クイックリファレンスカード BigDye® XTerminator 精製キットによる精製プロトコール TM 1. 反応液の調製：反応溶液の組成 反応溶液の組成 BigDye Terminator Ready Reaction Mix 8uL サンプルDNA ＊1 プライマー 3.2pmol 滅菌水 up to 20uL Total Volume 20uL ＊1 DNA量は以下を参考にしてください。 Single-staranded DNA Double-staranded DNA PCR Products （100-200bp） （200-500bp） （500-1000bp） （>2000bp） 25-50nｇ 150-300ng 1-3ng 3-10ng 10-40ng 20-50ng PCR条件＊2 Hold 25cycle Hold 2720, 2400, 9600システム 96℃ 96℃ 1min 10sec 60℃ 50℃ 4℃ 4min 5sec ∞ 2. 精製：BigDye® XTerminator TM ステップ１ 精製キットを用いた精製 XTerminator試薬の添加（96wellプレートまたは0.2ｍLチューブ を使用する場合） 反応済みサンプル 20uL + SAM溶液 90uL＊3 + XTerminator溶液 20uL＊4 Tota 130uL＊5 ステップ2 ＊2 推奨システム : GeneAmp® PCR System 9700, 2700, ＊3 反応溶液の4.5倍量を添加します。 ｝ ＊6 ＊4 よく攪拌し、反応溶液と等量を広径チップを使って分注します。 ＊5 チューブの容量によっては入りきらない場合があります。 ＊6 プレミックスする場合には、 プレミックス溶液を均一に保持するため に、十分かつ継続的な攪拌をしながら添加します。ピペッティング 中に時間がかかると、XTerminatorが沈殿するため、均一な分注が 出来ない場合があります。 ボルテックスミキサーによる攪拌 ①プレートをシール（e.g. Clear Adhesive Film 商品番号 4306311） します。 ＊7 チューブを攪拌する場合には、 チューブにキャップをしてベースにのせ、 テープで固定してからアダプタにセットします。 ②目盛りを最大にして30分間攪拌します。＊7, 8 ＊8 使用する装置の最速値（>2000rpm）に設定します。 ③1000xg、2分間で遠心します。 3. シーケンサの準備：Run moduleのインストール 3100/3130/3730システムシリーズ 3100/3130/3730システムシリーズのDataCollection ver2以降の場合は、以下のInstrument Protocolの 作成を行います。なおこの作業は初回のみです。 注意！：以降の操作は3100/3100-AVANT DataCollection ver1.xには対応していません。 Instrument Protocol の作成 ①DataCollectionソフトのProtocol Manager画面、 Instrument Protocolセクションで「New」をクリックします。 ②Protocol Editor のRun Module の項目で、XTerminator 試薬用のランモジュール＊9 とDyeSetを選択し、各Protocol に名前を付けてください＊10。 310 システムシリーズ 従来のサンプルと同様のRun Moduleを使用します。 ＊9 ランモジュールは以下のサイトからダウンロードします。 http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/BDX.html ＊10 プロトコール名の例：BDx_StdSeq50_POP7_BDv1 4. シーケンスラン 3100/3130/3730 システムシリーズの場合 1. シーケンサへのセット 以下の手順に従い、サンプルをシーケンサにセットします。 《96wellプレートの場合》 ボルテックス終了後のプレートにセプタをかぶせ、装置にセットしてください。 《1本/8連チューブの場合》 上清を全量96wellプレートに移してからセットしてください。 注意！：BigDye XTerminator 精製キット専用のInstrument Protocolを使用する場合、最低でも40μL以上の液量が必要です。 もし液量が不足している場合は、SAM溶液にて調整してください。 注意！：BigDye XTerminator 精製キットを含むサンプル溶液は、熱変性を決して行わないでください。 2. ランのスタート Plate Record の作成とラン ①DataCollectionソフトのPlate Manager画面の「New」をクリック します。 ②従来通りサンプル情報を入力した後、Instrumentカラムには “3. シーケンサの準備：Run moduleのインストール”で作成した Instrument Protocolをプルダウンメニューから選択します。 ③従来のサンプルと同様にランをスタートしてください。 310 システムシリーズ 1. シーケンサへのセット 上清を全量（20μL以上）シーケンス用チューブに移して装置にセットしてください。 2. ランのスタート 従来のサンプルと同様にランをスタートしてください。 注意！：BigDye XTerminator 精製キットを含むサンプル溶液は、熱変性を 決して行わないでください。 希釈例： 精製済みサンプル Hi-Di Formamide TM 20uL 10uL 重 要 ：シグナル強度が強すぎる場合には、サンプルをHi-Di Formamideで 希釈してからシーケンサにセットしてください。 BigDye® XTerminatorTM 精製キットのアプリケーションおよび技術情報サイト 以下のサイトの「テクニカル情報」に公開されています。 http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/BDX.html 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用はできません。 ©Copyright 2007, Applied Biosystems Japan Ltd. All right reserved. Applied Biosystems, ABI PRISM, BigDye and GeneAmp are registered trademarks and AB（Design）, Applera and Hi-Di are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the U. S. and/or certain other countries. All other trademarks are the property of their respective owners. Printed in Japan 商品番号：JP759
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