Presentación

Secuenciación de Nueva Generación (NGS)
para la Caracterización y Análisis de
Organismos Genéticamente
Modificados (OGM)
Marco legal
De acuerdo con el Protocolo de Cartagena sobre seguridad
de la biotecnología del convenio sobre la diversidad
biológica.
Anexo III, sobre la Evaluación del Riesgo:
a.
Una identificación de cualquier característica
genotípica y fenotípica nueva relacionada con el
organismo vivo modificado que pueda tener efectos
adversos en la diversidad biológica y en el probable
medio receptor, teniendo también en cuenta los
riesgos para la salud humana;
Diferentes regulaciones en el mundo:
•
•
•
•
Información del evento o construcción (Argentina)
Caracterización genético molecular (Uruguay)
Caracterización del OGM (México)
Caracterización del evento (Colombia)
a) Métodos convencionales de ingeniería genética:
1. Agrobacterium tumefaciens
2. Bombardeo de partículas “biobalística”
b)Nuevas técnicas de mejoramiento
1. Mutagénesis dirigida por Oligonucleótidos
2. Cisgénesis
3. Metilación de ADN, ARN-dependiente
4. Injertos en Biotecnología
5. Ingeniería reversa
6. Agro-infiltración
7. Edición de Genomas con Nucleasas
Sintéticas
8. Genómica sintética
Identificación
del OGM
Evaluación
del Riesgo
Información de la
caracterización
molecular
• Genotípica
•Fenotípica
• Análisis
• Dictamen
• NGS
• PCR
Objetivo:
Mostrar el uso de la tecnología de la
secuenciación de nueva generación para
coadyuvar en la evaluación del riego a través
de dotar de mayores elementos técnico
científicos a los reguladores en materia de
bioseguridad de organismos genéticamente
modificados.
¿QUÉ ES LA SECUENCIACIÓN?
Determinación del
orden exacto de los
pares de bases de una
región específica
de DNA
La
SECUENCIACIÓN
amplía la
información genética
del organismo a
analizar y permite
confirmar su
identidad
HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN
Secuenciación de
Maxam-Gilbert
1953
1977
Descubrimiento
de la doble
hélice del DNA
por Watson y
Crick
Secuenciación de
Frederick Sanger
Reacción en Cadena
de la Polimerasa
(PCR), desarrollada
por Kary B. Mullis
1983
Publicación del
método de
Pirosecuenciación
por Pál Nyren y
Mostafa Ronaghi
Inicio del
proyecto del
genoma
humano
1986
Applied Biosystems
pone en el mercado
el primer
secuenciador
automatizado (ABI
370)
1990
1995
Primer genoma
completo de un
organismo libre
vivo, la bacteria
Haemoplhilus
Influenzae
1996
HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN
Publicación del método
“MPSS” por Lynx
Technologies, lanzando
la Secuenciación de
Nueva Generación
(NGS)
2000
454 Life Sciences saca
al mercado la versión de
secuenciación por
Pirpsecuenciación
2003
Término del Proyecto
del Genoma humano
2004
Life Technologies
pone en el
mercado nuevas
tecnologías
2006
Sale al mercado el
secuenciador de
nueva generación de
Illumina
2010
2011
Pacific Biosciences
comercializa la
secuenciación
SMRT(del
inglés single
molecule real time
sequencing)
CLASIFICACIÓN DE LA SECUENCIACIÓN
Platform
Instrument
Year
Reads per run
Read length
Bases per run (gigabases)
3730xl
-
96
800
0.0000768
GS20
2005
200000
100
0.02
GA (launch?)
2006
28000000
25
0.7
GS FLX
2007
400000
250
0.1
SOLiD
1
2007
40000000
25
1
Illumina
GA
2008
28000000
35
1
SOLiD
2
2008
115000000
35
4
2009
1000000
500
0.45
ABI Sanger
454
Illumina
454
454 GS FLX Titanium
Illumina
GAIIx
2009
440000000
75
33
Illumina
HiSeq
2010
2000000000
100
200
GS FLX+
2011
1000000
700
0.5
IonTorrent
PGM 314 chip
2011
100000
100
0.01
IonTorrent
PGM 316 chip
2011
1000000
100
0.1
IonTorrent
PGM 318 chip
2011
5000000
100
0.5
Illumina
GAIIx
2011
640000000
75
48
Illumina
HiSeq
2011
3000000000
100
600
Illumina
MiSeq
2011
30000000
150
4.5
SOLiD
5500xl
2011
3000000000
60
180
PacBio
RS C1
2011
36000
1300
0.045
IonTorrent
PGM 318
2012
5000000
200
1
IonTorrent
Proton
2012
50000000
200
10
Illumina
MiSeq
2012
30000000
250
8.5
PacBio
RS C2
2012
36000
2500
0.09
PacBio
RS C2 XL
2012
36000
4300
0.155
454
EVOLUCIÓN EN LA ESCALA DE LOS PROYECTOS CIENTÍFICOS
www.454.com
EVOLUCIÓN DE LA CAPACIDAD DE
SECUENCIACIÓN
Ejemplo:
Genoma humano
Antes
20 instituciones de todo el
mundo
10-13 años de trabajo
 3,000 millones de dólares
Miles de científicos y
técnicos
Ahora
 1 laboratorio de
secuenciación masiva
 14 - 45 días
 Aprox 5,000-10,000
dólares (Dependiendo del
nivel de análisis deseado)
 Un par de científicos y
técnicos
SECUENCIACIÓN TIPO SANGER
 Usa dideoxinucleotidos.
 Reacción de Terminación de Cadena.
SECUENCIACIÓN DE NUEVA
GENERACIÓN (NGS)
Secuenciación masiva en paralelo, durante la cual
millones de fragmentos de ADN a partir de una
sola muestra se secuencian al unísono.
¿Qué es la Bioinformática?
¿Qué es la Bioinformática?
Genoma
completo
RNAseq
CHIPseq
NGS
Exoma
Metageno
mica
Deteccion
de SNPs
Datos
B+T+C+E+Q
Integración
conceptual y
computacional
Modelos
Biología
TI
Bioinformática
C.
Computacionales
Estadística
Química
Bioinformática
Biología
Ciencias computacionales y
Bioinformática tecnologías de la información
Ejemplo: Búsqueda de una
secuencia de ADN o de proteína
en una base de datos.
Es la integración y análisis de datos (principalmente moleculares)
mediante una intersección de modelos bioquímicos, matemáticos y
biológicos a través de métodos computacionales y de tecnologías de la
información para extraer y estructurar información de tipo biológica,
química, epidemiológica, etc a partir de dichos datos.
Bioinformática para OGM
• La bioinformática se aplica en el análisis de OGM a distintos niveles:
1.
2.
3.
4.
5.
Estructuración de la información molecular regulatoria asociada a OGMs
en bases de datos.Ejemplo: GmoDetectionDatabase
(http://gmdd.shgmo.org/) .
Desarrollo de software para la toma de decisiones. Ejemplo: GMOseek
(http://www.gmoseek.com/) .
Desarrollo de algoritmos para el análisis de datos de secuenciación masiva
de OGM. Ejemplo: Transeq.
(http://www.nature.com/srep/2013/131003/srep02839/full/srep02839.ht
ml)
Creación in-silico de sistemas análisis de OGM: Ejemplo: Métodos de
detección por primers y PCR.
Integración de datos moleculares, bases de datos, información regulatoria
y datos de secuenciación en sistemas de análisis que permitan caracterizar
muestras transgénicas: Ejemplo: Trabajo del CNRDOGM.
Bioinformática básica para análisis de datos de NGS:
Los dos tipos básicos de análisis:
Mapeo a referencia y ensamble de novo
Tomado de : http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_000000014352/thesis_nocv_neu.pdf
Consideración de la información de secuencia en la ley
• La palabra secuencia aparece 14 veces en el reglamento
de la Ley de Bioseguridad de OGM al 28 de Abril del 2015.
• El término secuencia se encuentra contemplado en los
títulos segundo (Permisos para las actividades con OGM) y
tercero (De las autorizaciones) de dicho reglamento.
• Aún donde el término secuencia no es usado hay
apartados donde esta información en conjunto el análisis
bioinformático podría proveer el dato requerido por la ley.
A continuación los ejemplos para el caso del titulo segundo…
Food Anal. Methods, DOI 10.1007/s12161-013-9673-x
Información solicitada en el RLBOGM que
puede ser presentada a partir de NGS
Tomado de: http://www.foodstandards.gov.au/code/applications/Documents/A1097-GM-CFS-SD1.pdf
INJERTOS VEGETALES
El injerto es la unión física de dos
plantas, la que proporciona la raíz se
llama patrón, portainjerto o pie y la
segunda es el vástago o injerto.
Ambas crecen como un solo individuo.
El portainjerto y/o el injerto pueden
transformarse a través de:
• Agrobacterium thumefasciens
• Biobalística
• Transgénesis
• Cisgenesis
• Etc.
Beatriz Xoconostle Cázares, Depto. de Biotecnología, CINVESTAV IPN
INJERTOS VEGETALES
A
B
Caracterización
Detección
Referencia
Secuenciación del
fruto y/o porta-injerto
Secuenciación de
genoma completo
PCR (diseño de
oligos)
Posibilidades:
Science 1 May 2009:
Vol. 324 no. 5927 pp. 649651,DOI: 10.1126/science.1170,397
Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 14; 109(7):
2439–2443.
Beatriz Xoconostle Cázares, Depto. de Biotecnología, CINVESTAV IPN
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR
OLIGONUCLEÓTIDOS (ODM)
Mutare (cambiar)
alteración o cambio en la información
genética (genotipo) de un ser vivo y que
por lo tanto, va a modificar las
características de éste; además se
puede heredar a la descendencia.
Técnica empleada para corregir o
introducir cambios específicos en sitios
definidos del genoma.
El oligonucleótido NO se integra al
genoma de las células de la planta
hasta que se INDUCE el Mecanismo de
Reparación que
cambia la secuencia endógena por la
secuencia deseada.
Dvorak Montiel Condado, Ph. D Profesor Tiempo Completo Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR
OLIGONUCLEÓTIDOS (ODM)
NO requiere de la introducción
de secuencias de ADN de
otras especies al genoma
natural.
Caracterización
Secuenciación por
amplicones/Resecuenciación
Detección
NA
Publicación
GA21
Dvorak Montiel Condado, Ph. D Profesor Tiempo Completo Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
METILACIÓN DE DNA DIRIGIDA POR RNA (RdDM)
La expresión de genes se modifica a
través de epigenética
RdDM induce al gen transcripcional de
silenciamiento (TGS ) de determinados
genes a través de la metilación de
secuencias promotoras. A fin de que
obtener la RdDM, los genes que
codifican para RNAs, los cuales son
homólogas a las regiones promotoras,
son liberados a las células de las
plantas por métodos adecuados de
transformación. Esto implica , en algún
momento, la producción de una planta
transgénica.
Dr. Edgar Rodríguez Negrete, CINVESTAV-IRAPUATO
METILACIÓN DE DNA DIRIGIDA POR RNA (RdDM)
Caracterización
Secuenciación de bisulfito
Detección
NA
Publicación
Methods Mol Biol. 2011;744:187-97. doi:
10.1007/978-1-61779-123-9_13.
MEJORAMIENTO GENÉTICO REVERSO
Método en el cual el orden de los
acontecimientos que conducen a la
producción de una variedad de
planta híbrida se invierte.
Se lleva a cabo a través del
silenciamiento de genes.
Hace uso de transgénesis para
suprimir la recombinación meiótica.
en pasos subsiguientes, sólo las
plantas no transgénicas son
seleccionadas.
DR. YURI JORGE PEÑA RAMÍREZ, ECOSUR CAMPECHE
MEJORAMIENTO GENÉTICO REVERSO
Hace uso de transgénesis para suprimir
la recombinación meiótica. en pasos
subsiguientes, sólo las plantas no
transgénicas son seleccionadas.
Caracterización
Detección
Referencia
Secuenciación de genoma
completo
NA
Sin referencia
DEDOS DE ZINC
Tecnología
Dedos de Zinc
Técnica de NGS
aplicable
Secuenciación de
genoma completo
Técnica de detección
aplicable
PCR de región
modificada por los
dedos de zinc
Referencia
Moreover, sequence analysis of the entire ben1(y462) mutant genome revealed only two
indels: the ZFN-induced ben-1 mutation and a
deletion unlikely to have been caused by ZFN
activity. The latter arose at a site unrelated to
the ZFN site (fig. S4) and at a frequency
consistent with spontaneous C. elegans indels
(3).
PMCID: PMC3489282
CISGÉNESIS E INTRAGÉNESIS
Tecnología
Cisgénesis
/Intragénesis
Aplicación de NGS
Secuenciación de
regiones
flanqueantes
Técnica de
detección
aplicable
PCR de
regiones
flanqueantes.
Referencia
Schubert and Williams state it would be difficult to characterize cisgenic plants
at the genomic level and monitor them after release. However, this is not the
case. As long as the insertion site differs from the native genomic site, an
event-specific PCR reaction can be developed with one primer that anneals to
the inserted sequence and another primer that anneals to flanking DNA. The
flanking DNA can be sequenced by using commonly available genome walking
kits.
Nature Biotechnology 24, 1331 - 1333 (2006)
doi:10.1038/nbt1106-1331
Agroinfiltración
Tecnología
Agroinfiltración
Aplicación de NGS
RNAseq,
Metagenómica,
Técnica de detección
aplicable
RNAseq, no
aplica PCR
Referencia
Prior to further propagation of plant tissue infected
withAgrobacterium, the plant material should be screened
for the absence of any foreign DNA sequences (e.g.,
chromosomal Agrobacterium DNA or T-DNA).
Use of Novel Techniques in Plant Breeding and Practical
Consequences Concerning Detection, Traceability,
Labeling, and Risk Assessment
GENÓMICA SINTÉTICA
Tecnología
Genómica
sintética
Técnica de NGS
aplicable
Secuenciación de
genoma completo
Técnica de
detección aplicable
PCR de marcas de
agua de “mensajes
encriptados en el
genoma”
Referencia
Creation of a Bacterial Cell
Controlled by a Chemically
Synthesized Genome
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Muchas Gracias!!!

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