............................................................................................83
Cuadro 5Diversidad de especies micorrízicas arbusculares en suelos palmeros
Puerto Wilches-Colombia ......................................................................................89
Cuadro 6. Frecuencia relativa de especies micorrízicas en suelos palmeros a dos
profundidades (10 y 20 cm) y en época seca y lluviosa.Frecuencia Máxima (Máx.)
y Frecuencia Mínima (Mín.) de una especie..........................................................90
CAPITULO III.
Cuadro 1. Origen geográfico de los aislamientos de micorriza arbuscular
y
características de la propagación de las esporas................................................ 115
ix
CAPITULO IV.
Cuadro 1. Porcentajes promedios de colonización micorrizica en raíces de palma
de 6 0 d í a s d e edad ..................................................................................... 147
Cuadro 2. Intensidad de Fluorescencia en raíces de palma aceitera con y sin
micorriza (n=45) .................................................................................................. 156
Cuadro 3. Promedios (n=15)±D.E de auto fluorescencia hallados en controles
para las raíces micorrizadas y no micorrizadas................................................... 156
CAPITULO V.
Cuadro 1 Análisis fisicoquímico de dos suelos ácidos de cultivos de palma
aceitera ............................................................................................................... 180
Cuadro 2. Parámetros considerados para clasificar raíces de palma aceitera en
fase de vivero ..................................................................................................... 186
Cuadro 3. Porcentaje de colonización en palma, por tipo de inóculo, suelo y
tiempo ................................................................................................................. 195
Cuadro 4. Promedios de biomasa radicular en palma aceitera en los tratamientos
con inóculos tolerantes y no tolerantes al Al y sin micorriza arbuscular .............. 197
x
RESUMEN GENERAL DE LA INVESTIGACION
Debido a los altos rendimientos el cultivo de la palma aceitera (Elaeis guineensis
Jacq.), se ha expandido en las zonas tropicales de Asia, África y América. En
Colombia se cultiva en cuatro zonas palmeras, y en particular en la zona central
los suelos se caracterizan por ser ácidos, bajos en contenidos de P y nutrientes,
condiciones por las cuales el establecimiento de la simbiosis micorrizica sugiere
un mayor beneficio para el aprovechamiento de nutrientes y de agua para el
cultivo.
El presente estudio permitió inicialmente caracterizar cuatro suelos de la región
central palmera (Municipio de Puerto Wilches) como suelos franco-arenosos,
ácidos pobres en nutrientes y con saturaciones de Al variable. En éstos suelos se
evaluó la simbiosis micorrizica; para tal fin se midió el porcentaje de colonización,
densidad y diversidad de hongos micorrizicos arbusculares (HMA) nativos,
durante la época seca y lluviosa durante un año, se consideró la evaluación a dos
profundidades del suelo 10 y 20 cm.Los resultados mostraron valores de densidad
de esporas entre 21,4 -130,8 esporas/100g de suelo seco siendo el rango más
bajo en la época de lluvia y el más alto en época seca.
La profundidad a la cual se tomó la muestra también influyó en los resultados
así la densidad de esporas disminuyo hasta un 49% a 20 cm en la época de
lluvias comparada con las muestras tomadas a 10 cm. La colonización nativa fue
más alta en la época lluviosa (±63,1%.), contrariamente los resultados obtenidos
en la densidad de esporas, en este período fue más bajo. El índice de diversidad
se midió por el índice de Shannon Weaver y estuvo en el rango de 2,42-2,58 en
la época seca, y en 1,77-2,54 en la época lluviosa. Doce especies micorrízicas y 4
morfoespecies de HMA fueron identificadas por las características morfológicas de
sus esporas, utilizando las técnicas de microscopia fotónica y de barrido y por
xi
análisis de ADN. Las esporas de HMA nativos fueron propagadas en cultivos
monoespóricos en Brachiaria decumbens Staps. y Manihot esculenta Crantz, bajo
condiciones de estrés ácido por riego y fertilización con soluciones mínimas de
nutrientes, con el fin de obtener esporas fúngicas en diferentes etapas de su
desarrollo ontogénico y facilitar su estudio y posterior identificación.
De acuerdo a los resultados obtenidos las esporas aisladas se ubicaron en cuatro
familias de la división Glomeromycota:
Acaulosporaceae, Gigasporaceae, Glomeraceae, Scutellosporaceae. Las especies
Identificadas fueron:(a) Acaulospora delicata, (b) Acaulospora denticulata, (c)
Acaulospora excavata (d) Acaulospora lacunosa, (e) Funneliformis mosseae, (f)
Glomus etunicatum, (g) Glomus geosporum, (h) Glomus magnicaule, (i)
Rhizophagus intraradices, (j) Rhizopagus manihotis, (k) Septoglomus constrictum,
(l) Sclerocystis rubiformis. Identificadas, reportadas e ilustradas en este trabajo por
primera vez en monocultivos de palma aceitera en Colombia.
Los resultados mostraron que la distribución y diversidad de especies fue
homogénea en la zona de estudio, la especie micorrizica que se encontró con
mayor frecuencia en las muestras analizadas fue A.excavata, independiente de la
profundidad y la época de muestreo. Como resultado de la propagación en las
plantas huésped ensayadas, se seleccionaron seis especies de HMA por su tasa
de crecimiento: A.excavata, G.geosporum, R.manihotis, F.mosseae, Sclerocystis
rubiformis, Scutellospora spp. Estas especies fueron evaluadas en un ensayo
posterior in vitro por su habilidad de germinación y crecimiento a pH 4,5 en un
modelo experimental modificado del sistema “sándwich”, utilizando cinco medios
de cultivo o sustratos: un primer medio de cultivo estuvo constituido por agaragua1%, otros cuatro medios se prepararon a partir de un medio de cultivo
modificado, el cual se preparó con agar agua 1%, 0,3% extracto de suelo, claforan
1%, y antes que el medio se solidificará se agregaron segmentos de raices
jóvenes de palma aceitera, las cuales fueron distribuidas por todo el medio de
xii
cultivo. En éste medio base, se prepararon los cuatro sustratos a 4
concentraciones 50,100 y 200 ppm de Al respectivamente.Un quinto medio se dejo
con el contenido del medio modificado pero sin Al .En este ensayo se
seleccionaron las especies micorrizicas R.manihotis, G.geosporum, F.mosseae,
las cuales mostraron mayor desarrollo y crecimiento hifal en los medios
modificados con Aluminio, por lo cual se considerarón como especies micorrízicas
tolerantes El inóculo mixto de especies micorrízicas tolerantes, se llevó a semillas
pregerminadas de Palma aceitera (DelixLame) y otro grupo de semillas se llevarón
a las bolsas sin inóculos micorrízicos, todas las plántulas, se dejaron crecer en
invernadero por 60 días, finalizado el tiempo,las plántulas se expusieron por 72
horas a pH 4,4± 0,1 en soluciones líquidas aireadas a concentraciones de Al
(50,100 y 200 ppm respectivamente), en comparación con plantas no
micorrizadas y expuestas igualmente a las diferentes concentraciones de Al. La
distribución y captación del Al se evaluó en muestras de ápices radiculares,
previamente embebidas en agarosa al 1%, y seccionadas en cortes longitudinales
de 100um de grosor, teñidas con DAPI y el colorante fluorescente Lumogallion.
La intensidad de fluorescencia obtenida de las preparaciones de raíces bajo
microscopia confocal y en cada tratamiento, fueron procesadas utilizando el
aplicativo software MATLAB®. Para evaluar la distribución del Al en los tejidos fue
utilizada la herramienta RGB y se comparó la intensidad de fluorescencia emitida
trasformando las imágenes a la escala de grises, utilizando la herramienta de
histograma de ecualización. La mayor intensidad de fluorescencia emitida por el
complejo Al-Lumogallion fue hallado en las hifas de los hongos micorrizicos(115)
seguida de los núcleos de la raíz (105), la alta señal de emisión de
fluorescencia,fue interpretada como mayor captación de Al, en comparación con
otras estructuras radiculares de la palma aceitera sin micorriza. Estos hallazgos se
muestran por primera vez para palma aceitera y podrían estar soportando la
importante contribución de los hongos micorrizicos en el cultivo de palma en la
disminución de la toxicidad del aluminio en suelos ácidos.Un ensayo final fue
xiii
realizado con el inóculo mixto de hongos tolerantes al Al, seleccionados por su
capacidad de germinar en medios ácidos y capturar Al (R. manihotis, G.
geosporum,F. mosseae) y otro inóculo micorrízico mixto nativo (G.constrictum,
Gigaspora spp, Scutellospora spp), éstos se llevarón a semillas pregerminadas
de palma aceitera , en un ensayo a nivel de previvero y en las etapas tempranas
de vivero, con el objetivo de evaluar el tipo, grado de colonización micorrizica y
biomasa radicular utilizando dos tipos de suelos ácidos, pobres en nutrientes
(P=5.0-12,0
cmo-Kg1, respectivamente) bajo
condiciones
de estrés, con
fertilización mínima y riego ácido.
El tipo de micorrización fue elucidado por microscopia fotónica y electrónica de
transmisión (MET) como un continuo de estructuras micorrízicas desde el tipo
Paris a Arum y estuvo influenciado en los primeros meses por las especies
micorrízicas utilizadas en la simbiosis, asi el tipo Paris fue evidente en los
tratamientos con inóculos micorrízicos no seleccionados por su tolerancia al Al
(Gigaspora spp, Scutellospora spp, Glomus constrictum), y la micorrización tipo
Arum, con los inóculos tolerantes al Al (R. manihotis,G. geosporum y F. mosseae),
sin embargo al final del tratamiento el tipo anatómico de micorrización Arum, se
estableció y se evidenció ultraestructuralmente, en cortes transversales de raíces
micorrizadas.
La simbiosis fue encontrada en raíces de tercero y cuarto orden en todos los
tratamientos, siendo más alta con el inóculo mixto tolerante al Al en los dos tipos
de suelos ensayados (81,6%-81,85%), en comparación con el inóculo no tolerante
(62,65%-71,4%), la biomasa seca fue también mayor en los tratamientos con los
inóculos tolerantes al Al.El análisis de varianza de los datos (ANOVA) mostró
diferencias significativas en la colonización (p <0.01) en tiempo, suelo y tipo de
inóculo. Los resultados mostraron variaciones en el diámetro, organización
vascular, desarrollo de espacios aéreos, grosor de las raíces de acuerdo a la
xiv
madurez o al tipo de raíz, se observó que la formación de raíces laterales
depende de la actividad celular proliferativa del periciclo.
Este es uno de los primeros estudios en palma aceitera desde campo a
laboratorio bajo condiciones de acidez y fertilización mínima de nutrientes que
muestra la diversidad y colonización micorrizica en campo, la selección de
inóculos in vitro, por su crecimiento y tolerancia al Al, la mayor capacidad de
captación del ion Al por las raíces micorrizadas en comparación con las no
micorrizadas, empleando para tal fin herramientas de manejo de imágenes
MATLAB®; igualmente es el primer trabajo en palma aceitera que evidencia y
d e s c r i b e el tipo anatómico de la micorrización como un Intermedio entre
Paris-Arum,
dependiendo
de
las
especies
micorrizicas
utilizadas
como
inóculos,sin embargo se muestra que el tipo anatómico Arum, se establece hasta
el final del experimento independientemente de los inóculos micorrízicos
utilizados,sugiriendo que ciertas especies fúngicas logran establecerse a través
del tiempo más que otras o que de cierta manera la especie vegetal podría
también ejercer un control. Con los resultados obtenidos en este trabajo se logró
comprobar la hipótesis planteada al inicio de esta investigación, y que se describe
más adelante. El presente trabajo de investigación doctoral se redacta y se
presenta en la modalidad de artículos científicos, cada capítulo corresponde al
desarrollo de los objetivos específicos planteados
xv
GENERAL SUMMARY OF RESEARCH
High yields of oil palm crops ( Elaeis guineensis Jacq.) h a v e expanded in
tropical areas of Asia, Africa and America. In Colombia palms grown in four areas,
particularly in the central area,soils are characterized by acidic,low P and
nutrients, conditions for which the establishment of the mycorrhizal symbiosis
suggests a greater benefit for crops by supplied nutrients and water.
This study allowed characterize four soils of central zone oil palm (Puerto
Wilches) as sandy loam soils, acid, poor in nutrient with varying Al saturations, in
these soils colonization density and diversity of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)
native was evaluated during the dry and rainy seasons for a year. The results
showed spore density values between 21,4 and 130,8 esporas/100g dry soil
being the lowest rank in the rainy season and the highest in the dry season.
Native colonization was higher in the rainy season± 67%; richness index was in
the range of 2,42-2,58, 12 mycorrhizal species and four AMF morphospecies
were i d e n t i f i e d by their morphological characteristics by light and scanning
microscopy, and DNA analysis. According t o t h e r e s u l t s o f i s o l a t e d
s p o r e s w e r e placed into four families:
Acaulosporaceae,
Gigasporaceae,
Glomeraceae,
Scutellosporaceae.
The
distribution and diversity of species was homogeneous in the study a r e a and
the most common species was A. excavata independently depth and t i m e of
s a m p l i n g Other assay was conducted in green house, native AMF species
from the study area of mycorrhizal fungi were propagated in B. decumbens and
M. esculenta, under conditions of acid stress by irrigation and low fertilizer
nutrients, in order to obtain fungal spores in different stages of ontogenetic
development and facilitate their study and identification as a result o f
p r o p a g a t i o n of HMA, finally six species w ere selected as aluminum tolerant
xvi
species, for growth rate (A. excavata, G. geosporum, R. manihotis, F. mosseae,
Sclerocystis rubiformis y Scutellospora spp) these species were evaluated in vitro
assay for germination and growth ability at pH 4.5 in a modified experimental
model of the "sandwich" system,using five substrates, a first culture medium
composed of 1%water agar, and four modified media, containing minimal soil
extract (0.3%) ,0.1% claforan and young roots segments palm, each medium was
made to three levels of Al (50,100,200 ppm) a fifth modified medium was
considered without Al, and served as control. A. excavata, G. geosporum, R.
manihotis and F. mosseae species generally showed a homogeneous pattern of
germination above 50%, the results of this assay were used to select a mixed
mycorrhizal inoculum (G. geosporum, R. manihotis and F. mosseae) to assess the
ability to capture Al. In a subsequent trial in greenhouse and laboratory
mycorrhizal oil palm was evaluated using the mixed selected inoculum, plants of
60 days age, exposed for 72 hours in liquid aerated solutions at pH 4.4 ± 0.1 at
concentrations of Al (50,100 and 200 ppm respectively),compared to nonmycorrhizal plants and exposed to different concentrations of Al. In this test the
distribution and uptake of Al by root tissues were evident in longitudinal sections
of 100um thick samples previously embedded in agarose, and stained with DAPI
(4'6-
diamino-phenylindole)
and
the
fluorescent
dye
Lumogallion
3-[2,4
dihydroxyfenilazol- -2-hydroxy-5-sulfonic acid chlorobenzeno].The fluorescence
intensity obtained in the Image of roots under confocal microscopy and i n each
treatment were processed using MATLAB® software application. To evaluate the
distribution of Al in the tissues was used the RGB tool and the fluorescence
intensity emitted by transforming the image to gray scale was compared using the
histogram equalization.
The greater intensity of fluorescence emitted by the Al- Lumogallion complex was
found in the hyphae of mycorrhizal fungi followed by the nuclei of the root, high
emission signal was interpreted as increased uptake of Al, compared with other
root structures oil palm without mycorrhiza. These findings show for the first time
xvii
for oil palm and could be supporting the important contribution of mycorrhizal fungi
in palm cultivation in reducing aluminum toxicity in acidic soils. A final test with the
selected fungi f o r their ability to germinate in acid soils and capture Al (R.
manihotis, G. geosporum, F. mosseae) and a mixed native inoculum (G.
constrictum, Gigaspora spp and Scutellospora spp) was carried in oil palm level
prenursery and the early stages of nursery,in order to assess the type, degree of
mycorrhizal colonization and efficiency of fungal inoculum in oil palm plants that
grew in two types of acid soils poor in nutrients (P = 5,0-12,0 cmol-kg-1) under
stress conditions, with minimal fertilization and irrigation acid.
The type of mycorrhizae was elucidated by photonic and transmission electron
m i c r o s c o p y (TEM) as a continuous of mycorrhizal structures from Paris to Arum
and was influenced by the type of inoculum, in the early stages of the symbiosis,
until the third month, after the third month until the end of the experiment the Arum
type was established, regardless of treatment mycorrhizal employee. The
symbiosis was found in roots of third and fourth order in all treatments, being
higher with inoculum tolerant aluminum, in two types of soils tested (81,6% 81,85%), compared to the native inoculum,not tolerant aluminum (62,65% 71,4%), the dry biomass was also higher in the treatments with the fungal
inoculum selected. The analysis of variance of the data (ANOVA) showed
significant differences in colonization (p <0.01) in time, soil type and inoculum.
The results showed variations in diameter, vascular organization development
airspaces root thickness according to maturity or root type, noted that the lateral
root formation depends on the cell proliferative activity of the pericycle.This is the
first study in oil palm from field to laboratory under acidic conditions and minimum
nutrien fertilization, showing the ability of Al ion uptake by mycorrhizal roots
compared with non-mycorrhizal, with management tools MATLAB ® imaging, is
also the first work in oil palm which shows the anatomical type of mycorrhization
as an intermediate between,-Paris to Arum,influenced by the type of inoculum
xviii
tested. In summary the results concluded that species of native arbuscular
mycorrhizal oil palm, selected under acid stress, have greater Al uptake capacity
and establish symbiosis in nutrient-poor soils and high aluminum concentrations
compared with no tolerant aluminum inoculum,
suggesting
that
certain
populations, have adapted more than other to natural soil conditions, and
therefore are more efficient in transporting nutrients for plant growth, turn the
plants without mycorrhizal symbiosis in acid soils do not have the same capacity
in biomass production when grown in nutrient- poor soils and low P.
.
xix
INTRODUCCIÓN AL TEMA DE INVESTIGACIÓN
Se considera que los hongos micorrizicos arbusculares (HMA) están presentes
en casi todos los ambientes naturales y agrícolas, así mismo en la mayoría de las
especies de plantas en cerca del 90% (Smith & Smith 2012).
La hifa fúngica desarrolla dentro de las células corticales de la raíz gran número
de ramificaciones dicotómicas intracelulares, llamadas arbúsculos, y éstos son el
sitio en el cual el fosfato (Pi), el nutriente mineral más estudiado en la simbiosis
micorrizica, es entregado a la raíz; de esta manera, ellos contribuyen en conjunto
con las hifas intercelulares,a la transferencia de compuestos de carbono (Helber
et al. 2011); ésta simbiosis beneficia principalmente a plantas que tienen una raíz
pequeña y gruesa, con pérdida o ausencia de pelos radicales, las cuales se
cultivan en suelos pobres, particularmente con fósforo disponible en bajas
concentraciones(Rohyadi, 2009). Particularmente la palma aceitera tiene un
limitado desarrollo de su sistema radicular y tanto la palma aceitera africana
(Elaeis guineensis Jacq.) como la americana (Elaeis oleífera Kunth.) producen
raíces adventicias cilíndricas,gruesas y no producen pelos radiculares, esta
condición anatómica de su sistema radicular sugiere que ella se beneficia
enormemente de la simbiosis. Gallaud (1904) identificó dos tipos morfológicos de
simbiosis denominadas Arum y Paris. Un gran número de plantas cultivadas
presentan la colonización tipo Arum, que se caracteriza por la formación de hifas
intercelulares y arbúsculos, mientras que otras hierbas y plantas de los bosques
forman el tipo Paris que se caracteriza por hifas intracelulares,colas hifales y
colas de arbúsculos dentro de la raíz.( Smith &Smith,1997). De acuerdo a Dickson
et al. (2007), los tipos anatómicos de micorrización Arum y Paris han sido
descritos para la familia Arecaceae.
.
1
Colombia es el cuarto productor de palma de aceite a nivel mundial y de acuerdo
al informe reportado por el minianuario estadístico de Fedepalma (Torres et al.
2013). Para el año 2012, se tenían sembradas 452 435 ha de palma aceitera,
de las cuales 129 112 ha sembradas corresponden a la zona cent ral palmera
de Colombia que comprende el Departamento de Santander ( Municipios de
Puerto Wilches, San Vicente de Chucurí, Rionegro, Barrancabermeja, y Sabana
de Torres), Departamento de Cesar y Norte de Santander. Estudios preliminares
realizados en los suelos de Puerto Wilches por Arias & Munévar (2004),
mostraron que las principales limitaciones para producción de palma de aceite
tenían que ver con la alta saturación de Al y la baja saturación de bases. De
acuerdo a Wood (1995) y Rohyadi (2006), las altas concentraciones de
Al+3,(especie del aluminio predominante en suelos ácidos a pH<5,0), puede ser
perjudicial para la microbiota del suelo involucrada en el ciclado de nutrientes y la
formación de asociaciones simbióticas con las raíces de las plantas, por lo cual
los cultivos que crecen en este tipo de suelo pueden llegar a tener ciertas
limitaciones en la nutrición,especialmente del ion fosfato,disminución en la
captación de agua disponible,retraso en el crecimiento de las raíces y por tanto
verse afectada la productivida y sostenibilidad del cultivo.
Sin embargo, se conoce que la simbiosis micorrizica brinda beneficios a las
plantas huésped incluyendo mejora en el crecimiento y nutrición mineral de la
planta, tolerancia a enfermedades y al estrés debido a la sequía, cambios y
fluctuaciones de temperatura, salinidad y resistencia a la toxicidad frente
a metales pesados (Meharg&Cairney 2000; Borowicz, 2001). A pesar del amplio
conocimiento de la función de la simbiosis micorrizica en los sistemas
agroecológicos, no se conoce con exactitud el mecanismo por el cual la simbiosis
micorrízica confiere tales beneficios a las plantas huésped, se cree que la
resistencia de las plantas expuestas a metales pesados, sea debido a un
incremento en la captación de fósforo. (Lux &Cummings, 2001).
2
Diversos trabajos han reportado la contribución de la simbiosis micorrizica en la
disminución del estrés, específicamente aliviando a la planta en la disminución de
la concentración de Al fitotóxico del suelo: Rufyikiri, et al. (2000), Cuenca, et al.
(2001), Barcelo& Poschenrieder (2002), Janouskova et al. (2005), Yano & Takaki
(2005), Borie et al. (2006), Gohre&Paszkowski (2006), Klugh&Cummings (2007),
Bedini, et al. (2009), Podila, et al. (2009), Zhang, et al. (2009), sin embargo
anterior al presente trabajo de investigación, no se conocía con exactitud por
tratamiento de imágenes, si las raíces micorrizadas expuestas a diferentes
concentraciones de Al y teñidas con colorantes específicos, estarían tomando
ventaja en la captación de Al en relación con los tejidos radiculares sin micorrizar
y de esta manera contribuyendo a disminuir la fitotoxicidad, específicamente para
el cultivo de palma aceitera. De otro lado, los estudios de biodiversidad de
hongos micorrizicos nativos en suelos ácidos palmeros a nivel mundial son
escasos, y en Colombia anterior a la presente investigación, no se habían
reportado trabajos similares; de igual manera el tipo anatómico de la micorrización
en palma, no había sido elucidado utilizando inóculos propagados bajo las
condiciones de este estudio , por lo tanto éste trabajo muestra la importancia de la
simbiosis micorrizica en las zonas particulares de producción de monocultivos de
palma de aceite y de interés económico en Colombia, como es la zona central del
Municipio de Puerto Wilches.
En particular en los monocultivos el uso intensivo de fertilizantes, el mismo
manejo agroecológico, el uso de pesticidas, son factores importantes a
considerar como causas directas que influyen en la disminución de las
poblaciones de HMA, sin embargo se conoce que ciertas poblaciones de hongos
llegan a adaptarse a condiciones adversas, por lo cual se puede inferir si las
poblaciones de HMA, de suelos palmeros pudieran llegarse a establecer bajo
estas condiciones y sobrevivir, por lo cual estudios enfocados a evaluar la
densidad y diversidad de HMA nativos en estos suelos toma gran importancia
ecológica y económica. Los estudios orientados en el conocimiento de la
3
diversidad de HMA nativos, es de interés para tener un entendimiento más
preciso del tipo y calidad de simbiosis micorrizica ,así como para dilucidar los
posibles ecotipos que estarían participando en la disminución del aluminio
fitotóxico de los suelos ácidos palmeros, condiciones que llevaron a plantear
las siguientes preguntas:

¿Qué densidad y que especies de hongos micorrizicos nativos son
particulares de los monocultivos de palma aceitera durante el periodo seco
y lluvioso?

¿Es posible encontrar densidades similares de hongos micorrizicos a dos
profundidades del suelo y en época seca o lluviosa?

¿Son todas las especies micorrízicas nativas de suelos palmeros, tolerantes
para germinar en condiciones de acidez y saturación de aluminio en
condiciones in vitro?

¿Existen diferencias significativas en el tipo anatómico de la micorrización,
porcentaje de colonización y producción de biomasa seca en plántulas de
palma aceitera a nivel de previvero y vivero cuando establecen simbiosis
con HMA tolerantes y no tolerantes al aluminio, bajo condiciones de estrés
ácido?
Cada una de estas preguntas fue de interés para construir los objetivos de esta
investigación. Para efectos de publicación este trabajo de tesis doctoral se
estructuro en la modalidad de artículos científicos, cada capitulo corresponde al
desarrollo de un objetivo
4
REFERENCIAS
Arias, A. Nolver., Munévar, F. (2004). Caracterización de la fertilidad de los suelos
de la Zona central palmera de Colombia. Palmas - 25 (II): 137-147.
Bedini, S., Pellegrino, E., Avio, L ., Pellegrini, S., Bazzoffi, P., Argese, E.,
Giovannetti, M. (2009). Changes in soil aggregation and glomalin-related soil
protein content as affected by the arbuscular mycorrhizal fungal species Glomus
mosseae and Glomus intraradices. Soil Biol Biochem 41:1491-1496.
Borie, F., Rubio, R., Rouanet, JL., Morales, A., Borie, G., Rojas, C (2006) Effect of
tillage systems on soil characteristics, glomalin and mycorrhizal propagules in a
Chilean Ultisol. Soil Tillage Res 88:253-261.
Barceló, J., Poschenrieder, C. (2002) Fast root growth responses, root exudates,
and internal detoxification as clues to the mechanisms of aluminum toxicity and
resistance: a review.Environ Exp Bot 48: 75-92.
Borowicz, V.A (2001).Do arbuscular mycorrhiza fungi alter plant-pathogen
relations? Ecology 82, 3057-3068.
Cuenca, G., de Andrade, Z., Meneses E. (2001) The presence of aluminum in
arbuscular mycorrhizas of Clusia multiflora exposed to increased acidity. Plant
Soil 231:233-241.
Dickson.S.(2004). The Arum–Paris continuum of mycorrhizal symbioses. New
Phytologist, 163: 187–200.
Dickson,S., Smith, Fa., Smith,S.E. (2007).Structural differences in arbuscular
5
mycorrhiza symbioses: m o r e than 100 years after Gallaud, where next?
Mycorrhiza 17:375-393.
Gallaud I. (1904). Études sur les Mycorrhizes Endotrophes. Lille, France: le
Bigotrères.
Gohre, V., Paszkowski .U. (2006). Contribution of the arbuscular mycorrhizal
symbiosis to heavy metal phytoremediation. Planta 223:1115-1122.
Helber, N., Wippel, K., Sauer N., Schaarschmidt S., Hause B., Requena N.
(2011).A versatile monosaccharide transporter that operates in the arbuscular
mycorrhizal fungus Glomus spp is crucial for the symbiotic relationship with plants.
The Plant Cell 23: 3812–3823.
Janouskova, M., Pavlikova, D., Macek T., Vosatka M (2005) Arbuscular
mycorrhiza decreases cadmium phytoextraction by transgenic tobacco with
inserted metallothionein. Plant Soil 272:29-40.
Klugh, K., Cumming, J. (2007) Variations in organic acid exudation and aluminum
resistance among arbuscular mycorrhizal species colonizing Liriodendron
tulipifera. Tree Physiol 27:1103-1112..
Luxh,
Malajezuk.,
N,
Brundrett.
M,Dell.B.
(1999).Fruiting
of
putative
ectomycorrhizal fungi under blue gum(Eucalyptus globulus) plantations of
differents ages in Western Australia. Mycorrhiza 8:255-261.
Lux, HB., Cumming, JR. (2001) Mycorrhizae confer aluminum tolerance to tulippoplar seedlings. Can J For Res 31:694-702.
Meharg, A.A., Cairney, J.W.G. (2000) Coevolution of mycorrhizal symbionts and
6
their host to metal contaminated environments.Advances in ecological
Research.30, 69-112.
Podila, GK., Sreedasyam, A., Muratet, MA. (2009) Populus rhizosphere and the
ectomycorrhizal interactome. Crit Rev Plant Sci 28:359-367.
Rohyadi A. (2006). Elevated aluminum concentrations in soil reduce growth and
function of external hyphae of Gigaspora margarita in growth of cowpea
plants. Bionatura 8:47-59.
Rohyadi A (2009) Neighboring plants alleviate aluminum toxicity on the external
hyphae of Gigaspora margarita. Microbiology.3 :( 1) 42-46.
Rufyikiri, G., Dufey J.E., Nootens D., Delvaux B. (2000) Effect of aluminium on
bananas (Musa spp.) cultivated in acid solutions. I. Plant growth and chemical
composition. Fruits 55:367379.
Šcancar ,J., Milacic,R. (2006) Aluminum speciation in environmental samples: A
review. Anal Bioanal Chem 386:999–1012.
Smith, SE., Smith FA. (2012). Fresh perspectives on the roles of arbuscular
mycorrhizal fungi in plant nutrition and growth. Mycologia 104: 1–3.
Torres,C.R.,A,Girón.,A.E.G.,Rincón,V.F.,Delgado,R.J(2013)Minianuario
estadístico Principales cifras de la agroindustria de la palma de aceite en
Colombia. Fedepalma - Unidad de Planeación
Sectorial y Desarrollo Sostenible.
Sistema de Información Estadística del Sector Palmero –SISPA-Impreso en
Colombia.
Wood M. (1995). A mechanism of aluminum toxicity to soil bacteria and possible
ecological implications. Plant Soil 171:63-9.
7
Yano K, Takaki M (2005) Mycorrhizal alleviation of acid soil stress in the sweet
potato (Ipomoea batatas). Soil Biol Biochem 37:1569-1572.
Zhang, XH., Lin, A.J., Gao, Y.L., Reid, R.J., Wong, M.H., Zhu, Y.G. (2009)
Arbuscular mycorrhizal colonization increases copper binding capacity of root cell
walls of Oryza sativa L. and reduces copper uptake. Soil Biol Biochem 41:930935.
8
HIPÓTESIS
Se reconoce a nivel mundial que la simbiosis micorrizica confiere a las plantas
múltiples beneficios tales como protección frente a patógenos del suelo, mejora
en la captación de agua y nutrientes, en especial facilitando la adquisición de
fósforo, en suelos de baja fertilidad, como ocurre en el cultivo de la palma aceitera
en Colombia, suelos que se caracterizan además por ser ácidos, y con alta
saturación de aluminio,razones por las cuales esta investigación se realizó a
través de experimentos in vitro e in vivo (fase de laboratorio y de invernadero)
para probar las siguiente hipótesis:
Hipótesis: Los hongos micorrizicos arbusculares tienen un potencial para
aumentar la tolerancia de la palma aceitera al Al.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el estado de la simbiosis y la captura de aluminio por inóculos
micorrizicos bajo estrés ácido para valorar los efectos de estos en plántulas de
palma aceitera a nivel de pre vivero y vivero.
OBJETIVOS ESPECIFICOS

Evaluar el estado de la diversidad, densidad, y colonización micorrizica
nativa en cultivos palmeros de Colombia (región central de Puerto- Wilches)
9

Seleccionar in vitro las especies fúngicas micorrízicas tolerantes al
Aluminio, por su capacidad para germinar bajo condiciones de estrés ácido y
a concentraciones de 50,100 y 200 ppm de Al
 Comprobar la capacidad de captura del ion aluminio en raíces micorrizadas y
no micorrizadas de Palma aceitera a concentraciones de 50,100 y 200
ppm de Al en un ensayo a nivel de pre vivero.

Comparar el tipo de micorrización, porcentaje de colonización y eficiencia en
la trasferencia de nutrientes de inóculos micorrizicos seleccionados como
tolerantes al Aluminio en condiciones de estrés ácido y hongos micorrízicos
arbusculares nativos no tolerantes al Al en plántulas de palma aceitera a
nivel de vivero
ALCANCES Y APORTES
La investigación permitió tener un conocimiento del estado de la simbiosis
micorrízica en campo en monocultivos de palma aceitera, en 4 zonas de la
región central palmera de Colombia-(Municipio de Puerto Wilches). Los suelos
se caracterizaron como suelos franco-arenosos, ácidos y con altas saturaciones
de Al. Se evaluó la densidad, colonización y diversidad de especies
micorrizicas nativas del área de estudio. Se reportó por primera vez para
Colombia, las especies micorrízicas nativas de los suelos palmeros de la región
Central, 12 especies y cuatro morfoespecies fueron identificadas. Acaulospora
excavata se consideró como la especie generalista en estos suelos (Cap.2).
Se estandarizó un nuevo protocolo para el estudio de hongos micorrízicos
arbusculares (HMA) por microscopia electrónica de barrido (MEB), obviando el
paso de secado a punto crítico que es un paso de rutina en las técnicas para el
proceso
de
muestras
y
uso
de
hexametildiasilizano
10
(HMDS),
ambas
metodologías generan altos costos y en ocasiones los especímenes se deterioran
durante los procesos de secado (Cap.2).
Mediante los ensayos de propagación de esporas en plantas hospedantes bajo
condiciones de estrés ácido y en las pruebas in vitro en medios modificados
ácidos, con raíces de palma y en presencia de Al, se elaboró una metodología
propia, (modificación método Sándwich) que sirvió para seleccionar las
especies micorrízicas tolerantes al Al por su capacidad de germinar y crecer a
pH 4,5, en concentraciones de 50,100 y 200 ppm de Al (Cap.3).
Acaulospora
excavata,
Glomus
geosporum,
Rhizophagus.manihotis
y
Funneliformis.mosseae se identificaron como las especies con alta capacidad
para germinar y crecer en sustratos ácidos en concentraciones de Al en pruebas
de laboratorio. Especies que son reportadas por primera vez bajo estas
condiciones de ensayo (Cap.3).
Se demostró por primera vez la capacidad de captura de Al por parte de
raíces de palma aceitera micorrizadas y no micorrizadas, mediante el tratamiento
de imágenes a través de la herramienta Software MATLAB® utilizando algoritmos
propios (Cap.4).
Se describió por primera vez la anatomía de la micorrización y sus raíces en
palma aceitera en suelos ácidos pobres en nutrientes por técnicas de embebido
de raíces en parafina y resina, metodología que fueron útiles para realizar las
descripciones correspondientes a nivel estructural y ultraestructural y de esta
manera dilucidar el tipo de micorrización en palma como un intermedio entre los
Tipos Arum-Paris ,utilizando una mezcla de inóculos fúngicos tolerantes y no
tolerantes al Al, se concluye que el tipo anatómico de la micorrización en palma
está relacionado con las especies micorrízicas que realizan la simbiosis, en las
etapas tempranas de la micorrización, sin embargo bajo las condiciones del
ensayo, el tipo Arum fue el tipo anatómico predominante de la simbiosis y se
11
estableció hasta el final del experimento independientemente del tratamiento
(Cap.5).
Se demostró que la propagación de inóculos micorrizicos bajo condiciones de
estrés acido en plantas hospedantes (B.decumbens y M. esculenta, ambas de
reconocida micotrofia, así como la selección in vitro de especies micorrízicas
tolerantes al Al por su capacidad de germinar y crecer, fueron metodologías útiles
que beneficiaron la simbiosis de palma aceitera.
LIMITACIONES
No existen referentes comparativos o estudios anteriores similares a los ensayos
realizados en palma aceitera bajo las condiciones del presente estudio
CONCLUSIONES GENERALES
Los suelos de las 4 zonas de estudio se caracterizaron como suelos ácidos
(promedio ±4,5) y de textura franco arenosa
El estado de la micorrización en campo se vio influenciado por la época de
muestreo y la profundidad a la cual se tomaron las muestras, el ´periodo seco en
general favoreció la mayor densidad de esporas y el periodo de lluvias favoreció
la colonización micorrizica.
La densidad de esporas estuvo afectada por el periodo de lluvias, y disminuyó
hasta un 49% a 20 cm del suelo en comparación con las muestras tomadas a 10
cm.
Los índices de biodiversidad (Shannon Weaver), en las zonas de estudio estuvo
en el rango de 2,42-2,58, en la época seca y en la época lluviosa disminuyó
1,77-2, 54, sin embargo éste índice se consideró alto con relación a los índices
de Shannon Weaver, reportados en otros monocultivos.
12
La distribución y diversidad de especies fue homogénea en la zona de estudio y
la especie más frecuente fue A.excavata independiente de la profundidad y la
época de muestreo, por lo que se consideró una especie micorrizica generalista
en los suelos de palma aceitera estudiados.
Doce especies micorrízicas y 4 morfoespecies de HMA fueron identificadas : las
esporas aisladas se ubicaron en cuatro familias de la división Glomeromycota:
Acaulosporaceae, Gigasporaceae, Glomeraceae, Scutellosporaceae.
Las especies identificadas fueron: (a) Acaulospora delicata, (b) Acaulospora
denticulata,
(c)
Acaulospora
excavata,
(d)
Acaulospora
lacunosa,
(e)
Funneliformis mosseae, (f) Glomus etunicatum, (g) Glomus geosporum, (h)
Glomus magnicaule, (i) Rhizophagus intraradices, (j) Rhizopagus manihotis, (k)
Septoglomus constrictum, (l) Sclerocystis rubiformis. Identificadas, reportadas e
ilustradas en este trabajo por primera en monocultivos de palma aceitera en
Colombia.
Rhizophagus manihotis, Glomus geosporum, y Funneliformis mosseae, fueron
seleccionadas como especies micorrízicas que crecen y toleran las condiciones
ácidas y de saturación de Aluminio en ensayos in vitro.
Las mayor intensidad de Fluorescencia emitida por el complejo Al-Lumogallion fue
detectado en raíces micorrizadas, especialmente en las hifas y micelio externo, en
comparación con la señal de fluorescencia que mostraron las raíces no
micorrizadas, cuando fueron expuestas a condiciones iguales por 72 horas y a
diferentes concentraciones de Al.
Las raíces micorrizadas mostraron mayor intensidad de Fluorescencia la cual se
interpretó como mayor captación de Al, comparada con las raíces sin micorrizar.
13
El aluminio se almacenó en alta proporción en raíces sin micorrizar en núcleos y
células de mucilago y esta acumulación fue directamente proporcional a la
concentración de Al a la cual estuvieron expuestas las raíces, contrariamente las
paredes externas e internas de la raíz, no mostraron el mismo patrón de
comportamiento, siendo menor la capacidad de captura del ion Al.
Se concluye por lo tanto que la micorriza arbuscular estaría beneficiando a la
palma aceitera de las altas concentraciones de Aluminio en los suelos.
Las técnicas de embebido de raíces en parafina y resina, fueron metodologías
útiles para realizar las descripciones correspondientes a nivel estructural y
ultraestructural y dilucidar el tipo de micorrización en palma como un “intermedio
entre los Tipos Arum-Paris”.
La simbiosis se llevó a cabo en raíces de tercero y cuarto orden, y el tipo
anatómico de la micorrización estuvo influenciado por el tipo de inóculo y por el
tiempo de la simbiosis.
Los Inóculos propagados bajo estrés ácido y seleccionados in vitro como
tolerantes al Al, mostraron mayor porcentaje de simbiosis y producción de
biomasa en plantas de palma aceitera en suelos ácidos en comparación con
inóculos micorrizicos no seleccionados.
La conclusión anterior sugiere que ciertas poblaciones se han adaptado más que
otras a las condiciones naturales de los suelos y por lo tanto son más
eficientes en el trasporte de nutrientes para el desarrollo de las plantas, a su vez
las plantas desprovistas de la simbiosis micorrizica en suelos ácidos no tienen la
misma capacidad en la producción de biomasa cuando crecen en suelos pobres
en nutrientes y bajo contenido de fósforo.
14
.RECOMENDACIONES
Continuar con estudios encaminados al aislamiento e identificación de especies
micorrízicas de suelos palmeros Colombianos, para aumentar los registros de
biodiversidad nativa y además para ampliar el conocimiento de las especies
adaptadas a las condiciones particulares del monocultivo de palma aceitera.
Seguir realizando estudios de germinación y crecimiento in vitro de especies
micorrízicas con el fin de seleccionar inóculos competentes y eficientes bajo
condiciones de estrés ácido y saturaciones de Al.
Se recomienda procesar las muestras de raíces en cortes transversales
embebidas en parafina y/o resina, para dilucidar el tipo anatómico de la
micorrización, aunque éstas técnicas son más dispendiosas, las imágenes
obtenidas son más claras, por lo tanto más fáciles de interpretar en comparación
con la técnica tradicional de azul tripano en raíces frescas, que no permite
observar con detalle la simbiosis en los tejidos celulares.
Rhizophagus manihotis, Glomus geosporum, y Funneliformis mosseae, fueron
seleccionadas como especies micorrízicas que crecen y toleran las condiciones
ácidas y de saturación de Aluminio en ensayos in vitro, por lo tanto se propone
como un inóculo eficiente para utilizar desde vivero en plántulas de palma
aceitera.
Continuar estudios tendientes a evaluar la capacidad de unión del Aluminio en
raíces micorrizadas y sin micorrizar a concentraciones menores de las utilizadas
en esta investigación, empleando de igual manera rangos o tiempos de
observación más cortos con el objeto de generar nuevos hallazgos y
conclusiones.
15
CAPITULO I.
LA PALMA ACEITERA Y SU RELACIÓN CON LA
SIMBIOSIS MICORRIZICA
AN OVERVIEW OIL PALM AND
ITS RELATIONSHIP WITH
MYCORRHIZAL SYMBIOSIS
16
RESUMEN
Beatriz Elena Guerra S*
La investigación a nivel mundial
h a proporcionado resultados claros sobre
cómo la asociación mutualista entre raíces de plantas y hongos comunes del
suelo, denominada “simbiosis micorrizica arbuscular”, es fundamental en las
interacciones multitróficas que se producen en el suelo, y a su vez, cómo estas
influyen en el establecimiento y diversidad de plantas, crecimiento, nutrición y
productividad vegetal.
La micorriza es una simbiosis antigua entre hongos comunes del suelo de la
división Glomeromycota y raíces de plantas de interés agrícola, esta asociación
beneficia significativamente la nutrición mineral de los cultivos, brinda protección
contra patógenos del suelo y confiere resistencia a diferentes agresiones tales
como sequía, salinidad, metales pesados, regulando de esta manera el stress
biótico y abiótico para la planta, por lo cual está simbiosis es considerada un
recurso biológico en la agricultura moderna y sostenible, tanto en programas de
seguridad alimentaria como de biorremediación de suelos.
Particularmente la simbiosis beneficia a aquellas especies vegetales que se
desarrollan en suelos ácidos, bajos en nutrientes con presencia de altos niveles
de aluminio(Al), así también en plantas cuyo sistema radicular esta desprovisto de
pelos radiculares, como es el caso particular de la palma aceitera, la cual es
considerada un cultivo multipropósito y de importancia económica en el mundo y
en países en desarrollo como Colombia.
17
Esta revisión pretende brindar un marco general de la botánica, sistema radicular
importancia del cultivo de la palma, enfermedades de interés económico y
algunos aspectos de los efectos benéficos de la simbiosis micorrizica en suelos
ácidos tropicales y en la disminución del aluminio para la planta.
Palabras clave: palma aceitera, simbiosis micorrizica, sostenibilidad, suelos
ácidos
Doctoranda en Ciencias-Universidad Nacional-Costa Rica-.
Correspondencia: [email protected]
18
ABSTRACT
Research worldwide has provided clear results on how the mutual association
between plant roots and common soil fungi , called symbiosis arbuscular
mycorrhizal ,is critical in multi-trophic interactions that occur in the soil , and in turn
how these influence the establishment and plant diversity ,growth, nutrition and
plant productivity. The mycorrhizal symbiosis is an ancient common relation
between soil fungi of the division Glomeromycota and roots of plants, which
benefits the mineral nutrition of crops, providing protection against soil pathogens
and resistance to various attacks such as drought, salinity, heavy metals, thereby
regulating biotic and abiotic stress to the plant ,this symbiosis is considered a
biological resource in modern, sustainable agriculture , in food security programs
and soil bioremediation .Symbiosis benefits particularly to those plant species
growing in acid soil, nutrients with low presence of high levels of aluminum
(Al), as well as in plants whose root hairs are absent, such as palm oil, which is
considered as multipurpose crop and economic importance in the world, which
includes developing countries such as Colombia .This review aims to provide a
general framework of aspects botany ,root
system and importance oil palm
crops with special emphasis on the beneficial effects of the symbiosis in tropical
acid soils and decreasing Al for the plant.
Key words: acid soil, mycorrhizal symbiosis, oil palm, sustainability
*Agro environmental Biotechnology Research Laboratory. MICROBIOTA Group,1 Science department-, University of Santander (UDES) Bucaramanga,
Colombia.Corresponding- author: [email protected]
19
1.0 INTRODUCCIÓN
Se estima que la palma de aceite proporciona los más altos rendimientos por
hectárea de todos los cultivos oleaginosos, estos rendimientos crecientes
han dado lugar a una rápida expansión mundial en la agroindustria.
En la actualidad existe la palma en un estado salvaje, semi-silvestre y cultivada
en tres áreas principales de los trópicos ecuatoriales: África, Asia Sudoriental y
América del Sur y Central, sin embargo la expansión de las plantaciones de
palma de aceite, tanto para alimento como para combustible, también es
preocupante debido a la destrucción de la selva húmeda en el sureste de Asia,
donde la superficie dedicada a la palma de aceite aumentó de 4,2 millones a 7,1
millones de hectáreas entre 2000 y 2009 (FAO (2012).Según McCarthy (2010), el
avance en la tecnología del cultivo de la palma de aceite va encaminada a
aumentar la producción, disminuyendo los costos, manejando el cultivo con un
mejor conocimiento de los suelos y las interacciones microbianas que participan
en el ciclado de nutrientes, uso y aprovechamiento del agua.
Otros factores tales como variedades vegetales de alta productividad, selección
de sitios con condiciones ambientales óptimas, mejoramiento de la fertilidad del
suelo, un sistema de control integrado para el control de plagas y patógenos, así
como mejora de la cosecha y procesos de recolección, son aspectos además
considerados por Murphy (2007) y Paterson (2007). De otro lado la Mesa
Redonda sobre el Aceite de Palma Sostenible (RSPO, por su sigla en inglés),
contempla la responsabilidad medioambiental, conservación de los recursos
naturales y la biodiversidad; en donde la biota y micro biota del suelo son
incluidas. En cultivos establecidos en campo, las raíces de la palma aceitera
son altamente colonizadas por hongos micorrizicos arbusculares (HMA) y de
20
acuerdo
a
Nadarajah
(1980)
y
Blal.et
al.
(1990)
son
probablemente
funcionalmente dependientes de éstos.
Los HMA son microorganismos comunes de los suelos agrícolas, establecen
simbiosis con la mayoría de plantas y se consideran un componente integral de
la biodiversidad y de las comunidades vegetales naturales como de los
ecosistemas agrícolas, ellos confieren numerosos beneficios a la planta huésped
incluida la mejora del crecimiento vegetal y la nutrición mineral, la tolerancia
a las enfermedades y estrés como la sequía, las fluctuaciones de temperatura,
la toxicidad de metales y la salinidad,Meharg &Cairney (2000), Borowicz (2001).
En suelos ácidos, la presencia del Aluminio constituye un factor limitante para el
crecimiento de las plantas, expresándose dicha toxicidad en el retraso y
crecimiento de las raíces, de ahí el interés de las asociaciones micorrízicas en los
cultivos agrícolas, por cuanto la simbiosis facilita la adquisición de fósforo(Pi) para
la planta dando lugar a grandes cambios en los genes y expresión de proteínas
en la planta huésped, éstos cambios podrían estar contribuyendo a la resistencia
del aluminio (Seguel et al.2013). En el presente trabajo se presentan aspectos
generales de la palma aceitera desde la botánica, las enfermedades más
relevantes, la importancia económica de los cultivos en el mundo y en Colombia y
se hace énfasis en los principales beneficios de la simbiosis para los cultivos
agrícolas en la protección frente al estrés causado por el Al de los suelos
ácidos.
21
2.0 BOTÁNICA DE LA PALMA ACEITERA (ELAEIS GUINEENSIS JACQ)
Es una planta monocotiledónea alógama, arborescente de la familia Arecácea,
perteneciente a la subfamilia Arecoideae,tribu Cocoseae y la subtribu Elaeidinae,
la subfamilia Arecoideae comprende 112 géneros (Dransfield et al.2005).Presenta
un penacho de hojas y un solo tallo en forma de columna. La apariencia
característica "desordenada" de la palma en contraste con el cocotero (Cocos
nucífera) se debe al ángulo irregular de inserción de los foliolos a lo largo
del raquis de la hoja, Hartley (1988). Las especies de Elaeis son: E. guineensis
(Jacq), de origen africano y E. oleífera (Kunth), de origen americano. El género
Elaeis se basó en las palmas introducidas en Martinica, la palma de aceite recibió
su nombre botánico de Jacquin (1763). Elaeis se deriva de la palabra griega
elaion, que significa aceite, mientras que el nombre específico guineensis
demuestra que Jacquin atribuyó su origen a la Costa de Guinea, en el oeste de
África (Jacquemard, 1988).
El tallo o estípite es recto, puede llegar a medir entre 25-30 m, el meristemo
apical, que es el lugar de crecimiento, se ubica en el centro del tallo. Una palma
adulta normal tiene un promedio de 30-49 hojas funcionales que alcanzan entre
siete y ocho metros de largo, cada hoja posee en su axila, una inflorescencia sin
sexo definido, produciendo separadamente flores tanto masculinas como
femeninas en la misma planta. Las flores masculinas son portadoras del polen, y
las flores femeninas se localizan alrededor del raquis en forma de espiral
disponible hasta un número de 4000 para ser polinizadas, los frutos miden de 3 a
6 cm de largo, y con un peso aproximado de cinco a doce gramos.
El fruto de la palma tiene una piel externa lisa llamada exocarpio de color
amarillento hasta anaranjado, el tejido fibroso conforma la pulpa donde se
encuentran las células productoras de aceite (mesocarpio), una nuez o semilla
22
compuesta por un cuesco lignificado (endocarpio), y una almendra aceitosa
o Palmiste, llamado Endospermo (Corley & Tinker, 2003). Se consideran tres
tipos o variedades de palma de aceite de acuerdo a la presencia o ausencia de
un cuesco o cáscara en la fruta (Beirnaert &Vanderweyen 1941),esta condición
es debida a la presencia de un gen principal llamado Sh, (del idioma inglés
“Shell”).Los genotipos de cada una de las variedades son: Variedad Dura:
genotipo homocigote (Sh+/Sh+), la cual produce frutos con una cáscara gruesa,
variedad Pisífera: genotipo (Sh/Sh),la cual esta desprovista
de
la
cáscara
raramente en frutos, variedad Tenéra:genotipo (Sh+/Sh), la cual es considerada
un híbrido de las dos variedades dura y pisífera. La morfología del fruto varía
considerablemente en cada una de las tres variedades (Fig.1).
Figura 1.
Esquema de semilla comercial Tenéra mediante el cruce de las
variedades Dura y Pisífera. Se muestran los porcentajes de endospermo,
endocarpio y mesocarpio de los frutos
Fuente: Oralys (2005)
De acuerdo a Meunier & Gascon (1972), los cruce dura x pisífera y dura x tenera
son más productivas en aceite y se mejoran a través de selección reciproca
recurrente. El aceite de palma se extrae de la pulpa, y el aceite de palmiste de la
almendra. La industrialización del cultivo conlleva el proceso de refinación y
fraccionamiento de los aceites para producir las oleínas y las estearinas de palma
y de palmiste (Bernal, 2001).
23
3. SISTEMA RADICULAR DE LA PALMA
Tomlinson (1961), describió en general la anatomía de la raíz de la palma,
específicamente la palma aceitera ha sido descrita en varios trabajos (Purvis
1956; Ruer, 1967; Jourdan & Rey, 1997; Jourdan et al. 2000). Según Hartley
(1983) & Purvis (1956) el sistema radicular de la Palma de aceite está formado
por una masa de raíces que parten del bulbo y se ramifican horizontal y
radialmente, y se han dividido según su posición jerárquica, longitud y diámetro
en primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias. En la Fig. 2 se muestra el
esquema del sistema radicular de la palma de aceite.
Figura 1.
Esquema del sistema radicular de la Palma de aceite
Fuente: Tomado de Purvis (1956)
La palma aceitera tiene un sistema de raíces; con raíces primarias que
generalmente miden de 6-10 mm en diámetro, originándose desde la base del
tronco, se extienden horizontalmente o descienden a varios ángulos en el suelo.
de la raíz primaria se originan raíces secundarias, estas miden cerca de 2-4 mm
en diámetro. Las raíces terciarias miden de 0,7-1,2 mm en diámetro, y son
ramificaciones de las raíces secundarias, las cuaternarias se originan de las
terciarias, ellas están desprovistas de lignina y en diámetro alcanzan de 0,1-0,3
mm y 1-4 mm de longitud, se asume que son las raíces absorbentes. Corley et
24
al.(1976).Fairhust & Härdter(2012),consideran que la mayor parte de la biomasa
de las raíces se encuentra localizada a un metro de la superficie del suelo y
que las raíces que llevan a cabo la absorción activa de nutrientes se encuentran
en mayor proporción en los primeros 0,5 m de la superficie del suelo. El tipo de
suelo, las condiciones físicas y químicas donde se desarrollan las raíces de la
palma tiene influencia sobre el crecimiento y desarrollo de las mismas, por lo que
se aconseja evitar el encharcamiento, la compactación y labranza excesiva de la
capa superficial del suelo donde se cultivan las plantas.
25
4. IMPORTANCIA Y PRODUCCIÓN DE LA PALMA ACEITERA A NIVEL
MUNDIAL Y EN COLOMBIA
Globalmente 13,5 millones de ha de palma aceitera se cultivan en zonas
tropicales de baja elevación, con alta humedad, principalmente en el Sudeste de
Asia (Malaysia e Indonesia) y Sur América (Brasil y Colombia), Fitzherbert,et.al
(2008).La producción y expansión del cultivo de palma obedece a varios factores
tales como el aumento de los precios del petróleo, el cual estimula la
producción de materias primas destinadas a la producción de biocombustibles; la
alta demanda de alimentos que se utilizan como materia prima para la fabricación
de productos derivados del aceite de palma, sus altos rendimientos y eficiencia y
su bajo precio en el mercado comparada con la producción de otros aceites y con
los altos precios del petróleo,son razones por las que se considera al aceite de
palma una fuente alternativa de combustible y un gran negocio mundial (Smith,
2006). Se ha estimado a la palma aceitera como la especie más productiva y
eficiente entre las especies oleaginosas del mundo, una hectárea de plantación
de palma de aceite es capaz de producir hasta diez veces más aceite que
cualquier otro grupo de semillas oleaginosas (Fig.3) y comparado con otros
aceites vegetales tales como la soja (Glicina max) y la colza (Brassica napus L.),
es una materia prima más barata para biodiesel, además es el aceite vegetal que
más se produce en abundancia en el mundo (Ramachandran, 2005). Según
Jalani et al. (1993), la palma aceitera en condiciones favorables produce un
promedio de 4,5 t/ha/año de aceite rojo de palma, 0,5 t/ha/año de aceite de
Palmiste (coquito) y 0,45 t/ha/año de torta de palmiste.
26
Figura 3. Comparación de la eficiencia de la palma de aceite con otros cultivos
importantes de oleaginosas-(Fuente Oil World 2013)
De acuerdo al reporte de la FAO (2006), y Mielke (2011), se considera que la
palma aceitera es un cultivo de alto rendimiento, que necesita temperaturas
cálidas, sol y mucha lluvia; condiciones por las cuales su cultivo se ha expandido
a las zonas tropicales de Asia, África y América. En particular, el cultivo de
palma aceitera se encuentra en producción en 46 países a nivel mundial (Fig. 4),
localizados entre las latitudes de 20 ° norte y 20 ° al sur del ecuador, de los cuales
Indonesia y Malasia aportan una producción alrededor del 85% al 90% del aceite
de palma del mundo.
27
Figura 4. Los cuarenta y seis países donde se cultiva palma aceitera
Fuente: ¿Where is it grown? The oil palm. http://theoilpalm.org/? page_id=2148
Según informe del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA,
2013), la producción global de palma de aceite para el año 2013 fue estimada en
56,2 MT (millones de toneladas), y se estima que la producción ha aumentado
más de nueve veces en las últimas tres décadas para abastecer los principales
mercados como la Unión Europea, China, Pakistán, Indonesia e India. El primer
productor de palma de aceite es Indonesia, y su producción para el año 2013 se
estimó en 31 000 00 /tonelada métrica, el segundo productor es Malasia, seguido
de Tailandia y Colombia. En la Figura 5, se muestra la producción de palma de
aceite a nivel mundial para el año 2013.
Tanto en Indonesia como Malasia y sus comunidades rurales, la producción de
aceite de palma es vital, tal producción representa el 3,2% del PIB de Malasia y
el 6 % y el 7 % del PIB de Indonesia (RSPO 2011).
28
Figura 5. Principales países productores de palma aceitera (Fuente: USDA-2013)
La industria de la palma conlleva una labor intensiva, requiriendo un promedio
global de cinco trabajadores por hectárea. En Malasia, el sector del aceite de
palma emplea a 590 000 trabajadores directos (incluidos un gran número de
trabajadores importados de Indonesia), y el 35 % de la producción proviene de
pequeños agricultores (NEAC, 2009). Indonesia un país con una población de
246 864,191 de habitantes, aporta un total estimado de 3,7 millones de personas,
que se dedican a la industria del aceite de palma y las industrias, con el 45 % de
la producción de los pequeños agricultores (RSPO, 2011). La palma de aceite es
un cultivo en continua expansión
por lo que se ha considerado que
aproximadamente 15 millones de hectáreas de suelos en el mundo son
dedicadas al cultivo. (Fitzherbert, et al. 2008). Según Barrientos (2009) a pesar
que el cultivo de palma de aceite a tenido fluctuaciones en el precio, éstos se han
ido recuperando desde la caída de precios del año 2008 y de acuerdo a Levang
et al. (2008); se espera que la demanda del aceite de palma siga
incrementándose en los próximos 20 años. Colombia es el principal productor
de palma de aceite en América Latina y de acuerdo a la USDA (2013), se ha
convertido en el cuarto productor más grande del mundo. En Colombia el cultivo
29
se ha expandido relativamente lento, con relación a los países de África y Asia,
por ejemplo mientras que en Colombia se desarrollaron alrededor de 150.000
hectáreas en cuarenta años (desde la llegada del cultivo a Colombia, hasta el año
2000), países como Malasia e Indonesia alcanzaron en el mismo periodo 3,5
millones de hectáreas, el primero y 2,5 millones de hectáreas el segundo, sin
embargo Colombia ha mantenido un crecimiento sostenido y expandido de la
palma de aceite, esto se demuestra con los registros que se tienen, pues a
mediados de la década de 1960 existían 18 000 hectáreas en producción, en 52
años el cultivo aumento considerablemente, pues ya para el año 2010,las
plantaciones alcanzaron a cubrir 404 104 ha y de estas aproximadamente 160
000 ha fueron utilizadas para la producción de biodiesel ( Fedepalma,2011).
En Colombia a nivel gubernamental se tiene el ambicioso objetivo para el año
2020 de reemplazar el diesel con el 20% de biocombustibles, para tal propósito
se requiere cultivar adicionalmente 600 000 ha de cultivos de Palma a nivel
nacional, estas políticas gubernamentales han originado un programa de
subsidios, diseñados a fomentar y aumentar el número de cultivos en el país. El
cultivo de la palma aceitera está consolidado en Colombia en cuatro regiones o
zonas palmeras definidas como: Zona Norte (Magdalena, Norte del Cesar,
Atlántico, Guajira), Zona Central (Santander, Norte de Santander, Sur del Cesar,
Bolívar), Zona Oriental (Meta, Cundinamarca, Casanare, Caquetá) y Zona Sur
Occidental (Nariño y Urabá). (Fig. 6).
30
Figura 6. Zonas palmeras en Colombia- hectáreas de producción al año 2012
La zona Oriental tiene la mayoría de las plantaciones y es también donde se
halla la mayor producción de palma 37,9%, seguida de la zona norte, la cual
participa con el 33,4%, la zona central con el 27,2% y finalmente la zona
Suroccidental aporta el 1,4 de la producción nacional. (Cuadro 1, Torres et al.
2013).Cuadro 1. Distribución del área sembrada, en producción y desarrollo de palma
aceitera en Colombia (año 2012).
Año
2012
ORIENTAL
Área
NORTE
CENTRAL
SUROCCIDENTAL
%
ha
Par
ha
%
Part
ha
%
Part
ha
%
Part
S
170 662
37,7
132 530
29,3
129 112
28,5
20 131
P
113 820
37,9
100 273
33,4
81 631
27,2
D
56 842
37,3
32 257
21,2
47 481
31,1
TOTAL
ha
%
P
4,4
452 35
100
4 229
1,4
299 953
15 902
10,4
152 482
100
100
ha=hectáreas, % Part=Porcentaje de participación, S= área sembrada, P=área en producción,D=área
en desarrollo
(Fuente: Adaptado de la información Torres et al.(2013)-Minianuario estadístico de palma).
31
5. ENFERMEDADES DE LA PALMA ACEITERA
Desde la etapa de semilla de la palma aceitera, se presentan ciertas
anormalidades o enfermedades, tales como la mancha marrón o botón emergente
en la semilla, atribuida a hongos tales como especies de Aspergillus y otras
especies fúngicas. En hojas se presenta varias enfermedades de mayor o menor
frecuencia algunas a tribuidas a virus. Estos incluyen la racha de bronce, la
mancha anular y clorosis infecciosa (Turner 1981), por lo cual es importante hacer
un seguimiento periódico de las plántulas que se desarrollan en los viveros de
palma, puesto que las plantas anormales pueden ser siempre halladas en un
vivero de palmas, y si son plantadas podrían reducir la homogeneidad de la
plantación y bajar su potencial de producción, entonces deben ser eliminadas
cortándolas.
La palma aceitera es afectada por varias enfermedades que varían más o menos
de acuerdo a la posición geográfica de las plantaciones, de acuerdo a Corley
&Tinker (2003), la enfermedad de mayor importancia en África, ha sido la
marchitez causada por Fusarium, en Nigeria, la pudrición seca basal
(Ceratocystis), en Asia, la pudrición basal del tallo, causada por Ganoderma
boniensis y en América Central y América del Sur son la enfermedad del anillo
rojo, la marchitez letal y la pudrición de cogollo(PC), causada por el Oomycete
Phytophtora palmivora. Se hace una breve descripción
enfermedad de la palma aceitera, por
el
impacto
de
esta
económico
última
que
ha
representado en Colombia.
5.1 LA PUDRICIÓN DEL COGOLLO
La pudrición del cogollo (PC), fue reportada por Reinking en 1928 en países
productores de las Américas y África. Se considera que la PC afecta los tejidos
jóvenes de las hojas o cogollo de la palma, presentándose un amarillamiento con
una progresiva pudrición y secamiento de la hoja que está aún sin abrir (flecha), si
32
la pudrición alcanza los tejidos meristemáticos conlleva a la muerte de la planta.
El primer síntoma que aparece en las plantas afectadas es una lesión necrótica
en la parte distal de las flechas jóvenes, seguido de la pudrición de la zona
afectada (Martínez et al. 2010), la zona radicular se ve afectada presentados
retraso en el crecimiento y anormalidades especialmente en las raíces terciarias y
cuaternarias, antes de que los síntomas de necrosis sean visibles en las flechas
(Albertazzi et al.2005).
De otro lado Franqueville (2003) determinó dos tipos de PC una forma letal, que
se localiza predominante en la Amazonía Brasileña y el Ecuador, y en algunas
zonas de Colombia y, la forma no letal se encuentra principalmente en la zona
oriental de Colombia, con una tasa alta de recuperación de la palma, aunque el
rendimiento se ve afectado de 18-24 meses, después de que los síntomas de la
enfermedad han disminuido, se reemplaza la cubierta de la hoja.
El agente etiológico de la enfermedad de la PC en palma ha sido desconocido
por cerca de 40 años, y varios hongos se han implicado en las lesiones, sin
embargo trabajos realizados por el Centro de investigaciones de la palma de
aceitera en Colombia (Cenipalma) se identificó a Phytophthora palmivora Butl,
como el agente causante de las primeras lesiones, y se han relacionado después
de la lesión la presencia de varios patógenos fúngicos oportunistas tales como:
Fusarium spp., Colletotrichum spp, Thielaviopsis spp y Rhizoctonia spp, entre
otros. También se han implicado en las lesiones bacterias tales como
Pseudomonas spp, Erwinia spp e insectos (Rhynchophorus palmarum) que
promueven el proceso de pudrición, el cual se inicia en los tejidos inmaduros de
las flechas que se están desarrollando (Martínez et al.2010).Sin embargo se
han considerado varios factores bióticos y abióticos como determinantes en la
aparición dela PC, por lo cual Douglas (2011) sugiere una hipótesis abiótica
relacionada con la deficiencia transitoria de calcio antes de la emergencia de las
flechas como la causa principal de la PC, esta deficiencia la atribuye a varios
33
interacciones
agronómicos
de
e
factores
hidrológicas
genéticos,
que
climáticos,
inducen
la
edáficos,
nutricionales,
susceptibilidad
en
palmas
individuales o grupos de ellas, sugiriendo que la falta de enmiendas de calcio (Ca)
y prácticas agrícolas adversas en suelos susceptibles con baja capacidad de
intercambio
catiónico
efectivo,
baja
amortiguación
estarían
afectando
negativamente la salud del suelo y el sistema radicular de la palma, también
enfatiza en que los síntomas de PC están frecuentemente presentes o
acentuados en suelos ácidos (pH<4,5). McLaughlin &Wimmer (1999) consideran
que uno de los efectos más drásticos y rápidos que afectan la fisiología de las
plantas superiores susceptibles, es el efecto de concentraciones altas de aluminio
soluble en las raíces sobre la interferencia en la absorción de Ca.
Otros factores también han sido considerados en la aparición del PC, como el
mal drenaje de los suelos, sin embargo Acosta & Munévar (2003) en trabajos
realizados en plantaciones de la Zona palmera Oriental Colombiana, encontraron
alta incidencia de PC en lugares tanto con mal drenaje como con buen manejo de
éste. La pudrición del cogollo es un grave problema para las plantaciones de
palma aceitera en América, y en particular, según informe de Dishington (2013)
en Colombia se han visto comprometidas en los últimos 25 años cerca de 150
000 ha, de las cuales 30 000 ha se encuentran en Tumaco, 30 000ha en el
Magdalena medio, cerca de 10 00 ha en el Urabá y más de 80 000 ha en los
llanos Orientales. Se considera que el 50% de los cultivos, han sido afectados de
manera letal. En Colombia se han sembrado más de 25 000 ha de material
hibrido interespecífico de palma de aceite (E. guineensis x E. oleífera), por
considerarse que presenta resistencia al PC, sin embargo la federación de palma
aceitera de Colombia (Fedepalma), considera que estos materiales están en
desarrollo y requieren mayor tiempo e investigación
34
6. GENERALIDADES DE LA SIMBIOSIS MICORRÍZICA
Los hongos micorrizicos son asociaciones simbióticas entre un organismo
fotosintético, en este caso una planta y un hongo filamentoso. El término
micorriza es una mezcla de latín y griego, y literalmente significa hongo-raíz
(µukes=hongo, rhiza=raíz), casi todas las plantas verdes terrestres forman
simbiosis, con algunas excepciones tales como miembros de pocas familias
Chenopodiaceae
asociaciones
y Crucífera que
micorrízicas
más
no establecen simbiosis.
comunes
son:
micorriza
Las
cuatro
arbuscular,
ectomicorrizas, micorriza ericoide y micorriza de orquídeas (Fortín, et al. 2009).
Los análisis filogenéticos mostraron un nuevo orden; “Sebacinales”, en las
ectomycorrhizas (Selosse & Moyersoen 2002), y también se reconoce la
micorriza jungermanoides (Kottke et al. 2003).Un resumen de las diferentes
Asociaciones micorrízicas se muestran en el Cuadro 2. Los Hongos micorrizicos
arbusculares son microorganismos rizosféricos cosmopolitas se encuentran
prácticamente en todos los ecosistema terrestres, incluyendo bosques tropicales
a templadas, dunas, desiertos pastizales, agro ecosistemas, por lo cual es
considerada la simbiosis más extendida en vegetaciones naturales y agrícolas
(Wang & Qui 2006), los hongos son biotróficos obligados, por lo cual son
incapaces de crecer y completar su ciclo de vida en la ausencia de una
asociación con una raíz viva (Smith& Read, 2008). En los suelos pobres en
nutrientes la simbiosis micorrizica tiene gran importancia en la translocación del
fósforo a la planta, éste elemento es requerido relativamente en grandes
cantidades, sin embargo está muy poco disponible en los suelos.
35
Cuadro 2. Tipos y Características de los Hongos micorrízicos
TIPO
DE MICORRIZA
HONGOS
INVOLUCRADOS
PLANTA
HUÉSPED
ARBUSCULAR
(Hongos
microscópicos)
Glomeromycetes
(más de 200
Especies)
Briófitas y
Plantas
vasculares
70%especi
es
existentes
ECTOMICORRIZA
(Hongos
Superiores)
Ascomycetes y
Basidiomicetes
(miles de
Especies)
ECTENDO
MICORRIZA
ARBUTROIDE
ERICOIDE
ORQUIDIOIDE
SEBACINOIDE
Gymnosper
ma
Angiosper
mas
5%
especies
existentes
Deuteromicetes
(unas pocas
especies)
Pinos:
rara
Basidiomicetes
(pocas especies)
Ericaceae:
raro
Ascomicetes
(varias decenas
De especies)
Ericaceae:5
%
especies
existentes
Orchidacea
e:
10%
especies
existentes
varios
Basidiomicetes
(pocos estudios
con micelio
estéril)
Piriformospora;
Basidiomicetes:
(pocas especies)
ESTRUCTURA FÚNGICA
arbúsculos,
vesículas,
micelio
extraradical,
esporas
ESTRUCTURA
HUÉSPED
Pocos
Cambios.
Coloración
amarilla
IMPACTO FISIOLÓGICO
Incremento
Acceso a P y Zn.
Resistencia a
sequía, enferme
dades, pastoreo,
marcados cambios
en metabolismo
Incremento acceso a
nutrientes uso de N
orgánico
Resistencia
enfermedades
y nematodos,
tolerancia bajos Ph y
metales
pesados
Manto Fúngico
Micelio
Intercelular
Rhizomorfos
Esclerotios
Ascoma,Basidio
mata No
penetración
intracelular
Hipertrofia
Cortical,
Ramifica
ción
dicotómica
ó
pinada
Micelio
Intercelular,
Penetración
intracelular
Penetración
Intracelular
Basidio
mata
Micelio
Intracelular
Ascomata
Hipertrofia
Cortical,
Ramifica
ciones
Hipertrofia
Cortical
igual
Poca
modificación
igual
Micelio
Intracelular
Basidio
mata
Poca
modificación
Esencial
Morfogénesis
Micelio
intracelular
Poca
modificación
Poco
conocido
Fuente: Fortín et al.(2009)
36
igual
Los hongos micorrízicos arbusculares se agrupan monofiléticamente en la división
Glomeromycota, que contiene todo los hongos conocidos como micorrizabuscular
(HMA),dichos hongos coevolucionaron con sus huéspedes desde que las
plantas conquistaron el medio ambiente terrestre lo cual parece coincidir muy bien
con el registro fósil de colonización micorrizica arbuscular (MA) en la tierra de
plantas vasculares.De acuerdo a la revisión de Stürmer (2012), acerca de la
taxonomía y sistemática de los hongos micorrizicos arbusculares (HMA), dicha
identificación paso por varios periodos que él los resume así: a) El periodo inicial
de descubrimiento (1845–1974) caracterizado por la descripción principalmente
de especies de micorrizas que forman esporocarpos, propuesta como una
característica para la clasificación b) Un periodo que denomino Taxonomía alfa
(1975–1989) en el cual se estableció las bases sólidas para la identificación
morfológica dando como resultado la descripción de nuevas especies
y
despertó la necesidad de estandarizar una nomenclatura para las estructuras
subcelulares de las esporas, c) El periodo de 1990-2000, el cual mostró la
primera clasificación cladística de los HMA basado en características fenotípicas
únicamente, al final de este periodo, las características genéticas fueron
importantes para definir taxas y dilucidar las relaciones evolutivas dentro de los
grupos. Se enmarca el periodo filogenético desde el año 2001 al tiempo
presente, mostrando ese inicio del periodo con la propuesta de la nueva
clasificación de HMA basada en características genéticas usando secuencias
de los genes multicopia ARNr. Sin embargo y por mucho tiempo la identificación
de los HMA estuvo basada en la formación de las esporas, estructura de las
paredes y estudio en general de la morfología de éstas, con el desarrollo de
métodos moleculares se ha podido construir arboles filogenéticos y se ha llegado
al conocimiento de la evolución de estos simbiontes utilizando secuencias de
SSU RNAr, diversos trabajos soportan la nueva clasificación: Shußler et al.
(2001), Oehl&Sieverding (2004), Walker & Schubler (2004), Oehl et al.(2011).
37
En general y de acuerdo a los trabajos anteriores se acepta que los HMA
pertenecen a la división fúngica denominada Glomeromycota, compuesta por tres
clases: Archaeosporomycetes, Glomeromycetes, Paraglomeromycetes, cinco
ordenes:
Archaeosporales,
Paraglomerales.
Sacculosporaceae,
Catorce
Diversisporales,
familias:
Gigasporales,
Diversisporaceae,
Pacisporaceae,
Scutellosporaceae,
Glomerales,
Acaulosporaceae,
Gigasporaceae,
Dentiscutataceae, Racocetraceae, Entrophosporacea, (o Claroideoglomeraceae),
Glomeraceae,
Ambisporaceae,
Geosiphonaceae,
Archaeosporaceae,
Paraglomeraceae. Veinte nueve géneros ubicados en las familias anteriores y
se estima un número de especies de 230 aproximadamente. En la Figura 7, se
muestra el árbol filogénetico de la división Glomeromycota, se incluye al género
Geosiphon, el cual fue reconocido como un ficomicete por Knapp en 1933 y más
tarde
la evidencia basada en análisis de secuencias de genes de la unidad
pequeña del ARN ribosomal SSU rRNA), mostraron que Geosiphon está
estrechamente relacionada con los hongos micorrizicos arbusculares.
.
Figura 2.
Árbol filogenético de los HMA (Glomeromycota)
Fuente: (http://www.amf- phylogeny.com.
38
BENEFICIOS DE LA MICORRIZA ARBUSCULAR EN PLANTAS
El concepto de un manejo adecuado de los suelos para mejorar la productividad y
sostenibilidad de los cultivos, ha sido objeto de estudio desde los años 70’s,
como una respuesta a los problemas económicos, sociales y medioambientales
generados por la agricultura intensiva. Internacionalmente ha cobrado importancia
la preocupación por el cuidado del medio ambiente y de las prácticas agrícolas
por lo cual se han generado una serie de conceptos para el desarrollo integrado
de la agricultura, tales como agricultura orgánica, agricultura ecoeficiente,
agricultura biológica entre otras.
En particular el término desarrollo sostenible o sustentable, fue popularizado y se
concretó en el documento publicado en el año 1987 por la Comisión mundial para
el desarrollo y el medio ambiente, el informe Brundtland. Según Atkinson et
al.(2002) en la agricultura orgánica o biológica el objetivo principal es el desarrollo
y optimización de los procesos del suelo. En este concepto la actividad
microbiana cumple un papel fundamental en el ciclado de los nutrientes y
contribuye a la optimización de los insumos y fertilizantes químicos, disminuyendo
la carga generada por los mismos al ambiente, y contribuyendo a reducir el efecto
invernadero. Una de las más importantes asociaciones microbianas de las
plantas, es la simbiosis micorrizica, ella aumenta la capacidad de suministro de
fósforo para las plantas, regula la pérdida de agua, especialmente en los casos
que los suministros son limitados, aumenta la conductividad hidráulica de la raíz
(Graham & Syversen 1984). De acuerdo a Song (2005), los posibles mecanismos
por los cuales la micorriza le confiere resistencia a la planta frente al estrés
hídrico son debidas a las siguientes razones: los HMA mejoran las propiedades
del suelo en la zona de la rizósfera, aumenta el área de las raíces de las plantas
huésped y mejora su eficiencia en la captación de agua, aumenta la absorción de
P y otros elementos nutricionales, por lo cual mejora el estado nutricional de la
39
planta hospedera, los HMA activan rápidamente el sistema de defensa de la
planta hospedera y protegen a la planta contra el daño oxidativo generado por
sequía o afectando la expresión del material genético. De otro lado, Johansen &
Jensen (1991), reportaron que la hifa externa de los HMA no solo tenía la
capacidad de capturar fosfato, sino también podían tomar el
15
N a partir de
sales de amonio y Tobar, Azcón & Barea (1994) demostraron que el micelio
externo de los HMA es activo en la captación y trasporte de NO 3 en suelos
relativamente secos.
Los hongos micorrizicos también brindan protección a la planta contra patógenos
de la raíz, en esta función interactúan muchas comunidades del suelo y se han
propuesto varios mecanismos para explicar cómo se da dicha protección.
Los mecanismos debidos a la mejora del estado nutricional de la planta huésped
se pueden resumir así: interacción competitiva con hongos patógenos, cambios
en la anatomía y arquitectura en el sistema de raíces, cambios en la comunidad
microbiana en la rizósfera, activación de los mecanismos de defensa de la planta,
involucrados en la defensa de los HMA para la planta, éstos mecanismos son
referenciados ampliamente en el trabajo de Wehner, et al.(2010). Otro aspecto
importante a considerar es la participación y beneficios que tienen las plantas
micorrizadas cuando se desarrollan en suelos agrícolas impactados por alta
concentración de metales pesados y aluminio. Los metales pesados son
contaminantes ambientales importantes y se definen como el grupo de elementos
con una densidad superior a 5 g/cm. De acuerdo a Weast (1984), 53 de 90
elementos presentes en la naturaleza son metales pesados, y 17 (Fe, Mo, Mn,
Zn, Ni, Cu, V, Co, W, Cr, As, Hg, Ag, Sb, Cd, Pb y U.), son de importancia para
los organismos y / o ecosistemas, en base a su solubilidad bajo condiciones
fisiológicas. Sin embargo, es ampliamente conocido que los elementos traza
tales como Cu, Fe, Mn, Ni y Zn, están involucrados en todas las funciones
metabólicas y celulares de las plantas, por lo cual
40
son esenciales para el
crecimiento y desarrollo de las mismas, mientras que Cd, Pb, Hg, y As no son
esenciales (Mertz 1981). El exceso de metales pesados en las células causan
daño molecular a las plantas ya sea directa o indirectamente a través de la
formación de especies reactivas de oxígeno (ROS de su sigla en inglés)
tales como peróxido de hidrógeno (H2O2), radicales hidroxilo (OH) y superóxido
hidroxilo (O2) (Lin &Kao 2000). Como una respuesta a la acción tóxica de los
metales pesados las plantas han desarrollado varios mecanismos tales como la
activación de antioxidantes de defensa, incluyendo la producción de enzimas
antioxidantes como la superoxido dismutasa, catalasa, y peroxidasa, mecanismos
complejos que no son considerados en esta revisión. Desde los años 60´s,
Somers (1961), Martin (1967), reportaron el efecto fungitóxico de los metales
pesados, sugiriendo la interrupción de la formación micorrizica y por lo tanto el
efecto negativo en la captura del fósforo para las planta hospedantes.
A pesar que se ha reportado el efecto deletéreo que tienen los metales pesados
(MP) sobre la sobrevivencia de las micorrizas, otros trabajos han demostrado que
éstos hongos son capaces de responder por diferentes mecanismos a la
presencia de metales pesados en el suelo, al igual que la planta hospedera utiliza
mecanismos para mantener la homeostasis de los iones bajo elevadas
concentraciones
de
MP (Hall
2002),
además
de
algunos
mecanismos
enzimáticos, se menciona en general que las plantas se defienden de la alta
concentración de metales pesados en el suelo a través de mecanismos tales
como la fitoestabilización y la fitoextracción.
Con relación a los HMA, se ha encontrado que ellos participan captando el metal
pesado en sus tejidos fúngicos o inmovilizando los mismos, por ejemplo la
glomalina es una glicoproteína que es producida y liberada por HMA y que tiene
la capacidad de ligar o atrapar metales pesados en el suelo (González, et al.
2004), además de contribuir a la captura de carbono del suelo (Wright &
Upadhyaya, 1996). Se le ha atribuido además a la glomalina, que es un indicador
41
de los efectos del cambio del uso del suelo. (Rillig et al.2003).Sin embargo, la
proliferación de HMA, y por tanto la producción de glomalina, está limitada en
suelos con alta disponibilidad de P e igualmente por algunas prácticas comunes
en la agricultura como: fumigación, fertilización y uso de plaguicidas. Estos
factores afectan negativamente el establecimiento y funcionalidad de los hongos
micorrízico arbusculares (Ryan & Graham, 2002).
De otro lado las especies fúngicas no responden igual ante las concentraciones
de metales pesados en los suelos, se menciona cierta tolerancia de cepas
fúngicas a metales pesados específicos (Gaur & Adholeya, 2004) y se ha
encontrado que dicha tolerancia varía dependiendo del genotipo fúngico. Vera
Gohre & Uta Paszkowski (2006) presentan un resumen, donde se amplía el
conocimiento de los mecanismos utilizados por los HMA en la fitorremediación de
metales pesados.Los hongos micorrizicos contribuyen a que las plantas se
adapten a las condiciones adversas del suelo, y una de sus principales
estrategias es dada por el incremento del área de superficie de su sistema
radicular vía simbiosis micorrizica (Marschner 1991), así mismo la anatomía de
las raíces y la longitud juega un importante papel en la absorción de nutrientes
en las plantas. En el año 1937, Peyronel distinguió dos categorías de plantas
de acuerdo al desarrollo de sus raíces, un grupo son aquellas que tienen
raíces
muy
delgadas
y
finas
con pelos radiculares largos, éstas son
escasamente micorrizadas y el segundo grupo formado por raíces gruesas que
en estado activo son fuertemente micorrizadas, estos hallazgos estarían
sugiriendo que algunos tipos de cultivos podría beneficiarse potencialmente de
la simbiosis micorrizica. De acuerdo a Janos (2007), el grado por el cual la
planta se beneficia de la micorriza puede variar ampliamente de acuerdo a la
dependencia que presentan ciertas especies de planta, está dependencia
micorrizica según Gerdemann (1975), se define como el grado por el cual una
planta es dependiente de la condición micorrizica para producir su máximo
crecimiento o rendimiento, a un nivel dado de fertilidad del suelo. Plenchette et al.
42
(1983a) definieron esta dependencia micorrizal en términos de porcentaje del
peso de la planta cuando esta micorrizada, así:
Porcentaje de dependencia micorrizica =
[(Peso seco de la planta micorrizada- Peso seco de la planta no micorrizada)
/peso seco de la planta micorrizada)] X100.
Esta relación ha sido ampliamente utilizada para evaluar la dependencia
micorrizica de las especies de plantas.
De otro lado Bates & Lynch, (2001) consideran que el incremento en el número y
longitud de pelos radiculares, son una adaptación que aumenta la adquisición de
fósforo (P) y constituye una ventaja competitiva de las plantas, cuando el fósforo
es el factor limitante para el crecimiento, como es el caso de los suelos ácidos.
Se considera que el fósforo, es un elemento fundamental y crítico para el
crecimiento de las plantas y representa cerca del 0,2% del peso seco, sin
embargo es uno de los nutrientes de más difícil adquisición para las plantas,
en el suelo puede estar relativamente en grandes cantidades, pero es muy
poco disponible, debido a la baja solubilidad de los fosfatos de Fe, Al y Ca,
quedando en la solución del suelo concentraciones de 10 micras o menos
con muy baja movilidad (Schachtman et al.1998). Baylis (1959) fue uno de los
primeros en sugerir que el efecto benéfico de la micorriza en las plantas era
mediada por la captación de fósforo, más tarde Gray (1964), demostró que las
plantas micorrizadas contenían más P que las plantas no micorrizadas y Holevas
(1966), demostró en suelos deficientes en P, los efectos positivos de la infección
micorrizica, mientras que no sucedía lo mismo en los suelos a los cuales se les
adicionaba P. A partir de éstos experimentos se han venido realizando
innumerables trabajos para demostrar el beneficio de la micorrización en la
trasferencia del fósforo a la planta, el beneficio en particular de la micorrización en
los suelos con bajo contenido de P y la respuesta a la infección micorrizica a
diferentes niveles de P.
43
8. MICORRIZAS Y PALMA ACEITERA
Los suelos tropicales donde se desarrolla la palma de aceite (Asia, África,
América Central y del Sur), son suelos en general con poco contenido de materia
orgánica, bajos en nutrientes y con altas tasas de evaporación, condiciones por
las cuales el establecimiento de la simbiosis micorrizica sugiere un mayor
beneficio para el aprovechamiento de nutrientes y de agua para el cultivo. La
palma aceitera carece de pelos radiculares por lo cual y de acuerdo a la tesis
expuesta de Peyronel (1937), debido a su anatomía y arquitectura de las raíces
sería una especie vegetal que estaría beneficiándose de la simbiosis micorrizica,
pues una vez el hongo coloniza la raíz, forma un extenso micelio externo que es
capaz de explorar mayor cantidad de suelo y actúa como una extensión del área
de absorción de la raíz.
Se han publicado varios trabajos científicos para demostrar los beneficios de la
inoculación de hongos micorrizicos en diversas especies de palmas y ha sido
ampliamente documentado, St. John (1988), Blal et al. (1990); Bouamri et al.
(2006); Fisher & Jayachandran ( 2008); Sin embargo con relación a la
micorrización en particular de palma aceitera y sus beneficios, hay relativamente
pocos trabajos publicados. Nadarajah (1980),fue el primero en reportar el efecto
benéfico de la micorriza en palma aceitera, Widiastuti &Tahardi(1993),
demostraron que plántulas de palma aceitera requerían menos fertilizantes
fosfóricos cuando crecían en suelos estériles inoculados con Gigaspora margarita
y otras especies de micorrizas, a diferencia de los suelos que no eran
micorrizados, sugiriendo que la aplicación de hongos micorrizicos era una buena
práctica biológica para disminuir los insumos fosfóricos en plántulas. Motta &
Munevár (2005),
mostraron que plántulas
de palma aceitera a nivel de
invernadero inoculadas con HMA crecían tres veces más en biomasa a
comparación de las plántulas no inoculadas en suelos sin adición de
44
fertilizantes, demostrando el aprovechamiento de los nutrientes del suelo y la
efectividad en la translocación de P a través de la simbiosis micorrizica en
palma. Sundram (2010), en un estudio en invernadero con plántulas de palma
aceitera encontró que G. etunicatum utilizado como inóculo micorrízico fue más
efectivo de promover con éxito el crecimiento de las plantas en comparación
cuando se utilizaba en consorcio con otras tres especies de micorrizas. Rinim
(2001) en su trabajo de investigación mostró los efectos benéficos de la
micorriza en el crecimiento de plántulas de palma y la protección contra
Ganoderma boninense.
Azzizah (2004), igualmente encontró que la palma micorrizada podría tener una
mayor resistencia a enfermedades como la pudrición del estípite producida por
Ganoderma boninense. Otros trabajos recientes como los de Bakhtiar et.al
(2012), sugieren que la utilización de bacterias endosimbiontes de micorrizas
tales como B. subtilis trabajan en sinergia con los hongos formadores de
micorrizas arbusculares en el aumento de adaptación de las plantas a estrés
biótico del patógeno G. boninense y podrían ser prometedores agentes de
biocontrol.
Phosri et al. (2010) en su trabajo de revisión del rol de las micorrizas en el cultivo
sostenible de palma, muestran el potencial de los HMA para ser considerados
como inoculantes en la fase de vivero, considerando especial atención al manejo
de fertilizantes, así como la optimización de los niveles de P utilizados,
demostrando que los niveles altos de P reduce los niveles de colonización
micorrizica en palma y enfatizando en el uso de la micorriza desde vivero para
mejorar la nutrición de las plantas y la sobrevivencia en campo, así mismo para
lograr reducir costos.
45
9. EL ALUMINIO Y EL ROL DE LA MICORRIZA
La presencia del aluminio (Al+3) en plantas se estudió en detalle durante 3+
los
siglos 19 y 20, Hutchinson (1943(a.b)-1945), fue uno de los primeros en realizar
estudios del Al y sus trabajos direccionaron los aspectos biogeoquímicos,
fisiológicos y ecológicos de la acumulación del aluminio en plantas, las funciones
biológicas, la toxicidad y la presencia de aluminio en animales. Las plantas
que crecen en suelos ácidos, como la palma aceitera son limitadas por varios
factores tales como el exceso de protones (H+) fitotoxicidad a causa de altos
niveles de Aluminio(Al), manganeso (Mn) y molibdeno (Mo) (Fageria & Baligar
2008). A pH <5,0 la forma predominante del Al es heptaedro hexahidratado,
+3
Al(H2O)6, llamado comúnmente Al , estos iones se solubilizan y pueden
penetrar células radiculares, lo cual inhibe el crecimiento de las raíces, el cual es
el primer síntoma de toxicidad por Al y dificulta la absorción de agua y nutrientes
esenciales como fósforo y calcio (Kochian et al.2005).Se ha considerado que un
factor determinante en la rigidez de la pared celular y la inhibición del crecimiento
de la raíz por aluminio es el incremento instantáneo y sostenido de especies
reactivas al oxigeno (ROS) en la raíz y no es debida a la peroxidación de
+2
lípidos (Yamamoto, et al. 2003), además es considerado que el Ca
aumenta
su actividad en el citosol a causa del aluminio, alterando numerosos
procesos bioquímicos y fisiológicos involucrados en el crecimiento de la raíz,
+3
el Al
permea la membrana plasmática al parecer a través de canales de
+2
cationes no selectivos, pudiendo interactuar con canales de Ca permitiendo que
este sea liberado e incrementado en el citosol,(Rincón-Zachary et al.2010).
De otro lado se considera que el grado de toxicidad por Al varía ampliamente
dependiendo de la especie de la planta, las condiciones de crecimiento, las
concentraciones de aluminio y el tiempo de exposición (Kochian, et al. 2004). En
46
general las plantas tienen dos mecanismos que funcionan dentro de la rizósfera
para defenderse de los efectos tóxicos del Al, un mecanismo es referido a la
exclusión para evitar su penetración en los tejidos de la raíz a través de
mecanismos tales como la permeabilidad selectiva de la membrana plasmática
frente al flujo de aluminio, la formación de barrera de pH en la rizósfera o en el
apoplasma de la raíz, la inmovilización del aluminio en la pared celular (Jones,
et al. 2006) o la exudación de ligandos quelatantes provenientes del ápice de la
raíz. Un segundo mecanismo es debido a la detoxificación interna, cuando el
aluminio ya ha penetrado al simplasma de las células, entonces es quelado por
aniones de carboxilatos que son secuestrados en vacuolas (Kochian et al.
2005).
Otros estudios realizados por Hoekenga, et al. ( 2006), Yang et al. ( 2008); Liu et
al. (2009), Yamaji et al. (2009), Xia et al. (2010), Panda et al. (2013); han
mostrado que la resistencia a la toxicidad y la híper-acumulación del aluminio es
debida a caracteres heredables, así que se han implicado una serie de genes en
la tolerancia de las plantas frente a las concentraciones de Al del suelo tales
como: genes que codifican transportadores de membrana, genes involucrados en
factores de transcripción, y genes que participan en la mitigación del estrés
Oxidativo. Según Marschner (1991), la asociación de los hongos micorrízicos
arbusculares (HMA) con las raíces de las plantas es un factor importante en la
adaptación a suelos ácidos, De otro lado, el micelio externo de los HMA
produce exudados de bajo peso molecular o glomalina, y la bioabsorción de
metales pesados por la hifa fúngica podría estar modulando las interacciones
entre plantas y el Al del suelo (Barceló & Poschenrieder 2002) A este respecto
Cummings & Ning (2003), encontraron que las soluciones de la zona radicular de
plántulas de L.tulipifera y Andropogon virginicus colonizadas por HMA contenían
significativamente menos Al reactivo comparado con las soluciones de las plantas
no micorrizadas, en otros trabajos Klugh & Cummings(2007) encontraron que la
resistencia al Al conferida a la planta estaba asociada la especie de micorriza, en
47
el estudio que ellos llevaron a cabo con de L. tulipifera, encontraron que Glomus
clarum fue la especie de micorriza más benéfica para la planta hospedante frente
a otras especies de micorriza aisladas también de suelos ácidos, este trabajo
demostró que especies de micorriza podrían responder diferente a la exposición
de Al y por lo tanto a la producción sostenida de ácidos orgánicos, los cuales se
han asociado a la disminución de la fitotoxicidad del Al, se ha sugerido que ésta
es debida a la reducción de la biodisponibilidad del Al que conlleva a una mejor
adquisición de fósforo, en especial en suelos ácidos donde se desarrollan cultivos
de interés económico como la palma de aceite.
A pesar de las anteriores observaciones, Seguel et al (2013) consideran que la
tolerancia del Al en plantas depende de la adaptabilidad de los hongos a las
condiciones edáficas, incluyendo los altos niveles de Al, la fisiología especifica de
la planta huésped con un particular ecotipo de HMA, lo cual estaría dando
respuesta a la pregunta ¿Por qué las mismas especies o ecotipos de HMA dan
diferentes respuestas cuando se asocian con diferentes especies de plantas?
En síntesis, el papel de la micorriza en la detoxificación de Al para la planta
se basa en la capacidad que tiene el hongo de extenderse en el suelo a través del
micelio externo y su capacidad de secuestrar o ligar el aluminio o crear un
ambiente propicio en la zona de influencia de la micorrizósfera en el cual el Al es
detoxificado.
Seguel, et al. (2013) presentan un modelo hipotético para la resistencia del Al
inducida por HMA en plantas superiores, mostrando una serie de eventos que se
suceden en esta interacción planta hongo resumidas así: La colonización de HMA
aumenta la demanda y afluencia de la fijación de C a las células radiculares, a
su vez los HMA aumentan la captación de P, a la cual lo trasfieren a la planta
huésped cubriendo las posibles limitaciones de P que puedan generarse por la
presencia de Al en la rizósfera, estimulándose también el proceso del C en las
48
raíces a través de la glicolisis y el ciclo del ácido cítrico, lo cual da como
resultado el aumento y disponibilidad de ácidos orgánicos y otros sustratos de
C para la exudación, los cuales a su vez atrapan el Al
+3
en la zona de la
rizósfera, de otro lado la producción activa de la glomalina por los HMA permite el
secuestro Al+3 continuamente, el cual se acumula en las estructuras fúngicas tales
como esporas e hifas. Todos los cambios que se suceden en la micorrizósfera
alteran el metabolismo de la raíz, estimulando la producción de exudados,
cambios en pH, que conllevan a quelar y secuestrar el Al.
De acuerdo a lo expuesto, son innumerables los beneficios que estarían
aportando los hongos micorrizicos al suelo, al ciclado de nutrientes y a la
protección de los cultivos en general frente a diversos tipos de estrés; tal como la
concentración de metales pesados en el suelo, por lo cual éstos deben ser
insumos biológicos a considerar en cultivos tropicales de interés en suelos ácidos.
49
10. CONCLUSIONES
La palma aceitera es un monocultivo en expansión, multipropósito de interés
mundial, que se lleva a cabo en suelos tropicales ácidos los cuales presentan
poco contenido de materia orgánica y nutrientes, presentan altas tasas de
evaporación, condiciones por las cuales el establecimiento de la simbiosis
micorrizica no solo sugiere un mayor beneficio para el aprovechamiento de
nutrientes y de agua para el cultivo, protección de patógenos de la raíz, sino
que también estaría protegiendo a la palma frente al stress producido por los
altos niveles de Aluminio en el suelo, a través de los mecanismos que alteran la
biodisponibilidad de éste metal en la micorrizósfera y que han sido ensayados y
ampliamente discutidos en varios trabajos. Existe un trabajo científico robusto que
soporta en general el beneficio de la simbiosis micorrizica para las plantas y en
particular para monocotiledóneas como la palma aceitera, la cual dada su
condición anatómica natural de la raíz, desprovista de pelos radiculares sugiere el
aprovechamiento de la simbiosis en los suelos tropicales ácidos. El uso
adecuado de la simbiosis desde la etapa de vivero en plántulas de palma aceitera
es una herramienta biológica sugerida para aumentar la sobrevivencia de las
plantas en campo. A pesar que hay una búsqueda de especies de palma
genéticamente tolerantes al aluminio ,la micorriza arbuscular es una herramienta
biotecnológica que se debe considerar en el manejo sostenible del cultivo ,
debido a que el uso continuo de fertilizantes, siempre representarán u n
aumento en los riesgos de contaminación ambiental, por el contrario el uso de
hongos micorrizicos tiene un significado funcional para la mejora de la planta, el
aprovechamiento de nutrientes y la sostenibilidad de los monocultivos,
contribuyendo al cumplimiento de los estándares ambientales exigidos para
mantener la conservación de la biodiversidad y buenas prácticas para la
conservación del manejo del suelo y cultivos sostenibles, como ha sido
propuesto por la RSPO.
50
11. REFERENCIAS
Acosta, A., Munévar, F. (2003). Efecto de drenaje sobre el desarrollo de síntomas
de PC.Better Crops International, 17 (2).
Albertazzi,
H.,
Bulgarelli,
J.,
Chinchilla,
C.
(2005).
Eventos
previos
y
contemporáneos a la aparición de los síntomas de la pudrición del cogollo en
palma aceitera. ASD oil palm papers, 28, 21-41.
Atkinson, D.,Baddeley, J., Goicoechea , N., Green, J., Sanchez, M., Watson, C.
(2002).Arbuscular
mycorrhizal fungi in low input
agriculture.
Mycorrhizal
Technology in Agriculture, 211 – 222.
Azizah,H.(2004).Ganoderma boninense Pat. Microbiology Indonesia, 16(4) 157164
Bakhtiar, Y., Yahya, S., Sumaryono, W., Suradji, S., Buids, W. (2012). Adaptation
of Oil Palm Seedlings Inoculated with Arbuscular Mycorrhizal Fungi and
Mycorrhizal Endosymbiotic Bacteria Bacillus subtilis B10 towards Biotic Stress of
Pathogen Ganoderma
Bates, T., Lynch, J. (2001). Root hairs confer a competitive advantage under low
phosphorus availability. Plant and Soil, 236 243–250.
Barceló J, Poschenrieder C (2002). Fast root growth responses, root exudates,
and internal detoxification as clues to the mechanisms of aluminium toxicity and
resistance: a review. Environmental and Experimental Botany 48: 75-92.
Barrientos, M. (2009) Index Mundi. http://www.indexmundi.com. Consultado el
30 Abril de 2013.
51
Baylis, G. (1959). Effect of vesicular-arbuscular mycorrhizas on growth of
Griselinia littoralis (Cornaceae). New Phytologist, 5 (3):274-280.
Blal, B; Morel, C; Gianinazz-Pearson, V., Fardeau, J., Gianinazzi, S. (1990).
Influence of vesicular-arbuscular mycorrhizae on phosphate fertilizer efficiency in
two tropical acid soils planted with micropropagated oil palm (Elaeis guineensis
Jacq.). Biology and Fertility of Soils, 9 (1):43-48.
Beirnaert, A.,Vanderweyen, R. (1941). Contribution a l'etude génétique et
biométrique des varietés d'Elaeis guineensis Jacquin. Pub Inst Nat Etude agron
Congo Belge Ser Sci, 27 1-101.
Bernal, F. (2001). El cultivo de la palma de aceite y su beneficio: Guía para el
nuevo palmicultor. Fedepalma y Cenipalma, Colombia.
Borowicz, V. (2001). Co-evolution of mycorrhizal symbionts and their hosts to
metal- Contaminated environments. Advance in Ecological Research, 30 69-112.
Bouamri, R., Dalpe, Y., Serrhini, N., Bennani, A. (2006). Arbuscular mycorrhizal
fungi Species associated with rhizosphere of Phoenix dactylifera L. (date palm) in
Morocco. African Journal of Biotechnology, 5 (6): 510-516.
Corley, R., Hardon, J., Wood, B. (1976). Oil Palm Research. Elsevier Scientific
Publishing Company, Holland, 532.
Corley, R., Tinker, P. (2003). The Oil Palm, 4th edn. Blackwell Science Ltd,
Oxford,
UK.604.
Cumming, J., Ning, J. (2003). Arbuscular Mycorrhiza fungi enhance aluminum
52
resistance of broomsedge (Andropogon virginicus L.). Journal of Experimental
Botany, 54 1447–1459.
Dishington, J. (2013). Palma de aceite: fuente de oportunidades, progreso y
desarrollo.Palmas, 34 (1): 9-29.
Douglas, L. (2011). La deficiencia transitoria de calcio como causa primordial de la
pudrición de cogollo de palma de aceite. Informaciones agronómicas, 3 26-52.
Dransfield, J.,Natalie, W.,Asmussen, B., Baker, W., Harley, M; Lewis, C. (2005).
An outline of a new phylogenetic classification of the palm family, Arecaceae. Kew
Bulletin, 60 (4) 559–569.
Fageria, N.,Baligar, V. (2008). Aminorating soil acidity of tropical oxisol by liming
for sustainable crop production. Advances in Agronomy, 99 345-399.
Fairhust, T. & Härdter, R. (2012). Palma de Aceite: Manejo para Rendimientos
Altos y Sostenibles, (1ª ed.). 404.
Federación Nacional de Cultivadores de Palma de Aceite. (2001). La palma
africana en Colombia, apuntes y memorias 1. Federación Nacional de
Cultivadores de Palma de Aceite, Bogotá.
Fitzherbert, E., Struebig, M.,Morel, A; Danielsen, F., Brühl, C; Donald, P.,Phalan,
B.(2008). How will oil palm expansion affect biodiversity? Trends in Ecology &
Evolution, 23 538-545.
Fisher, J.,Jayachandran, K. (2008). Beneficial Role of Arbuscular Mycorrhizal
Fungi on Florida. Palms, 52 (3): 113–123.
53
Food and Agriculture Organization of the United Nations.FAO (2006). World
agriculture: towards 2030/2050 – Interim report. In: Prospects for food, nutrition,
agriculture and major commodity groups. Rome.
Food and Agriculture Organization of the United Nations.FAO (2012). World Food
and Agriculture. Rome.
Fortin, J., Plenchette, C.,Piché, Y. (2009). Mycorrhizas the new green revolution
(pp. 10-17). Québec-Canada.
Franqueville, H. (2003). Oil palm bud rots in Latin America. Experimental
Agriculture, 39 (3):225-240.
Gaur, A., Adholeya, A. (2004). Prospects of arbuscular mycorrhizal fungi in
phytoremediation of heavy metal contaminated soils. Current Science, 86 528–
534.
Gerdemann, J. (1975). Vesicular-arbuscular mycorrhiza. In The Development and
Function of Roots. JG Torrey and DT Clarkson (pp. 575-592). Academic
Press, London.
González, M., Carrillo, R; Wright, S; Nichols, K. (2004). The role of glomalin, a
protein produced b y a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i , i n
s e q u e s t e r i n g p o t e n t i a l l y t o x i c elements.
Environ Pollution, 130
317–323.
Graham, J., Syversen, J. (1984). Influence of vesicular arbuscular mycorrhiza on
the hydraulic conductivity of roots of two citrus rootstocks. New Phytology, 97 277284.
54
Gray, L. (1964). Endotrophic mycorrhizae on trees and field crops. MSc Thesis,
University of Illinois, Urbana.
Hall, L. (2002). Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance.
Journal of Experimental Botany, 53 1–11.
Hartley, C. (1988). The oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) (3a ed.). London, U.K.
761
Hoekenga, O.,Maron, L.,Piñeros, M.,Cançado, G.,Shaff , J.,Kobayashi, Y., Ryan,
P., Dong, B; Delhaize, E., Sasaki, T.,Matsumoto, H.,Yamamoto, Y., Koyama,
H.,Kochian, L. (2006). AtALMT1, which encodes a malate transporter, is
identified as one of several genes critical for aluminum tolerance in
Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103 9738-9743.
Holevas, C. (1966). The effect of a vesicular-arbuscular mycorrhiza on the uptake
of soil phosphorus by strawberry (Fragaria spp. var. Cambridge Favorite).
Journal of Horticultural Science, 41 557–564.
Hutchinson, G. (1943a). The biogeochemistry of aluminum and of certain related
elements. The Quarterly Review of Biology, 18 1–29.
Hutchinson, G.,Wollack, A. (1943b). Biological accumulators of aluminum.
Transactions of the Connecticut Academy of Arts and Sciences, 35 73–128.
Hutchinson, G. (1945). Aluminum in soils, plants, and animals. Soils Science, 60
29–40.
Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales. (2004). Informe
Anual sobre el Estado del Medio Ambiente y los Recursos Naturales Renovables
en Colombia. Bogotá, Colombia.
55
Jacquemard, J. (1998). Oil Palm. (The Tropical Agriculturalist), Macmillan
Education Ltd, in cooperation with CTA; (pp. 144). London, UK
Jalani, B., Rajanaidu, N., Ariffin, D. (1993). Perspectives for the XXI - Century: The
ideal oil palm and palm oil quality for the future. Jalani, B, X Conferencia
Internacional de Palma Aceitera; (pp. 15). Santa Marta, Colombia: Fedepalma,
Cenipalma y Burotrop.
Janos, D. (2007). Plant responsiveness to mycorrhizas differs from dependence
upon mycorrhizas. Mycorrhiza, 17(2) 75-91.
Johansen, A., Jakobsen, I., Jensen, E. (1992). Nitrogen transport and depletion of
soil nitrogen by external hyphae of VA mycorrhizas. Mycorrhizas in ecosystems,
3 8 5 -386.
Jourdan, C., Rey, H. (1997). Architecture and development of the oil-palm (Elaeis
guineensis Jacq.). Root system Plant and Soil,189 33–48.
Jourdan, C., Michaux-Ferriere, N., Perbal, G. (2000). Root system architecture and
gravitropism in the oil palm. Annals of Botany, 85 861–868.
Kochian, L., Hoekenga, O.,Pineros, M. (2004). How do plants tolerate acid soils?
Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Annual Review
of Plant Biology, 55 459-493.
Kochian, L.,Piñeros, M.,Hoekenga, O. (2005). The physiology, genetics and
molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity. Plant and Soil, 247
175-195.
56
Kottke,
I.,Beiter,
A.,Weiss,
(2003).Heterobasidiomycetes
M.,
form
Haug,
symbiotic
I.,Oberwinkler,
associations
F.,NebeL,
with
M.
hepatics:
Jungermanniales have sebacinoid mycobionts while Aneura pinguis (Metzgeriales)
is associated with a Tulasnel-la species. Mycological Research, 107(8) 957-968.
Klugh, K., Cumming, J. (2007). Variations in organic acid exudation and aluminum
resistance among arbuscular mycorrhizal species colonizing
Liriodendron
tulipifera. Tree Physiol. 27: 1103-1112.
León, B. O. (2005). Perspectivas del Mejoramiento Genético de la Palma Aceitera
en
Venezuela,
9.
Consultado
el
20
de
Noviembre
de
2011
www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n9/arti/leon_o/arti/leon_o.htm.
Levang, P., Sheil, D., Kanninen, M. (2008). Le palmier à huile. Dr Jekill pour
l'énergie, Mr Hyde pour la biodiversité. Liaison énergie
francophonie/UICN,
Special Congrès mondial de la nature (pp. 26-31). Indonesie, Malasie.
Lin, C., Kao, C. (2000). Effect of NaCl stress on H2O2 metabolism in rice leaves.
Plant Growth Regulation, 30 151-155.
Liu, J., Magalhaes, J., Shaff, J., Kochian, L. (2009). Aluminum activated citrate and
Malate transporters from the MATE and ALMT families function independently
to confer Arabidopsis aluminum tolerance. The Plant Journal, 57 389-399.
Marschner, H. (1991). Mechanism of adaptation of plant to acid soils.
Developments of Plant and Soil Science, 45 683-702.
Martin, H. (1967). Insecticide and Fungicide Handbook for crop protection issued
by British insecticide and Fungicide council. Blackwell Scientific Publication,
London.
57
Martínez, L. Gerardo., Sarria, A., Torres, L., Gabriel, A., Varón, F., Romero, A.,
Sánz, S., Jose, I. (2010). Avances en la investigación de Phytophthora palmivora,
el agente causal de la Pudrición del cogollo de la palma de aceite en Colombia.
Palmas, 31 (1): 55-63.
McCarthy, J. (2010). Processes of inclusion and adverse incorporation: oil palm
and agrarian change in Sumatra, Indonesia. The Journal of Peasant Studies
37(4):821–850.
McLaughlin, B., Wimmer, R. (1999). Calcium physiology and terrestrial ecosystem
processes. New Phytology, 142 373-435.
Meharg A., Cairney, J. (2000). Co-evolution of mycorrhizal symbionts and their
hosts to metal-contaminated environments. Advances in Ecological Research, 30
69–112.
Mertz, W. (1981). The essential trace elements. Science, 213 1332–1338.
Meunier, J., Ascon, J. (1972). Le schéma de selection du palmier a huile a l’ R
Oleagineux, 27 1–12.
Mielke,T.(2011) Global supply and demand outlook for palm and lauric oils−Trends
and future prospects, Presentation at MPOC POINTERS 2011. Internet
conference.Consultado: agosto 10 de 2012
http://www.pointers.org.my/report_details.php?id=46.
Motta, D.V.,Munévar, F.M., 2005. Response of oil palm seedlings to
mycorrhization.Palmas Journal 26, 11
Murphy, D. (2007). Future prospects for oil palm in the 21 century: Biological and
58
related Challenges. European Journal of Lipid Science and Technology, 109 29630.
Nadarajah, P. (1980). Species of endogonaceae and mycorrhizal association of
Elaeis guineensis and Theobroma cacao. Tropical mycorrhiza research, 232-237.
National Economic Advisory Council (NEAC). 2009. New Economic Model for
Malaysia,
Part
1,
(pp.
193).
Consultado
junio
27
de
2013
http://www.pmo.gov.my/dokumenattached/NEM_Report_I.pdf.
Oehl,F., Sieverding.E (2004).Pascispora, a new vesicular-arbuscular mycorrhizal
fungal genus in the Glomeromycetes Journal of Applied Botany and Food
Quality.78:72-82
Oehl,F.,Silva,G.A.,Sanchez,Castro.I.,Goto,BT,Maia.L.C.,Vieira HEE.,Barea,J.M.,
Sieverding,
E.,Palenzuela,J
(2011)
revision
of
Glomeromycetes
with
entrophosporoid and glomoid spore formation with three new genera. Mycotaxon
117:297-316
Panda, S.,Sahoo, L.,Katsuhara, M.,Matsumoto, H. (2013). Overexpression of
Alternative Oxidase Gene Confers Aluminum Tolerance by Altering the
Respiratory Capacity and the Response to Oxidative Stress in Tobacco Cells.
Molecular Biotechnology, 54 551-563.
Paterson, R. (2007). Ganoderma disease of oil palm-A white rot perspective
necessary for integrated control. Crop Protection, 26 1369-1376.
Peyronel, B. (1937). Le “Endogone” quasi produttrici di micorize endotrofiche nelle
Fanerogame alpestri. Nuovo Giordanel Botanico Italiano,44 584–586.
59
Phosri, C., Rodriguez, A.,Sanders, I. R.,Jeffries, P. (2010). The role of mycorrhizas
in more sustainable oil palm cultivation. Agriculture, Ecosystems and
Environment, 135 187-193.
Plenchette, C.,Furlan, V., Fortin, J. (1983a). Responses of endomycorrhizal plants
grown in calcined montmorillonite clay to different levels of soluble phosphorus. I.
Effect on growth and mycorrhizal development. Canadian Journal of Botany,
61(5: 1377-1383.
Purvis, C. (1956). The root system of the oil palm: Its distribution, morphology, and
anatomy. Journal of Oil Palm Research, 1 60–82.
Ramachandran, H. (2005). Biodiesel set to ignite palm oil’s prospects Press
Release for Business Times. National Economic Action Council, Malaysia.
Redecker, D., Kodner, R., Graham, L. (2000). Glomalean fungi from the
Ordovician.Science, 289 1920–21
Rillig, M., Ramsey, P., Morris, S., Paul, E. (2003). Glomalin, an arbuscularmycorrhizal fungal soil protein, responds to land-use change. Plant Soil, 253 293299.
Rincón-Zachary M (2010) A possible mechanism and sequence of events that
lead to the Al3+-induced [Ca2+]cyt transients and inhibition of root growth. Plant
Signaling & Behavior 5 (7): 881-884.
Rini, M. (2001). Effect of arbuscular mycorrhiza on oil palm seedling growth and
development of basal stem rot disease caused by Ganoderma boninense
(Doctoral dissertation, University Putra Malaysia).
60
Roundtable on Sustainable Palm Oil (RSPO). (2011). Indonesia: Benchmark for
Sustainable Oil Palm in Emerging Markets. Consultado mayo 16 de 2012http://www.rspo.org/?q=content/
Indonesia-benchmark-sustainable-palm-oil-
emerging-marke.
Ruer, P. (1967). Morphologie et anatomie du système radiculaire du palmier à
huile.Oléagineux, 22 595–599
Ryan, M.,Graham, J. (2002). Is there a role for arbuscular mycorrhizal fungi in
production agriculture? Plant Soil, 244 263-271.
Schachtman, D.,Reid, R.,Ayling, S. (1998). Phosphorus uptake by plants: from soil
to cell. Plant Physiology, 116 447-453.
Schu¨ßler ,A., Schwarzott, D., Walker C. (2001). A new fungal phylum, the
Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycological Research 105:
1413–1421.
Seguel, A., Cumming, J., Klugh-Stewart, K.,Cornejo, P., Borie, F. (2013). The role
of arbuscular mycorrhizas in decreasing aluminium phytotocity in acid soils: a
review. Mycorrhiza, 23 (3)167-83.
Selosse, MA.,Bauer, R.,Moyersoen, B. (2002). Basal hymenomycetes belonging
To the Sebacinaceae are ectomycorrhizal on temperate deciduous trees. New
Phytologist, 155 (1)183-195.
Sieverding, E.,Oehl,F (2006) Revisison of Entrophospora and description of
Kuklospora and Intraspora, two new genera in the arbuscular
mycorrhiza.Glomeromycetes.Journal of Applied Botany and Food Quality. 80:6981
61
Smith, G. (2006). Palm oil: deforestation diesel? Wren Media and the New
Agriculturalist.Available athttp://www.new-ag.info/06-6/focuson/focuson6.html
Smith, S., Read, D. (2008). Mycorrhizal symbiosis Cambridge, UK: Academic
Press, London.
Somers, E. (1961). The fungi toxicity of metals ions. Annals of Applied Biology, 49
246-253.
Song, H. (2005). Effects of VAM on host plant in the condition of drought stress
and
its Mechanisms. Electronic Journal of Biology, 1 (3) 44-48.
St John TV .1988 Prospects for application of vesicular-arbuscular mycorrhizae in
the culture of tropical palms. Adv Econ Bot 6:5055
Stürmer, S. (2012). A history of the taxonomy and systematics of arbuscular
mycorrhizal fungi belonging to the phylum Glomeromycota. Mycorrhiza, 22 247–
258.
Sundram, S. (2010). Growth effects by Arbuscular Mycorrhiza Fungi on Oil Palm.
(Elaeis gineensis Jacq) seedlings. Journal of Oil palm Research, 22 796-802.
Tobar, R., Azcón, R., Barea, J. (1994). Improved Nitrogen Uptake and Transport
from 15N- Labelled Nitrate by External Hyphae of Arbuscular Mycorrhiza Under
Water- Stressed Conditions. New Phytologist, 126 (1) 119-122.
Tomlinson, P. (1961). Anatomy of the monocotyledons. II. Palmae,Oxford
University Press, Oxford.
Torres, C., Girón, A., Rincón, V., Ruiz, J. (2013). Minianuario estadístico
62
Principales cifras de la agroindustria de la palma de aceite en Colombia, (pp.
54), mayo 2013. Fedepalma, Colombia.
Turner, P.D., 1981. Oil Palm Diseases and Disorders. Oxford Unviersity
Press, Oxford, pp: 88-110.
United States Department of Agriculture, USDA. (2013) Oils seeds: World Markets
and Trade. Approved by the World Agricultural, Outlook Board/USDA Circular
Series FOP 12- 13 -United States Department of agriculture Foreign Agricultural
Service.
Consultado
septiembre
11
de
2011-
http://apps.fas.usda.gov/psdonline/circulars/oilseeds.pdf.
Vera, G., Paszkowski, U. (2006). Contribution of the arbuscular mycorrhizal
symbiosis to heavy metal phytoremediation. Planta, 223 1115–1122.
Walker,C.,Schussler,A(2004) Nomenclatural clarifications and new taxa in the
Glomeromycota Mycological Research 108:979-982
Wang, B.,Qiu, Y. (2006). Phylogenetic distribution and evolution of mycorrhizas in
land plants. Mycorrhiza, 16 299–363.
Wehner, J., Antunes, M., Powel, R., Mazukatow, J., Rilling, C. (2010). Plant
pathogen protection by arbuscular mycorrhizas: A role for fungal diversity?
Pedobiologia, 53 (3) 197-201.
Widiastuti, H., Tahardi, J.S., (1993). Effect of vesicular-arbuscular mycorrhizal
inoculation on the growth and nutrient uptake of micropropagated oil palm. Menara
Perkebunan 61, 56–60.
63
Wright, S., Upadhyaya, A. (1996). Extraction of an abundant and unusual protein
from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi.
Soil Science,161 575-86.
Xia, J., Yamaji ,N., Kasai, T., Ma, J (2010) Plasma membrane-localized
transporter for aluminum in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences
107(43): 18381-18385.
Yamaji, N., Feng, C., Nagao, S., Yano, M., Sato, Y., Nagamura, Y., et al (2009) A
Zinc Finger Transcription Factor ART1 Regulates Multiple Genes Implicated en
Aluminum Tolerance in Rice. The Plant Cell21: 3339-3349.
Yamamoto, Y., Kobayashi, Y., Devi, S., Rikiishi, S.,Matsumoto, H. (2003).
Oxidative stress triggered by aluminum in plant roots. Plant and Soil, 255 239-243.
Yang, J., Li, Y., Zhang, Y., Zhang, S., Wu, Y., Wu, P., Zheng, S. (2008). Cell wall
polysaccharides are specifically involved in the exclusion of aluminum from the
rice root apex. Plant Physiology, 146 602-611.
64
CAPITULO II.
DIVERSIDAD, DENSIDAD Y COLONIZACION MICORRIZICA
NATIVA EN PALMA ACEITERA
(Elaeis guineensis Jacq.).
DENSITY, COLONIZATION
AND MYCORRHIZAL DIVERSITY
IN MONOCULTURE
OIL PALM(Eaeis guineensis Jacq.)
65
RESUMEN
La colonización, densidad y diversidad de hongos micorrizicos arbusculares
(HMA) asociados a cuatro zonas de cultivos de palma aceitera en Puerto WilchesColombia, fue estudiado durante la época seca y lluviosa durante un año. Para la
separación de esporas se usó la técnica de tamizado húmedo y centrifugación en
gradiente de sacarosa, la colonización micorrizica se evaluó en raíces coloreadas
con azul tripano mediante la técnica de interceptos. La identificación de especies
micorrizicos se realizó a partir de descripciones e identificación morfológica en
microscopia de luz y de barrido y extracción de DNA de esporas y su posterior
amplificación con PCR utilizando primers específicos. La densidad de esporas
estuvo entre 21,4 y 130,8 esporas/100g de suelo seco siendo el rango más bajo
en la época de lluvia y el más alto en época seca. La colonización nativa fue más
alta en la época lluviosa ±67%, en todos los sitios del estudio.El índice de riqueza
estuvo en el rango de 2,42-2,58, 12 especies micorrízicas y cuatro morfoespecies
de HMA fueron identificados en los 4 suelos palmeros de las zonas de estudio, de
acuerdo a los resultados las esporas aisladas pertenecen a cuatro familias:
Acaulosporaceae,
Gigasporaceae,
Glomeraceae,
Scutellosporaceae.La
distribución y diversidad de especies fue homogénea en las zonas de estudio. La
especie más frecuente fue A.excavata, independiente de la profundidad y la
época de muestreo.El pH de todos los suelos fue acido, con bajos contenidos de
nutrientes, sugiriendo que la palma aceitera pudiera ser altamente dependiente de
los HMA.
Palabras clave: diversidad- densidad de esporas, ecología- micorriza arbuscular
palma aceitera, suelos ácidos
*. Doctoranda en Ciencias-Universidad Nacional de Costa Rica-Correspondencia:
[email protected]
66
ABSTRACT
Studies of colonization, density and arbuscular mycorrhizal fungi diversity
(AMF) associated with four plantations of oil palm in Puerto W ilches-Colombia,
was studied during the dry and rainy seasons for a year. spore separation, was
carried by wet sieving technique and sucrose gradient centrifugation, Mycorrhizal
colonization was assessed with trypan blue staining, using the technique of
intercept. Identification of mycorrhizal species was conducted from descriptions
morphological identification in light and
scanning
microscopy. Spore DNA
extraction and subsequent PCR amplification was conducted from specific
primers. The spore density was between 21.4 and 130.8 spore/100 g dry soils
being the lowest rank in the rainy season and the highest in the dry season,
native colonization was higher in the rainy season ±67%. Shannon index richness
was in the range of 2.42-2.58, 12 mycorrhizal species and four morphospecies
were identified in 4 oil palm areas of study, According to the results, spores
isolated belong to four families: Acaulosporaceae, Gigasporaceae, Glomeraceae,
Scutellosporaceae.The distribution and diversity of species was homogeneous in
study area. The most common species was A.excavata, regardless of depth
and time of sampling. The pH of all soils was acidic, low nutrient content,
suggesting that oil palm could be highly dependent on the HMA
Key words –arbuscular mycorrhizal fungi, acid soil- diversity-ecology –oil
palm- spore density-
*. Doctoranda en Ciencias-Universidad Nacional de Costa Rica-Correspondencia:
[email protected]
67
1.0 INTRODUCCION
La Zona Central palmera de Colombia cuenta con 129 112 ha de palma aceitera
sembrada (Torres et al. 2013), ésta región presenta variaciones en topografía,
clima y suelos donde se establecen grandes extensiones de monocultivos que
han sustituido bosques tropicales, éstos suelos se caracterizan por ser ácidos,
con alto contenido de aluminio y de baja fertilidad (Guerra & Chacón 2012). Las
condiciones propias de los suelos del monocultivo de palma, sumadas al manejo
de fertilización podrían estar afectando la biodiversidad micorrizica, o por el
contrario estas mismas condiciones podrían favorecer a ciertas poblaciones de
hongos que logran a través del tiempo adaptarse y vivir.
Según Smith & Read (1997), los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) son
abundantes, ubicuos en casi todas las comunidades terrestres naturales y
agrícolas; forman asociaciones simbióticas obligadas con algo más del 80% de las
plantas vasculares, se ubican taxonómicamente en la división Glomeromycota y
son conocidos generalmente por sus esporas que se encuentran en los suelos.
Los tamaños de las esporas varían desde 40-800 µm, contienen cientos a miles
de núcleos y presentan paredes organizadas en capas (Becard & Pfeffer 1993).
Las esporas pueden formarse solitarias o en grupos o agregados llamados
esporocarpos (Gerdemann & Trappe 1974), sus hifas son aceptadas o
cenocíticas. Se conocen cerca de 200 especies, las cuales han sido
tradicionalmente identificadas a través de las características morfológicas y de las
paredes de las esporas.
De otro lado, los estudios de diversidad micorrizica inician desde el aislamiento
de las esporas del suelo y su posterior observación al microscopio, el cual es un
procedimiento de rutina para el reconocimiento de las diversas morfoespecies de
la división Glomeromycota. El estudio
68
de
la
forma,
tamaño,
color
y
principalmente la estructura de la pared de las esporas de HMA, son
características útiles para la identificación taxonómica, sin embargo el estudio de
las paredes por microscopia de luz es una tarea difícil, su interpretación depende
de varios factores tales como el tipo de microscopio e iluminación, medios de
montaje, y experiencia del observador en el reconocimiento de las diversas
características morfológicas especiales de cada género, sin embargo para lograr
una identificación exitosa se hace necesario contar con material biológico vivo y
saludable, no obstante la edad misma de la espora, la tasa de desarrollo y las
condiciones de crecimiento, podrían afectar la morfología de la paredes de las
esporas (Morton 1988), dificultando la identificación. Como un complemento de
los estudios morfológicos de la pared de HMA por microscopia de luz, se ha
utilizado la microscopia electrónica de transmisión (MET) y de barrido (MEB), sin
embargo las publicaciones en este campo son limitadas, y hoy día se realizan
más estudios de identificación a nivel molecular.
En general existe un limitado conocimiento del estado de la micorriza, de la
densidad y de la riqueza de especies nativas en suelos dedicados al monocultivo
de palma aceitera en Colombia. De acuerdo a Nadarajah (1980); Blal &
Gianinazzi-Pearson (1990), las raíces de palma aceitera de plantas establecidas
en campo son naturalmente colonizadas en gran medida por hongos micorrizicos,
sin embargo la distribución y densidad de esporas puede ser afectada por varios
factores; como las mismas propiedades físico-químicas del suelo, la profundidad
del suelo,Dalpé et al. (2000) y el manejo del cultivo (Alarcón &Cuenca, 2005)., a
este respecto Bolan et al.(1984), han considerado que el manejo inadecuado
desde vivero con la aplicación de grandes cantidades de fertilizantes químicos (P
y N) ha ido dejando relegada la actividad y función de la micorriza nativa, pues los
altos niveles de P inhiben la formación de esporas .
La hipótesis de que las micorrizas se adaptan a cada tipo de suelo,(acidez,
nutrientes) y que la densidad, colonización y riqueza de especies difiere entre los
69
diversos sitios o zonas de estudio, de acuerdo a las condiciones del suelo, incluso
de la época y profundidad del muestreo, sirvieron para llevar a cabo este estudio
del estado de la simbiosis en monocultivos de palma aceitera de 3-5 años de
edad en cuatro zonas de
la región palmera de Puerto Wilches-Colombia,
durante el periodo seco y lluvioso del año 2012.
70
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS
Descripción del área de estudio: Región del municipio de Puerto WilchesColombia, ubicado sobre la margen derecha del rio Magdalena 07o20’88’’N y
73o54’22’’W a una altura de 80 msnm, con precipitación acumulada anual de
2600 mm, temperaturas promedia mínima de 27,5 oC y máxima de 39oC y un
brillo solar acumulado de 2400 h sol/año. Las cuatro zonas palmeras de
estudio fueron: Bucarelia, Brisas, Palmas de Puerto Wilches, Monterrey (Fig.1.).
2.1 MUESTREO DE SUELOS Y RAÍCES PARA ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO,
COLONIZACIÓN, DENSIDAD Y DIVERSIDAD DE ESPORAS
En cada una de las cuatro zonas palmeras se escogieron lotes en producción de
palma de edades entre 3 a 5 años de siembra. El muestreo se realizó durante
dos épocas del año: periodo seco y período de lluvias. Las muestras de suelo y
raíces se tomaron en el área de crecimiento radical (proyección de la copa sobre
el suelo) y en la parte media tomada desde el tronco de la planta hasta una
distancia de 30 cm y a dos profundidades; 10 y 20 cm respectivamente.
Figura 1. Mapa de las cuatro zonas palmeras (región central-Puerto WilchesColombia.Fuente: autor
71
A. Mapa del Departamento de Santander-Colombia B. Ubicación del municipio de Puerto Wilches
(recuadro) C.Ubicación geográfica de las cuatro zonas palmeras: Las Brisas, Monterrey, Palmeras
de Puerto Wilches y Bucarelia donde se recolectaron las muestras para el estudio.
2.2 TAMAÑO DE MUESTRA
Las muestras compuestas del suelo de cada zona palmera resulto de la
combinación de 25 submuestras de 200g, en cada una de las profundidades
estimadas para los estudios. Las muestras compuestas de los suelos nativos de
cada zona palmera, fueron consideradas para el análisis de densidad de esporas,
frecuencia de morfoespecies y diversidad micorrizica. Se realizaron al menos 20
tamizajes de cada uno de los 4 suelos de la
zona de estudio, en cada época
climática y a las dos profundidades consideradas, utilizando una serie de
tamices con apertura de malla de 400 µm, 250 µm, 150 µm, 90 µm, y 45 µm para
separar las esporas de HMA para los estudios. Para los est udi os de
colonización micorrí zica se consideraron un total de 1000g de raíces para
cada zona palmera y en cada periodo de muestreo, de esta se tomaron
submuestras al azar representadas por al menos 60 segmentos de raíces, de cada
zona de estudio para evaluar el porcentaje de colonización.
Para la identificación de especies de HMA, fue necesario propagar los suelos de
cada zona palmera, para obtener esporas en diferentes estadios de maduración,
para el reconocimiento de sus características morfológicas. Los suelos nativos se
mezclaron con arena estéril en la proporción 1:1 (w/w),se llevaron a potes de 30
cm de diámetro y de capacidad 1000 g de suelo, un total de 12 potes por suelo
fueron mantenidos durante 5 meses, utilizando Brachiaria decumbens-Staps y
Manihot esculenta-Cranzt como plantas hospederas, bajo condiciones de
invernadero. Los potes fueron regados diariamente durante los primeros quince
días, posteriormente se realizó cada dos o tres días de acuerdo a las condiciones
72
climáticas, en los últimos dos meses el periodo de riego se realizó cada ocho
días.
La fertilización se realizó a los quince días de iniciados los cultivos y
posteriormente las plantas solo fueron fertilizadas cuando se presentaron
deficiencias, con 100 ml de una solución nutritiva de Hoagland compuesta por:
NO3 (1,0 mM), NH4 (0,2mM), K (0,60 mM), Ca (0,50 mM), Mg (0,20 mM), SO4
(0,15 mM),H2PO4 (15 mM), Fe (20 mM), B (20 mM), Mn (4,5 mM), Zn (0,35mM),
Cu (0,16 mM), y Mo (0,06 mM). El pH del riego para todos los suelos, se ajustó a
4,5 con solución de HCL 0,1 N. En la última semana se suspendio el riego, el
o
suelo de cada zona palmera fue almacenado a 4 C hasta el análisis de
identificación de esporas. Los estudios se llevaron a cabo en el invernadero y
Laboratorio de Biotecnología Agroambiental-LIIBAAM de la Universidad de
Santander
2.3 ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DEL SUELO
El análisis físico de la clase textural se realizó por el método de Bouyocous, el
análisis de pH de cada uno de los suelos se midió potencio métricamente con un
electrodo de vidrio en una suspensión suelo: agua en relación suelo, disolución
1:2:5, el contenido de Nitrógeno por el método de Kjeldalh, la determinación de
aluminio intercambiable mediante análisis volumétrico utilizando KCl 1N, según
NTC 5263 y espectrofotometría de absorción atómica, (Espectrofotómetro, AA,
Unicom 969), los análisis de cationes intercambiables se realizaron mediante
absorción atómica, en el laboratorio de suelos y consultas industriales de la
Universidad Industrial de Santander de acuerdo a los métodos estándar y a la
norma técnica Colombiana(NTC).1
1
Norma Técnica Colombiana 5263.Calidad de suelo. Determinación de la acidez intercambiable ICONTEC. Apartado
14237 Bogotá DC.
73
2.4 ANÁLISIS DE LA DENSIDAD Y COLONIZACIÓN NATIVA DE HONGOS
MICORRIZICOS ARBUSCULARES EN LA ZONA DE ESTUDIO
Extracción de esporas HMA para evaluar densidad: Las esporas fueron
extraídas por el método de tamizaje húmedo y centrifugación en solución
saturada de azúcar (Brundrett et al.1996), utilizando 100g de suelo seco, un
promedio de al menos 20 tamizajes de suelo por cada zona de estudio fue
considerado en cada época (lluvia o tiempo seco). Una vez separadas las esporas
por tamaño de malla, se cuantificó la densidad bajo un microscopio compuesto,
marca Nikon modelo SMZ445. El criterio para cuantificar la densidad de esporas
nativas de HMA de cada suelo se realizó así, muy bajos: < 10 espora / 100 g de
suelo seco, bajos: 10-100 esporas/100 g de suelo seco, medios 100-200 esporas
/g de suelo seco y altos > 200 esporas/100g de suelo seco.
2.5 PORCENTAJE DE COLONIZACIÓN MICORRIZICA NATIVA
Las raíces fueron limpiadas mecánicamente del suelo y se llevaron a bolsas
plásticas conteniendo 60% de etanol en agua, s e c o r t a r o n a l a z a r a l
menos
60segmentos
de
raíces desde 0,657 mm hasta 3,36mm de
diámetro y de 1,0 cm de longitud medidos desde el ápice al punto de corte, para
cada muestra rotulada de la zona de estudio, para visualizar las estructuras de
la simbiosis en las raíces, estas fueron coloreadas utilizando el protocolo de
tinción con azul tripano al 0,05% descrito por Brundrett et al. (1996) modificando
los tiempos de clarificación de las raíces. El porcentaje de colonización
micorrizíca se evaluó usando el método de interceptos (Brundrett et al.1996), la
lectura se efectuó bajo un microscopio compuesto a 50X. En el material de raíces
analizado, se encontró micelio de endófitos negros septados, sin embargo su
cuantificación no fue estimada en este estudio.
2.6 IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE ESPORAS DE HMA
74
Las esporas fueron separadas por tamaño de malla de tamiz usando la técnica
de tamizado húmedo y centrifugación en gradiente de sacarosa (Brundrett et
al.1996). y se transfirieron a placas de Petri, donde fueron separadas por
grupos semejantes en tamaño y color, para su identificación y posterior análisis de
frecuencias. Se realizaron al menos 20 tamizajes para cada tipo de suelo. Un
promedio de esporas intactas y rotas fueron montadas en láminas de vidrio en
una mezcla de alcohol poli vinílico-ácido láctico –glicerina (PVL) y el reactivo de
Melzer en PVLG, en la proporción 1:1, las láminas se dejaron en preparaciones
permanentes para observación microscópica a 25-1200x. Las características
fenotípicas como tamaño, color, número de paredes, características de la pared
externa, formación de esporocarpos,conexión hifal, estructuras de germinación,
hifa suspensora y reacción a la tinción de Melzer de las esporas micorrízicas,
fueron consideradas de acuerdo a las descripciones originales de Shenck & Pérez
(1990), Morton,(1986-1995)- Morton,JB y Benny (1990),Colección internacional de
cultivos
de
hongos
micorrizicos
arbusculares-INVAM(http:www.invam).
Se
realizaron preparaciones permanentes de esporas para microscopia de luz
utilizando un microscopio fotónico de alta resolución Nikon ® 80i eclipse, equipado
con contraste diferencial de interferencia (DIC). Las fotografías se obtuvieron con
una cámara digital Nikon® DS-.Para los estudios morfológicos por microscopia
electrónico de barrido (MEB), las esporas fueron secadas utilizando alcohol
etílico al 70%, sometidas a un ciclo de ultrasonido y dos o tres ciclos adicionales
de centrifugación con la subsecuente resuspensión en etanol, después fueron
cubiertas con oro, y posteriormente las muestras fueron examinadas en un
microscopio JEOL-JSM-6490LV(Universidad del Valle-Colombia).Las esporas,
láminas y fotografías correspondientes se registraron en la colección de hongos
micorrizicos arbusculares de la región del Magdalena medio Santandereano
que se lleva a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Agroambiental de la
Universidad de Santander (LIIBAAM_UDES), Colombia.
75
2.7ANÁLISIS MOLECULAR DE HMA
Para la extracción de ADN, se consideró el tamaño de las esporas así: se
seleccionó una única espora de un morfotipo cuando su tamaño fue 150µm o
mayor, 4 esporas para tamaños entre 80-150 µm y 6 esporas para tamaños
inferiores a 80 µm, posteriormente la o las esporas se llevaron a tubos plásticos
de capacidad 0,2 ml, se lavaron tres veces con agua destilada estéril ,se retiró el
agua totalmente con ayuda de una pipeta de 20 µm, posteriormente se adiciono 1
µl de la solución extractora de ADN Prepman Ultra Reagent (Applied Biosystems)
y con ayuda de un pistilo se maceraron bajo un microscopio estereoscopio, para
asegurar la visualización y extracción del ADN, seguidamente los tubos se
llevaron a centrifugación a 15.000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante fue
colectado en un tubo estéril de capacidad 0,5 ml y se diluyo (1:10) usando 10
mM Tris pH 8.0 de acuerdo al protocolo sugerido por Seguin Sylvie (comunicación
personal, junio 15-2011).
Los fragmentos parciales del ADNr-18S de los hongos micorrizicos arbusculares
fueron amplificados por nested PCR (Van Tuinen et al. 1998), en un termociclador
automático (PTC-200 Peltier Thermal Cycler, MJ Research, INC.USA). La primera
PCR fue realizada utilizando dos pares de cebadores especifico y universal
así:AML1 :(5'-AAC-TTT-CGA-TGG-TAG-GAT-AGA-3') NS4 (5'-TTC-CAT-CAATTC-CTT-TAA-G-3'), por 30 ciclos (1 ciclo a:95oC por 3 minutos, a 45oC por 1
min, a 72o C por 1 min 30 seg, 28 ciclos a 95oC,por 30 seg, a 45oC por 1 min, a
72o C por 1 min 30 seg, 1 ciclo a 95 oC 30 seg, a 45oC por 1 min ,a 72o C por
10 min .El ADN amplificado fue separado utilizando un gel de agarosa al 1%, y
bromuro de etidio como colorante, las bandas fueron visualizadas en luz UV
bajo un tras iluminador (MiniBISPro DNR 17 mm). Los productos de la primera
PCR fueron utilizados como plantilla, para la segunda amplificación con cebadores
específicos de hongos micorrízicos, la cual fue realizada con algunas
76
modificaciones del protocolo propuesto por Lee et.al (2006): AML1(5´-AAC-TTTCGA-TGG-TAG-GAT-AGA-3´) y AML2 (5´-CCA-AAC ACT-TTG-GTT-TCC-3´) y
los cebadores Glo2A(CGT-AAC-AAG-GTT-TCC-GTA GG) y GLO2R(GCG-GGTACT-CCT-ACC-TGA-TT), para cada uno de las parejas de cebadores se corrieron
o
30 ciclos así: Primer ciclo:(a 95 C, 3 minutos; 47oC por 1 min 30 seg; 72oC por 1
min 30 seg), 28 ciclos (a 95oC, 40 seg;47oC por 1 min 30 seg; 72oC por 1 min
30 seg );un ciclo Final:(a 95oC por 40 seg;47oC por 1 min 30 seg;72o C por 8
minutos) Los productos de la segunda PCR fueron enviados y contratados para
secuenciación a un laboratorio prestador de servicios en Corea.Las secuencias
más similares para cada secuencia de esporas de HMA se obtuvieron del
GenBank a través del sistema BLAST en el Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI) y utilizado para la identificación molecular de cada espora
fúngica.
2.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La Biodiversidad de especies fue evaluada el índice de Shannon Winner y el
Índice de diversidad de Simpson. La densidad de esporas fue analizada por
métodos estadísticos descriptivos comparando promedios, y graficando los
respectivos datos con sus promedios y errores estándar. Para la colonización
micorrizica los datos fueron analizados utilizando análisis de varianza (ANOVA) de
una vía y los resultados de las distintas factores fueron comparadas utilizando un
valor de p=0,05. El análisis estadístico se llevó a cabo con el paquete SPSS
versión 20. –
77
3.0 RESULTADOS
3.1 ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DE SUELOS
Los resultados de los análisis físico-químicos de los suelos de las zonas de estudio
se muestran en el Cuadro 1
Cuadro1. Parámetros Fisicoquímicos de suelos de palma –
(Puerto-Wilches-Colombia).
Suelos
pH
1:1
H2O
MO
Brisas
4,3
6,3
112
0,56
0,45
0,35
0,67
2,5
Monterey
4,6
2,1
10,0
0,96
0,33
0,07
0,04
0,6
F-A
4,9
6,1
25,2
0,43
0,33
0,13
0,26
1,4
F-A
4,5
1,9
61,6
0,40
0,54
0,07
0,27
1,8
F-A
g Kg
P
-1
Ca
Mg
p.p.m.
Na
K
Al
meq/100 g
Textura
B*
F
Palmeras
de Puerto
Wilches
Bucarelia
Los valores representan la media de 4 repeticiones. Textura B= textura Bouyoucos , F=francoFA=franco-arenoso.
Los resultados de los análisis físico-químicos de los suelos de las zonas de
estudio de la región de Puerto Wilches (Cuadro 1), se caracterizaron en general
por ser ácidos (promedio pH= 4,5), de textura franco-arenosa, con niveles de
saturación de aluminio en la solución del suelo en concentración media y alto, el
valor de la materia orgánica vario desde muy baja a un valor medio: 1,9-6,3g/kg,
los valores para el contenido de fósforo varió desde bajo a alto, rango 10-112
ppm, los valores de magnesio fueron altos en los 4 suelos.
78
3.2 DENSIDAD DE ESPORAS
Los valores obtenidos representan la media del número de muestras analizadas
para cada suelo, en la época y profundidad determinada, en la época seca se
observó mayor densidad de esporas (Fig.2).
Figura 2. Densidad nativa de hongos micorrizicos arbusculares en suelos
palmeros (Puerto Wilches-Colombia).
S=periodo seco, L=periodo lluvioso. Zonas de estudio: BR=Brisas, MN=Monterrey, WI=Palmeras
de Puerto Wilches, BU=Bucarelia, Densidad 10= densidad de esporas a profundidad 10 cm del
suelo, Densidad 20= densidad de esporas a profundidad 20 cm del suelo
El rango en las 4 zonas de estudio estuvo entre 91-130 esporas/100g de suelo
seco, contrariamente en la época de lluvia, la densidad de esporas fue menor y
estuvo en el rango d e 21,4 -87,4 esporas /100g de suelo. En el periodo de
lluvias el número de esporas en las cuatro zonas de muestreo se vio afectada por
79
la profundidad a la que se tomaron las muestras, así el número de esporas a 20
cm, disminuyó hasta un promedio de ± 49% en todos los 4 suelos en comparación
con las muestras tomadas a 10 cm, como se puede observar en la Figura 2 y
Cuadro 2.
Cuadro
2.
Densidad
de
esporas/100
g
de
suelo
seco
de
micorriza
arbuscular(n=20)±error estándar(ee) en suelos palmeros, a dos profundidades en
época seca(S) y lluviosa(L).
SUELO
ÉPOCA
PROFUNDIDAD
10 CM
Brisas
S
D
106,4
Monterey
S
91,5
± 4,1
95,1
± 3,9
*P.de Puerto Wilches
S
122,1
± 5,6
122,0
± 8,4
Bucarelia
S
115,4
± 6,5
130,8
± 7,8
Brisas
L
57,6
± 4,6
34,4
± 2,8
L
52,0
± 3,0
21,4
± 2,3
L
84,5
± 3,0
35,0
± 3,3
Monterey
de Puerto
*P. de Puerto Wilches
ee
± 4,0
PROFUNDIDAD
20 CM
ee
D
109,1
± 7,1
Bucarelia
L
87,4
± 4,2
46,8
± 3,5
Puerto
Los valores de las densidades representan el promedio de veinte tamizados de
Puertopara cada zona y en cada periodo S=seco, L=lluvioso. ee=
suelos analizadas
error estándar de la media de densidad D=Densidad número de esporas/100g de
suelo seco. *Palmeras de Puerto Wilches.
3.3 COLONIZACIÓN MICORRÍZICA
La simbiosis micorrízica nativa de las zonas de estudio, estuvo en un rango
variable (43,6%-66,4%) durante las dos épocas de muestreos y análisis
80
(Fig.3). Siendo en general la época lluviosa la que favoreció la mayor
colonización micorrizica en todas las zonas de estudio a diferencia de la
densidad de esporas que no estuvo favorecida por la lluvia. Los análisis de
varianza muestraron
que hubo diferencias significativas, (p< 0.01) en la
colonización micorrizica de acuerdo a la época de muestreo en cada una de las
zonas de estudio ( Figura 3 y Cuadro 3), excepto en la zona de Monterrey donde
los porcentajes de colonización micorrizica en las dos épocas fueron muy
similares, (p>0,01).
Figura 3. Colonización micorrizica nativa en 4 zonas de palma, en época
seca y lluviosa (Puerto Wilches-Colombia),(barras angostas son errores estándar)
Cuadro 3. Media de colonización micorrízica (n=50)±error estándar(ee) de suelos
de palma, en época seca y lluviosa (Puerto Wilches-Colombia).
SUELOS
ÉPOCA SECA
media
ee
b
Brisas
50,7
Monterrey
56,1
ÉPOCA LLUVIA
media
ee
2,31
61,3
a
1,79
1,68
58,6
2,94
81
Wilches
59,3
b
1,81
66,1
a
1,52
Bucarelia
43,6
b
1,58
66,4
a
2,00
*Letras diferentes en una misma fila indican diferencias (p<0,01) entre épocas para un mismo
suelo.
3.4 IDENTIFICACIÓN DE HMA-ÍNDICES DE DIVERSIDAD Y FRECUENCIA
Doce especies y cuatro morfoespecies de HMA de la división Glomeromycota,
clase Glomeromicetes, fueron identificados en los 4 suelos palmeros de las zonas
de estudio, la identificación se realizó a partir de las descripciones de las esporas
en microscopia de luz y de barrido, así como también por análisis de las
secuencias de ADNr, obtenidas de la base de datos del Centro Nacional para la
información Biotecnológica, de sus siglas en inglés (NCBI), utilizando un programa
informático de alineamiento de secuencias BLAST de las siglas del inglés(Basic
Local Alignment Search Tool). El análisis molecular, permitió la identificación de
cinco especies: Acaulospora delicata, Acaulospora denticulata, Funneliformis
mosseae, Glomus geosporum, Glomus etunicatum, se muestran en el Cuadro 4,
junto con la identificaciones morfológica de las demás especies micorrízicas (La
clasificación se realizó de acuerdo a Oehl et al. (2011c).
82
Cuadro 4.Especies micorrízicas identificadas mediante biología molecular(I.M.O)
y morfológicamente (I.M.R) en suelos de palma aceitera de la región de PuertoWilches (Colombia).
CÓDIGO
Adlp01
ORDEN
FAMILIA
Diversisporales Acaulosporacea
Adtp02
Alcp03
Alexp04
Aspp05
Fms01
Glomerales
Glomeraceae
Ggp01
Gmgp02
Getp03
Gspp04
Gitp05
Gmhp06
Spcnp01
Scrbp01
Gpspp01
Stspp01
Gigasporales
Gigasporacea
Scutellosporacea
ESPECIE
%S.S
C.
I.M.O
/I.M.R
I.M.O
I.M.R
SI
SI
A.delicata
Acaulospora
delicata
Acaulospora
denticulata
Acaulospora
lacunosa
Acaulospora
excavata
Acaulospora
spp
Funneliformis
mosseae
Glomus
geosporum
Glomus
magnicaule
Glomus
etunicatum
Glomus spp
753/762
(98%)
703/711
(98%)
NA
SI
SI
A.denticulata
NO
-
NA
NO
NA
NO
635/650
(97%)
681/689
(99%)
NA
SI
Acaulospora
Lacunosa
Acaulospora
excavata
Acaulospora
spp
SI
F.mosseae
SI
SI
G.geosporum
NO
-
698/719
(97%)
NA
NO
Rhizophagus
intraradices
Rhizophagus
manihotis
NA
NO
NA
NO
Glomus
geosporum
Glomus
etunicatum
Glomus
spp
Rhizophagus
intraradices
Rhizophagus
manihotis
Septoglomus
constrictum
Sclerocystis
rubiformis
Gigaspora spp
NA
NO
NA
NO
NA
NO
Scutellospora
spp
NA
NO
SI
Septoglomus
constrictum
Sclerocystis
rubiformis
Gigaspora
spp
Scutellospora
spp
-
G.etunicatum
-
-
%S.S=Porcentaje de similitud en la secuencia de acuerdo a la base de datos ,
C.I.M.O/ I.M.R=Concordancia en La identificación molecular y la identificación morfológica,NA: no
aplica ,especies que no se Identificaron por análisis de ADN
De acuerdo a los resultados morfológicos y moleculares las esporas aisladas
pertenecen a cuatro familias: Acaulosporaceae, Gigasporaceae, Glomeraceae,
Scutellosporaceae.
83
Descripción morfológica
Acaulospora
delicata
(a-c):
esporas en diversas fases de
maduración
a:
espora
joven
mostrando el sáculo esporífero
(s.s),barra=25µm.b-c:esporas
maduras; barra=40 µm. c: paredes
de la espora:, swl1: primera capa
de la espora, iw1: pared interna
número uno, iw2, pared interna dos,
cx: cicatriz remanente de la
conexión entre la pared de la
espora y la pared de la hifa
parental. Acaulospora denticulata
(d)- ornamentación de la pared de
la espora (s.w) barra =30 μmAcaulospora lacunosa (e) barra
=50 μm. Acaulospora excavata (f):
espora con grandes y profundas
depresiones globosas, barra= 20
μm,
pared
externa
laminada
amarilla pálida (sw), no reacciona
con colorante de Melzer, i.w: pared
interna. Septoglomus constrictum
(g-h) g:barra=25 μm, h: bar=50 la
flecha muestra la hifa subtendida
(s.h), hifa marcadamente constricta
en la base de la espora h: espora
con dos capas (swl1 y swl2)
Glomus geosporum (i)barra=50µm
espora con tres capas (swL1-3),
Rhizophagus
manihothis
(j)
barra=50μm,
imagen
superior
mostrando la pared de la espora:
tres
capas:
swl1,swl2,swl3;
Acaulospora spp (k): espora rota,
flecha mostrando contenido lipídico
barra=35μm.Glomus
spp
(l),
barra=30 μm.
Figura 4 Descripción morfológica de
especies micorrízicas nativas de suelos
palmeros (Zona central-Puerto WilchesColombia).
84
Las imágenes de las especies y sus descripciones se muestran en las Figs.4 y 5.
Las especies identificadas utilizando descripciones morfológicas y análisis
moleculares fueron: (a) Acaulospora delicata (C. Walker, C.M. Pfeiff. & Bloss), (b)
Acaulospora denticulata (Sieverd. & S. Toro), (c) Acaulospora excavata (Ingleby &
Walker), (d) Acaulospora lacunosa (J.B. Morton), (e) Funneliformis mosseae(T.H.
Nicolson & Gerd.- C.Walker & A. Schüßler) Sinónimo:Glomus mosseae Gerd. &
Trappe, (f) Glomus etunicatum (Becker & Gerdeman)(g) Glomus geosporum
(Nicol. & Gerd.), (h) Glomus magnicaule (I.R.Hall), (i) Rhizophagus intraradices
Basiónimo: Glomus intraradices (N.C. Schenck & G.S. Sm). (j)Rhizopagus
manihotis: Basiónimo Glomus manihotis (R.H. Howeler, Sieverd.
& N.C.
Schenck), ( k) Septoglomus c o n s t r i c t u m S i n ó n i m o : Glomus constrictum
( Trappe, Sieverding. G . A . Silva & O e h l , C . Walker), ( l) Sclerocystis rubiformis
Sinónimo: Glomus rubiforme (R.T.Almeida, Ger. &Trappe, N.C Schenck). Otro
grupo de cuatro morfoespecies se identificaron como: Acaulospora spp, Glomus
spp, Gigaspora spp y Scutellospora spp,
85
Rhizophagus
intraradices:
(a-c); a: se muestran las dos
capas en una espora madura
con PVL (swL2-3),la capa
swl1, no se encontró. (s.h)=:
hifa subtendida b: espora con
reactivo de Melzer. a-b:
barra=25μm (c): grupo de
esporas
jóvenes
de
R.
intraradices,barra=10μm.
Funneliformis mosseae-(d-e)
d: espora subglobosa con tres
capas (swl1, swl2, swl3) e: la
flecha
muestra
la
hifa
subtendida (sh) en forma de
embudo (barra= 40 μm).
Glomus magnicaule (f) se
muestra la hifa subtendida
(sh), barra=50μm.
Sclerocystis rubiformis (g-h),
espora madura, (barra=35μm)s.h: hifa subtendida,
(h)Clamidosporas arregladas
radialmente en esporocarpos
barra=40µm
Scutellospora
spp (i): Hifa subtendida (s.h)
mostrando la base bulbosa
(barra 15 μm).
Figura 5 Descripción morfológica de especies micorrízicas nativas de suelos
palmeros (Zona central palmera, Puerto Wilches- Colombia
Microscopia electrónica de Barrido (MEB): En las Figs. 6 y 7, se muestran
las imágenes obtenidas en MEB y detalles de la pared externa, que fueron útiles
para complementar la identificación de especies.
86
Acaulospora excavata:
(a-b) a espora madura,
mostrando la
ornamentación típica de
la pared externa, b:
detalles de la
ornamentación de la
superficie externa por
pozos circulares y
subcirculares, barra=5µm.
Septoglomus
constrictum(c-d):
esporas viejas del suelo
que han perdido toda su
capa externa.
Glomus geosporum (ef)-e. espora joven globosa
mostrando la cubierta
entera de la capa externa
f. detalles de la
ornamentación de la capa
externa, note su
superficie erosionada.
Figura 6
Ornamentación de la pared externa de
hongos micorrízicos arbusculares (Suelos palmeros Colombianos).
87
Funneliformis mosseae (ac) a: espora madura-vieja
mostrando la hifa subtendida
(flecha), b: espora rota
mostrando los detalles del
grosor de la pared y la
presencia de bacterias en su
interior (flecha). c: peridium
o manto alrededor de las
esporas (flecha).
Rhizophagus manihothis
(d-f): d. espora mostrando la
hifa subtendida, e. se
muestra la continuidad de la
pared externa de la espora a
lo largo del cuerpo de la hifa
(flecha), f .detalles de
ornamentación de la pared
externa de la espora, en la
parte central se muestra un
hueco,
tal
vez
como
producto del parasitismo
debido a la degradación de
la espora
Figura 7 Ornamentación de la pared externa de hongos micorrizicos arbusculares
(Suelos palmeros Colombianos).
3.5 DIVERSIDAD DE ESPECIES
88
La diversidad de especies hallada en los suelos se calculó de acuerdo al índice
de Shannon Weaver, el rango estuvo entre 2,42-2,58. En la época seca, este
rango fue muy similar en las dos profundidades sin diferencias significativas; a
diferencia de la época lluviosa donde el rango estuvo más bajo entre 1,77-2,54.m.
(Cuadro 5).
Cuadro 5 Diversidad de especies micorrízicas arbusculares en suelos palmeros
Puerto Wilches-Colombia.
Índice
Zona
Brisas
Shannon
Simpson
Época Seca
Profundidad
20 cm
10 cm
2,58
2,58
Época Lluviosa
Profundidad
10 cm
20 cm
2,54
2,14
Monterrey
2,42
2,43
2,22
2,01
Wilches
2,58
2,55
2,46
2,19
Bucarelia
2,51
2,45
2,35
1,77
Brisas
0,935
0,937
0,939
0,912
Monterrey
0,922
0,930
0,905
0,890
Wilches
0,936
0,934
0,934
0,924
Bucarelia
0,930
0,927
0,925
0,857
La diversidad de especies en todos los suelos fue alta, y homogénea en las
zonas de estudio; independiente de la época y profundidad de muestreo,
(Cuadro 5), a diferencia del suelo de Bucarelia donde se observó que los valores
de riqueza (Shannon) y diversidad (Simpson) fueron más bajos, e n l a é p o c a
lluviosa
con relación a las demás zonas palmeras. La especie más
frecuente en todos los tipos de suelos, independiente de la época y profundidad
del muestreo, fue Acaulospora excavata. Cuadro 6-(especie, N0.4), con un valor
de frecuencia relativa =0,33.
3.6 FRECUENCIA DE ESPECIES
89
Cuadro 6. Frecuencia relativa de especies micorrízicas en suelos palmeros a dos
profundidades (10 y 20 cm) y en época seca y lluviosa.Frecuencia Máxima (Máx.)
y Frecuencia Mínima(Mín.) de una especie.
.Las especies más frecuentes para cada uno de los cuatro suelos (BU: Bucarelia, BR: Brisas, Mn:
Monterrey, Wi: Palmeras de Puerto Wilches), aisladas por época y profundidad de muestreo, se indican
en la parte inferior de cada una de las columnas, en sentido vertical.(-)=ausencia de la especie HMA
según época, profundidad de muestreo y tipo de suelo.
Los resultados mostraron que el número de especies de HMA estuvo influenciado
por la época y profundidad del muestreo en el suelo como se observa en las
Figuras 8 y 9, persistiendo las especies de Acaulospora en el periodo lluvioso y
seco en todos los suelos.
90
Figura 8. Frecuencia relativa de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en
cuatro zonas palmeras en época seca (A) a 10 cm y (B) a 20 cm del suelo.
Hongos micorrizicos arbusculares (HMA). (1) A.delicata,(2) A.denticulata, (3) A.lacunosa, (4)
A.excavata, (5) Acaulospora spp,(6) F.mosseae, (7) G.geosporum (8) G.magnicaule,(9)
G.etunicatum, (10)Glomus spp,(11) G.intraradices,(12) R.manihotis, (13)Septoglomus constrictum
(14) Sclerocystis rubiformis, (15) Scutellospora spp,(16) Gigaspora spp.
En el período lluvioso la
frecuencia de especies se vio más afectada a la
profundidad de 20 cm, no se encontraron: Acaulospora spp, G.magnicaule,
G.etunicatum, Scutellospora spp y Gigaspora spp, como se aprecia en la Figura 7.
91
Figura 9. Frecuencia relativa de hongos micorrízicos arbusculares(HMA) en
cuatro zonas palmeras en época lluviosa (A) a 10 cm y (B) a 20 cm del suelo.
Hongos
micorrizicos
,(4)A.excavata,
arbusculares(HMA).(1)
(5)Acaulospora
A.delicata,(2)A.denticulata,
spp,(6)F.mosseae,(7)G.geosporum
3)A.lacunosa,
8)G.magnicaule,(9)
G.etunicatum, (10)Glomus spp,(11) G.intraradices,(12) G.manihotis, (13)Septoglomus constrictum
(14) Sclerocystis rubiformis, (15) Scutellospora spp,(16) Gigaspora spp.
92
4. DISCUSIÓN
4.1SUELOS
Los resultados en este trabajo coinciden con el trabajo de Garzón et al. (2006),
ellos describieron los suelos de la región central palmera de Colombia como
fuertemente ácidos y con valores de pH iguales o por debajo de 4,5 unidades,
predominando en mayor extensión inceptisoles.
4.2 DENSIDAD, RIQUEZA Y FRECUENCIA DE ESPORAS DE HMA
En general el periodo seco favoreció la mayor densidad de esporas de hongos
micorrízicos arbusculares (HMA), a las dos profundidades de muestreo (10 y 20
cm respectivamente), el rango estuvo entre 91-130 esporas/100g de suelo seco,
contrariamente en la época de lluvia, la densidad de esporas fue menor y estuvo
en el rango d e 21,4 -87,4 esporas /100g de suelo, como se puede observar en
la Figura 2 y Cuadro 2, resultados similares fueron encontrados por Birhane et al.
(2010), en suelos cultivados con Boswellia papyrifera, ellos hallaron la mayor
densidad de esporas de HMA en el periodo seco (p < 0.001), en todos los sitios de
estudio. En general el bajo número de esporas en las zonas de estudio, también
podrían estar asociadas a diversos factores; como
las condiciones físico-
químicas del suelo y la práctica del mismo monocultivo, a este respecto Johnson
et al.(1992), consideraron que los monocultivos alteran la distribución y
composición de las comunidades microbianas de la micorrizósfera y Sieverding
(1991), encontró que en agroecosistemas con monocultivos, la labranza
convencional , la alta aplicación de P soluble, nitrógeno y pesticidas disminuyen
el número de especies fúngicas a más del 50% en comparación con
ecosistemas nativos. A pesar que la densidad de esporas no fue alta en las
zonas estudiadas, la diversidad (H) de especies micorrízicas para cada zona
93
estuvo en el rango 2,42-2,58, estos resultados concuerdan con lo expuesto por
Clapp et al. (1995), ellos señalaron que la producción de esporas no siempre
refleja la abundancia de especies micorrízicas en las raíces de las plantas. En un
trabajo similar Oehl et al.(2005), encontraron valores de diversidad de HMA entre
1,4 –1,8 en cultivos de maíz, en campo.Cuenca & Meneses (1996) encontraron en
suelos de cacao en Venezuela, valores de diversidad de HMA entre 0,6–0,78,
siendo los valores de diversidad reportados en éstos trabajos, más bajos que los
hallados en
las zonas de monocultivos de palma. Sin embargo,Tchabi et al.
(2008), afirman que independientemente de la zona ecológica de estudio, la
riqueza de especies de hongos micorrizicos disminuye por el uso intensivo de la
tierra. Los resultados encontrados sugieren que no hay una relación directa entre
la densidad de esporas y la diversidad de especies HMA en palma, y que las
especies encontradas probablemente se han adaptado a través del tiempo a la
práctica del monocultivo, al pH del suelo y al manejo del suelo.
De otro lado, A.excavata presentó la frecuencia de aislamiento más alta (33%)
independientemente de la profundidad y época de muestreo en todas las zonas
de estudio (Cuadro 5), esta especie es reportada en este trabajo, por primera vez
en los suelos palmeros Colombianos. Ingleby et. al. (1994), aislaron esta especie
de los suelos de Cote D’ vore (algunas veces referida como Costa Ivory)
occidente de África, a pH alto (8,2), contrariamente al pH ácido característico de
los suelos palmeros del presente estudio, sugiriendo que es una especie que se
adapta bien a diferentes pH del suelo. La alta frecuencia de especies de
Acaulosporas encontradas en los suelos palmeros en este trabajo (Figuras. 6-7),
en las dos épocas seca y lluviosa, concuerda con los reportes realizados por
Sieverding (1988) en los que se encontró una alta frecuencia de aislamiento en
suelos tropicales ácidos. En otros trabajos, Walker et al.(1986), también aislaron
especies de Acaulosporas de suelos con altos contenidos de aluminio y bajos
niveles de pH.
94
4.3 COLONIZACIÓN MICORRÍZICA
Oehl et al. (2005), consideran que la colonización micorrizica se ve influenciada
por el periodo estacional de muestreo, concordando c o n l o s r e s u l t a do s d e
este
estudio,
en
donde
la
c o l o n i za c i ó n
m i c o r r í zi c a
e s t uv o
i n f l u e n c i a d a p o r l a é p o c a d e l mu e s t r e o , presentándose diferencias
estadísticas significativas (p< 0,01) entre la época lluviosa y seca, s i e n d o
ma yo r e n l a é p o c a d e l l u v i a s ( p r o me d i o 6 3 % ) , e n r e l a c i ó n c o n l a
é p o c a s e c a ( 5 3 % ) , excepto en la zona de Monterrey donde no hubo
diferencias. Se demostró que no existe una correlación entre el número de
esporas y la colonización micorrizica, estos resultados, n o concuerdan con el
trabajo realizado por Louis& Lim (1987), ellos encontraron que en un bosque
lluvioso tropical, cuando el número de esporas tendía a disminuir, la colonización
por HMA incrementaba y contrariamente cuando el número de esporas era alto, la
colonización micorrizica era baja.
4.4 IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE HMA
En el presente estudio la identificación de las especies se logró utilizando
descripciones morfológicas y estudios de ADN, asi la identificación morfológica por
microscopia de luz y barrido fue útil para la descripción de todas las especies y en
particular para: A. lacunosa, A. excavata, Acaulospora spp, Glomus magnicaule,
Glomus spp, Rhizophagus intraradices, Septoglomus constrictum, Sclerocystis
rubiformis, Scutellospora spp, Gigaspora spp, de las cuales no se obtuvieron
buenos resultados en la identificación molecular. Para el género Acaulospora la
observación de su desarrollo ontogénico,la observación de la formación de
esporas cerca a los sáculos esporíferos laterales en los estadios tempranos, así
como la observación de sáculos colapsados durante etapas más avanzadas en
maduración de las esporas, observación de paredes internas flexibles(paredes
germinales) además de las descripciones de la ornamentación de la pared
95
externa por microscopia de barrido fueron criterios taxonómicos de interés para
la clasificación de especies, las características morfológicas obtenidas por
especie f u e r o n c o n f i r ma d a s con las claves taxonómicas utilizadas en este
estudio. La presencia de bulbo suspensorio en la familia Gigasporacea (Gigaspora
spp y Scutellospora spp), las diferencias de tamaño, así como paredes interiores
germinales y presencia del escudo de germinación, fueron aspectos considerados
para la identificación de los géneros. En el género Glomus, se identificaron las
paredes (capas) características, así como el desarrollo de las esporas por
gemación en la región terminal de las hifas, se evidenció la presencia de hifa
subtendida, que típicamente se encuentra unida a la espora madura Figura 4 (h,i,
j.l) y Figura 5 (e,f,i). De acuerdo a Redecker&Raab (2006), esta germinación
“glomoide” es llamada simplesiomorfica y ocurre en muchos linajes en los que se
ha mencionado entre otros, al género Glomus. De acuerdo a Oehl et al.(2011a),la
diferenciación morfológica de las especies glomoides está basada principalmente
en la morfología de la “hifa subtendida” de las esporas y su estructura de la pared,
de acuerdo a éstos autores, las esporas de especies de Glomus,Septoglomus
,Funneliformis y Simiglomus(este último, no encontrado en este trabajo),
presentan hifas subtendidas que son coloreadas similarmente a la pared de la
espora o ligeramente más claro que el color de la pared de la espora, datos que
concuerdan con lo observado en este trabajo para las especies identificadas. A
pesar
que los
taxónomos
han
agrupado
las especies glomoides casi
exclusivamente por las características moleculares, Oehl et al. (2011b), en su
reciente revisión de las especies glomoides muestran que la filogenia molecular es
actualmente congruente con las características morfológicas de estos hongos. De
otro lado, la presencia de esporocarpos globosos a subglobosos en Sclerocystis
rubiformis,Figura 5- (h) de color marrón hasta color mora y el arreglo de las
clamidosporas radialmente, a través de un plexo central de hifas encontradas en
las descripciones en este trabajo, junto a las demás características morfológicas
típicas de la especie concuerda con lo reportado por Almeida &Shenck (1990).
Glomus etunicatun, Glomus geosporum, Funneliformis mosseae, se identificaron
96
igualmente por descripciones morfológicas y para estas especies en particular se
logró, obtener buenas extracciones de ADN, lo que permitió su identificación
molecular por el análisis de secuencias, obteniendo similitud entre 97-99%
para las especies de Glomus y 97% para F. mossseae, de acuerdo al análisis de
secuencias De igual manera se encontró similitud entre las descripciones
morfológicas con la identificación molecular de Acaulospora denticulata y A.
delicata.
La identificación de especies micorrízica se puede realizar por la morfología de
sus esporas o por la identificación de métodos moleculares basados en la
reacción en cadena de la polimerasa PCR, no obstante Sanders (2004) considera
que ambos métodos no son absolutos y presentas debilidades, puesto que de un
lado para la identificación morfológica, se requiere la esporulación de las especies
micorrízicas en las condiciones de los suelos de estudio y de otro lado la
identificación molecular ha tenido inconvenientes debido a que una secuencia de
ADN de un gen particular debe ser conocido y correctamente identificado, además
la variación genética dentro de una especie fúngica es alta y esto se relaciona con
el hecho de que esporas de especies de micorrizas pueden contener cientos de
núcleos, de otro lado la calidad y salud de las esporas es fundamental para
obtener extracciones exitosas de ADN; parte del material de las esporas utilizadas
en este trabajo se encontraron parasitadas o en mal estado, como se pudo
evidenciar por las observaciones detalladas de la pared de algunas especies en
MEB,Figura 7 (f), estos inconvenientes se presentan comúnmente en la
propagación de esporas micorrízicas en potes en invernadero, donde el control de
insectos u otros organismos parásitos, a veces es incontrolable, por lo tanto
se justifican estudios morfológicos y moleculares. En el área de monocultivos de
palma del presente estudio, doce especies micorrízicas y 4 morfoespecies de
HMA se aislaron e identificaron por primera vez para Colombia (Cuadro 4). Se
consideraron especies micorrízicas “generalistas” para las zonas palmeras de
estudio a: A.delicata, A.denticulata, A.excavata, Glomus geosporum, Septoglomus
97
constrictum, y Sclerocystis rubiformis, por cuanto sus esporas se aislaron en
todos los suelos estudiados (Cuadro 6), demostrando la capacidad de crecer y
formar esporas en las diversas condiciones físico-químicas de la zona de estudio.
En este estudio se demostró que especies de Acaulospora tuvieron la mayor
frecuencia de aislamiento en los suelos palmeros, seguido de especies
micorrízicas pertenecientes al género Glomus, por el contrario las especies de
Scutellospora tuvieron una frecuencia baja de aislamiento (12%). Cuadro 5;estos
resultados son contrarios a lo expuesto por Sieverding (1991),él considera que en
los agroecosistemas tropicales Acaulospora spp, Glomus spp, y Scutellospora spp
pueden tener la misma frecuencia alta de aparición.
El índice de Shannon y Simpson mostraron que existe cierta homogeneidad en la
biodiversidad y distribución de las especies micorrízicas en los suelos ácidos
estudiados de palma aceitera, sugiriendo también que las especies micorrízicas
comunes encontradas en los 4 suelos palmeros han venido adaptándose a las
condiciones de acidez, altos contenidos de aluminio y bajos nutrientes de estos
suelos palmeros. Varios estudios se han encaminado a estudiar la diversidad en
ecosistemas naturales, sin embargo estudios de diversidad micorrizica nativa en
monocultivos de palma son escasos por los cuales no existen referencias
comparativas con el presente estudio.
98
5. CONCLUSIONES
Las poblaciones de micorriza arbuscular juegan un papel fundamental en la
sostenibilidad y productividad de la palma aceitera en los suelos ácidos, pobres
en nutrientes y con altos contenidos de aluminio como los de la región central de
Colombia. A pesar de las condiciones ácidas y la alta saturación de Al de
los suelos palmeros, así como el manejo del monocultivo, los resultados de este
trabajo, permiten inferir que varias poblaciones de micorrizas han logrado
sobrevivir y adaptarse al cultivo, destacándose las especies de Acaulospora y
Glomus, particularmente la especie Acaulospora excavata, que se aisló de todas
las zonas de estudio en época seca y lluviosa, demostrando así que es una
especie generalista del cultivo de palma en estos suelos. La colonización
micorrizica en palma aceitera en condiciones de campo y de acuerdo a la zona
de estudio en este trabajo tanto en época seca como lluviosa estuvo en un
rango de 53 a 63%. Sin embargo las prácticas intensivas del manejo de
fertilizantes químicos en el monocultivo de palma podrían ir dejando relegada la
actividad de los hongos micorrizicos, por lo cual se requiere continuar con estudios
encaminados a la selección de especies micorrízicas adaptadas a estos suelos y
a la multiplicación en plantas trampa para la conservación de este recurso
biótico como una recomendación para ser aplicado eficientemente desde vivero.
99
6. REFERENCIAS
Alarcon, C., Cuenca, G (2005). Arbuscular mycorrhiza in coastal sand dunes of the
Paraguana Peninsula, Venezuela. Mycorrhiza 16, 1–9.
Almeida, R.T., N.C Shenck (1990) A revision of the Glomus Sclerocystis
(Glomaceae, Glomales).Mycologia 82:703-4
Becard G., Pfeffer, PE. (1993). Status of nuclear division in arbuscular mycorrhizal
fungi during in-vitro development.Protoplasma 174:62–68.
Birhane, Emiru.,Kuyper, Thomas. W.,Sterck.Frank. J.,Bongers, Frans (2010)
Arbuscular mycorrhizal associations in Boswellia papyrifera (frankincense-tree)
dominated dry deciduous woodlands of Northern. Ethiopia Forest Ecology and
Management. 260(12) 2160-2169
Blal, B., Morel, C., Gianinazzi-Pearson, V., Fardeau, J., & Gianinazzi, S. (1990).
Influence of vesicular-arbuscular mycorrhizae on phosphate fertilizer efficiency in
two tropical acid soils planted with micropropagated oil palm (Elaeis guineensis
Jacq.). Biology and Fertility of Soils, 9 (1), 43-48.
Bolan, N., & Abbott, L. (1983). Seasonal variation in infectivity of vesiculararbuscular m y c o r r h i z a l
fungi
in
relation
plant response to
applied
phosphorus. Australian Journal of Soil Research, 21, 208-210.
Bolan, N., Robson, A., & Barrow, N. (1984). Increasing phosphorus supply can
increase the infection of plant roots by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. Soil
Biology and Biochemistry, 16, 419–420.
100
Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T., & Malajczuk, N. (1996). Working
with Mycorrhizas in Forest and Agriculture.ACAIR Monograph, No 32, Canberra,
Australia.
Clapp, J., Young, J., Merryweather, J., & Fitter, A. (1995). Diversity of fungal
symbionts in arbuscular mycorrhizas from a natural community. New
Phytology, 130, 259-5.
Cuenca G, Meneses E. 1996. Diversity patterns of arbuscular mycorrhizal fungí
associated with cacao in Venezuela.Plant Soil 183:315–322, DOI:10.1007/BF0001
1447
Dalpé, Y., Diop, T.A., Plenchette, C., Gueye, M. (2000). Glomales species
associated with surface and deep rhizosphere of Faidherbia albida in Senegal.
Mycorrhiza 10, 125–129
Garzón, E., Fino, W., Múnevar, F. (2006). Diversidad de suelos en la región
palmera de Puerto Wilches y San Vicente de Chucurí, departamento de
Santander-Colombia. Palmas, 26 (4), 11-23.
Gemma, J., Koske, R., & Habte, M. (2002). Mycorrhizal dependency of some
endemic and endangered Hawaiian plant species. American Journal of Botany,
89, 337-345.
Gerdemann JW ., Trappe JM. (1974). Endogonaceae in the Pacific Northwest
Mycol Mem 5:1–76.
Guerra, S.B., Chacón, M. (2012). Simbiosis micorrizica arbuscular y Acumulación
de aluminio en Brachiaria decumbens Y Manihot esculenta. BioAgro, 10 (2),8798.
101
Ingleby, K., Walker. C., & Mason, P. (1994). Acaulospora excavate Sp. Nov. and
Endomycorrhizal fungus from Cote D’ voire. Mycotaxon, 99-105.
Louis I, Lim G. (1987). Spore density and root colonization of vesicular-arbuscular
mycorrhizas in tropical soils. Trans Brit Mycol Soc, 88: 207-212.
Morton, J. (1986). Three new species of Acaulospora (Endogonaceae) from high
aluminum, low pH soils in West Virginia. Mycologia, 78, 641-648.
Morton, J. (1988). Taxonomy of VA mycorrhizal fungi: classification, nomenclature,
and identification. Mycotaxon, 32, 267- 324.
Morton, J., Benny, G. (1990). Revised classification of arbuscular mycorrhizal fungi
(Zygomicetes): a new orden Glomales, two new suborders, Glomineae and
Gigasporineae, and two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with
an emendation of Glomaceae. Mycotaxon 37, 471-491.
Morton,
J.
Scutellospora
(1995).Taxonomic
species
based
and
on
phylogenetic
comparative
divergence
developmental
amount
five
sequences.
Mycologia, 87, 127-137.
Nadarajah, P. (1980). Species of endogonaceae and mycorrhizal association of
Elaeis guineensis and Theobroma cacao. Tropical mycorrhiza research,
232-7.
Oehl, F., Sieverding, E., Ineichen, K., Mader, P., Boller, T., & Wiemken, A. (2003).
Impact of Land use intensity on the species diversity of arbuscular mycorrhizal
fungi in agroecosystems of Central Europe. Applied and Environmental
Microbiology, 69, 2816-2864.
102
Oehl, F., Sieverding, E., Ineichen, K., Ris, E., Boller, T., & Wiemken, A. (2005).
Community structure of arbuscular mycorrhizal fungi at different soil depths in
extensively and intensively managed agroecosystems. New Phytology,165,
273-283.
Oehl, F., Sieverding, S., Palenzuela, J., Ineichen, K., da Silva. (2011a) Advances
In Glomeromycota taxonomy and classification. IMA Fungus. 2(2): 191–
199.
Oehl. F., Silva, GA.,Goto, BT.,Maia, LC.,Sieverding E (2011b).Glomeromycota:
Two new classes and a new order. Mycotaxon 116:365–379
Oehl. F., Da Silva.G., Goto,B.,Sieverding,E.(2011c).Glomeromycota :Three new
genera and glomoid species reorganize.Mycotaxon 116:75-120
Phiillips, J., & Hayman, D. (1970). Improved procedures for clearing roots and
staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment
of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55,159-161.
Redecker. D., Raab,P (2006) Phylogeny of the Glomeromycota (arbuscular
mycorrhizal fungi): Recent developments and new gene markers. Mycologia,98(6),
885–895.
Sanders, I. (2004). Plant and arbuscular mycorrhizal fungal diversity – are we
looking at the relevant levels of diversity and are we using the right techniques?
New Phytologist 164, 415-418.
Shenck, N., & Pérez, Y. (1990). Manual for identification of VA mycorrhizal
fungi.3ra ed.Synergistie, Gainesville, Fla, U.S.A. 241.
103
Sieverding,E. (1989). Ecology of VAM fungi in tropical agrosystems -Agriculture
. Ecosystems Environmental, 29, 369-390
Sieverding, E. (1991). Vesicular-arbuscular mycorrhiza management in tropical
agrosystems. GTZ, Eschborn and Hartmut Bremer Verlag, Friedland, 365
pp.Press, L London, UK. Sieverding, E. (1991). Vesicular-arbuscular mycorrhiza
management in tropical agrosystems. GTZ, Eschborn and Hartmut Bremer
Verlag, Friedland, 365 pp.
Smith, S., & Read, D. (1997).Mycorrhizal Symbiosis. Second Edition. Academic
Press, L London, UK.
Tchabi, A., Coyne, D., Hountondji, F., Lawouin, L., Wiemken, A., & Oehl, F.
(2008).Arbuscular mycorrhizal fungal communities in sub-Saharan savannas of
Benin, West Africa, as affected by agricultural land use intensity and ecological
zone. Mycorrhiza, 18, 181-195.
Torres,C.R:,Girón,A.E.,Rincón,V.F.,Ruiz,D.J.(2013)
Minianurio
estadistico
Principales cifras de la agroindustria de la palma de aceite en Colombia.
Disponible
en
http://fedepalma.portalpalmero.com/bigdata/fedepalma/pdf
Consultado: febrero 14 de 2013.
Van Tuinen, D., Jacquot, E., Zhao, B., Gollotte, A. and Gianinazzi, P.V.(1988)
Characterization of root colonization profiles by a microcosm community Of
arbuscular mycorrhizal fungi using 25S rDNA-targeted nested PCR. Mol. Ecol.
7: 879-887.
White ,T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing
Of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH,
Sninsky JJ, White TJ (eds)PCR protocols, a guide to methods and applications.
Academic, San Diego, pp315–322
104
CAPITULO III.
SELECCIÓN DE UN INÓCULO MICORRIZICO POR
GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO EN MEDIOS CON
ALUMINIO
SELECTION OF MYCORRHIZAL
INOCULUM BY GROWTH AND
GERMINATION IN SUBSTRATES
CONTAINING ALUMINUM
105
RESUMEN
Beatriz Elena Guerra Sierra*
Seis especies de hongos micorrizicos arbusculares (HMA), nativos de suelos
palmeros de la región central de Colombia, propagados previamente en cultivos
monoespóricos en Brachiaria decumbens-Staps y Manihot esculenta-Crantz,
fueron evaluados por su habilidad de germinación y crecimiento a pH 4,5 en un
modelo experimental modificado del sistema “sándwich”. Cinco sustratos fueron
evaluados, utilizando Agar- agua 1%, como medio base, extracto mínimo de
suelo(0,3%) claforan 0.1% y segmentos de raíces jóvenes de palma , los medios
se prepararon a concentraciones de Al( 0,50,100,200 ppm), un quinto medio fue
considerado sin Al y sin nutrientes, solo con agar-agua 1% . Las esporas de HMA
fueron lavadas rigurosamente con agua destilada sin utilizar antibióticos, y
llevadas en filtros millipore, a incisiones previas realizadas en los sustratos de tal
forma que el millipore quedó atrapado en sándwiches entre el agar de cada uno
de los medios de cultivo, diez esporas de cada una de las seis especies de HMA
constituyeron la unidad experimental, tres replicas iguales fueron consideradas
por especie micorrizica en cada uno de los 5 sustratos. Los ensayos fueron
evaluados a los 8,16 y 30 días, en oscuridad, cámara de CO 2 al 2%,
temperatura 28ºC±2, los datos de germinación se registraron y posteriormente
las esporas fueron sacadas de la exposición a CO 2, se continúo la incubación a la
misma temperatura, hasta el periodo final de observación. Los resultados
mostraron una rápida formación de tubo germinativo en el medio de agaragua 1% (8 días), para algunas especies micorrízicas en comparación con los
medios
modificados
(rango 10-15 días), sin embargo el porcentaje de
germinación en el agar agua 1%, fue el más bajo al periodo final de observación,
resultados similares se vieron en el sustrato 2 (Medio de cultivo modificado base
más 50 ppmAl). En los medios modificados y a las mayores concentraciones de Al
106
(100 y 200 ppm) las especies A. excavata, G. geosporum, R. manihotis y F.
mosseae mostraron en general un patrón homogéneo de germinación por
encima del 50%. Scutellospora spp no mostró un patrón de crecimiento regular
y obtuvo mayor germinación (75%)en el sustrato con más aluminio, con relación a
las demás especies,contrariamente su crecimiento hifal no progreso siendo muy
bajo (4mm).Los factores tipo de sustrato, especie micorrizica y tiempo afectaron
significativamente el crecimiento de los hongos(p<0,005**), En general el Al no
afecto la germinación de las esporas pero si redujo el crecimiento para
Scutellospora(Stspp01), Acaulospora excavata y Sclerocystis rubiformis. Las
especies que presentaron mayor crecimiento fueron R.manihotis, seguida de G.
geosporum y F. mosseae. Los resultados sugieren que ciertos
ecotipos
micorrizicos se adaptan mejor a través del tiempo a las condiciones de acidez
compuestos
de
la
raíz,
nutrientes
del
suelo,
concentraciones
de
Al,
condiciones que estimularon el desarrollo de los HMA en este trabajo. Los
resultados fueron analizados mediante el análisis de ANOVAS, con un diseño
completamente aleatorio. Los datos estadísticos se realizaron con el software
SPSS 20 y programa estadístico R.
Palabras clave: aluminio, crecimiento hifal, germinación, micorriza arbuscular,
palma aceitera.
*. Doctoranda en Ciencias-Universidad Nacional de Costa Rica-.
Correspondencia: [email protected]
107
ABSTRACT
Six species of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), from oil palm soils of central
region of Colombia, previously propagated in Brachiaria decumbens-Staps and
Manihot esculenta-Cranzt in monoesporic cultures, were evaluated for their ability
to germinate and grow at pH 4.5 in a in a modified experimental model from
“sandwich” model.Agar-water 1%, and four modified media with minimal soil
extract (0.3%), 0.1% claforan segments of young oil palm roots,each one at three
concentrations of Al (50,100,200 ppm), a fifth substrate was considered without Al.
AMF spores were washed thoroughly with distilled water without antibiotics, and
carried on millipore filters, to previous cuts made in each substrates, leaving filter
that contained spores trapped in the agar to sandwiches way. 10 spores of each of
the six species of AMF were the experimental unit, three identical replicas were
considered by mycorrhizal species in each of the 5 substrates. The tests were
evaluated at 8,16 and 30 days in darkness, CO2 chamber 2%,temperature 28° C
± 2 for a week, germination data were recorded and then were removed from
exposure to CO 2, the incubation continued at the same temperature until the end
of observation period. Although germ tube formation occurred faster (8 days) in
the agar-water 1%, for some species compared to modified media (range 10-15
days) it was in this substrate where the lowest average germination was recorded
at the end of the observation period, similar results were seen in substrate 2
(modified substrate more 50ppmAl). In modified substrates and Al concentrations
(100 and 200 ppm) A.excavata, G.geosporum, F.mosseae R.manihotis showed in
general a homogeneous germination pattern above 50%. Scutellospora spp
showed no regular pattern of growth obtained higher germination (75%) with more
aluminum substrate, relative to other AMF species, unlike their hyphal growth was
very low (4mm). Substrate type, mycorrhizal species and time significantly
affected the growth of fungi (p <0.005 **) Overall Al, did not affect spore
germination
but reduced the growth Scutellospora (Stspp01) Acaulospora
excavata and Sclerocystis rubiformis. The HMA with the highest growth were
108
R.manihotis, followed by G geosporum and F. mosseae .The results suggest that
certain mycorrhizal ecotypes are better adapted overtime to conditions of acidic
compounds from the root, soil nutrient concentrations of Al, conditions that
stimulated the development of HMA. Los results were analyzed using ANOVA
analysis with a design completely random. All statistics were performed
using SPSS 20 software and statistical program R
Key Words: acid soils, aluminum, arbuscular mycorrhiza, hyphal growth,
germination oil palm.
*Agro environmental Biotechnology Research Laboratory. MICROBIOTA Group, 1 Science department-Industrial Microbiology, Street 70, number 55-210, University
of Santander (UDES) Cacique´s Lake, Bucaramanga, Colombia. Corresponding
author: [email protected]
109
1.0 INTRODUCCIÓN
Los hongos Glomeromycota son simbiontes de un gran rango de especies de
plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas de interés agrícola, en esta asociación
la planta se beneficia debido a que el hongo le trasfiere efectivamente nutrientes
especialmente fósforo y a su vez el hongo encuentra un nicho en la raíz donde
obtiene carbono para su crecimiento y mantenimiento, este intercambio
bidireccional de nutrientes se lleva a cabo en una estructura que se deriva de la
ramificación intracelular del hongo en la raíz, conocida con el nombre de
arbúsculo. Los HMA dependen completamente del suministro de carbón de las
plantas huésped y son incapaces de completar su ciclo de vida sin ellas. El
proceso de micorrización en plantas puede ser resumido en cuatro fases: (I) La
fase pre simbiótica (II) El contacto y la entrada del hongo dentro del tejido
radicular, (III) la proliferación fúngica intraradical y (IV) la invaginación celular y
trasferencia de nutrientes (Uta Paszkowski, 2006). Las esporas son los
propágulos más importantes para la mayoría de hongos micorrizicos arbusculares
(HMA) y el impacto que éstos produzcan en sus huéspedes dependerá de la
habilidad para germinar rápidamente y colonizar la raíz de la planta hospedera
(Tommerup 1983).En el proceso simbiótico todos los pasos son importantes, sin
embargo, es en la fase pre simbiótica, donde ocurre la germinación del hongo, y
se producen una serie de ramificaciones de la hifa para acercarse y establecer
contacto con la raíz de la planta, este evento ocurre antes de la formación del
apresorio, que es la hifa especializada de unión en la pared de las células
epidérmicas de la raíz de la planta huésped (Nagahashi 2000). Un esquema
general del proceso de micorrización se muestra en la Figura 1.
Según Pellegrino et al. (2010) la infectividad es la habilidad de un aislamiento
fúngico para establecer rápidamente una simbiosis micorrizica extensiva y esta
se correlaciona con la etapa pre-simbiótica del ciclo de vida del hongo; tal
como la germinación de la espora y el crecimiento. Sin embargo diversos
110
factores influyen o afectan la germinación de hongos micorrizicos tales como
compuestos químicos solubles del suelo, exudados radiculares y /o volátiles,
temperatura, luz, pH, humedad, presencia de flavonoides y de bacterias (Jeffries
et al.2003), el estado de dormancia del hongo es también un factor importante a
considerar (Safir 1990), al igual que la concentración de CO2, siendo ésta, una
fuente esencial de carbono para el crecimiento de la hifa
Figura 1. Esquema del proceso de colonización micorrizica
Fuente: Adaptado de Martin Parniske (2008).
Eventos o fases de la colonización: I.Fase pre simbiótica: reconocimiento hongo-raíz ,mediado
por una serie de señales, tales como exudados radiculares;flavonoides, manitol, compuestos
hidrofóbicos, sustancias volátiles, estringolactona y otras hormonas, e incluso bacterias que
ayudan a la germinación de la espora, a su vez el hongo produce factores que permiten la
micorrización (Factores Myc), éstos se encargan de producir cambios en la concentración de calcio
en las células epidérmicas (Kosuta et.al.2008) y activan genes relacionados con la simbiosis. Fase
II.Contacto y entrada del hongo: El hongo forma una estructura especializada de la hifa llamada
apresorio o Hifopodio, como se muestra en la Fig. (1), para ingresar a la célula huésped.
Seguidamente y debido a la estimulación química y mecánica, las células de la planta producen un
111
aparato de pre penetración(APP), así la hifa fúngica formada desde el apresorio entra al APP
constituyendo la Fase III de invaginación celular, de acuerdo a Genre et.al (2008),en esta etapa
el hongo sale de la célula de la planta y entra en el apoplasto , donde se ramifica y crece
lateralmente a lo largo del eje de la raíz, las hifas inducen el desarrollo del APP en las células de la
corteza interna, seguidamente estas células se dividen dicotómicamente para formar los
arbúsculos, estructuras en la cual se produce la transferencia efectiva de nutrientes (fase IV).
Otras estructuras micorrízicas intracelulares que se forman son las vesículas (no mostradas en el
esquema) éstas, son estructuras de reserva de nutrientes y están presentes en el apoplasto, solo
algunas especies de micorrizas las forman. Las nuevas esporas se forman fuera de la raíz de la
planta, en el micelio externo, y generalmente en un extremo o punta de la hifa
No obstante muchos hongos parecen estar adaptados al pH y a las condiciones
donde viven (Sylvia & Williams, 1992), por lo cual es importante la evaluación de
la infectividad de dichos ecotipos. En el caso de los suelos ácidos, y con
elevadas concentraciones de Al, se han registrado pocos estudios encaminados a
buscar y seleccionar ecotipos de hongos micorrizicos potencialmente tolerables e
infectivos en condiciones de acidez y saturación de aluminio, características
particulares de los suelos donde se desarrolla la palma aceitera. El efecto del
aluminio en la germinación y crecimiento hifal de las esporas ha sido
investigado en pocas especies de hongos micorrizicos.Lambais &Cardozo
(1989), encontraron que el crecimiento del tubo germinal se disminuía en
especies micorrízicas como Glomus macrocarpum, Gigaspora margarita, y
Scutellospora gilmorei en presencia de concentraciones de Al desde 0 a 130 µm,
resultados similares encontró Bartolomé-Esteban y Schenck (1994). Otros
trabajos relacionados con la tolerancia al Al en HMA han sido realizados por
Clarck (1997), Klugh-Stewart & Cummings (2009). Uno de los principales
obstáculos de los inóculos micorrizicos, es la producción a gran escala de
propágulos o esporas que sean infectivas y eficientes.
El Objetivo de este trabajo consistió en evaluar la capacidad de germinación y
crecimiento de esporas de HMA aisladas de suelos de la región palmera de
Puerto Wilches-Colombia, en un ensayo in vitro en medios de cultivo de agar-agua
112
1%, modificado con extracto mínimo de suelo, segmentos de raíces jóvenes de
palma aceitera, a pH promedio de los suelos ácidos de donde se aislaron las
esporas (4,5) y diferentes concentraciones de Aluminio, con el propósito de
seleccionar un inóculo micorrízico infectivo para palma aceitera.
113
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 MATERIAL FÚNGICO
Seis aislamientos de hongos micorrízicos nativos de la región central palmera de
Colombia fueron utilizados para evaluar su capacidad de germinación y
crecimiento en condiciones in vitro en diferentes sustratos ácidos y con contenido
de Al. Los detalles de los aislamientos son dados en el Cuadro 1. Esporas de cada
una de las seis especies micorrízicas listadas en el Cuadro (1) fueron
preliminarmente aisladas, e identificadas (Guerra 2014 en prep), y propagadas en
potes en suelos nativos de palma aceitera en una proporción 1:1 con arena, a pH
4,5. La propagación se realizó a partir de cultivos monoespóricos, y multiespóricos
(una única espora o 2-5 esporas de un mismo morfotipo respectivamente),
utilizando B.decumbens y M. esculenta como plantas trampa durante un tiempo
de cuatro meses, finalizada el tiempo en el invernadero, se tomaron submuestras
de 100 g de suelo por cada pote de cultivo y planta hospedera (n=12), las
esporas fueron extraídas del suelo por la técnica de tamizaje húmedo y
centrifugación en sacarosa (Brundrett et al. 1996), utilizando una serie de tamices
de diferente apertura de malla (300, 250, 150, 90 y45 µm respectivamente). Las
esporas se recolectaron manualmente con ayuda de pinzas elaborados con
agujas calibre 31 y media pulgada de longitud (aguja de insulina-BD Ultra-Fine™),
y se llevaron a cajas de petri, posteriormente se tomaron esporas viables, en
buen estado y finalizada el tiempo en el invernadero, se tomaron submuestras de
100 g de suelo por cada pote de cultivo y planta hospedera (n=12), las
esporas fueron extraídas del suelo por la técnica de tamizaje húmedo y
centrifugación en sacarosa (Brundrett et al. 1996), utilizando una serie de tamices
de diferente apertura de malla (300,250,150,90 y45 µm respectivamente).
114
Cuadro 1. Origen geográfico de los aislamientos de micorriza arbuscular y
características de la propagación de las esporas.
Especies Fúngicas
Acaulospora excavata
Funneliformes mosseae
Glomus geosporum
Rhizophagus manihotis
Sclerocystis rubiformis
Scutellospora spp
Código
Suelos Palmeros
Aexcp 04
Br,Mn,Wi,Bu
Fmsp 01
Br,Wi
Ggpp 01
Br,Mn,Wi,Bu
Gmhp 06
Br,Mn,Wi,Bu
Scrbp 01
Br,Mn,Wi,Bu
Stspp 01
Br,Mn,Wi,Bu
pH original
4,3-4,5
4,6-4,9
4,3-4,5
4,6-4,9
4,6-4,9
4,6-4,9
4,3-4,5
4,6-4,9
4,6-4,9
4,6-4,9
4,3-4,5
4,6-4,9
Plantas
trampa
pH
Propg.
Bd, Me
4,5
Bd, Me
4,5
Bd, Me
4,5
Bd, Me
4,5
Bd, Me
4,5
Bd, Me
4,5
*Zonas de la región central de palma de aceite en Colombia, donde se aislaron los
hongos:
(Br= Brisas, Mn=Monterrey, Wi=Wilches, Bu=Bucarelia), Plantas utilizadas para propagar e
incrementar las esporas: ¥Bd=Brachiaria decumbens, Me=Manihot esculenta. PH Propg=pH de
propagación de los hongos en las plantas hospederas.
Las esporas se recolectaron manualmente con ayuda de pinzas elaborados con
agujas calibre 31 y media pulgada de longitud (aguja de insulina-BD Ultra-Fine™), y
se llevaron a cajas de petri, posteriormente se tomaron esporas viables, en
buen estado y se contaron t re i nt a es po ra s par a ca da u n a de l a s se is
esp ec i es d e est u di o, bajo un Microscopio estereoscopio (Nikon-SMZ-645),
finalmente cada grupo de esporas se lavaron rigurosamente con agua destilada
estéril, cinco veces, y se dejaron listas para los ensayos de germinación, no se
utilizaron antibióticos.
115
2.2 MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo modificado base /100 ml, fue elaborado a partir de agar
agua1%(Bacto agar) 0,3% de extracto de un suelo ácido (pH 4,5), pobre en
nutrientes (P=10ppm, Ca=0,45meq/100gde suelo, Mg=0,25meq/100gsuelo,
K=0,20meq/100gsuelo), el medio base fue autoclavado a 121ºC, 1 atm, por 20
minutos y suplementado con 0,1% de claforan (cefotaxima sódica) más
segmentos de raíces jóvenes de palma aceitera (cortadas a 5mm de longitud),y
homogenizadas en el medio antes de su solidificación. Las raíces fueron
lavadas previamente antes de incorporarlas al agar rigurosamente en agua
destilada y desinfectadas por 3 minutos en hipoclorito de sodio al 1%, con
cinco lavados finales en agua destilada estéril. El medio de cultivo así
modificado sirvió como medio base para preparar cuatro medios de cultivo
suplementados con 50, 100 y 200 ppm Al, un quinto medio fue preparado sin
Al. Todos los medios se ajustaron a pH 4,5 y se sirvieron en cajas Petri de
plástico estériles (tamaño 14 cm de diámetro).
2.3 MONTAJE DEL EXPERIMENTO
El modelo del experimento fue una modificación del sistema “sándwich” ideado
para investigar las primeras etapas del ciclo de vida deHMA, Giovannetti et al.
(1993). Bajo una cámara de Flujo laminar (ESCO- Modelo AVC-4D), se llevaron
dos esporas individuales de cada una de las seis especies de micorrizas
(Cuadro1), entre dos
pedazos
de
membranas
de nitrato de celulosa-
MilliporeTMtamaño de apertura de poro de 0,45 µm,y 25 mm de diámetro, la
membrana conteniendo las esporas se dobló rigurosamente en dos partes,
seguidamente se realizó en el agar-sustrato una incisión de 1 cm de longitud y 0,5
cm de profundidad con una hoja de bisturí estéril
No.10 (DemeTech), las
membranas fueron colocadas por el lado del vértice principal del doblez con
ayuda de pinzas estériles (Figura 2).Este procedimiento se realizó para cada uno
116
de los cinco sustratos ya descritos, y en cada caja de cultivo se realizaron 5
incisiones iguales, de tal forma que en cada medio de cultivo se aseguraron 10
esporas por especie micorrizica, constituyendo la unidad experimental, tres
replicas similares fueron montadas para cada una de las seis especies
micorrízicas a evaluar en los cinco medios ensayados. Todos los tratamientos
fueron guardados en oscuridad en cámara de CO2, al 2%, temperatura 28ºC ± 2,
durante las primera semana para estimular la germinación, después todos los
tratamientos (medios de cultivo), fueron sacados de la exposición a CO2 y se
dejaron en incubación a 28ºC ± 2, hasta completar el periodo de observación. El
esquema del modelo de germinación en sustratos con
segmentos de raíces
ideado para este experimento, se muestra en la Figura 2.
Figura 2. “Modelo Sándwich con raíces para germinación de esporas de hongos
micorrizicos.”
117
2.4 EVALUACIÓN DE LA GERMINACIÓN Y EL CRECIMIENTO DE HIFAS
La
germinación
de
las
esporas
fue
observada
a
40x
usando
un
estereomicroscopio (Nikon-745/T), se consideró la germinación positiva, cuando
se observó presencia de un tubo germinal más largo que el diámetro de la espora.
La germinación de las esporas fue expresada como el porcentaje del número total
de esporas evaluadas. El crecimiento hifal fue evaluado mediante tinción con una
gota de azul tripano al 0,05% en ácido láctico. La longitud del micelio se midió
bajo un microscopio estereomicroscopio mediante el uso de la línea de rejilla
método de intersección (Giovannetti & Mosse,1980). El crecimiento de la hifa se
expresó en mm y fue considerado como el promedio del total de esporas
evaluadas por especie micorrízica.
2.5 ESTADÍSTICA Y ANÁLISIS DE DATOS
La especie micorrizica, el tipo de sustrato y el tiempo fueron los factores
considerados para el análisis de germinación y crecimiento hifal de los HMA. Para
la germinación la unidad de medida fue el porcentaje promedio de germinación de
30 esporas de cada especie micorrizica, ésta germinación fue analizada por tipo
de sustrato ensayado y durante el tiempo del experimento. Para el crecimiento
hifal, la unidad de medida fue el mm. Los resultados obtenidos fueron analizados
mediante la comparación de medias (prueba de Tukey) ,análisis de ANOVAS, con
un diseño completamente aleatorio. Todas las estadísticas se realizaron con el
software SPSS 20 y programa estadístico R.
118
3. RESULTADOS
3.1 GERMINACIÓN
A los ocho días en el sustrato 1 (Agar-agua 1%) se evidenció la presencia de tubo
germinativo en un 40% de las especies fúngicas de A.excavata y R. manihotis, en
comparación a las otras cuatro especies micorrízicas evaluadas que no
alcanzaron más del 20% de germinación en el mismo tiempo (datos no
graficados),la tasa de germinación aumentó hasta 60% para A.excavata y 58%
para R. manihotis, al periodo final de observación, siendo las dos especies que
mostraron la mayor germinación en Agar-agua 1% (Fig.3).
En el sustrato 2 (medio modificado+50 ppm-Al) la germinación ocurrió a los 10
días, para la mitad de las esporas evaluadas de G. geosporum y R. manihotis,
ambas alcanzaron un promedio de germinación de 60%, la mitad de las esporas
evaluadas para Scutellospora spp, también germinaron, siendo estas especies las
que mayor promedio de germinación alcanzaron al periodo final de observación.
La germinación de los HMA en los medios modificados (3, 4,5) fue más tardía, los
tubos germinativos fueron evidenciados hacia los días 13 y 15 (dato no graficado),
aumentando su tasa de germinación hasta un 65% para A.excavata y F.mosseae,
en el sustrato 3 (medio modificado+100 ppm Al), al periodo final de observación.
G. geosporum y R. manihotis también alcanzaron porcentajes promedios de
germinación por encima del 50% en este mismo sustrato,Figura 3. En el sustrato
4 (medio modificado+200 ppm-Al), el rango de germinación estuvo entre 50%75%, excepto, la especie S. rubiformis que solo mostró un promedio del 25% de
germinación. Scutellospora spp mostró el mayor porcentaje de germinación (85%)
con relación a las demás especies micorrízicas en el sustrato 5 (Medio de cultivo
modificado sin Al), el rango de germinación para las demás especies estuvo entre
55%-72%. En general la germinación ocurrió más rápido en el medio de agar
119
agua 1%, en comparación con los medios modificados, pero contrariamente los
porcentajes más altos de germinación de los hongos fueron observados en los
medios modificados a excepción del sustrato 2.
.
Figura 3. Porcentaje de Germinación promedio de especies micorrízicas
arbusculares nativas de palma aceitera en sustratos modificados a los 30 días.
Sustratos: S1: agar-agua1%, S2: Medio de cultivo modificado base más 50ppmAl, S3: Medio de
cultivo modificado base mas100ppm Al, S4: Medio de cultivo modificado base más 200ppmAl, S5:
Medio de cultivo modificado base sin aluminio
3.2 CRECIMIENTO HIFAL
El crecimiento de los hongos estuvo influenciado por los tres factores evaluados
(tiempo,
sustrato
y
especie
micorrizica)
así
las
especies
(A)
Scutellospora(Stspp01),(B) Acaulospora excavata y (F) Sclerocystis rubiformis,
fueron las especies que mostraron el más bajo crecimiento en los sustratos
120
ensayados a través de los tres tiempo de observación, en comparación con las
especies:(C) Glomus geosporum,(D) Rhizophagus manihotis y (E) Funneliformis
mosseae, las cuales alcanzaron mayor crecimiento hifal Figura 4.
De acuerdo a los resultados, el tiempo influyo positivamente para el crecimiento
hifal de las especies micorrízicas evaluadas. La especie Rhizophagus manihotis
Fig.4 (Hongo D), mostró el mayor crecimiento en todos los sustratos ensayados y
en particular en los sustratos 2,3 y 4 a diferentes concentraciones de Al (50,
100,200ppm respectivamente).
121
Figura 4. Crecimiento hifal de seis especies de hongos micorrizicos arbusculares
nativos de palma aceitera en medios modificados in vitro.
122
Gráfica superior: Scutellospora(Stspp01) (A izquierda),Acaulospora excavata(B,centro) y Glomus
geosporum (C,derecha) Gráfica inferior: Rhizophagus manihotis (D,izquierda),Funneliformis
mosseae ( E, centro) y Sclerocystis rubiformis,(F, derecha).El número inmediatamente debajo de
las bases de las barras de cada uno de los gráficos corresponden a los tres días de observación
(8,16 y 30 respectivamente), los números inmediatamente debajo, del 1-5 corresponden a los
sustratos ensayados. Sustrato (1) Medio agar- agua1%. (2) Medio de cultivo modificado base más
50ppmAl (3) Medio de cultivo modificado base mas100 ppm Al (4) Medio de cultivo modificado
base más 200 ppmAl (5). Medio de cultivo modificado base sin aluminio. El último número en la
parte inferior de las gráficas corresponde a los promedios de crecimiento en mm. El resultado
promedio de crecimiento y el error estándar se calculó con base a 30 esporas evaluadas por
cada especie micorrizica a través del tiempo de observación.
En general para los casos en que se observó crecimiento (mm>0), el ANOVA
gráfico mostró diferencias estadísticamente significativas en el crecimiento, de
acuerdo a los bloques, formados por especies de hongos, sustratos y tiempo.
(p<0,005**).Fig. (5).De otro lado, se aprecia un comportamiento homogéneo de
crecimiento (gráfico derecha), en las especies micorrizicos formando bloques así:
Scutellospora (Stspp01) y S. rubiformis (A y F) respectivamente, (media
5,5mm).S.rubiformis y A.excavata, (F y B), respectivamente, media= (7,0mm).
G.geosporum, y F.mosseae (C y E), respectivamente, media= (15,2mm),
diferenciándose de las demás especies, R. manihotis (D), (media=23,7mm), con
mayor crecimiento
123
Figura 5.Gráfico-del crecimiento de
hongos micorrizicos (HMA) sustratos y
tiempo.
(p<0,005) Derecha: Influencia de cada uno de los tres factores en el crecimiento promedio de
especies micorrízicas
[(A) Scutellospora spp(Stspp01),(B)Acaulospora excavata,(C)Glomus geosporum, (D)Rhizopaghus
manihotis,(E) Funneliformis mosseae,(F)Sclerocystis rubiformis] ,Sustratos:[(1) Medio de cultivo
agar-agua 1%)(2) Medio de cultivo modificado base más 50ppmAl (3) Medio de cultivo
modificado base mas100ppm Al(4) Medio de cultivo modificado base más 200ppmAl(5).Medio
de cultivo modificado base sin Al. Tiempo (8,16 y 30 días)]
124
4. DISCUSIÓN
Los medios modificados favorecieron a través del tiempo la mayor germinación de
las esporas de HMA (Fig.3), en comparación con el agar agua-1%, en donde la
germinación se dió más rápido (8 días), pero contrariamente la tasa promedio de
germinación a través del tiempo de observación en este medio fue más baja para
las especies ensayadas (rango 22%-60%),estos resultados de germinación solo
fueron comparables con el sustrato modificado a 50 ppm de Al, e n los demás
medios modificados la tasa de germinación fue mayor.
Contrario a estos resultados, Maia .&Yano (2001), encontraron un porcentaje de
germinación del 100% en agar-agua 1% para la especie micorrízica Gigaspora
albida, estos resultados estarían sugiriendo que ciertas especies se encuentran
más adaptadas para germinar en determinados sustratos. De otro lado, en la
mayoría de ensayos de germinación de esporas de HMA se han utilizado
extractos de raíces, en el presente trabajo, estos extractos fueron reemplazados
por la utilización de raíces jóvenes de palma aceitera, de acuerdo a los resultados
obtenidos influyeron positivamente sobre el desarrollo de los HMA, obteniendo
resultados equivalentes con lo reportado por Paula et al.(1990), ellos observaron
que los porcentajes de germinación y crecimiento del micelio de los HMA
aumentaba significativamente cuando el medio de agar-agua era suplementado
con células vegetales.
Los resultados obtenidos no mostraron una correlación entre el porcentaje de
germinación de las esporas con el crecimiento hifal, o viceversa, así la
germinación de Scutellospora spp (Stspp 01) en el sustrato 4 (200 ppmAl), fue
del 75%, (Fig.3), sin embargo el promedio de crecimiento de la hifa se vio
afectada en el mismo sustrato, no superando los 4 mm de crecimiento en el
periodo final de observación (Fig.4). Estos resultados coinciden con lo expuesto
125
por Bartolomé- Esteban & Schenck (1994), ellos encontraron que las especies de
Scutellospora son afectadas variablemente por las altas concentraciones de
aluminio. De otro lado, R.manihotis mostró un promedio de germinación del 60%,
siendo más bajo que el porcentaje mostrado por Scutellospora spp-Stspp01
(Fig.3), sin embargo R.manihotis fue la especie micorrizica que presento el mejor
crecimiento en los sustratos con mayor concentración de Al ,sustrato con 100 ppm
Al (promedio 57 mm) y sustrato con 200 ppm Al (promedio 53mm) (Fig. 4).En un
trabajo similar de evaluación de la respuesta de R. manihotis a la exposición de
diferentes
concentraciones
de
Al,
Bartolomé-Esteban
&
Schenck(1994),
encontraron que dicha especie solo crecía 27 mm a una concentración de 100
ppm de Al, siendo estos resultados diferentes a los obtenidos en el presente
trabajo. Esta variación de respuesta podría estar reflejando de alguna manera la
variación en la cantidad de genotipos entre las esporas y también la respuesta
posible de adaptación dentro de las diferentes plantas trampa utilizadas en la
propagación de las especies micorrízicas bajo condiciones de acidez, para este
caso particular se utilizaron B. decumbens y M. esculenta, dos plantas de
reconocida micotrofia y tolerancia a la acidez.
De acuerdo a los resultados presentados en la Fig. (5), se muestra que el tipo
de sustrato, la especie fúngica y el tiempo, presentaron diferencias estadísticas
significativas (p<0,005) en el crecimiento de los hongos, por lo cual son factores
decisivos en la respuesta de los hongos micorrizicos, demostrando que (C)
Glomus geosporum, (D) Rhizopaghus manihotis, (E) Funneliformis mosseae,
fueron las especies más tolerantes a la acidez y concentración de Al, para este
ensayo. A pesar de que las seis especies de HMA, utilizadas fueron
aisladas de los mismos suelos, se obtuvieron diferentes respuestas tanto en la
germinación como en el crecimiento sugiriendo así que las especies han variado
la tolerancia a la acidez, a pesar de que la mayoría de los aislamientos de HMA
parecen estar adaptados a pH 4,5, valor cercano al pH de los que fueron aislados.
Los resultados aquí obtenidos, podrían estar reflejando de alguna manera lo
126
expuesto por Ashen & Goff (2000), ellos afirman que la selección natural favorece
la presencia de ecotipos micorrizicos mejor adaptados en suelos ácidos
desplazando aquellos con menos habilidad de competencia.
127
5. CONCLUSIONES
En general los estudios relacionados con el efecto del Al en la germinación y
crecimiento hifal para seleccionar hongos micorrizicos infectivos para palma
aceitera, son muy limitados, en este trabajo la incorporación de raíces jóvenes de
palma aceitera en los medios modificados, favoreció la germinación y crecimiento
hifal de las especies fúngicas ensayadas. Las diferentes concentraciones de Al
utilizadas no afectaron el crecimiento de los hongos, sin embargo se demostró
que las especies Rhizophagus manihotis, Glomus geosporum y Funneliformis
mosseae fueron más tolerantes a la acidez y presencia de Al, por lo cual se
sugiere la utilización de estas especies, como inóculos para evaluar la simbiosis
en cultivos de palma aceitera en suelos ácidos.
128
6. REFERENCIAS
Asen J, Golf L (2000). Molecular and ecological evidence for species specificity
and coevolution in a group of marine algal-bacterial symbiosis.Appl Environ
Microbiol 66:3024-3030.
Barkdoll,A. (1987).The effect of aluminum on the growth phytotoxic levels of of
selected
species
of
vesicular-arbuscular
mycorrhizal
fungi.Ph.D.
Dissertation.University of Florida. Gainesville, 148.
Bartolomé, E., &Schenck, N. (1994). Spore germination and hyphal growth of
arbuscular mycorrhizal fungi in relation to soil aluminum saturation.Mycologia,
86217-226.
Becard, G., &Y. Piche.(1989). Fungal growth stimulation byCO2 and root exudates
in vesicular-arbuscular mycorrhizal symbiosis. Appl. Environ. Microbiol. 55:23202325
Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T., & Malajczuk, N. (1996).Working
with Mycorrhizas in Forest and Agriculture. ACAIR Monograph 32, Canberra,
Australia.
Clarck,
R.
(1997).
Arbuscular
mycorrhiza
adaptation,
spore
germination,rootcolonization,and host plant growth and mineral acquisition at low
ph. Plant soil, 192 15-22.
Genre, A., Chabaud, M., Faccio, A., Barker, D. &Bonfante, P. (2008).
Prepenetration apparatus assembly precedes and predicts the colonization
129
patterns of arbuscular mycorrhizal fungi within the root cortex of both
Medicagotruncatula and Daucuscarota. Plant Cell,20 1407–1420.
Giovanetti M, Mosse B. 1980. An evaluation of techniques for measuring vesiculararbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytol. 84:489-500.
Jeffries, P., Gianinazzi, S., Perotto, S., Turnau, K., &Barea, J. (2003).The
contribution of arbuscular mycorrhizal fungi in sustainable maintenance of plant
health and soil fertility. Biology and Fertility of Soils, 37 1-16.
Klugh-Stewart, K., & Cumming, J. (2009).Organic acid exudation by mycorrhizal
Andropogon virginicus L.(broomsedge) roots in response to aluminum. Soil Biology
and Biochemistry, 41367-373.
Kosuta, S., Chabaud, M., Lougnon, G., Gough, C., Dénarié, J., Barker, D., &
Bécard G. (2003).A diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi induces
symbiosis-specific MtENOD11 expression in roots of Medicagotruncatula. Plant
Physiology, 131 952–962.
Kosuta, S., Hazledine, S., Sun, J., Miwa, H., Morris, R., Downie, J., & Oldroyd, G.
(2008). Differential and chaotic calcium signatures in the symbiosis signaling
pathway of legumes.Proceedings of National Academy of Science,1059823–9828.
Lambais, MR., & Cardozo, E. (1989 ). Germinação de esporos e crescimento do
tubo germinativo de fungos micorrizicos vesiculo-arbusculares em
diferentes concentrações de aluminio. BrasileiraCiência do Solo,
13 (2) 151-154.
Maia,L. C., Yano, M.A. (2001). Germination and germ tube growth of the
arbuscular mycorrhizal fungi,Gigaspora albida in different substrates. Brazilian
Journal of Microbiology, 32281-285.
130
Nagahashi, G. (2000). In vitro and in situ techniques to examine the role of
root exudates during AM fungus-host interactions. In Arbuscular Mycorrhizas:
Physiology and Function. Edited by Y. Kapulnik and J.D.D. Douds. Kluwer
Academic Publishers, Netherland, 287-305.
Parniske,
M.
(2008).Arbuscular
mycorrhiza:
the
mother
of
plant
root
endosymbiosis. Nature reviews microbiology, 6 763-775
Paszkowski.,Uta. (2006). A journey through signaling in arbuscular mycorrhizal
symbioses. New Phytologist, 172 (1) 35-46.
Paula, M.A.; Siqueira, J.O.; Pinto, J.E.B.P Pascal, M. (1990) Beneficios da
suspensão de células vegetáis para fungos micorrizicos vesículo arbusculares in
vitro. 1. Efeito da espécie vegetal e da idade das células. Pesq. Agropec. Bras.,
25(8): 1101-1108.
Pellegrino, E., Kamatchi, S., Sbrana, C., Barberi, P.,&Giovannetti, M. (2010).
Selection
of
Infective
Arbuscular
Mycorrhizal
Fungal
Isolates
for
Field
Inoculation.Italian Journal of Agronomy, 3 225-232.
Safir, G., Coley, S., Siqueira, J., Carlson, P. (1990). Improvement and
synchronization of VA mycorrhiza fungal spore germination by short-term cold
storage. Soil Biology Biochemist, 22(1) 109-111.
Sylvia,
M.,
Williams,
S.
(1992).
Vesicular-arbuscular
mycorrhizae
and
environmental stresses. ASA, Madison, 101–12.
Tommerup, I. (1983). Spore dormancy in vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi.
Transactions of the British Mycological Society, 81 (1) 37-45.
131
CAPITULO IV.
CONTRIBUCION DE LA MICORRIZA ARBUSCULAR
PARA REDUCIR FITOTOXICIDAD DEL AL
EN SUELOS CULTIVADOS CON
PALMA ACEITERA
CONTRIBUTION ARBUSCULAR MYCORRHIZA
TO REDUCE THE ALUMINUM
PHYTOTOXICITY,
CULTIVATED OIL PALM SOILS
132
RESUMEN
Beatriz Elena Guerra S.*
La acidez de los suelos es un problema serio para la producción de cultivos,
particularmente en suelos tropicales a pH <5,0 en donde el Al esta principalmente
como Al+3, siendo ésta una forma fitotóxica que afecta el crecimiento y la
producción agrícola. En este trabajo se realizó un ensayo con raíces de palma
aceitera micorrizadas y no micorrizadas de 60 días de edad, expuestas por 72
horas en soluciones líquidas aireadas a pH 4,4± 0,1, a concentraciones de
Al 50,100 y 200 ppm respectivamente, un control de plántulas no expuestas fue
considerado. El objetivo del ensayo fue determinar la capacidad de captación
de Al en raíces micorrizadas especialmente por el micelio interno y externo de la
micorriza, en comparación con estructuras celulares de la raíz de palma no
micorrizada.
La distribución y captación del Al por los tejidos radiculares fueron evidenciados
en cortes longitudinales a 100um utilizando un vibrátomo rotatorio, en muestras
previamente embebidas en agarosa de baja densidad. Las secciones fueron
lavadas con 10 mM de citrato para remover el Al apoplásico, y teñidas con DAPI
(4'6-diamino-fenilindol)
y
el
colorante
fluorescente
Lumogallion
(3-[2,4
dihydroxyfenilazol]-2-hydroxy-5- ácido chlorobenzeno-sulfónico] para determinar
la captación de Al ligado a los tejidos de raíces micorrizados y no
micorrizados. Una serie
de
controles
para la auto fluorescencia
fueron
utilizados tales como raíces no micorrizadas expuestas al Al y sin Lumogallion,
raíces micorrizadas, expuestas al Al y sin Lumogallion, y raíces no expuestas Al y
con Lumogallion. La intensidad de fluorescencia obtenidas en cada imagen de
raíces bajo microscopia confocal y en cada tratamiento, fueron procesadas
utilizando el aplicativo software MATLAB®. Para evaluar la distribución del Al en
los tejidos radiculares fue utilizada la herramienta RGB y se comparó la
133
133
intensidad de fluorescencia emitida transformando las imágenes a la escala de
grises, utilizando la herramienta de histograma de ecualización. El promedio de
intensidad de la fluorescencia de cada una de las estructuras radiculares
micorrizadas y no micorrizadas fue hallada mediante la comparación de medias
(n=45), encontrándose en las Anovas diferencias estadísticamente significativas
(p<0,0001) para cada una de las concentraciones de Al y estructuras evaluadas.
La mayor intensidad de fluorescencia emitida por el complejo Al-Lumogallion fue
hallado en las hifas de los hongos micorrizicos seguida de los núcleos de la raíz.
La alta señal de emisión fue interpretada como mayor captación de Al, en
comparación con otras estructuras radiculares de la palma aceitera sin micorriza,
estos hallazgos podrían estar soportando la importante contribución de los
hongos micorrízicos en el cultivo de palma en la disminución de la toxicidad del
aluminio en suelos ácidos.
Palabras clave: captación Al, fluorescencia, micorriza arbuscular, palma aceitera,
lumogallion
*. Doctoranda en Ciencias-Universidad Nacional de Costa Rica-.
Correspondencia:[email protected]
134
134
ABSTRACT
Beatriz Elena Guerra S.*
The acidity of soils is a serious problem for crop production, particularly in tropical
regions. At pH <5.0 predominant Al species exists as Al +3, being a phytotoxic
species which limits plant growth and production. In this assay, oil palm roots with
and without mycorrhiza, were exposed for 72h at 50,100,200 ppm Al3
+
concentrations, in aerated liquid solutions at pH 4.4±0.1, seedling control not
exposed to Al was considered. The goal of this work was to determine the ability to
capture Al in mycorrhizal and non-mycorrhizal roots .
The distribution and Al uptake by root tissues were evidenced in roots embedded
in low density agarose, sectioned in longitudinal cuts to 100um, using a rotary
vibratome, the roots were washed with 10 mM citrate in order to remove the
apoplastic Al, sections were stained with DAPI (4'6-diamino-phenylindole) and
Lumogallion dye(3-[2,4 dihydroxyphenylazol]-2-hydroxy-5-chlorobenzenesulfonic
acid] to determine the uptake of Al bound to DNA in nuclei and mycorrhizal and
not mycorrhizal root tissues. A series of controls for autofluorescence were
used such as not mycorrhizal roots exposed to Al +lumogallion, and mycorrhizal
roots exposed to Al and unstained with lumogallion, and other non-exposed to Al,
but stained with lumogallion.The fluorescence intensity obtained in each images of
roots under confocal microscopy were processed using the software MATLAB ®
application. To evaluate distribution of Al in the tissues, was used the RGB
tool. Emitted fluorescence Intensity by roots was measured by transforming the
image to gray scale, using the histogram equalization. The average fluorescence
intensity of each root mycorrhizal and non-mycorrhizal structures was found by
135
135
comparison of means(n=45),by ANOVA, finding statistically significant differences
(p<0.0001).
The results show for the first time in mycorrhizal root oil palm, that the fungal
hyphae emit higher fluorescence signal, followed by the nuclei of the root tissue,
interpreted as Al uptake in comparison with other structures of oil palm roots
without mycorrhiza, these findings could be supporting the important contribution
of mycorrhizal fungi in the cultivation of oil palm and contribution in reducing
aluminum toxicity in acidic soils.
Keywords:
aluminum
toxicity,
arbuscular
mycorrhiza,
fluorescence,
lumogallion,MATLAB ®, oil palm,
*Agro environmental Biotechnology Research Laboratory. MICROBIOTA Group, 1 Science department-Industrial Microbiology, Street 70, number 55-210, University
of Santander (UDES) Cacique´s Lake, Bucaramanga, Colombia. Corresponding
author: [email protected]
136
136
1.0 INTRODUCCION
Los suelos ácidos limitan la producción de cultivos en un 30-40% y hasta el 70%
de las tierras potencialmente arables del mundo (Haug, 1983). Se estima que en
Colombia alrededor del 85% de los suelos son ácidos.(Casierra & Aguilar 2007) y
en particular en la zona palmera central de Colombia existen suelos de extrema
acidez (pH=3,7) hasta suelos muy alcalinos (pH=7,9) sin embargo gran parte de
los suelos tienen un pH<5.0, en éste valor de pH el aluminio está en la forma
de Octaedro hexahidratado o Al+3, generalmente esta forma es la más
fitotóxica, y afecta negativamente la producción de cultivos, siendo un factor que
afecta la salud de las plantas. De acuerdo a Douglas (2011), la acidez y la alta
saturación de aluminio presente en los suelos palmeros de Colombia, son
considerados factores abióticos que inciden en la enfermedad de la pudrición del
cogollo de palma aceitera (PC).
El principal síntoma de la toxicidad de Aluminio es la rápida inhibición del
crecimiento radicular y el ápice es el sitio crítico para la toxicidad; Ryan et al.
(1993). Las plantas difieren en su capacidad para tolerar el Al, dicha capacidad
puede ser entendida por los diversos mecanismos que facilitan la exclusión del
metal del ápice radicular, conocidos como mecanismos de tolerancia externa,
tales como exudación de ácidos orgánicos, Pellet et al.(1995); De la Fuente et
al.(1997), inmovilización del Al a la pared celular, exudación de fosfatos, flujo
activo de Al a través de la membrana plasmática, producción de mucilago en la
raíz, exclusión de Al por alteración del pH en la rizósfera (Kochian,1995; Pellet et
al.1997),permeabilidad selectiva de la membrana plasmática(Taylor 1991). De otro
lado están los mecanismos de tolerancia interna del Al, que le confieren la
habilidad de tolerancia del metal en el simplasma de la planta, tales como: Al
ligado a proteínas, quelación en el citoplasma, compartimentación en la vacuola,
137
137
evolución de enzimas tolerantes al Al y elevada actividad enzimática (Taylor,
1991; Carver &Ownby, 1995; Kochian, 1995).
En los suelos ácidos, s e h a n involucrado diversos factores en la disminución de
la productividad agrícola, uno de éstos es la disminución de la actividad
microbiana, debida a la presencia de altas concentraciones de formas tóxicas del
Al, sin embargo tanto microorganismos como especies vegetales han venido
adaptándose a las condiciones ácidas del suelo. De otro lado, la palma aceitera
es considera como un cultivo ácidofilo, que tolera pH ácidos desde un rango de
4,0-6,0 (Hartley 1988), igualmente a este rango de acidez diferentes especies de
hongos comunes de los suelos del Phyllum Glomeromycota denominados hongos
micorrizicos arbusculares (HMA), son capaces de establecer simbiosis con raíces
de palma aceitera, brindándole diversos beneficios, entre los cuales se destaca
la trasferencia de P a la planta, principalmente de fuentes lábiles en el suelo
(Smith & Read, 1997). Diversos trabajos han mostrado que ésta simbiosis cumple
un papel fundamental en la disminución del estrés abiótico presentes en el medio
ambiente y en el suelo, tales como la presencia de niveles Fitotóxicos de aluminio
(Rufyikiri et al.2000; Yano &Takaki, 2005; Klugh &Cummings, 2007; Arriagada, et
al.2007.; Guerra &Chacón, 2012), sin embargo trabajos encaminados a demostrar
la unión del Al en los tejidos micorrizicos en plantas y especialmente en palma
aceitera son escasos. A este respecto, el desarrollo de fluorocromos para
evidenciar el Al en los tejidos, ha sido fundamental para el apoyo de la
investigación en este campo. Tanoi, et al. (2001) desarrollaron un método
altamente sensible para determinar Al en cultivos celulares y raíces de plantas, se
trata del colorante fluorescente Lumogallion; el cual se ha reportado de mayor
sensibilidad para detectar aluminio bajo microscopia confocal. En este trabajo se
hipotetizó que hongos micorrizicos nativos de suelos palmeros ácidos, podrían
capturar Al, por lo cual se propuso demostrar y determinar específicamente la
capacidad de unión del Al en ápices de raíces de palma aceitera con y sin
micorrizas, previamente expuestas a diferentes concentraciones de Al, en medios
138
138
líquidos y comparar el grado de fluorescencia emitido utilizando el complejo
colorante Lumogallion+Dapi, los resultados obtenidos fueron interpretados con el
procesamiento de las imágenes correspondientes a cada uno de los tratamiento
ensayados con raíces y concentraciones de Al, para tal fin se utilizaron las
herramientas del aplicativo software MATLAB®. Este es el primer trabajo que se
realiza en palma aceitera, los resultados obtenidos en este estudio, estarían
soportando el importante papel de la micorriza en el cultivo y su contribución en la
reducción de la toxicidad del Aluminio en suelos ácidos.
139
139
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 FASE EN INVERNADERO Y ESTABLECIMIENTO DE LA SIMBIOSIS
MICORRIZICA
Doscientas semillas de E.guineensis Jacq. (DelixLame) pregerminadas con
radícula de 2 cm y plúmula aprox de 1 cm, fueron suministradas por la
Cooperativa de palmicultores de Colombia –COPALCOL-para este experimento.
Todas las semillas fueron desinfectadas con ácido hipocloroso (HOCL) al 5%
(v/v) x 5 minutos, lavadas con agua desionizada por 10 minutos, 5 veces. Una vez
desinfectadas, las semillas se llevaron a bolsas de capacidad de 500 g, utilizando
como sustrato una mezcla de arena estéril+ vermiculita (2:1), el sustrato con 70%
de humedad se llevó a las bolsas y se esterilizó 15 minutos diarios, por tres días
consecutivos, usando un horno microondas de alto poder.
El sustrato se dejó enfriar por 12 horas y seguidamente se realizó la siembra de
cien semillas de palma, a las que se les agregó en el momento de la siembra y a
cada una 20 g de un inóculo mixto de esporas (Glomus geosporum, Funneliformis
mosseae, Rhizophagus manihotis),esporas que fueron propagadas previamente
en Manihot esculenta y Brachiaria decumbens en condiciones de estrés por
acidez y aluminio (Guerra&Chacón 2012), adicionalmente este inóculo se
seleccionó preliminarmente in vitro por su capacidad de germinar y crecer en
soluciones ácidas a diferentes concentraciones de Al.(Guerra,.2014,en prep).Un
número similar de semillas, se sembraron directamente en el sustrato estéril sin
inóculo micorrízico. Todas las plántulas de palma aceitera con micorrizas (MA+) y
sin inoculo micorrízico (M-) se dejaron crecer por 60 días en el invernadero de la
0
Universidad
de
Santander
(temperatura
28 C,
humedad
relativa
fotoperiodos 16h/dia, 8 h oscuridad), para favorecer la simbiosis micorrizica.
140
140
75%,
Durante el periodo de crecimiento radicular y establecimiento de la simbiosis, las
plántulas fueron regadas diariamente con agua ultrapura y desionizada estéril pH
4,4±0,1, a la capacidad de campo. A partir de la tercera semana se inició la
fertilización con 50 ml de solución de nutrientes para cada plántula, con una
periocidad semanal y hasta la quinta semana del experimento. La solución de
nutrientes se preparó igualmente en agua desionizada ultra pura y se ajustó a pH
4,4±0,1, los nutrientes en la solución fueron: NO3 (1,0 mM), NH4 (0,2mM), K
(0,60 mM), Ca (0,50 mM), Mg (0,20 mM), SO4 (0,15 mM),H2PO4 (15 mM), Fe
(20 mM), B (20 mM), Mn (4,5 mM), Zn (0,35mM), Cu (0,16 mM), y Mo (0,06 mM).
2.2 EVALUACIÓN DE LA SIMBIOSIS MICORRIZICA
Se muestrearon al azar raíces de cada grupo de plántulas micorrizadas (M+) y no
micorrizadas (M-), las raíces se cortaron a 1 cm de longitud desde el ápice y se
consideraron diámetros desde 0,88 mm hasta a 1,85 mm, las raíces se llevaron a
tubos de vidrio de capacidad 10 ml, conteniendo agua desionizada estéril,
debidamente rotulados hasta el procesamiento del laboratorio donde se les realizó
tres lavados adicionales con agua desionizada estéril. Un número total de
50 raíces frescas (MA+) y un número igual de raíces sin micorrizar, fueron
seleccionadas al azar para verificar inicialmente la simbiosis por la técnica de
coloración de azul tripano, (Phillips & Hayman 1970). La evaluación de la
colonización se realizó por el método de segmentos de 1 cm de raíces en láminas
de vidrio, éstas se examinaron al azar y se consideraron 100 campos
microscópicos. Una sección de la raíz se contó como infectada cuando se
observaron cualquiera de las tres estructuras de la simbiosis (hifas, vesículas o
arbúsculos). La colonización de la raíz por cada una de las tres estructuras
fúngicas se expresó como la relación entre el número de secciones colonizadas
para el número total de secciones examinadas. Los preparados se observaron
con microscopio fotónico de alta resolución Nikon® 80i eclipse, equipado con
141
141
contraste diferencial de interferencia (DIC). Las fotografías se obtuvieron con una
cámara digital Nikon® DS-2MV.
2.3 EXPOSICIÓN DE PLÁNTULAS A DIFERENTES SOLUCIONES DE AL
BAJO CONDICIONES CONTROLADAS PERIODO DE ACLIMATIZACIÓN
Del total de plántulas iniciales del experimento se seleccionaron al azar ciento
veinte plántulas de palma aceitera; el 50% inoculadas y el otro 50% no inoculadas
con hongos micorrizicos, homogéneas en tamaño y en número de raíces laterales
(25±3), las plantas se llevaron a cámaras hidropónicas conteniendo una solución
aireada y con recirculación constante de CaSO 4, por 14-h, como un periodo de
aclimatización por 10 horas de fotoperiodo, a 28ºC, 75% humedad.
2.4 EXPOSICIÓN A SOLUCIONES DE AL
Pasado el tiempo de aclimatización, las plántulas tanto inoculadas con hongos
M(+) y no inoculadas M(-), se pasaron en grupos de 5 plántulas a cámaras
hidropónicas conteniendo cada una 10 l, de soluciones liquidas de Aluminio a
concentraciones 0, 50, 100, 200 ppm respectivamente, el Al fue adicionado en la
forma de cloruro de Al hexahidratado (ALCl3 6 H2O), y a cada una de las
concentraciones preparadas, temperatura de 28ºC,humedad 75%, por un período
de 72 h. Para cada concentración y nivel de micorrización (inoculadas y no
inoculadas) se consideraron tres replicas, la solución de Al se mantuvo a pH
4,4±0,1 con continuo monitoreo y cuando hubo variaciones, el pH se ajustó con
HCL 0,1M ( Un esquema del montaje del experimento se muestra en la Fig.1)
Las cantidades de Al agregadas a las soluciones, así como el pH fueron
consideradas de acuerdo a las características fisicoquímicas de los suelos
palmeros de la región central de Colombia, y a otros trabajos en palma realizado
por Cristancho et al. (2007).Una vez finalizado el tiempo de exposición, las
plántulas fueron sacadas de las soluciones liquidas y lavadas siete veces con
142
142
agua de alta pureza, antes del procesamiento de las raíces para la coloración con
Lumogallion y Dapi.
Figura 1. Esquema general de la exposición de plántulas de palma aceitera de 60
días de edad en soluciones liquidas y a diferentes concentraciones de Al.
2.5 PROCESAMIENTO DE RAÍCES DE PALMA ACEITERA Y COLORACIÓN
CON LUMOGALLION Y DAPI
Se consideraron raíces micorrizadas (M+) y sin micorrizar (M-) en cada una de las
cuatro concentraciones de Al (0, 50,100 y 200 ppm), las raíces no expuestas a Al
sirvieron como control. De cada tratamiento se escogieron al azar 30 ápices
radiculares de 7-10 mm de longitud, y se llevaron a cubetas de tejidos
debidamente marcados de acuerdo al tratamiento, a cada cubeta se le realizaron
tres lavados con agua ultrapura por 5 minutos, y un lavado con 5 mM de Citrato
(pH 4,35) por 40 minutos. Los ápices fueron embebidos en agarosa (Sigma) al
6% (w/v) de baja electro endosmosis (EEO) y se cortaron en secciones
longitudinales de 100µm, utilizando un vibratomo (Leica VT1200S), operado a una
velocidad de 0,32 mm/sg y con una amplitud de 0,40mm. Las muestras se dejaron
en baño de flotación en buffer acetato pH (5,2) por veinte minutos a 250C.
Posteriormente, las secciones de raíces, se llevaron a pozos de coloración con el
143
143
indicador de Aluminio- Lumogallion (3-[2,4dihydroxy-fenilazol]-2hydroxy-5 ácido
clorobenze-sulfonico), preparado a una concentración 10 uM en 100 uM buffer
acetato (pH 5,2). Todas las secciones de raíces se dejaron por 80 minutos, a
oscuridad y a 55 0C, en un baño de rotación a 70 rpm(JULABO-Sw22Labortechnik GmbH). Las secciones se sacaron y se lavaron tres veces con
buffer de acetato y se montaron en láminas de vidrio con una gota de Dapi (1 uM
mL-1), preparado en 90% de glicerol, para la coloración de DNA. Al igual que el
protocolo de Silva, et al. (2000), se usaron raíces frescas y se omitió el paso de
fijación. La principal diferencia en este trabajo, fue la especie vegetal empleada y
el tipo de raíces utilizadas, la condición de estar previamente micorrizadas, la
variación en los tiempos de lavado, la concentración de citrato utilizada y las
variaciones en el tiempo de coloración con el indicador de Aluminio-Lumogallion.
2.6 ANÁLISIS EN MICROSCOPIA CONFOCAL
Los tratamientos fueron diseñados en un experimento factorial completamente
aleatorizado, la unidad experimental estuvo compuesta por quince secciones de
raíces coloreadas para cada concentración de Al, tanto en raíces micorrizadas y
sin micorrizar, tres replicas fueron consideradas para cada tipo de raíces. Para
los controles de autoflurescencia se consideraron secciones de raíces no
micorrizadas expuestas al Al y sin Lumogallion, raíces micorrizadas expuestas al
Al y sin lumogallion y raíces no expuestas al Al y con Lumogallion.
Las muestras fueron examinadas durante las primeras ocho horas después de la
preparación utilizando un Microscopio invertido, confocal laser de barrido (LSM700 Carl Zeiss), condiciones de magnificación: 20x/0,60 apertura numérica o
40x/1,25. Para la visualización de núcleos y estructuras coloreadas con Dapi,
se utilizó un láser UV con longitudes de excitación de 351 y 361 nm y un láser
para la visualización del complejo Al-Lumogallion de argón al 100%,el
fotomultiplicador utilizado para recoger la fluorescencia se fijó entre 405 y 639 nm.
144
144
La intensidad de fluorescencia emitida se recogió a longitudes de onda de 500 a
550 nm. La intensidad de la fluorescencia, obtenida en las imágenes como
resultado de la unión del colorante Lumogallion- al Al a las diferentes estructuras
celulares de la raíz y a las hifas de hongos micorrizicos arbusculares, fueron
interpretadas como captación de Al, y se analizaron mediante el aplicativo
Software Matlab®.
2.7 INTERPRETACIÓN Y TRATAMIENTO DE IMÁGENES MEDIANTE EL
APLICATIVO SOFTWARE-MATLAB®
Las imágenes de las raíces tanto micorrizadas como sin micorriza se evaluaron
teniendo en cuenta la intensidad emitida por la fluorescencia del Lumogallion a
las diferentes concentraciones de Al ensayadas y con relación a los controles de
auto fluorescencia, las señales de intensidad se evaluaron mediante la aplicación,
the Image Processing Toolbox™ software. Para realizar el procesamiento digital
de las imágenes se realizaron los siguientes pasos: (a) Evaluación de la
distribución del Aluminio en las estructuras radiculares- Todas las imágenes
que dieron fluorescencia con el Lumogallion, se procesaron utilizando el aplicativo
software MATLAB®, por medio de la herramienta RGB(Red, Green and Blue) a
una imagen indexada, con el fin de conocer sus índices de color y los
componentes de los mismos que permitierá analizar la distribución e intensidad
del color del marcador de fluorescencia en las imágenes utilizando el método
Mínimum variance quantization. (b) Comparación de la intensidad de
fluorescencia (color verde).Una vez detectadas la distribución del Al en los
tejidos radiculares, se analizaron las muestras de raíces (laminas) para cada uno
de los tratamientos. De acuerdo a Floyd (2002) y Jahne (1997), se utilizó una
función que escala los datos de color de la imagen por datos, utilizando límites de
mínimos y máximos, tales como el patrón de comportamiento de color, q u e
p e r m i t i ó visualizar las intensidades del color verde mediante una escala y de
esta manera diferenciando la presencia de aluminio a lo largo de la imagen
145
145
procesada. Una vez realizado este procedimiento se seleccionaron imágenes
representativas de cada tratamiento y se seccionaron a un tamaño de corte de
111X51 pixeles, el valor de intensidad del Lumogallion se pasó a escala de grises,
se asignó el valor del color verde al respectivo valor en la tonalidad de grises,
posteriormente se ecualizó la imagen y se visualizó su histograma de intensidad,
la ecualización se usó para generar una distribución uniforme de la imagen
mediante la asignación de un mismo número de pixeles para cada nivel de gris del
histograma, finalmente se diferenció la estructura en relación al fondo. La
función de ecualización de MATLAB utilizada fue histeq choosing a grayscale
transformation to minimize.
2.8 DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADISTICO
El diseño experimental para el análisis por microscopia confocal consistió en un
diseño de factores 3x5, tres niveles de Aluminio (50, 100, 200 ppm
respectivamente) y 5 estructuras celulares: (1) raíces micorrizadas, y estructuras
de raíces no micorrizadas (2) núcleos, (3) pared externa,(4) pared interna de la
raíz y (5) células del ápice radicular productoras de mucilago. Los resultados
fueron analizados mediante la comparación de medias por Tukey, y análisis de
ANOVAS, con un diseño completamente aleatorio. Todas las estadísticas se
realizaron con el software SPSS 20 y programa estadístico R.
146
146
3. RESULTADOS
3.1 ANÁLISIS Y VERIFICACIÓN PRELIMINAR DE LA SIMBIOSIS
El porcentaje de colonización micorrizica obtenida en las raíces de palma aceitera
de
60
días
de
edad,
se muestran
en
el Cuadro 1. Las
imágenes
correspondientes se muestran en la Fig. (1)
Cuadro 1. Porcentajes promedios de colonización micorrizica en raíces de palma
de 6 0 d í a s d e edad.
Diámetro de raíz Colonización total
mm
%
Arbúsculos
%
Hifas
%
Vesículas
%
0.88-1.0
94.7±5.0
45±3.0
40±3.0
22±3.0
1.2-1.85
72.0±5.0
6.0±1.0
35±3.0
33±2.0
Figura 2. Estructuras de colonización micorrízica en raíces de palma aceitera
con coloración Azul tripano.
-a. Hifas internas en raíces de 1,85 mm de diámetro escala de la barra = 60 μm; b.
vesículas de hongos micorrizicos en raíces de 1,0 mm de diámetro, barra = 60 μm c.
147
147
Detalle de un arbúsculo, barra = 20 μm d. Micelio externo a lo largo de células de la
raíz- barra =50 μm.
3.2 OBTENCIÓN DE IMÁGENES DE SECCIONES DE RAÍCES JÓVENES DE
PALMA ACEITERA POR MICROSCOPIA CONFOCAL
Las secciones longitudinales de raíces de palma aceitera mostraron una
intensidad de fluorescencia diferente en cada una de las concentraciones de Al
ensayadas y para cada una de las estructuras de raíces con y sin micorrizas En
la Fig.(3),se muestran las imágenes obtenidas por microscopia confocal utilizando
el complejo colorante Dapi+Lumogallion de los ápices radiculares de palma
aceitera, a 200 ppm de Al: (A1) imagen obtenida con DAPI, en (A2): señal
fluorescente en la región de la caliptra y células productoras de mucilago;
mostradas en el recuadro y la fluorescencia emitida utilizando el colorante
Lumogallion. En (A3): imagen procesada con los filtros para Dapi y Lumogallion
resaltando la zona de acumulación del aluminio en el meristemo apical y en las
células productoras de mucilago (véase el recuadro). En la sección B, se muestra
la respuesta de fluorescencia de los núcleos de tejidos meristemáticos de una raíz
terciaria en desarrollo de palma aceitera, en B1 la imagen con Dapi, en B2 con
Lumogallion y en B3 utilizando los dos filtros Dapi+Lumogallion, nótese en el
recuadro la intensidad de la señal fluorescente emitida por los núcleos, que
corresponde a la captura del Al en la estructura. En la sección C, se muestran las
imágenes de los controles utilizados para la autofluorescencia.
En C1 se muestran las raíces de palma aceitera no micorrizadas expuestas a Al y
sin Lumogallion, en C2 raíces de palma aceitera micorrizadas con Al y sin
lumogallion y en C3 las raíces de palma aceitera sin Al, sin Lumogallion. En la
parte inferior se muestra en (D) raíz terciaria micorrizada de palma aceitera,
expuesta a 100 ppm de Al, en el recuadro la intensidad de fluorescencia emitida
por las hifas micorrízicas y en (E) la señal emitida de la fluorescencia
148
148
.
Figura 3-Raíces de palma aceitera con y sin micorrizas expuestas
a
concentraciones de Al, coloreadas con Dapi y Lumogallion.
Fig.3-(A1, A2, A3): barra 50 µm -ápices de raíces sin micorrizas expuestas a 200 ppm Al. (B1, B2,
B3): barra 50 µm- sección de una raíz lateral expuesta a 200 ppm de Al. Cada imagen muestra la
fluorescencia con Dapi, Dapi+Lumogallion respectivamente, la flecha y el recuadro muestran los
sitios con mayor respuesta de fluorescencia. (C1, C2, C3): controles; raíces no micorrizadas con Al
sin Lumogallion, raíces micorrizadas con Al sin Lumogallion y raíces no expuestas Al con
Lumogallion, respectivamente. (D) raíz terciaria micorrizada de palma aceitera, (E) Núcleos de
tejido meristemático de una raíz cuaternaria emergente, (D–E): ambas expuestas a 100 ppm, en el
recuadro el área de mayor intensidad de fluorescencia.
149
149
de núcleos del tejido meristemático de una raíz cuaternaria que está emergiendo,
ambas imágenes corresponden a un tratamiento con 100 ppm Al y las
imágenes fueron tomadas utilizando los dos filtros tanto para la coloración de
DAPI como para la coloración de Lumogallion, a simple vista las diferencias en
intensidad fluorescente mostradas en las imágenes de la Fig.(3), no se pueden
diferenciar por la intensidad de fluorescencia
3.3 DISTRIBUCIÓN E INTENSIDAD DE LA FLUORESCENCIA
Todas las estructuras que presentaron fluorescencia con el Lumogallion, se
procesaron utilizando el aplicativo software MATLAB®, por medio de la
herramienta RGB, sigla del inglés (Red, Green and Blue), a una imagen indexada,
con el fin de conocer sus índices de color y los componentes de los mismos que
permitió realizar el análisis de la distribución e intensidad del color del marcador
de fluorescencia utilizando el método mínimum variance quantization.
En la Fig. (4) Se muestran las imágenes obtenidas por microscopia confocal de
raíces c on y si n micorrizadas, expuestas a 50,100,200 ppm de Al (A;B;C;D)
respectivamente. Obsérvese en (A) las hifas de hongos micorrizicos arbusculares
(HMA) intracelulares en una sección longitudinal de una raíz de palma aceitera y
la intensidad de fluorescencia emitida por la pared y núcleos de HMA (mostrada
por la flecha), en (B) la intensidad de fluorescencia emitida por una hifa del
micelio externo de HMA en la parte exterior de la epidermis de la raíz, nótese la
señal débil de fluorescencia en los compartimentos celulares de la raíz (apoplasto
y simplasto). En (C) las flechas muestran la fluorescencia emitida por la unión del
complejo Al-Lumogallion en la región de la caliptra del tejido en crecimiento del
ápice radicular y en la parte inferior, la flecha muestra una célula productora de
mucilago, en el tejido de borde de la zona epidérmica, en (D) se muestra la
fluorescencia emitida por un tejido meristemático de una raíz lateral en
crecimiento. En las imágenes: A1, B1, C1, D1; se muestra la escala de las
150
150
diferentes intensidades del color verde y en A2,B2,C2,D2 se muestran imágenes
procesadas con la herramienta RGB del aplicativo software MATLAB®, en donde
las diferentes intensidades del color verde se traducen a la escala de rojos,
verde y azul, indicando el color rojo como el 100% de intensidad, nótese la
intensidad de la fluorescencia mostrada por la flecha en hifas fúngicas internas y
externas (A2 y B2) ,en una célula secretora de mucilago, de la pared externa del
ápice radicular (flecha C2) y en los núcleos de un tejido meristemático de una raíz
lateral(D2)
Figura 4. Intensidad de la fluorescencia, complejo Al-Lumogallion en secciones
longitudinales de raíces jóvenes de palma aceitera con y sin micorrizas,
(herramienta-RGB, Software MATLAB)
151
151
Fig.4-(A, B, C, D): Imágenes de cortes longitudinales a 100µm de raíces de palma micorrizadas y
sin micorrizar, obtenidas por Microscopia confocal. (A1-D1): imágenes procesadas en la escala de
verdes.(A2-D2):
imágenes
con
DAPI+Lumogallion;procesadas
con
(RGB);mostrando
la
distribución del Al en el segmento de raíz, nótese que la escala del RGB permite cualificar la
intensidad de la señal de fluorescencia emitida por la unión del Lumogallion en los sitios de mayor
captura del Al en un rango desde bajo, medio y alto.
3.4 COMPARACIÓN DE LA INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA
En la Fig.(5); se muestra el resultado del proceso de comparación de la intensidad
de fluorescencia de las estructuras de raíces micorrizadas y no micorrizadas
expuestas a las diferentes concentraciones de Al (seleccionadas previamente por
la herramienta RGB), se muestra la señal de fluorescencia de las hifas fúngicas y
de diferentes células de la raíz, así: Hifas fúngicas (a1, a2, a3);células productoras
de mucilago localizadas en la zona apical de raíces jóvenes de palma aceitera
(b1,b2, b3); núcleos de tejidos meristemáticos radiculares(c1,c2,c3);células de la
pared externa de la epidermis(d1, d2, d3);células de la pared de compartimientos
internos de la raíz (e1, e2, e3). El orden de los números corresponde a las
concentraciones de Al 50, 100,200 ppm respectivamente. En la Fig. (5), se
muestra la segmentación de cada imagen a escala de grises e inmediatamente
debajo se muestra el histograma de la valoración de la intensidad media,
interpretada como captación complejo Al-Lumogallion. En la parte inferior derecha
se muestra el control de auto fluorescencia en raíces no micorrizadas y
micorrizadas expuestas a Al-y sin Lumogallion.
.
152
152
Figura 5. Captación de Al, por la intensidad de fluorescencia en raíces jóvenes de
palma aceitera micorrizadas y no micorrizadas -Software MATLAB®.
153
153
Fig.5 (a1)=hifas de HMA. (b1)=células de la caliptra productoras de mucilago (c1)= núcleos de
tejidos radiculares. (d1)= pared externa –epidermis de la raíces jóvenes de palma aceitera. (e1)=
simplasto; compartimentos internos de las paredes de la raíz. Los números: 1,2,3-; que
acompañan las letras, corresponden a las d i s t i n t a s concentraciones de Al 50, 100,200 ppm
respectivamente.
Para las tres concentraciones de Al evaluadas, la intensidad de fluorescencia (IF),
disminuye al pasar de la estructura (a1), (c1), (b1), (d1) y (e1) respectivamente y
para cada una de tres concentraciones de Al evaluadas. La Fig. (.6); muestra que
la (IF) es mayor para concentraciones mayores de Al: IF200 (rojo)>IF100
(azul)>IF50 (verde), excepto para la estructura (4) pared externa-epidermis en la
concentración de Al 200 ppm, en donde se observa una reducción mayor de la IF,
y no sigue los patrones observados para los demás casos.
Figura.6 Intensidad de Fluorescencia ( Lumogallion-Al) en raíces de palma
aceitera con y sin micorrizadas, expuestas a diferentes concentraciones de Al.
Fig.6 El gráfico muestra en el eje Y: los niveles de intensidad de la fluorescencia. En el eje X: el
primer número corresponde a la concentración de Al y el numero entre paréntesis corresponde a la
estructura celular.
154
154
Aparentemente en la Fig.6, se observan dos grupos de estructuras en cuanto a la
respuesta de fluorescencia (IF): Grupo1, formado por las estructuras (1): Hifas
fúngicas, (2): núcleos, (3): células productoras de mucilago del ápice radicular, las
cuales muestran en general una señal de fluorescencia más alta y proporcional
con la concentración de Al ensayada. Grupo 2: (4): células de la pared externa de
la raíz y (5) células de la pared interna de la raíz, mostrando una señal de
fluorescencia más baja que el Grupo 1.
El promedio de intensidad de la fluorescencia de cada una de las estructuras
radiculares micorrizadas y no micorrizadas fue hallada mediante la comparación
de medias (n=45), encontrándose en las Anovas diferencias estadísticamente
significativas (P<0,0001) para cada una de las concentraciones de Al y
estructuras evaluadas como se muestra en la Fig (7).
Figura 7. Gráfico de la intensidad de fluorescencia en raíces micorrizadas y no
micorrizadas expuestas a concentraciones de Al .
Fig.7- Izquierda: Anova Grafico, para cada una de las concentraciones de Al (50, 100,200 ppm
respectivamente) y por estructuras.Derecha: Eje X:(1) Hifas fúngicas de HMA, (2) núcleos del tejido
radicular. (3) células productoras de mucilago del ápice radicular (4) células de la pared externa de
la epidermis radicular (5) células de la pared interna, eje Y: intensidad de Fluorescencia (P<0,001)
En el Cuadro 2, se muestra los promedios de IF para cada estructura.
155
155
Cuadro 2. Intensidad de Fluorescencia en raíces de palma aceitera con y sin
micorriza(n=45).
ESTRUCTURA
MEDIAS
5
4
3
2
1
25.7
31.6
81.5
105.0
115.0
Estructuras: (1) Hifas fúngicas,(2)núcleos,(3) células productoras de mucilage del
ápice radicular,(4) Simplasto-paredes internas de la raíz,(5)Células de la pared
externa-epidermis de la raíz.
Estadísticamente cada Estructura define un grupo homogéneo y diferente de los
demás. Las hifas fúngicas de HMA (1) mostraron mayor intensidad de
fluorescencia (IF), con un promedio de 115, y se diferencia significativamente
de las otras estructuras, seguida de la estructura (2) que corresponde a los
núcleos y tejidos en crecimiento de raíces jóvenes de palma aceitera, que también
muestra un promedio elevado(IF=102) (3) células productoras de mucilago del
ápice radicular, (4) simplasto-paredes internas de la raíz y (5) células de la
epidermis- pared externa. Los promedios hallados en los controles de
autofluorescencia (n=15) se muestran el Cuadro 3 y son representados
respectivamente en la Fig. (8)
Cuadro 3. Promedios(n=15)±D.E de auto fluorescencia hallados en controles para
las raíces micorrizadas y no micorrizadas
CONTROL
PROMEDIO
DE
GRUPOS
DESCRIPCIÓN
Raíces no micorrizadas
C3
0.04
0.06
X
expuestas al Al y con
Lumogallion
C1
0.67
0.43
X
156
156
Raíces no micorrizadas con
Al y sin Lumogallion
C2
2.30
0.61
X
Raíces micorrizadas sin Al y
sin Lumogallion
C1= raíces no micorrizadas con Al y sin Lumogallion, C2=raíces micorrizadas sin Al y sin
Lumogallion, C3= raíces no micorrizadas expuestas Al y con Lumogallion, DE=desviación
estándar-n= número de muestras.
Figura 8. Auto fluorescencia emitida por los controles de raíces de palma aceitera
con y sin micorrizas.
C1= raíces no micorrizadas con Al y sin Lumogallion, C2=raíces micorrizadas sin Al y sin
Lumogallion, C3= raíces no micorrizadas expuestas Al y con Lumogallion
157
157
4. DISCUSIÓN
4.1 VERIFICACIÓN DE LA SIMBIOSIS MICORRIZICA
Los inóculos mixtos de HMA utilizados en este trabajo fueron aislados de suelos
de palma aceitera y seleccionados preliminarmente in vitro por sus condiciones
de
germinación
y
crecimiento
en
medios
de
cultivo
modificados
en
concentraciones de Al. Los altos niveles de micorrización en palma aceitera en el
presente trabajo (Cuadro 1), demuestran que los HMA conservaron su capacidad
infectiva a pH ácido. De otro lado se observó que los valores de colonización
micorrizica para este experimento vario de acuerdo al diámetro de las raíces
consideradas para este estudio, siendo mayor la colonización para las raíces de
menor diámetro y menor la colonización para raíces de mayor diámetro, estos
resultados son consistentes con los hallados por Fisher & Jayachandran (1999),
ellos
encontraron
mayor colonización
por
estructuras
micorrízicas
como
arbúsculos y vesículas en las raíces más finas de una palma nativa del sureste de
los Estados Unidos, de igual forma los resultados obtenidos son similares a los
hallados por Corley & Thinker (2008), ellos describieron que las raíces más finas
de palma aceitera denominadas cuaternarias son las preferidas para la
colonización micorrizica, en este trabajo se encontró simbiosis micorrizica en las
raíces de este orden en un 94,7±5,0, de las muestras analizadas.
4.2 IMÁGENES DE RAÍCES JÓVENES DE PALMA ACEITERA OBTENIDAS
POR MICROSCOPIA CONFOCAL
El lavado de las raíces con 5 mM de Citrato antes de la coloración con
DAPI+Lumogallion, fue un paso clave para remover el exceso de Al ligado a las
paredes
y
para
reducir
el
ruido
que
puede
ser
generado
por
la
fluorescencia, debida a exceso de Al tanto en las muestras como en los controles
158
158
de la autofluorescencia. Estudios anteriores han demostrado que los lavados con
citrato pueden remover una mayor porción del Al adsorbido a las paredes
celulares Archambault et al.(1996);Rengel &Reid(1997); Silva, et al.(2000).La
reducción del exceso de Al es importante cuando se trabaja con concentraciones
altas de Al como en este ensayo, los tres autocontroles registraron una señal débil
de autofluorescencia, siendo mayor para el control de raíces micorrizadas sin Al y
sin tratamiento con el colorante Lumogallion Cuadro 3 (C2) y Fig.(8), estos
resultados concuerdan con un trabajo realizado por Aguilera et al (2011),ellos
demostraron la autofluorescencia de las hifas de G. intraradices bajo la
excitación de luz láser, y sin exposición a Al, sin embargo los niveles de auto
fluorescencia obtenidos no son comparables con los resultados de este estudio.
La baja autofluorescencia detectada en el control 3, donde no se utilizó Al,
sugiere que aún en tejidos no expuestos, la poca autofluorescencia observada
sea debida probablemente a impurezas de los reactivos analíticos o a la misma
manipulación de las muestras, o debidas a concentraciones iónicas de Al halladas
en los mismos tejidos. De otro lado el análisis de los valores de intensidad
emitidas en los controles de la autofluorescencia, no fueron significativos
comparados con las intensidades de fluorescencia emitidas por las estructuras
ensayadas de las raíces micorrizadas y no micorrizadas en cada uno de los tres
niveles de Al evaluados y ligadas al Lumogallion (Figs.7-8).La intensidad de
fluorescencia emitida por el complejo Al-Lumogallion-Dapi en cada uno de los
tratamientos de las secciones de raíces micorrizadas y no micorrizadas fue
evidente; a través del tejido radicular la señal vario de intensidad mostrando zonas
con mayor captación de Al, en las imágenes sin procesar(Figs.3-4),en la región
del ápice radicular zona de la caliptra y células de borde productoras de mucilago,
núcleos de tejidos radiculares en crecimiento e hifas de HMA. La acumulación de
Al en estas zonas de la raíz son consistentes con otros trabajos anteriores donde
se observó la acumulación de aluminio en diversas especies de plantas. Sasaki et
al. (1997), demostraron la acumulación del Al en el ápice de la raíz, en la caliptra y
159
159
en la zona meristemática en diversas variedades de trigo, aplicando la tinción de
hematoxilina.
En otro ensayo con ápices de raíces de Arabidopsis thaliana expuestas al Al por 7
días, illés et-al.(2006), demostraron histoquímicamente la acumulación de Al en la
zona apical, utilizando la coloración de hematoxilina y Morina. Así también
Babourina y Rengel (2009) en un ensayo con raíces de Arabidopsis thaliana
coloreadas con Lumogallion demostraron por microscopia confocal, la alta
acumulación de Al+3 en la zona madura meristemática de la raíces expuestas a
100 µm AlCl3(pH 4,2) .No obstante a est as técnicas y colorantes histoquímicas
utilizados para evidenciar las zonas de mayor acumulación de Al , los resultados
han
mostrado
que
las
zonas
de
mayor
acumulación
de
aluminio,
independientemente de la especie de planta, es la parte apical de las raíces(véase
la revisión de Kochian 1995), en particular en la zona de la caliptra, las células
parenquimatosas producen almidón y las células periféricas secretan el mucigel, o
mucilago
compuesto
principalmente por
polisacáridos
donde
el
Al
se
acumula,,como se pudo evidenciar en este estudio en las raíces de palma ( Fig.
3 -A2 y A3 y Fig.4-C), de igual forma la fluorescencia obtenida en la Fig.3 (B2,
B3, E) correspondiente a núcleos de raíces laterales y de la zona meristemática
apical mostraron alta señal de fluorescencia, demostrando también la captación
de Al, contrariamente en las paredes internas (simplasto), y en las paredes
externas de la epidermis, la señal emitida fue más débil. En un trabajo similar
utilizando microscopia confocal, Silva et al. (2000) utilizaron plántulas de soya
(Glycine max L.Merr) expuestas a concentraciones de Al, y emplearon la tinción
de DAPI+lumogallion, los resultados evidenciaron el Al-ligado a los núcleos
después de 72 horas de exposición, sin embargo no detectaron la intensidad de la
fluorescencia emitida. De otro lado en esta investigación se muestra que las
raíces micorrizadas (hifas intracelulares Fig.3-D) , e hifas extracelulares de palma
aceitera, (Figs.4-AyB),emitieron una alta señal de fluorescencia, estos resultados
se correlacionan con los trabajos realizados por Kataoka et al.(1977),ellos
160
160
demostraron que la fluorescencia del lumogallion es proporcional a la
concentración del Al, sin embargo la intensidad emitida por la unión LumogallionAl en las imágenes obtenidas por microscopia confocal, por si solas no son
cuantificables, y no se pueden diferenciar cualitativamente al ojo humano, por lo
que se hizo necesario realizar el tratamiento de imágenes.
4.3 TRATAMIENTO DE LAS IMÁGENES E INTERPRETACIÓN DE LA
INTENSIDAD DE EMISIÓN DE FLUORESCENCIA
La distribución del Al utilizando la herramienta RGB (del inglés Red, Green, Blue)
permitió preseleccionar las zonas de mayor fluorescencia en el tejido radicular,
en una escala de colores. Figs. 4 (A2, B2, C2, D2) Este sistema RGB es el que se
utiliza en todos los sistemas que forman imágenes a través de rayos luminosos, ya
sea emitiéndolos o recibiéndolos. Las técnicas actuales en el procesamiento de
imágenes permiten generar resultados de valor significativo, cuando se trabaja
con técnicas estandarizadas en cuanto a tinciones, tamaño de muestra, tiempo de
exposición a fluorocromos, tiempos de excitación, y magnificación de la imagen en
microscopia. De acuerdo a Floyd (2002); estas técnicas pueden ser capaces de
generar datos significativos, que de alguna manera describen aspectos
particulares de una muestra, por ejemplo cuando la muestra es coloreada por un
constituyente especifico, y el grado al cual tales características interactúan con el
tejido/célula, cuando el componente es conocido, entonces es posible usar datos
fotométricos para producir números que corresponden a la cantidad del
constituyente presente o sustancia a analizar, teniendo en cuenta esta teoría en
este trabajo se realizó la trasformación de las imágenes a la escala de grises
(Fig.5), mediante el análisis de intensidad
medido por los histogramas,
demostrando que las estructuras radiculares micorrizadas y no micorrizadas
emiten una señal de fluorescencia proporcional a la concentración de Al a la cual
han sido expuestas, con excepción del tejido de la epidermis de la raíz (pared
externa) que mostró un patrón de Fluorescencia diferente con relación a las
161
161
demás estructuras, y significativamente más baja (p<0,0001), sugiriendo de
alguna manera que los tejidos más expuestos al Al podrían perder la tolerancia a
la captación del Al, o de otro lado la falta de señal fluorescente podría estar
también indicando la quelación del Al por exudados propios de la raíz y que
estarían explicando los cambios de pH, que pudieron ser evidenciados en este
experimento (dato no mostrado), durante el tiempo del ensayo, en el cual se hizo
necesario corregir el pH en las soluciones liquidas de Al en las cuales las
plántulas de palma fueron expuestas por 72 h ,en donde se evidenciaron cambios
de pH hasta 5,6±0,2, durante los intervalos de monitoreo (cada 60 minutos)
necesitando el uso del HCL para mantener la solución a pH 4,3±0,1. Estos
cambios podrían estar indicando la producción de ácidos orgánicos por parte de
la planta. De acuerdo a Ma et al. (2001) se conoce que muchas especies de
plantas tolerantes al Al secretan ácidos orgánicos previniendo su acumulación en
el ápice radicular y protegiendo a la planta, en respuesta a los tratamientos de Al.
De igual forma,los resultados obtenidos en este trabajo se correlacionan de alguna
manera con el trabajo de Cristancho et al. (2011), ellos demostraron la producción
de ácido oxálico en ápices radiculares de 4 progenies de palma expuestas a
diferentes concentraciones de Al, en soluciones liquidas, demostrando que el
ácido oxálico aumenta con el incremento de concentraciones de Al a 200 ppm. De
otro lado, la captación de Al en las células de borde de los ápices radiculares que
se halló en este trabajo (Fig.4:C-C1), también estaría demostrando un importante
mecanismo para disminuir la entrada del Al en raíces de palma aceitera. De
acuerdo a Mench et al. (1987); los polisacáridos en el mucilago contienen
ácidos urónicos y los grupos carboxilos presentes podrían absorber e inactivar el
Al en la rizosfera, en otro trabajo similar, Watannabe et al. (2008) también
evidenciaron la captación de Al por el mucilago secretado por Melastoma
malabathricum L, una especie que crece en suelos tropicales ácidos.
La alta señal de Fluorescencia obtenida por las hifas de los hongos micorrízicos
arbusculares en este trabajo, es comparable de alguna manera con un trabajo
162
162
anterior de Moyer et al.(2005), ellos utilizaron ápices de raíces de la especie de
pino “Loblolly” colonizadas con “ectomicorrizas”,encontrando gran acumulación de
Al en el manto fúngico y en la red de Harting, evidenciando así, la alta
fluorescencia obtenida en las imágenes y poca fluorescencia en el simplasto de
las raíces laterales, utilizando la coloración de Lumogallion, y demostrando que
alguna protección podría estar sucediendo en los tratamientos con altas
concentraciones de Al o con periodos largos de exposición, sin embargo la
ectomicorriza típicamente no coloniza todo el sistema radicular de la planta
hospedera como si lo hace la endomicorriza arbuscular utilizada en este estudio,
sugiriendo la importancia de la simbiosis micorrizica arbuscular en los suelos
ácidos.
La intensidad de la fluorescencia emitida por el complejo Al-lumogallion en las
raíces micorrizadas de palma aceitera, es consistente con trabajos anteriores que
demuestran la extensiva red de hifas producidas por los HMA y la capacidad
directa de ligar Al (Joner et al. 2000,Gohre & Paszkowski 2006) ,asi mismo la
glomalina producida por los hongos micorrizicos secuestra el Al +3, durante largo
tiempo;ésta acumulación se lleva a cabo tanto en esporas como hifas, (véase la
revisión de Seguel et al .(2013).
Los ANOVAS de los datos de la emisión de fluorescencia registrada en los
histogramas mostraron un valor promedio de fluorescencia más alto para las
raíces micorrizadas (115) seguido de los núcleos de la zona meristemática, raíces
laterales (105), y las células de mucilago (85,5). En general la acumulación del Al
en tejidos radiculares, esta soportado por trabajos anteriores que demuestran
que el sitio primario para la entrada del Al+3 son las zonas del meristemo o
tejidos en crecimiento y las zonas de elongación distal, mientras que la captación
de Al +3 vía córtex y epidermis en la zona madura del ápice es limitada.(Babourina
& Rengel 2009). La capacidad de captación del Al por los hongos micorrizicos,
hallado en el presente estudio, mediante la intensidad de fluorescencia obtenida
163
163
en microscopia confocal y posterior análisis de imágenes utilizando el aplicativo
MATLAB, es evaluada por primera vez en palma aceitera, por lo tanto no existen
trabajos comparativos similares; los resultados hallados en esta investigación
estarían soportando la importante contribución de la micorriza en la disminución
de la fitotoxicidad del Al, en los suelos palmeros.
164
164
5. CONCLUSIONES
En este trabajo se evidencia por primera vez la mayor capacidad de captura del Al
en las hifas de hongos micorrizicos arbusculares, en raíces micorrizadas con
relación a las raíces no micorrizadas de palma aceitera, demostrando que los
mecanismos internos propios de las plantas pueden ser reforzados con la
micorrización, la cual contribuye a aumentar la tolerancia de la planta al Al, por el
almacenamiento o ligación del Al. Aparentemente la palma aceitera utiliza
mecanismos de acumulación de Al en los ápices de las raíces principalmente
en la zona de la caliptra y células de borde acumuladoras de mucilago, tejidos
en crecimiento, núcleos, cuando es expuesta por largos periodos a diferentes
concentraciones de Al, de igual forma posee otros mecanismos externos como la
producción de ácidos orgánicos para disminuir los niveles de Al. Los mecanismos
exactos en la palma aceitera que son responsable para la exclusión de la raíz del
Al o compartimentalización en particular en áreas celulares son desconocidas, por
lo cual se sugiere continuar con otros estudios para dilucidar estos aspectos.
165
165
6. REFERENCIAS
Aguilera, P., Borie, F., Seguel, A., Cornejo, P.(2011) Fluorescence detection of
aluminum in arbuscular mycorrhizal fungal structures and glomalin using confocal
laser scanning microscopy. Soil Biology & Biochemistry 43: 2427-2431
Arriagada, C.A., Herrera, M.A., Borie, F., Ocampo, J.A. (2007).Contribution of
arbuscular Micorrhyzal and saprobe fungi to the Aluminium Resistance of
Eucalyptus globulus. Water Air soil pollut.182:383-394.
Archambault, D.J., G. Zhang and G.J. Taylor. 1996. Accumulation of Al in root
mucilage of an Al-resistant and an Al-sensitive cultivar of wheat. Plant Physiol.
112:1471–1478
Babourina, O., & Rengel, Z. (2009). Uptake of aluminium into Arabidopsis root cells
measured by fluorescent lifetime imaging. Annals of botany, 104(1),189-195.
Carver. B.F., & J.D. Ownby. (1995). Acid Soil Tolerance in Wheat. Advances
In Agronomy 54:117-173.
Casierra, P.F., Aguilar, Avendaño. O. (2007). Estrés por aluminio en plantas:
reacciones en el suelo, síntomas en vegetales y posibilidades de corrección.
Una revisión. Revista colombiana de ciencias hortícolas .1 (2) 246-257.
Corley, R.H.V. & P.B.H. Thinker. (2008).The oil palm. 4 ed. John Wiley and
Sons, London.
Cristancho, R. J. A., M. F. Munévar., G. A. Acosta., A. L. Santacruz, and V.
M.Torres. (2007).The relationship between soil characteristics and the distribution
of immature oil palm (Elaeis guineensis Jacq) root system. Palmas 28(1): 24–30.
166
166
Cristancho, R. J. A., Hanafi, M. M., Syed Omar, S. R. and Rafii, M. Y. (2011),
Variations in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) progeny response to high
aluminium concentrations in solution culture. Plant Biology, 13: 333–342.
De la Fuente, J.M., V. Ramírez-Rodríguez, J.L. Cabrera-Ponce, and L. HerreraEstrella (1997).Aluminum Tolerance in Transgenic Plants by Alteration of
Citrate Synthesis. Science 276:1566-1568.
Fischer, J.B&Jayachandran,K.(1999).Root structure and arbuscular mycorrhizal
colonization of the palm Serenoa repens under field conditions. Plant and soil
217:229-241
Floyd AD (2002) Quantitative data from microscopic specimens. In: Bancroft JD,
Gamble M, eds. Theory and Practice of Histological Techniques. Edinburgh:
Churchill-Livingstone; 729-747.
Göhre,V.,& Paszkowski,U (2006).Contribution of the arbuscular mycorrhizal
symbiosis to heavy metal phytoremediation. Planta, 223(6), 1115-1122.
Guerra, S.B. E., & Chacón, M. R. (2012). Arbuscular mycorrhizal symbiosis and
Acumulation of Aluminum Brachiaria decumbens and Manihot esculenta.
Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, 10(2), 87-98.
Hartley,C.W.S.1988. The Oil palm. Tercera edición.Longman.U.K.Group Limited.
England.
Haug, A.(1983).Molecular aspects of aluminum toxicity. CRC Crit. Rev. Plant. Sci.
1:345-373.M
Jahne B (1997). Digital Image Processing: Concepts, Algorithms and Scientific
167
167
Applications. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag.
Joner, E. J., Briones, R., & Leyval, C. (2000). Metal-binding capacity of arbuscular
mycorrhizal mycelium. Plant and soil, 226(2), 227-234
Kataoka. T.,Mori.M.,Nakanishi,TM.,Matsumoto.S.,Uchimi A (1997) Highly sensitive
analytical method for aluminum movement in soybean root through Lumogallion
staining Plant Res 110:305-309
Klugh K, Cumming J (2007) Variations in organic acid exudation and aluminum
resistance among arbuscular mycorrhizal species colonizing Liriodendron tulipifera.
Tree Physiol 27:1103-1112
Kochian L.V. (1995) Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in
plants. Annua Review of Plant Physiology, 46,237–260
Laing, D (2011) La deficiencia transitoria de calcio como causa primordial de la
pudrición de cogollo de palma de aceite. Informaciones agronómicas, 3: 26-52.
lléš, P., Schlicht, M., Pavlovkin, J., Lichtscheidl., Baluška, F., &
večka, M. (2006).
Aluminum toxicity in plants: internalization of aluminum into cells of the transition
zone in Arabidopsis root apices related to changes in plasma membrane potential,
endosomal behaviour, and nitric oxide production. Journal of experimental botany,
57(15), 4201-4213.
Ma, J. F., Ryan, P. R., & Delhaize, E. (2001). Aluminium tolerance in plants and
the complexing role of organic acids. Trends in plant science, 6(6), 273-278.
Mench, M., Morel, JL. and Guckert A.(1987); Metal binding properties of high
molecular weight soluble exudates from maize (Zea mays L.) roots. Biol Fertil
Soils 3:165-69.
168
168
Moyer,K., Silva, I., Macfall, J., Johannes, E., Allen, N., Goldfarb, B. and Rufty, T.
(2005), Accumulation and localization of aluminium in root tips of loblolly pine
seedlings and the associated ectomycorrhiza Pisolithus tinctorius. Plant, Cell&
Environment, 28: 111–120.Pellet, D.M., D.L. Grunes, and L.V.
Kochian. (1995).Organic acid exudation as an aluminium tolerance mechanism in
maize (Zea mays L.).Planta 196:788-795.
Phosri, C., Rodriguez, A., Sanders, I.R.,Jeffries, P .(2010).The role of mycorrhizas
in more sustainable oil palm. Agriculture, Ecosystems and Environment .135:187193
Phillips,JM., Hayman DS. (1970). Improves procedures for clearing roots and
staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment
of infection. Trans.Br. Mycol. Soc. 55: 158-161
Rengel Z, Reid RJ (1997) Uptake of Al across the plasma membrane of plant
cells. Plant Soil 192: 31–35.
Rufyikiri G, Dufey JE, Nootens D, Delvaux B (2000) Effect of aluminum on
bananas (Musa spp.) cultivated in acid solutions. I. Plant growth and chemical
composition. Fruits 55:367379
Ryan, PR., Di Tomaso, JM., Kochian LV. (1993). Aluminium toxicity in roots: an
investigation of spatial sensitivity and the role of the root cap. Journal of
Experimental Botany 44, 437–446.
Sasaki, M., Yamamoto, Y., Ma, J. F., & Matsumoto, H. (1997). Early events
induced by aluminum stress in elongating cells of wheat root. In Plant Nutrition for
Sustainable Food Production and Environment 439-444Springer Netherlands.
169
169
Seguel, A., Cumming, J. R., Klugh-Stewart, K., Cornejo, P., & Borie, F. (2013). The
role of arbuscular mycorrhizas in decreasing aluminium phytotoxicity in acidic soils:
a review. Mycorrhiza, 23(3)167-183.
Silva.R.I ., Smyth,T.J., Moxley,D.F.,.Carter,T.E., Allen,N.S., Rufty,T.W.(2000).
Aluminum accumulation at nuclei of cells in the Root Tip.Fluorescence Detection
using
Lumogallion
and
Confocal
Laser
Scanning
Microscopy.
Plant
Physiology.123:543-552
Smith, S.E., Read, D.J., 1997. Mycorrhizal Symbiosis, second ed. Academic Press,
San Diego.605
Tanoi, K., Hayashi, Y., Iikura, H., Nakanishi M.(2001). Aluminum detection by
lumogallion staining method in plants. Analytical Science 17,1455–1458
Taylor,G.J.(1991).Current
Views
of
the
aluminum
stress
response:
The
physiological basis of tolerance.Current Topics of Plant Biochemistry and
Physiology 10:57-93.
Yano K, Takaki M (2005) Mycorrhizal alleviation of acid soil stress in the sweet
potato (Ipomoea batatas). Soil Biol Biochem 37:1569-1572
Watanabe, T., Misawa, S.,Hiradate, S., & Osaki, M. (2008). Characterization of
root mucilage from Melastoma malabathricum, with emphasis on its roles in
aluminum accumulation. New phytologist, 178(3), 581-589.
170
170
CAPITULO V.
SIMBIOSIS EN PALMA ACEITERA
(Elaeis guineensis Jacq.), CON INÓCULOS MICORRÍZICOS
TOLERANTES Y NO TOLERANTES AL ALUMINIO Y
DETALLES DESCRIPTIVOS DE SUS RAÍCES
SYMBIOSIS OF OIL PALM (Elaeis guineensis Jacq.), WITH
MYCORRHIZAL INOCULA TOLERANT AND NON TOLERANT
TO ALUMINUM, AND DESCRIPTIVE DETAILS ANATOMY
ROOTS
171
171
RESUMEN
Beatriz Elena Guerra Sierra*
Los estudios sobre la micorrización con inóculos tolerantes y no tolerantes
al aluminio en palma aceitera y detalles descriptivos de la anatomía de sus
raíces en fase de vivero son escasos en la literatura científica. Se describe la
anatomía de la simbiosis micorrízica, porcentaje de colonización, producción de
biomasa seca, aspectos generales de la morfogénesis y ontogenia de raíces
laterales de palma aceitera en vivero. Se consideró un experimento factorial 2x4
para evaluar porcentaje de simbiosis micorrizica y biomasa seca de las plantas,
utilizando dos tipos de suelos ácidos, y cuatro niveles de micorrización: un Inóculo
nativo mixto,no tolerante al Al , compuesto por ±200esporas/10 g de suelo
(Glomus constrictum, Acaulospora spp, Gigaspora spp), un inóculo mixto
preseleccionado por su capacidad de germinar y crecer en medios ácidos a
concentraciones de aluminio, compuesto por ±200esporas/10 g de suelo (Glomus
geosporum,Rhizophagus manihotis, Funneliformis mosseae),y controles sin
micorriza para cada tipo de suelo.
Se utilizó un diseño experimental totalmente al azar donde la unidad en cada
tratamiento fue seis plantas, con cinco repeticiones por tratamiento. Se
muestrearon al azar raíces de 0,888mm hasta 2,65mm de diámetro y de 1cm de
longitud medidas desde el ápice al punto de corte, se tiñeron con azul tripano para
evaluar porcentaje de simbiosis y para descripciones de raíces y anatomía de la
micorriza, las muestras fueron fijadas en glutaraldehído, procesadas en resina y
seccionadas en ultra micrótomo (70-80 nm), teñidas con acetato de uranilo y
citrato de plomo; otro grupo de raíces se fijaron en FAA, deshidratadas en la serie
clásica de alcoholes, embebidas en Paraplast plus, seccionadas a 5-7µm de
grosor y teñidas con colorantes para contrastar detalles de la simbiosis y de la
morfología radicular Los resultados mostraron variaciones en las raíces con
172
172
relación al diámetro, organización vascular, desarrollo de espacios aéreos, y
grosor de acuerdo a la madurez o al tipo de raíz, permitiendo agruparlas en cuatro
órdenes. Se observó formación de raíces laterales debida a la actividad celular
proliferativa del periciclo. La anatomía de la micorrización se evidenció tanto por
microscopia ftónica y electrónica de transmisión (MET) como un continuo de
estructuras micorrízicas desde París a Arum y estuvo influenciada por el tipo de
inóculo en los primeros tres meses de la simbiosis, posteriormente se estableció el
tipo Arum en todos los tratamientos. La simbiosis fue encontrada en raíces de
tercero y cuarto orden y fue más alta con el inóculo tolerante al Al, en comparación
con el inóculo no tolerante, el mismo comportamiento se observó en la biomasa. El
análisis de varianza de los datos (ANOVA) mostró diferencias significativas en la
colonización (p<0.01) en tiempo, suelo y tipo de inóculo. El beneficio de la
simbiosis en suelos ácidos, pobres y bajos en P es mayor con inóculos
micorrízicos tolerantes al Al en comparación con inoculos micorrízicos no
tolerantes al Al.
Palabras clave: arum, inóculo preseleccionado, micorriza arbuscular, paris, raíces
de palma,
*. Doctoranda en Ciencias-Universidad Nacional de Costa Rica-.
Correspondencia: [email protected]
173
173
ABSTRACT
Beatriz Elena Guerra Sierra*
Abstract: Studies of mycorrhizal symbiosis in oil palm with tolerant and non
tolerant inoculum to Al and descriptive details of the anatomy of their roots
are scarce in the scientific literature. The anatomy of the mycorrhizal symbiosis,
colonization
rate,
and
production
of
dry
biomass,
general
aspects
of
morphogenesis and ontogeny of lateral roots of oil palm nursery is described. It
was considered a design factor completely randomized 2x4 to assess percentage
of mycorrhizal symbiosis and dry biomass of plants, using two types of acid soils
and four levels of mycorrhizae by soil tested: a mixed native Inoculum not tolerant
to Al of ±200esporas/10g of soil (Glomus constrictum, Acaulospora sp, Gigaspora
sp), and inoculum tolerant to Al ±200esporas/10g of soil (Glomus geosporum,
Rhizophagus manihotis, Funneliformis mosseae), and a control for each soil
without mycorrhizal respectively. The experimental unit in each treatment was six
plants, five replicates per treatment. Roots of 0,888 mm to 2,65 mm in diameter
and 1 cm in length measured from the apex to the breakpoint were sampled
randomly, stained with trypan blue to assess percentage of symbiosis. For
anatomical description and mycorrhization of roots, the samples were fixed in
glutaraldehyde, processed in resin and sectioned into ultra microtome (70-80nm),
stained with uranyl acetate and lead citrate, another group of roots were fixed in
FAA, dehydrated in alcohol series classical, embedded in Paraplast Plus,
sectioned at 5-7μm thickness and stained with dyes to contrast details symbiosis
and root morphology. The results showed variations in the roots relative to the
diameter, vascular organization, development of airspace, and thickness according
to maturity or type of root; allowing classification in four orders. Lateral root
formation due to pericycle cellular proliferative activity was seen. The anatomy of
mycorrhization was evidenced both by photonic and transmission electron
microscopy (TEM) as a continous of mycorrhizal structures from Paris to Arum and
was influenced by the type of fungal inoculum tested at the beginning of the
174
174
symbiosis,at final observations the Arum type was established in all treatments.The
symbiosis was found in roots of third and fourth order in all treatments, being
higher with tolerant inoculum to Al, similarly the highest biomass was observed
with the same inoculum. The analysis of variance of the data (ANOVA) showed
significant differences in colonization (p <0.01) in time, soil and type of inoculum.
The benefit of mycorrhizal symbiosis in oil palm poor soils is higher with
mycorrhizal tolerants inoculants to Al in comparatión mycorrhizal inoculants
intolerants to Al.
Keywords: arbuscular mycorrhiza, arum, paris, preselected inoculum, root palm
*Agro environmental Biotechnology Research Laboratory. MICROBIOTA Group, 1 Science department-Industrial Microbiology, Street 70, number 55-210, University
of Santander (UDES) Cacique´s Lake, Bucaramanga, Colombia.Corresponding
author: [email protected]
175
175
1.0 INTRODUCCIÓN
La Palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.), es una planta monocotiledónea
perenne, que crece en suelos tropicales de Asia, África y Suramérica, la anatomía
de sus raíces fue descrita en particular por Purvis (1956), Ruer (1967), Jourdan &
Rey (1997) y más adelante por Jourdan et al. (2000).
En forma general la anatomía de la raíz de la palma consta de una epidermis
externa, seguida de una exodermis lignificada de varias capas celulares que
rodean toda la corteza, un cilindro central con varios haces vasculares y médula
lignificada en raíces viejas, el cilindro vascular está rodeado de una capa
endodérmica y el periciclo compuesto por un solo estrato celular, las raíces
secundarias y terciarias conservan la misma estructura de la raíz primaria, pero
con menores haces vasculares. Durante su ontogenia, la raíz de E. guineensis
forma diferentes tipos de raíces en una secuencia ordenada, las raíces laterales
se originan por proliferación y diferenciación de las células del periciclo. La
radícula de acuerdo a Edelin (1984), Atger & Edelin (1994), es transitoria y es
reemplazada rápidamente por numerosas raíces adventicias que gradualmente
incrementan el desarrollo de raíces laterales hacia la periferia del sistema, a lo
largo de las líneas de crecimiento por intercalación. De acuerdo a Fisher &
Jayachandran (1999) la simbiosis micorrízica ocurre en los tres principales tipos
de palma comercial: en palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq), de coco (Cocos
nucífera L.) y palma datilera (Phoenix dactylifera L), así como también en muchas
especies de palma salvaje, debido a que la palma aceitera tiene un sistema
radicular pobre, sin pelos radiculares es usualmente colonizada por hongos
micorrízicos arbusculares (HMA),esta dependencia simbiótica fue reportada en los
primeros trabajos realizados por Morton (1942);Nadarajah (1980); St John
(1988);Blal et al. (1990);Ramlah & Mohd Tayeb, (1991)
176
176
La simbiosis micorrízica ocurre en un 85% de las plantas terrestres y la anatomía
de la colonización en las raíces se define como tipo “Arum” si se presentan hifas
intercelulares y arbúsculos; o tipo “París”, caracterizado por la formación de hifas
intracelulares, con presencia de colas hifales y colas de arbúsculos, sin embargo
se han descrito combinaciones de los dos tipos anatómicos de la micorrización,
formando así tipos intermedios. De acuerdo a Dickson (2004), la identificación de
estructuras fúngicas y la clasificación en tipos morfológicos no es fácil, la
inspección visual de la raíz en preparaciones en aplastamientos no siempre es
adecuada, especialmente donde las secciones transversales son necesarias para
determinar si las hifas longitudinales son inter o intracelulares; esto es esencial
para distinguir tipos intermedios.
Varios trabajos han demostrado los beneficios de la micorrización en cultivos de
interés agrícola y especialmente en palma aceitera, donde se ha observado el
desarrollo de mayor biomasa de las plántulas micorrizadas y mayor vigor a nivel
de pre-vivero y vivero (Motta & Múnevar 2007; Galindo & Romero 2013). Un
resumen detallado de la importancia de micorrizas en palma aceitera es soportado
ampliamente en la revisión de Phosri et al. (2010). La mayoría de los trabajos
realizados para evaluar la simbiosis micorrízica en palma aceitera, al menos en
Colombia, han sido con inóculos micorrízicos comerciales, dejando de lado los
estudios con especies nativas o seleccionadas por su capacidad de germinar en
condiciones de acidez y tolerancia a concentraciones de Al. Phosri et al. (2010)
reportó que en vivero las palmas son propagadas en suelos sin esterilizar los
cuales contienen HMA indígenas, pero la simbiosis no llega a ser efectiva debido a
las altas dosis de fósforo aplicadas en la fertilización (41,9 g/palma como P2O5),
estos hallazgos justifican el estudio, selección y propagación de estas
poblaciones, para rescatar las especies nativas, hacer un uso adecuado de la
micorriza y uso racional de fertilizantes, cobrando así importancia los estudios
encaminados a la selección de especies micorrízicas, evaluación de la tasa de
colonización y su capacidad de trasferir nutrientes de acuerdo al tipo de suelo, la
177
177
cual puede ser evaluada en la biomasa de la planta. El objetivo de este trabajo
consistió en describir algunos aspectos anatomícos de las raíces de palma y de la
micorrización en plantas desarrolladas en pre-vivero y vivero en dos suelos ácidos
pobres en nutrientes utilizando inóculos nativos tolerantes al Aluminio
y con
inóculos no tolerantes al Al, preseleccionados en un ensayo a nivel de laboratorio
por su capacidad de germinar y crecer a pH 4,5 y en concentraciones de Aluminio
desde 50 a 300 ppm (Guerra B., en prep 2014), un segundo objetivo fue comparar
el porcentaje de colonización micorrizica y la producción de biomasa radicular
desarrollada en los dos tipos de suelos; debida a los inóculos empleados
178
178
2.0 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 SITIO DE ESTUDIO Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ENSAYO
Las plántulas de palma aceitera utilizadas en el presente estudio se desarrollaron
durante 240 días en el vivero de la Cooperativa de palmicultores, ubicado en el
corregimiento El Ocho, 7°21′88″ N, 73°54′22″ W, municipio de Puerto Wilches
(Colombia), temperatura promedio 28°C, altura 75msnm y humedad relativa de
75%. El porcentaje de micorrización en raíces jóvenes de palma aceitera se
evaluó a los 30, 60, 90, 120 y 240 días de edad utilizando dos tipos de inóculos:
micorriza nativa seleccionada in vitro por su tolerancia al Al y un inóculo mixto
native no tolerante al Al; se utilizaron como sustratos dos clases de suelos ácidos,
pobres en nutrientes y con diferentes contenidos de Al, 2,1±0.3 ppm para el suelo
1 y 0,61±0,1ppm para el suelo 2 (Cuadro 1).
179
179
Cuadro 1 Análisis fisicoquímico de dos suelos ácidos de cultivos de palma
aceitera
PARÁMETROS
SUELO
1
SUELO
2
UNIDADES
MÉTODO
PREPARACIÓN
MUESTRA
Textura
arena
limo
arcilla
F.A.
66
26
8
F.A.
70
15
15
%
%
%
Bouyoucos
Bouyoucos
Bouyoucos
Bouyoucos
4,36±0.1
4,45±0.1
unidades
Potenciométrico
Relación agua:suelo
1:1
*pH
*Aluminio
2,1±0.3
0,61±0.1
ppm
Absorción
atómica
Secado
*Carbono
orgánico
2,3±0.03
1,8±0.03
%
Walkley Black
Volumétrico
Absorción
Acetato de amonio
atómica
-1
*Fósforo
5,9±0.21
12±0.3
cmol.kg
Colorimétrico
Bray II
Absorción
*Magnesio
0,61±0.18 1,1±0.25
cmol.kg-1
Acetato de amonio
atómica
Absorción
*Calcio
0,89±0.22 1,9±0.33
cmol.kg-1
Acetato de amonio
atómica
F.A.=Franco-arenoso- *= Valores promedio±desviación estándar de tres réplicas para cada suelo
*Potasio
2,63±0.25
5,6±0.22
cmol.kg-1
2.2 MATERIAL BIOLÓGICO Y SUSTRATOS
Semillas de E.guineensis (variedad DelixLame), pregerminadas y homogéneas;
con radícula de 2cm y plumula de aproximadamente 1cm, fueron desinfectadas
con ácido hipocloroso (HOCl) 50 ppm x 5 minutos, lavadas con agua desionizada
durante 10 minutosx5 veces. Se utilizaron como sustratos dos tipos de suelos
palmeros de la región de Puerto Wilches (Cuadro 1), éstos se sometieron a
solarización de acuerdo a los protocolos propuestos por Katan et al. (1976) y
Katan. & de Vay(1991), por un periodo de 45 días con volteos periódicos;
finalizado el tiempo de solarización de los suelos, se empacaron en bolsas de
capacidad 1.5kg y las semillas de palma se plantaron en el sitio de siembra donde
180
180
cada una fue inoculada con micorrizas en una concentración de ±200 esporas/10g
de suelo, de acuerdo a los tratamientos.
2.3INÓCULOS MICORRÍZICOS UTILIZADOS
Inóculo no tolerante(HMAN) al Al: Compuesto por una mezcla de ± 200
esporas/10g de suelo, de Glomus constrictum (Trappe), Acaulospora sp,
Gigaspora sp. Inóculo preseleccionado como tolerante(HMAS) al Al: esporas de
hongos micorrízicos seleccionadas en ensayos previos de laboratorio por su
capacidad de germinar en sustratos ácidos con Al; compuesto por una mezcla de
± 200 esporas/10g de suelo, de Glomus geosporum (Nicol. & Gerd), Rhizophagus
manihotis (N.C.Schenck&G.S.Sm), Funneliformis mosseae (Nicol. &Gerd.); Gerd.
&Trappe.
2.4 DISEÑO DEL EXPERIMENTO Y TRATAMIENTOS
Se utilizó un experimento factorial 2x4 completamente al azar. La unidad
experimental en cada tratamiento estuvo representada por seis plántulas
obtenidas a partir de semilla con cinco repeticiones por tratamiento.
Los factores considerados fueron: Dos suelos franco arenosos ácidos y pobres en
nutrientes (Cuadro 1), cada uno de los dos suelos, inoculados con hongos
micorrízicos seleccionados como tolerantes al Al (HMAS) y con hongos
micorrízicos no tolerantes al Al (HMAN), donde se dejaron crecer las semillas
pregerminadas de palma aceitera por 240 días, se consideraron controles sin
micorrizar para cada uno de los dos tipos de suelos ensayados como sustratos
La evaluación de la colonización micorrízica de la palma aceitera se realize en 5
observaciones:30, 60, 90,120 y 240 días respectivamente.. La biomasa seca de la
raíz se evaluó al final del experimento.
181
181
2.5 PARTE DESCRIPTIVA DE LA MICORRIZACIÓN, ONTOGENIA Y MORFOANATOMÍA DE LAS RAÍCES DE PALMA
15 secciones de raíces de cada uno de los tratamientos fueron consideradas para
realizar las respectivas descripciones
2.6 MONTAJE DEL EXPERIMENTO EN INVERNADERO
Todas las semillas de palma se sembraron a una profundidad de 1cm y se aplicó
el inóculo micorrízico inmediatamente debajo del sitio donde quedó sembrada la
semilla, las plántulas se dejaron crecer durante los primeros tres meses en bolsas
negras de polietileno de 15 x 23cm perforadas con pequeños orificios de 0,5cm de
diámetro, calibre de 0,01cm, llenadas con 1.5kg de cada suelo, durante este
periodo en pre-vivero, las plantas crecieron bajo una casa de malla con polisombra
a las condiciones de campo, las plántulas fueron regadas periodicamente con
agua destilada estéril (pH 4,4±0,1), cada plántula recibió una fertilización, a partir
del dia 45 y el día 90, con una solución mínima de nutrientes compuesta por: NO3
(1,0mM), NH4 (0,2mM), K (0,60mM), Ca (0,50mM), Mg (0,20mM), SO4 (0,15mM),
H2PO4 (10mM), Fe (20mM), B (20mM), Mn (4,5mM), Zn (0,35mM), Cu (0,16mM), y
Mo (0,06mM), finalizada la etapa de cuatro meses, todas las plántulas se pasaron
a bolsas negras de polietileno de mayor capacidad (5kg) y a su trasplante se
reinocularon con inóculos micorrízicos nativos y seleccionados de acuerdo al
tratamiento con la misma cantidad que se aplicó al inicio del montaje del
experimento, se dejaron crecer hasta completar los 240 dias, se regaron
periodicamente con agua destilada, y la solución de nutrientes se ajustó a pH 4.5
antes de ser aplicada a las plántulas. En vivero las plantas recibieron tres
fertilizaciones más a los 120, 160 y 200 días.
182
182
2.7 DESCRIPCIÓN MORFOANATÓMICA DE RAÍCES DE PALMA ACEITERA Y
SIMBIOSIS MICORRÍZICA
Para la descripción morfoanatómica de las raíces se utilizaron muestras tomadas
al azar de cada uno de los tratamientos al final del ensayo (ocho meses). Para
evaluar la colonización micorrízica en cada uno de los tratamientos, se tomarón
ápices radiculares totalmente al azar durante el periodo de observación, y al final
del ensayo. Procesamiento y tinción de raíces: Para todos los casos se tomaron
al azar 5 plantas por cada tratamiento, se lavaron cuidadosamente y se cortaron
varios pedazos de raíces. Se obtuvieron raíces de tamaño promedio desde
0,657mm hasta 3,36mm de diámetro y de 1,0-1,5cm de longitud medidos desde el
ápice al punto de corte, de éstas; un grupo de raíces frescas se escogieron para
identificar la presencia de HMA, para este propósito se utilizó la técnica de clareo y
tinción propuesta por Phillips & Hayman (1970), con modificaciones para raíces de
palma. El porcentaje de colonización micorrízica para cada uno de los diversos
tratamientos en los dos suelos se evaluó en 100 segmentos apicales de raíces
coloreadas con azul tripano, usando el método de interceptos (Brundrett et
al.1996) bajo un microscopio fotónico a 50X. Al menos 20 raíces por tratamiento,
fueron llevadas a placas de vidrio en montajes permanentes con polivinil-alcohol,
para las descripciones de la colonización micorrízica
2.8 TINCIONES PARA ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS DE LA SIMBIOSIS Y
ANATOMÍA DE LAS RAÍCES DE PALMA ACEITERA
Otro grupo de raíces, al menos 35 de cada uno de los tratamientos, fueron fijadas
en FAA y un número similar en glutaraldehído durante 24 h. Las raíces fijadas en
FAA, fueron deshidratas en la serie clásica de alcoholes con dos pasos de
aclaramiento en xilol por 4 h y embebidas en Paraplast plus®, por 24 h a 55oC.Las
muestras fijadas en glutaraldehído además fueron post-fijadas en tetraóxido de
osmio al 2% por dos h e incluidas en una serie creciente de etanol más LR White
183
183
en proporción 3:1;2:1; 1:1, 0:1 hasta LR White puro, por cuatro h en cada paso, y
finalmente 12 h más en LR White puro, las muestras fueron polimerizadas en
horno a 60 ºC por 48 h.
Secciones: Las muestras embebidas en Paraplast-plus® fueron seccionadas a
espesores de 5-7µm en micrótomo rotatorio (Spencer 820) y coloreadas con
safranina, fast green, azul de alcian y fuscina ácida para contrastar las estructuras
celulares, montadas con Entellan ®.Las raíces procesadas en resina fueron
cortadas en ultra-micrótomo (Ultracut Leica), seccionadas a 70-80 nm con cuchilla
de diamante y contrastadas con acetato de uranilo al 1% y citrato de plomo,
durante 40 min y 5 min respectivamente. Todas las secciones obtenidas fueron
utilizadas para describir las características morfo-anatómicas de las raíces de
palma aceitera y la simbiosis micorrízica. Las preparaciones de raíces frescas y
teñidas con azul tripano, así como las seccionadas en Paraplast-plus® fueron
observadas con un microscopio fotónico Nikon ® 80i eclipse, equipado con
contraste diferencial de interferencia (CDI). Las fotografías se obtuvieron con una
cámara digital Nikon® DS-2MV y las secciones obtenidas en resina fueron
observadas en un microscopio electrónico de trasmisión JEOL JEM-1011.
Por cada uno de los tratamientos finalmente se prepararon al menos 15 láminas,
para cada tinción. Las raíces jóvenes laterales que se procesaron, se definieron
como secundarias, terciarias y cuaternarias de acuerdo a los diámetros estimados
por Tinker (1976)
2.9 ESTIMACIÓN DE LA BIOMASA SECA DE LA RAÍZ
Finalizado el tiempo del experimento (240 días) se escogieron al azar plantas de
cada uno de los tratamientos, las partes constituyentes de las palmas fueron
separadas y el sistema radicular fue lavado sobre malla para eliminar el suelo
adherente, posteriormente fue secado en estufa de ventilación forzada a 75ºC por
18 h, hasta obtener peso constante; el promedio de biomasa seca fue evaluado al
menos en 5 plantas de cada uno de los tratamientos.
184
184
2.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos en la colonización micorrízica y en la biomasa en los
diversos tratamientos fueron sometidos a un análisis de varianza y la comparación
de medias se efectuó mediante la prueba de rangos múltiples de Tukey, utilizando
el sistema estadístico SPSS versión 20 y el programa estadístico R
185
185
RESULTADOS
3.1 DESCRIPCIÓN MORFOANATÓMICA Y ASPECTOS DE LA ONTOGENIA DE
LAS RAÍCES DE PALMA ACEITERA
Los diámetros, el haz vascular y la corteza, permitieron agrupar las raíces en tres
órdenes raíces secundarias, terciarias y cuaternarias como se muestra en el
Cuadro 2..
Cuadro 2. Parámetros considerados para clasificar raíces de palma aceitera en
fase de vivero
TIPO DE
RAIZ
Primaria
TAMAÑOS
HAZ VASCULAR
CORTEZA
*Máximo/Mínimo/
Promedio
diámetro (µm)
*Máximo/Mínimo/
Promedio
diámetro (µm)
*Máximo/Mínimo/
Promedio
radio (µm)
3 750 2 980 3 365 1 414 950 1182 1 169 1 015 1 092
Secundaria 2 650 2 200 2 432
Terciaria
2 100 860,5 1 687
Cuaternaria 1 080 888,0
657
BANDAS
DEL
XILEMA
Número
MÉDULA
Presencia
14-20
(SI)
668
520
613 990,0 789,0 910,0
10-12
(SI)
380
285
335 335,5 860,5 526,6
7-10
(SI)
250
190
213 213,0 452,0 344,9
5-7
(NO)
*Los valores del tamaño de las estructuras corresponden a secciones transversales de raíces de
palma aceitera.
Se describen algunos detalles morfoanatómicos de las raíces de palma aceitera
de diferentes diámetros, en la Fig.1A, se muestra una raíz primaria con grandes
áreas de aerénquima, y en la Fig.1B, una raíz secundaria que muestra la
emergencia de una raíz lateral terciaria originada en las células del periciclo., en
éstas raíces no se observó presencia de hongos micorrizicos arbusculares, pero si
en las raíces terciarias y cuaternarias (Fig.1 C-D,) respectivamente, en éstas, las
186
186
estructuras fúngicas de la simbiosis fueron especialmente abundantes en el
parénquima asociado a la corteza. En la Fig.1 D, se muestra una raíz madura con
Figura 1. Detalles morfológicos de raíces de palma aceitera y simbiosis
micorrízica en secciones transversales
A.Raíz primaria que muestra grandes áreas de aerénquima, B. Raíz de orden secundario, que
muestra la emergencia de una raíz lateral terciaria desde las células del periciclo, C-D. Secciones
de raíces terciarias y cuaternarias respectivamente, que muestran variaciones de tamaño, con gran
colonización micorrízica arbuscular en la corteza interna, por arbúsculos (arb), E. Raíz madura que
muestra una célula típica de la epidermis, F. Detalles ultra-estructurales de una célula típica del
parénquima, vacuola (v),núcleo (n).
187
187
Las células típicas de la epidermis y en la Fig.1 F, se muestran detalles
ultraestructurales de las células del parénquima, que se caracterizan por su forma
irregular ovalada, con un núcleo excéntrico y un gran nucléolo,presentando una
gran vacuola, que ocupa la mayor parte del espacio celular, apreciándose
espacios intercelulares prominentes; bien definidos.
En la Fig.2 C, se muestra el cilindro vascular correspondiente a una raíz
cuaternaria, con ausencia de médula y con menor número de vasos xilemáticos y
floemáticos en relación a las raíces secundarias y terciarias. De acuerdo a los
resultados, la formación de las raíces laterales en palma depende de la actividad
proliferativa de las células fundadoras del periciclo que se localizan próximas a los
polos del xilema. (Fig.2 E-G), estas células experimentan divisiones anticlinales
aumentando la superficie a medida que la raíz madura y concomitante con el
desarrollo del haz vascular. Posteriormente, experimenta divisiones periclinales y
anticlinales consecutivas (Fig. 2, D-E), con lo cual se forma el primordio de la raíz
lateral, (Fig. 2-F) En este primordio inicialmente solo es posible identificar la zona
que da origen a la epidermis, otro grupo de células que formará la corteza y un
agregado celular en la parte interna del primordio que formará el cilindro vascular
(Fig.2-G). Con el desarrollo a partir de la capa más externa se diferenciarán la
epidermis, de la capa intermedia se formará la corteza, en tanto que el haz
vascular se formará a partir de la capa interna. Unido a estos procesos de
diferenciación tisular se forman células de taninos asociadas principalmente a la
zona basal central del primordio (Fig. 2H)
188
188
Figura 2. Características del cilindro vascular y aspectos de la formación de raíces
laterales en palma aceitera. .
A-B-C. Raíces secundarias, terciarias y cuaternarias de palma, mostrando la zona del cilindro vascular,
número de bandas del xilema (x) y el floema (flo), D. Emergencia de raíces laterales, observe las primeras
189
189
divisiones en un solo estrato celular del periciclo, E-F-G. Diferentes fases del desarrollo de primordios de
raíces laterales, H. Células productoras de tanino
3.2 MICORRIZACIÓN
Todos los tratamientos con hongos micorrizicos no tolerantes al Al (HMAN) o
seleccionadas como tolerantes al aluminio(HMAS) establecieron simbiosis con la
palma aceitera en los dos tipos de suelos ácidos ensayados. La colonización se
presentó en las raíces terciarias y cuaternarias en todos los tratamientos. La
formación de colas hifales (Fig. 3 A) fue observada en muestras aleatorias de los
tratamientos con HMAN y especialmente en los primeros muestreos hasta el día
60, pero no fue observado este tipo anatómico de la simbiosis en los tratamientos
con HMAS, esta simbiosis se presentó en las capas celulares de la exodermis y en
la zona del esclerénquima en raíces jóvenes en diferentes grados de maduración y
lignificación de los tejidos sugiriendo un patrón de micorrización tipo Paris.
A partir del día 60 la micorrización comúnmente observada en los tratamientos con
el inóculo nativo no tolerante al Aluminio, se caracterizó por un patrón combinado
de colonización de hifas intercelulares e intracelulares, presentándose tanto en las
células epidérmicas en el esclerénquima y parénquima cortical de raíces de
tercero y cuarto orden, (Fig.3B-D). A partir del día 120 las muestras de raíces de
todos los tratamientos se caracterizaron por presentar un patrón de colonización
común con hifas intercelulares y presencia de arbúsculos Fig. 3-E, sugiriendo un
tipo anatómico de micorrización tipo Arum. Se observó este patrón de
micorrización, indistintamente en los tratamientos inoculados hasta la etapa final
del experimento, siendo mayor la colonización en las capas celulares más
externas de la corteza con hifas fúngicas intercelulares, mientras que la presencia
de arbúsculos intracelulares se encontró en las capas más internas del
parénquima cortical, y no se presentó en los estratos celulares cercanos a la
endodermis. Las vesículas fueron observadas a través del tiempo tanto en raíces
terciarias y cuaternarias después del día 45 de establecida la simbiosis, y hasta el
190
190
final del experimento, en los tratamientos con inóculos seleccionados como
tolerantes al Al, pero no en los tratamientos con inóculos no tolerantes Fig.3-F
Figura 3. Colonización micorrízica en raíces terciarias y cuaternarias de palma
con inóculos tolerantes y no tolerantes al Al.
A.Colas hifales, tipo Paris de hongos micorrizicos arbusculares (HMA), en células del parénquima
B.Apresorio de hongos micorrizicos en pared externa de la epidermis de una raíz terciaria, note la
formación de hifas intracelulares y colas hifales C. Hifas de HMA penetrando en dos células
epidérmicas de una misma raíz, note la micorrización en el tejido lignificado del esclerénquima, D.
Distribución de la colonización micorrízica desde la epidermis celular hasta la zona del parénquima
191
191
cortical. E. Células de parénquima colonizadas por hifas intercelulares (flechas) y arbúsculos
intracelulares, tipo Arum. F. Vesículas de HMA en raíces de palma aceitera.
En los cortes transversales para microscopía electrónica de trasmisión se pudo
evidenciar con detalle el patrón de colonización común que se estableció en las
últimas etapas en los tratamientos con los diferentes inóculos micorrizicos,
correspondientes al tipo Arum, caracterizado por hifas intercelulares, éstas se
aprecian con paredes definidas, gruesas y altamente contrastadas en la tinción de
acetato de uranilo al 1% y citrato de plomo, de tal forma que se diferencian de las
demás estructuras de la célula huésped (Fig 4,A_B) características que permiten
diferenciarlas en el espacio intercelular de dos células del parénquima cortical,
(Fig.4-B) por presentar núcleos prominentes, con una gran vacuola, en la Fig.(4B)
se muestra en detalle el espacio ocupado por las hifas micorrízicas en los
espacios intercelulares de las células corticales. Posteriormente estas hifas se
dividen dicotómicamente formando los arbúsculos intracelulares, Fig. (4 C), estás
estructuras se observan en estado senescente, dentro de las células corticales. Se
observa con el desarrollo de los arbúsculos, la formación de la membrana
periarbuscular (mp), caracterizada por rodear estas estructuras (Fig 4 D), se
considera a la mp como una continuación de la membrana plasmática de la célula
cortical de la planta huésped.
(
192
192
Figura 4. Detalles ultraestructurales del tipo de micorrización Arum en palma
aceitera en suelos ácidos
A. Hifa intercelular (hi) de hongos micorrizicos arbusculares, vacuola (v), membrana de la vacuola
(mv), núcleo prominente (n), nucléolo (nu) en una célula típica del parénquima B. hifas
intercelulares (hi) C. Detalles de las finas ramificaciones de arbúsculos en estado senescente y
degenerado (ad) en una célula del parénquima, D. Detalles de las finas ramificaciones de los
arbúsculos , rodeados de la membrana periarbuscular (mp).
193
193
3.3 RESULTADOS DE LA CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN DE LA
SIMBIOSIS MICORRÍZICA EN LOS TRATAMIENTOS
En la Fig. 5, se ilustra el comportamiento de la simbiosis micorrízica en los
tratamientos mostrando un patrón de colonización más alto con el inóculo de
hongos micorrízicos tolerantes al Al, tanto en el suelo 1 (panel superior -color rojo)
como en el suelo 2, (panel inferior-color azul ) en comparación con el inóculo
micorrízico no tolerante al Al que mostró porcentajes de colonización inferior a
través del tiempo de observación formando un patrón de micorrización “ondulante”
con aumentos y descensos en la colonización a través del tiempo.
.
Figura 5 Porcentaje de colonización micorrízica en raíces terciarias y cuaternarias
de palma aceitera ,en suelos ácidos con inóculos tolerantes y no tolerantes al Al.
1=HMAS, inóculo micorrizico tolerante al aluminio. 2= HMAN, inóculo micorrízico no tolerante al
Al.(30, 60 90, 120, 240); periodo de observación respectivamente.
194
194
El análisis de la varianza de los datos (Anova) de colonización mostró diferencias
significativas (p<0.01) en Tiempo, Suelo y Hongo. El factor Tiempo forma dos
grupos (120 días), y el resto de los días, como se observa en los resultados del
Cuadro 3.
Cuadro 3. Porcentaje de colonización en palma, por tipo de inóculo, suelo y
tiempo
TIEMPO
Días
30
HMAN
61.50
SUELO 1
EE
HMAS
3.10
86.50
EE
6.91
HMAN
72.50
SUELO 2
EE
HMAS
3.12
86.50
EE
4.33
60
66.75
2.93
85.25
3.50
81.00
4.38
88.25
1.80
90
66.00
3.03
80.00
4.97
72.75
5.65
87.25
2.87
120
55.00
3.86
74.50
3.29
53.75
4.50
65.75
7.78
240
64.00
2.43
81.75
2.12
77.00
2.80
81.50
2.33
HMAN: inóculo micorrízico no tolerante al Al.. HMAS: inóculo micorrízico tolerante al Al. EE: error
estándar
Con el inóculo micorrízico tolerante al aluminio (HMAS) se obtuvo mayores
porcentajes de colonización: promedios suelo 1= 81,6% y suelo 2= 81,85% con
relación al inóculo no tolerante al Al (HMAN): promedios suelo 1=62,65% y suelo
2=71,4%. La interacción Suelo X Hongo resultó ser significativa (p>=0,01), no así
las interacciones Suelo X Tiempo, Hongos X Tiempo (p>=0,10)
Las Pruebas de Rangos Múltiples (Tukey %) indicaron que hay diferencias
estadísticamente significativas (p<5%) entre los dos suelos, y entre los dos tipos
de hongos. Con relación al tiempo, se observaron diferencias significativas entre
los promedios de colonización medidos en los días 30, 60, 90 y 240
195
195
3.4 RESULTADOS DE LA BIOMASA EN LOS TRATAMIENTOS.
El promedio de biomasa disminuye en los tratamientos sin micorrizas, tanto en el
sustrato 1 como en el 2 (Fig. 6 y el Cuadro 4). Hay diferencias significativas entre
los niveles del factor (tipo de micorrización HMAN y HMAS) para ambos sustratos
(p<0,01). Los sustratos muestran diferencias marginales entre ellos (p<0,01).
Figura 6. Evaluación de la biomasa seca radicular de palma aceitera de 240 dias
de edad, con inóculos tolerantes y no tolerantes al Al, y sin micorrizas.
1) HMAS: inoculo de micorrizas no tolerantes al Al (Glomus constrictum, Acaulospora spp,
Gigaspora spp). (2)HMAN: inóculo de micorrizas tolerantes al Al(Glomus geosporum, Rhizophagus
manihotis, Funneliformis mosseae). (3) SM: sin micorrizas
196
196
Cuadro 4. Promedios de biomasa radicular en palma aceitera en los tratamientos
con inóculos tolerantes y no tolerantes al Al y sin micorriza arbuscular
TRATAMIENTO
PROMEDIO (g)
DE
EE
Suelo 1+HMAS
29,06
1,02
0,26
Suelo 2+HMAS
31,76
2,23
0,57
Suelo 1+HMAN
21,58
2,17
0,56
Suelo 2+HMAN
25,39
1,08
0,28
Suelo 1-SM
14,10
2,79
0,72
Suelo 2-SM
12,97
1,92
0,50
HMAN: inóculo micorrízico no tolerante al Al. HMAS: inóculo micorrízico tolerante al Al. SM: sin
micorriza. DE: desviación estándar. EE: error estándar
De acuerdo a Plenchette (1983), la dependencia micorrizal (DM) de una planta,
puede ser estimada mediante la expresión:
Por tanto la dependencia micorrizal de la palma aceitera en los suelos utilizados
en este estudio, y de acuerdo a los tratamientos con cada tipo de inóculo
micorrízico (Cuadro 4), se calculó así:
DM de la palma en el suelo (1) con Inóculos tolerantes al Al =51,47%;
DM de la palma en el suelo (2)con Inóculos tolerantes al Al =59,16%;
DM de la palma en el suelo (1) con Inóculos no tolerantes al Al = 34,66%;
DM de la plama en el suelo (2) con Inóculos no tolerantes al Al=48,91%.
197
197
4. DISCUSIÓN
4.1 ASPECTOS MORFO-ANATÓMICOS Y ONTOGENIA DE LAS RAÍCES DE
PALMA ACEITERA:
La estructura anatómica de las raíces de la palma aceitera, es similar a la
encontrada en las raíces de las monocotiledóneas. El cuerpo de la raíz está
formado por la epidermis de un solo estrato celular, la exodermis de varios
estratos celulares que se suberifican o lignifican según la madurez. La corteza de
naturaleza parenquimatosa que puede presentar o no espacios aéreos;
internamente y delimitando el cilindro vascular que se localiza en la endodermis y
el periciclo ambos de un solo estrato celular de grosor. El cilindro vascular está
constituido por varias bandas de xilema intercalado con bandas o agrupaciones de
floema.
La
médula,
si
está
presente,
puede
ser
parenquimatosa
o
esclerenquimática. Se pueden presentar variaciones anatómicas en las raíces
como diferencias en el diámetro, organización del cilindro vascular, desarrollo de
espacios aeríferos, grado de engrosamiento y lignificación de los tejidos
radiculares dependiendo de la madurez o de acuerdo al tipo o clasificación de la
raíz , como se pudo evidenciar en este trabajo. La formación de raíces laterales
depende de la actividad proliferativa de las células fundadoras del periciclo.
4.2 TIPO DE MICORRIZACIÓN Y SIGNIFICANCIA EN SUELOS ÁCIDOS
La simbiosis micorrízica se encontró en las raíces más finas de palma aceitera
correspondientes a tercero y cuarto orden, estos resultados son consistentes con
lo reportado en el trabajo de Nadarajah (1980). No se encontró micorrización en
las raíces de primer y segundo orden, así como tampoco en las zonas o espacios
aéreos (aerénquima), estos resultados son consistentes con el trabajo de Dreyer
et al. (2010), ellos encontraron resultados similares en un estudio comparativo de
198
198
la simbiosis micorrízica en 4 especies de palma, sin embargo a diferencia de este
trabajo, bajo las condiciones de la presente investigación, la colonización
micorrízica no estuvo restringida a la corteza interna, sino que se observó en todos
los estratos celulares de la corteza desde la epidermis, exodermis, y parénquima
radicular en raíces de tercero y cuarto orden (Fig. 3-4), éstos resultados estarían
soportados por Brundrett & Kendrick (1990 a y b), ellos observaron que los puntos
de entrada de las plantas colonizadas por HMA estuvieron cercanos al ápice de la
raíz donde las paredes celulares aún no estaban lignificadas o suberizadas. La
ausencia de colonización micorrízica en raíces de primero y segundo orden podría
estar relacionada a su estructura anatómica, al anillo celular de esclerénquima en
la corteza externa que ofrece una barrera a la entrada de los hongos y a los
espacios celulares o aerenquimas en la corteza interna donde debido a la
reducción del tejido celular no se observó colonización, características que fueron
observados igualmente por Dreyer et al. (2009) en el estudio de micorrización con
4 especies de palma.
El tipo de simbiosis micorrízica predominante en palma aceitera a nivel de previvero y vivero en las dierentes muestras analizadas en este trabajo con inóculos
tolerantes y no tolerantes al Al fue del tipo Arum, éste se caracteriza por la
colonización intercelular de hifas, y formación de arbúsculos intracelulares, este
tipo anatómico de simbiosis se presentó tanto en los dos tratamientos con los
inóculos micorrízicos y en los dos tipos de suelos ácidos ensayados, sin embargo
en las primeras observaciones aisladas de los tratamientos con inóculos no
tolerantes al Al se apreciaron colas hifales, ausencia de arbúsculos e hifas
intracelulares sugiriendo una colonización tipo Paris, estos resultados son
consistentes con lo reportado por Smith & Smith (1997); Dickson et al. (2007)
quienes han señalado que ambos tipos de micorrización, Arum y Paris, se han
descrito para la familia Arecaceae. En general los factores que podrían determinar
el tipo anatómico de la formación de la micorriza en plantas, no se han
determinado con exactitud, algunos trabajos han mostrado que el genoma fúngico
199
199
es importante, por ejemplo Cavagnaro et al. (2001), observaron en tomate
colonización tanto tipo Arum y Paris, utilizando diversas especies micorrízicas,
ellos demostraron que tres especies fúngicas (R. intraradices, F. mosseae y G.
versiforme) formaban estructuras tipo Arum, otros tres hongos Scutellospora
calospora, G. coronatum, Gigaspora margarita formaban estructuras tipo Paris,
estos hallazgos son comparables de cierta manera con los resultados obtenidos
en la micorrización en palma aceitera en este trabajo, pues el inóculo tolerante al
Al compuesto por G. geosporum, R. manihotis, F. mosseae, formó siempre
estructuras tipo Arum , sin embargo el inóculo no tolerante al Al, compuesto por la
mezcla de esporas de Gigaspora sp, Glomus constrictum, Acaulospora sp formo
tanto estructuras tipo Paris en las primeras observaciones y estructuras tipo Arum
al final de las observaciones de la simbiosis. De otro lado, la formación de dos
tipos anatómicos diferentes en la simbioisis en palma con el mismo inóculo no
tolerante ,sugiere que podría ser debido al establecimiento o competencia de las
especies dentro del mismo inoculo mixto, no obstante otros estudios han
demostrado que el tipo anatómico de la micorriza podría estar bajo control de la
planta huésped (van Aarle et al. 2005).
De otro lado, las vesículas fueron observadas con la tinción en azul tripano (Fig.
3F), en todos los tratamientos tanto con el inóculo de esporas micorrízicas
seleccionadas y nativas, sugiriendo que la simbiosis debida a las especies de
Glomus presentes en cada uno de los inóculos mixtos fue efectiva, pues de
acuerdo a Abbott (1982) las especies de Acaulosporas y Gigasporas nunca
desarrollan vesículas. Independientemente a los tratamientos. La aparición de
vesículas, en las muestras siempre estuvo precedida de las observaciones de
arbúsculos, en diferentes periodos. La ocurrencia de las vesículas se relaciona
con el almacenamiento de nutrientes y podría estar relacionada con la baja
cantidad de fósforo en los suelos ácidos ensayados, estos resultados podrían
relacionarse con el trabajo de Pérez & De La Ossa (2013), ellos trabajaron con la
simbiosis micorrízica de pastos en suelos ácidos Colombianos, y correlacionaron
200
200
los parámetros físico-químicos con la presencia de arbúsculos y vesículas en
suelos con alto contenido de calcio, magnesio y potasio y bajos valores de
nitrógeno y fósforo, similares a los suelos utilizados en este trabajo.
Las imágenes obtenidas a partir de las secciones trasversales de las raíces de
palma y las preparaciones por microscopía electrónica de trasmisión (MET)
sirvieron para observar con exactitud la presencia de hifas en los espacios
intercelulares, característicos en el tipo anatómico de micorrización Arum, que fue
el patrón de colonización mas predominante en palma, bajo las condiciones de
este estudio, además se pudo observar los arbúsculos formados dentro de la
vacuola de una célula cortical, rodeados por una capa del citoplasma de la célula
huésped, conocida como membrana peri-arbuscular (mp), y mostrada en la Fig.
4D De acuerdo a Dexheimer et al. (1985), esta estructura es una modificación
funcional de la membrana plasmática periférica que conserva las propiedades de
tinción y algunas actividades similares a la mp de la célula de la cual se deriva. De
acuerdo a Balestini & Bonfante (2005), la importancia de esta estructura radica en
que delimita una zona interfacial (matriz interfacial o apoplasto) la cual es una
zona altamente especializada con respecto a las moléculas localizadas dentro de
ella y la cual tiene una importancia en la trasferencia de nutrientes entre la
simbiosis, por lo cual se resalta en los hallazgos obtenidos por las imágenes.
4.3 RESULTADOS DE LA SIMBIOSIS MICORRÍZICA Y BIOMASA EN LOS
TRATAMIENTOS:
Los suelos en los que crecieron las plántulas a nivel de vivero fueron suelos
pobres en nutrientes con bajo contenido de P (Cuadro 1) y en estrés ácido, puesto
que la fertilización y el agua de riego también fue ajustada al pH de los suelos, sin
embargo, la colonización micorrízica no se vio afectada en ninguno de los
tratamientos debido a las condiciones de acidez o bajos nutrientes. A pesar del
bajo contenido de nutrientes en los dos tipos de suelos ensayados, las
201
201
fertilizaciones con soluciones mínimas ayudaron a mantener el desarrollo
fisiológico de las plantas. El promedio del porcentaje de colonización fue mayor
con los inóculos tolerantes al Al (HMAS), en ambos tipos de suelos (81,6%81,85% para el suelo 1 y 2 respectivamente; en comparación con el inóculo
micorrízico no tolerante al Al (HMAN) que mostró un promedio del porcentaje de
colonización entre 62,65%-71,4% para el suelo 1 y 2 respectivamente. Las
diferencias encontradas en la dependencia micorrizal al estimar la biomasa
estuvieron influenciadas más por el tipo de inóculo micorrízico, que por la cantidad
de P de cada uno de los suelos, siendo los hongos tolerantes al Al, los que
mostraron mayor influencia en la dependencia micorrizal (DM) de las plantas. En
general, al comparar los resultados de la biomasa seca obtenida en los
tratamientos con micorrizas e indistintamente de los inóculos siempre fue mayor
en comparación con los testigos sin micorrizas, de acuerdo a estos resultados
Motta & Munévar (2005), encontraron que la inoculación con hongos micorrizicos
en plantas de palma en fase de vivero, acumulaba masa seca aérea 305% (más
que en plantas no inoculadas), a los 19 meses de inoculación, aunque en el
presente trabajo las condiciones del experimento fueron diferentes y solo se
evaluaron las plantas hasta los 8 meses, también se observó un beneficio de la
inoculación micorrízica en la mayor producción de biomasa en los tratamientos
micorrizados. Los resultados obtenidos estarían correlacionados con lo expuesto
por Hungría et al. (2006); en relación a que experimentalmente se ha comprobado
que la inoculación con microorganismos seleccionados y bioaumentados en los
mismos suelos de donde éstos han sido aislados permiten un incremento de la
productividad vegetal.
Los diferentes resultados obtenidos en la colonización y biomasa en este trabajo,
con los hongos micorrízicos tolerantes al Al, se relacionan de alguna manera con
el trabajo de Schultz (2001), ella encontró que los hongos difieren enormemente
en su biología y eficiencia en la promoción de crecimiento en palma de aceite. En
su ensayo utilizó plántulas micro-propagadas in vitro, bajo condiciones de
202
202
invernadero, encontró un aumento en el éxito del trasplante y una mejora en la
aclimatación de plántulas, con un proceso riguroso de selección de once (de
veinte) cepas de HMA, las cuales ocasionaron incrementos positivos de
parámetros de crecimiento y resistencia al trasplante, demostrando que la
selección de especies es más eficiente.
Los resultados obtenidos en este trabajo mostrarón que la palma aceitera tiene
mayor capacidad de simbiosis en suelos ácidos pobres en nutrientes y con
concentraciones altas de Aluminio con inóculos micorrízicos previamente
seleccionados por su capacidad de germinar y crecer a tasas superiores frente a
otras especies , en medios ácidos y a concentraciones de diferentes
concentraciones de Aluminio, en pruebas
in vitro en comparación con las
micorrizas no tolerantes al Al , sugiriendo que en el suelo existen diversas
poblaciones de micorrizas, sin embargo algunas especies son más eficientes en el
trasporte de nutrientes, para el desarrollo de las plantas, a su vez las plantas
desprovistas de la simbiosis micorrízica en suelos no tienen la misma capacidad
en la producción de biomasa cuando crecen en suelos pobres en nutrientes y bajo
contenido P. De acuerdo a otros trabajos relacionados con la efectividad de la
micorrización, Harris et al. (2009); Schultz (2001), Phosri et al. (2010) señalan que
aunque la relación hongo micorrízico-planta, no es considerada específica,
algunas especies de micorrizas, si pueden beneficiar mejor o en mayor grado un
determinado hospedero, bajo ciertas condiciones edafo-climáticas, esto es
consistente con los resultados encontrados en este estudio.
.
203
203
5. CONCLUSIONES
Los resultados mostraron variaciones anatómicas de las raíces de palma aceitera
en diámetro, organización del cilindro vascular, desarrollo de espacios aeríferos,
grado de engrosamiento y lignificación de tejidos radiculares dependiendo de la
madurez o tipo de raíz. La formación de raíces laterales depende de la actividad
proliferativa de las células fundadoras del periciclo. La asociación micorrízica
arbuscular en suelos ácidos se establece tanto con hongos nativos como
seleccionados, sin embargo los porcentajes de colonización y el rendimiento de
biomasa es mayor con inóculos micorrizicos preseleccionados por su capacidad
de germinar en las condiciones de acidez y presencia de aluminio.
El tipo anatómico de micorrización que se presentó en las plantas de palma
aceitera a nivel de vivero, fue una mezcla de estructuras reconocidas como del
tipo anatómico “Arum y Paris”, esta simbiosis se presentó en raíces terciarias y
cuaternarias, desde la epidermis, el esclerénquima hasta la zona del parénquima
cortical, siendo en esta última la mayor zona de micorrización por arbusculos. Las
diferencias anatómicas de la micorrización en palma aceitera podrían ser debidas
a las diferentes especies micorrízicas ensayadas en los inóculos utilizados en el
presente trabajo, al tiempo de la simbiosis o a algún control ejercido por la planta
huésped. las variaciones estructurales de las raíces ,asi como los espacios aéreos
también podrían estar jugando un papel importante, en la anatomia de la
micorrización.
Los resultados obtenidos en este trabajo, muestran que la palma aceitera tiene
mayor capacidad de simbiosis en suelos ácidos pobres en nutrientes y con
concentraciones altas de Aluminio con inóculos micorrízicos nativos previamente
seleccionados como tolerantes al Al, en comparación con las micorrizas no
tolerantes al Al, sugiriendo que en el suelo existen diversas poblaciones de
204
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micorrizas, sin embargo algunas especies son más eficientes en el trasporte de
nutrientes, para el desarrollo de las plantas, a su vez las plantas desprovistas de la
simbiosis micorrízica en suelos ácidos, no tienen la misma capacidad en la
producción de biomasa, que las plantas micorrizadas.
205
205
6. REFERENCIAS
Atger, C. & Edelin, C. (1994). Premiéres données sur l’architecture compareé des
systémes racinaires et caulinaires des arbres. Can. J. Bot., 72, 963–975.
Balestrini, R. & Bonfante, P. (2005). The interface compartment in arbuscular
mycorrhizae: a special type of plant cell wall? Plant Biosystems, 139, 8-15.
Brundrett, M.C. & Kendrick, B. (1990a). The roots and mycorrhizas of herbaceous
woodland plants I. Quantitative aspects of morphology. New Phytologist, 114, 457468.
Brundrett, M.C. & Kendrick, B. (1990b). The roots and mycorrhizas of herbaceous
woodland plants II. Structural aspects of morphology. New Phytologist 114, 469479.
Cavagnaro, T.R., Gao, L-L., Smith, F.A. & Smith, S.E. (2001). Morphology of
arbuscular mycorrhiza is influenced by fungal identity. New Phytologist, 151, 469475.
Dexheimer, J., Marx, C., Gianinazzi-Pearson, V. & Gianinazzi, S. (1985).
Ultracytological studies on plasmalemma formations produced by host and fungus
in vesicular-arbuscular mycorrhizae. Cytology, 50, 461-471.
Dickson, S. (2004). The Arum–Paris continuum of mycorrhizal symbioses. New
Phytologist, 163, 187–200
206
206
Dickson, S., Smith, F.A. & Smith, S.E. (2007). Structural differences in arbuscular
mycorrhizal symbioses: more than 100 years after Gallaud, where next?
Mycorrhiza, 17, 375-393.
Dreyer, B., Morte, A., Lopez, J.A. & Honrubia, M. (2010). Comparative study of
mycorrhizal susceptibility and anatomy of four palms species. Mycorrhiza, 20, 103115.
Edelin, C. (1984). L’architecture monopodiale: l’exemple de quelques arbres d’Asie
tropicale. Th. Doct. Etat., Univ. Montpellier II. 258.
Fisher, J.B. & Jayachandran, K. (1999). Root structure and arbuscular mycorrhizal
colonization of the palm Serenoa repens under field conditions. Plant and Soil,
217, 229-241.
Galindo, T. & Romero, H. (2013). Mycorrhization in oil palm (Elaeis guineensis and
E. oleifera x E. guineensis) in the pre-nursery stage. Agronomía Colombiana,
31(1), 95-102.
Guerra,S. B. & Chacón, M. (2012). Simbiosis micorrízica arbuscular y acumulación
de aluminio en Brachiaria decumbens y Manihot esculenta. Rev. Bio. Agro., 10(2),
87-98.
Hartley, C.W.S. (1988). The Oil Palm. Tropical Agriculture Series, (3rd ed.).
Longman Scientific and Technical, Harlow, 761.
Hungria, M., Campo, R. J., Mendes, I. C., & Graham, P. H. (2006). Contribution of
biological nitrogen fixation to the N nutrition of grain crops in the tropics: the
success of soybean (Glycine max L. Merr.) in South America. Nitrogen nutrition
and sustainable plant productivity. Houston: Studium Press, LLC, 43-93.
207
207
Jourdan, C. & Rey, H. (1997). Architecture and development of the oil-palm (Elaeis
guineensis Jacq.) root system. Plant and Soil, 189, 33–48.
Jourdan, C., Ferrie, N.C. & Perbal, G. (2000). Root System Architecture and
gravitropism in the oil palm. Annals of Botany, 85, 861-868.
Katan, J., Greenberger, A., Alon, H. & Greenstein, A. (1976). Solar heating by
polyethylene mulching for control of disease caused by soil-borne pathogens.
Phytopathology, 66, 683.
Katan, J. & DeVay, J. E. (1991). Soil solarization: historical perspectives,
principles, and uses. Soil solarization, 23-37.
Motta, D. & Munévar, F. (2005). Respuesta de plántulas de palma de aceite a la
micorrización. Rev. Palmas, 3, 11-20.
Morton, A.G. (1942). A study of the relationship between growth and mycorrhizal
development in the oil palm. Internal report, Lever Bros y Unilever.
Nadarajah, P., & Mikola, P. (1980). Species of Endogonaceae and mycorrhizal
association of Elaeis guineensis and Theobroma cacao. Tropical mycorrhizae
research, 232-237.
Pérez, A. & De La Ossa, J. (2013). Variables físicas y químicas del suelo y su
relación con la colonización de micorrizas arbusculares en raíces del pasto
angleton (Dichanthium aristatum Benth). Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient. 16(1), 7178.
208
208
Plenchette, C., Fortin, J.A. & Furlan, V. (1983). Growth responses of several plant
species to mycorrhizae in a soiI of moderate P-fertility. I. Mycorrhizal dependency
under field conditions. Plant .Soil, 70,199-209.
Phillips, J.M. & Hayman, D.S. (1970). Improved procedures for clearing and
staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment
of infection. Trans. Brit. Mycol.Soc., 55, 158-161.
Phosri, C., Rodriguez, A., Sanders, I. & Jeffries, P. (2010). The role of mycorrhizae
in more sustainable oil palm cultivation. Agric. Ecosyst. Environ., 135, 187-193.
Purvis, C. (1956). The root system of the oil palm, its distribution morphology and
anatomy. Journal of The West African Institute for Oil Palm Research, 1, 60–82; 4,
60-82.
Ramlah Ali, A.S. & Mohd Tayeb, D. (1991). Status of mycorrhizal research in oil
palm. PORIM Bulletin, 23, 4-14.
Ruer, P. (1967). Morphologie et anatomie du systeme radiculaire du palmier a
huile. Oleagineux, 22, 595-599.
Schultz, C. (2001). Effect of vesicular- arbuscular mycorrhiza on survival and post
vitro development of micropropagated oil palms (Elaeis guineensis Jacq.). Th.
Doct. Georg-August Universität Göttingen, Göttingen, Germany.
Sieverding, E. (1991). Vesicular-arbuscular mycorrhiza management in tropical
ecosystem. Federal Republic of Germany, Eschborn, Germany.
Smith, F.A. & Smith, S.E. (1997). Tansley Review No. 96. Structural diversity in
vesicular-arbuscular mycorrhizal symbioses. New Phytol, 137, 373-388
209
209
Smith, S. & D. Read. (2008). Colonization of roots and anatomy of arbuscular
mycorrhiza. Mycorrhyzal. (3rd ed.), 42-90. Elsevier, London.
St John, T.V. (1988) Prospects for application of vesicular-arbuscular mycorrhizae
in the culture of tropical palms. Adv. Econ. Bot., 6, 50-55
Van Aarle, I.M., Cavagnaro, T.R., Smith, S.E., Smith, F.A. & Dickson, S. (2005)
Metabolic activity of Glomus intraradices in Arum- and Paris-type arbuscular
mycorrhizal colonization. New Phytol., 166, 611–618
210
210

LISTA DE INSTITUCIONES HABILITADAS LA PAZ

Ficha técnica Aceite Crudo Palma CPO

Porta injertos: Garnem(POV) - INVISA Biotecnología Vegetal

Tríptico de actividades Rudy Fernandez julio y agosto 2015

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Ver Documento - Gobernación de Norte de Santander

22 mayNoticia Cremades, puesta de largo en Palma.

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