実験テキストPDF ファイルは - 千葉工業大学工学部｜生命環境科学科

5S 生命環境科学科
遺伝子工学実験テキスト
平成 27 年度版
―担当教員―
坂本泰一
河合剛太
滝口泰之
根本直樹
橋本香保子
黒崎直子
1
目次
学生実験に関する注意事項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 3
「予習レポート」、
「実験ノート」および「実験報告書」の作成・・・
7
スケジュール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10
実験１ : RNA の試験管内合成・・・・・・・・・・・・・・・・・・ I-1
（坂本泰一）
実験２ : RNA の二量体調製実験・・・・・・・・・・・・・・・・・ II-1
（河合剛太）
実験３ : 大腸菌の増殖と抗生物質の効果・・・・・・・・・・・・ III-1
（滝口泰之）
実験４ : 微生物形質転換実験・・・・・・・・・・・・・・・・・・ IV-1
（根本直樹）
実験５ : 磁気結合抗体を用いた細胞の分離・・・・・・・・・・・・ V-1
（橋本香保子）
実験６ : DNA の抽出・遺伝子型決定・・・・・・・・・・・・・・・ VI-1
（黒崎直子）
2
学生実験に関する注意事項
１．実験を始める前の注意事項
1) 実験計画を立てる
学生実験は限られた時間の中で行われるので、各自が一連の作業をス
ムーズに進めなければいけない。そのためには、事前に実験テキストを
よく読み、目的と方法を十分に理解し、しっかりと実験計画を立てる必
要がある。
2) 実験に適した身支度をする
実験内容によっては、薬品やサンプルの付着によって衣服が汚染し
たり損傷したりするので、各実験担当者の指示に従い、白衣を着用す
る。また、裸足でサンダル履きはしない、長髪の場合は束ねる、指輪
やネックレスなどの装飾具は外す、ヒールの高い靴は履かない、爪は
のばさない、ネイルの装飾は控えるなど、実験に適した身支度をして
おく。安全メガネを携行し、必要に応じて着用する。
3) 安全確保の確認
火災等、万一の事故に対処するため、消火器の設置場所や避難経路な
どを事前に確認しておく。遺伝子工学実験室は P2 仕様になっているた
め、非常の場合以外は、遺伝子工学実験室から直接廊下への出入りはで
きない。
3
２．実験中の注意事項
1) まじめな態度で取り組む
学生実験時間中は、担当教員の説明や指示をよく聞き、集中して実験
に取り組まなければならない。不真面目な態度は、実験がうまく進まな
いだけでなく、周りの学生に迷惑をかけ、大きな事故につながるので、
各自が責任ある行動を取ることが求められる。このことを守れない学生
に対しては、すぐに実験を中止させ、以後のすべての実験に参加させな
い措置をとる場合がある。
2) 周辺の整理・整頓
各自が使用する実験台、器具類、装置類は、常にきれいにし、整理・
整頓する。また、実験室に持ち込んだカバン類は、各担当教員の指示に
従って、適切な場所に置いておく。
3) 飲食・喫煙の禁止
実験室内では、絶対に飲食・喫煙をしてはいけない。
4) 火気および危険薬品類に対する注意
火気を扱うとき、および引火性・発火性の危険薬品を扱うときは、そ
れらの取り扱いに十分注意し、火災を発生させないよう細心の注意を払
わなければならない。
5) ケガ・火傷に対する処置
実験作業中は、各自ケガや火傷には十分に注意しなければならない。
・
刃物などでケガをした場合、およびガスバーナーなど高温の装置を
使用中に火傷をした場合は、応急手当をすると同時に、担当教員に
知らせる。
・
酸やアルカリなど危険な薬品類が皮膚や目などに直接かかったと
きは、すぐに流水で洗い流し、担当教員に知らせて応急手当を受け
る。
・
ケガや火傷の症状が重い場合は、すぐに保健室または病院に行って
手当を受ける。
4
6) 薬品類をこぼしたとき
実験中に薬品類をこぼしたときは、すぐに備え付けの雑巾やペーパー
タオルなどできれいに拭きとる。とくに多くの学生が共用する機器・装
置類は、常にきれいに保っていなければならない。これを怠ると事故の
原因になりかねないので、各自が常に気をつける必要がある。
7) 器具類を破損したときの処置
実験中にガラス器具を破損したときは、すぐに備え付けのほうき類で
破損したガラスを回収し、担当教員の指示を受けて、適切な場所に廃棄
する。また、装置類を破損した場合は、すぐに担当教員に知らせて、処
置の指示を受ける。
8) 機器・装置類の異常に気づいたとき
機器・装置類が正常に作動していないことに気がついたら、作業を中
止し、すぐに担当教員に報告して指示を受ける。
9) 実験記録の作成
各自が実験時間内に行ったことは、必ず実験ノートに書き込み、あと
で行う実験報告書の作成に活用する。また、実験時間内にすべての作業
を終了し、やり残したことがないように注意する。実験に関して不明な
点があるときは、担当教員に質問し、必ず実験時間内に解決するよう心
がける。
5
３．実験が終わった後の注意事項
1) 廃棄物の処理
実験で出た廃棄物は、次のように処理する。
・
有機溶媒、無機溶液、酸・アルカリ溶液、菌懸濁液などは、担当教
員の指示に従い、一旦所定の廃液容器に貯蔵する。勝手に流しなどへ廃
棄してはいけない。また廃棄する液体を入れていた容器についても、担
当教員の指示に従い、洗浄または廃棄する。
・
特に危険性のない廃棄物は、可燃ゴミや不燃ゴミに分別して廃棄す
る。
2) 器具の洗浄および機器・装置類の清掃
繰り返し使用する器具については、丁寧に洗浄し、所定の位置に戻す。
また、使用した機器・装置類およびその周辺をきれいに清掃する。
3) 実験台および床の清掃
各自が使用した実験台をきれいに清掃する。また、周りの床もきれい
に清掃する。
4) 電気、ガス、水道の確認
使用した装置類の電源、ガスの元栓、水道の蛇口を確認する。
5) 実験終了の報告
すべての作業が終了し、退室する際は、その旨を担当教員に報告する。
6
「予習レポート」、「実験ノート」および「実験報告書」の作成
学生実験の成績は、各自が作成した「予習レポート」、「実験ノート」
および「実験報告書」などから総合的に判断され、採点される。
予習レポート
予習レポートを作成する目的は、行う実験の目的と内容、およびその
周辺知識を事前によく理解し、実験当日の作業を円滑に進められるよう
にするためである。
予習レポートに記載する内容の詳細とその形式、提出期限等について
は、各実験担当教員の指示に従う。
予習レポートを作成する際には、次のポイントを参考にするとよい。
・
行う実験の基本原理や理論、具体的な実験方法が書かれている文献
をよく読んで、それらの内容を分かりやすく要約する。
・
実験に関連する周辺知識、初めて目にする学術用語、意味を忘れた
用語などを丁寧に調べ、予習レポートのなかにまとめておく。
実験ノート
学生実験を行うときは、必ず大学指定の実験ノートを持参する。
実験ノートには、予習した内容、実験の手順と注意点、実験の経過、測
定結果、実験中に受けた指示、各自が気づいたことなど、学生実験に関
わるあらゆることを記録する。記録した内容は、後述する「実験報告書」
の作成や、再実験において活用する。
また、試薬の濃度計算、器具・装置類の取り扱い方法、実験手順など、
実験当日に行う作業に関してあらかじめ準備をしておき、実験ノートに
記載し、当日の作業を円滑に進められるように努める。
実験ノートのでき具合がその実験の成否を大きく左右するといえる
ので、こまめにノートをとり、内容をよく整理することを習慣づけるこ
とが大事である。
7
実験報告書
実験が終了したら、行った内容や結果および考察を整理し、それらを
実験報告書としてまとめ、指定の期日までに各担当教員に提出する。
実験報告書は、以下の要領で作成する。
・報告書を作成するときは、見る側の立場に立って、文章や図表を順
序よく構成し、丁寧に書くことを心掛ける。
・報告書は、「実験課題名および実験者名」、「緒言（または目的）」、
「実験方法」、「結果」、「考察」、「まとめ」、「参考文献」の順に記載
するのが一般的である。
・「実験課題名および実験者名」などは、指定の表紙に記載する。
・「緒言（または目的）」では、行った実験の目的、意義、基本原理
などを整理して、分かりやすく記載する。説明に際して参考文献を
利用した場合は、後述する「参考文献の書き方」に習って、その出
典を明確にする。
・「実験方法」では、行った実験を手順通りに分かりやすく記載する。
このとき、実験テキストに書かれていることをそのまま写すのでは
なく、テキストに書かれていない細かな事柄まで記載する。
・「結果」では、実験で得られた結果を図や表を使いながら文書で分
かりやすく説明する。図を使う場合、その表題を必ず図の下に明記
する。また、表を使う場合、その表題を必ず表の上に明記する。
・「考察」では、実験結果から明らかになったことや推察されたこと
を説明する。その際に参考文献を利用した場合は、後述する「参考
文献の書き方」に習って、その出典を明確にする。
・「まとめ」では、実験の内容、得られた結果と考察について、それ
らの要点を簡潔に記載する。
・「参考文献」では、実験報告書を作成した際に利用したすべての文
献を明記する。文献の引用は、つぎの方法で行う。
１．引用した文献は、著者名、論文タイトル、雑誌名、巻、ページ、出
版年の順に明記する。
（書き方の例）
1) Hikida, Y., Kimoto, M., Yokoyma, S., Hirao, I., Site-specific
fluorescent probing of RNA molecules by unnatural base-pair
transcription for local structural conformation analysis. Nature
Protocols 5, 1312-1323 (2010).
2) 木川隆則、無細胞系を用いたタンパク質の大量合成、生物物理 40,
8
391-394 (2000).
また、本の場合は、著者名、書名、出版社、引用したページ、出版年の
順に明記する。
3) Sambrook, J., Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p.128（ 2001）．
4) Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K.,
Walter, P.著、細胞の分子生物学第 5 版、ニュートンプレス p.358
（ 2 0 1 0 ）．
２．文献を引用したら、本文中で文献番号を用いて、「現在までに、 ○
○ は、 ××であることが知られている
9
1)
。」のように必ず明示する。
H27 年度遺伝子工学実験スケジュール
週
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
日
4/8
4/15
4/22
5/13
5/20
5/27
6/3
6/10
6/17
6/24
7/1
7/8
7/15
7/22
7/29
実験１
（坂本）
実験 2
（河合）
実験 3
（滝口）
実験 4
（根本）
実験 5
（橋本）
実験 6
（黒崎）
予習レポートは、各実験の 1 回目に提出。実験報告書は、各実験で指定された日に提出。
3 回目の週には講評を行う。
10
I-1
I-2
I-3
I-4
I-5
遺伝子工学実験
RNA の二量体調製実験
１．目的
RNA の機能や構造を解析するために，コンホメーションが整った RNA 試料
を調製することは重要なステップである．
本実験では， H I V- 1 のゲノム R N A の二量体化開始部位（ D I S ）に由来する 3 9
残基の R N A を用いて，２種類のコンホメーションになるよう試料の調製を行い
（第１週）， PA G E 法により分析する（第２週）．なお，第３週では，実験結果
の解説を行う．
２．実験方法
2.1. 注意事項
汗や唾液には R N A の分解酵素が含まれている．実験の際には，必ずポリビニ
ル手袋を着用し，必要な内容であっても試料に向かって話さないこと．
重合前のアクリルアミドは神経毒である．試薬が皮膚に付着しないように注
意すること．また，舞い上がった試薬を吸い込まないよう十分に注意すること．
2.2. 試薬および器具
2.2.1. 器具および装置
マイクロピペット，ピペットチップ，マイクロチューブ，チューブラック，
アイスボックス，ゲル染色用トレイ，恒温槽，泳動プレート（ 2 枚），コーム，
U 字型シリコンパッキング，電気泳動装置，微量遠心分離機，シリンジ，ゲル
写真撮影装置
2.2.2. 試薬
R N A 溶液， 1 0 % アクリルアミド溶液（ T B M および T B E ）， 1 0 % A P S 水溶液，
T E M E D ，電気泳動用緩衝液，色素溶液，トルイジンブルー O（和光純薬工業製）
II-1
2.3 実験方法
2.3.1. RNA のコンホメーションの調製
１）配付される RNA 試料を， 10 µl ずつ２本に分取する．なお，液体試料
を分取する際には，必ず遠心して試料をチューブの底に集めること（ス
ピンダウン）．
２）つぎのいずれかの方法でコンホメーションを調製する．奇数番号の班
は（ A ），（ B ）を，偶数番号の班は（ A ），（ C ）を行う．
（Ａ） 95℃ の恒温槽で 5 分間保温したのち，氷水で急冷する．
（Ｂ） 95℃ の恒温槽で 5 分間保温したのち，室温放置で徐冷する．
（Ｃ） 55℃ の恒温槽で 30 分間保温したのち，室温放置で徐冷する．
３）フリーザーに保管する．
2 . 3 . 2 . PA G E 用ゲルの作成
※ 実験台ごとに， TBE のゲルと TBM のゲルのどちらかを１枚作成する．
実験室の前方（スクリーン側）の実験台の班は TBE のゲルを，後方（入
口側）の実験台の班は TBM のゲルを作成することとする．
１）泳動プレート，コーム，U 字型シリコンパッキングをエタノールでよ
く拭き，２枚の泳動プレートの間に U 字型シリコンパッキングをはさみ，
クリップでとめ，コームを挿す．
２） 10%アクリルアミド溶液 10 ml に， 10% APS 水溶液 100 µl を加えてよ
く混ぜる．さらに， TEMED 5 µl を加えてよく混ぜたのち，速やかに，
泳動プレートの間に注ぎ込み，コームをさし， 10〜 20 分静置する．
３）ゲルが固まったら，泳動プレートを湿らせた紙で包み，さらにラップ
で包んでクリップでとめ，次週まで冷蔵庫に保存する．
II-2
2 . 3 . 3 . PA G E
１）前週に作成したゲルのコーム，U 字型シリコンパッキングを外し，超
純水でゲル片を洗い流してから電気泳動装置にセットし，泳動用緩衝液
を注ぎ込む．もし気泡が入っていたら，シリンジなどで取り除く．
（ TBE
のゲルと T B M のゲルを組み合わせてセットする．）
２）前週に用意した RNA 試料 10 µl と色素溶液 10 µl を混合する（２組．
色素は T B E のゲル用と T B M のゲル用で異なるので注意する）．
３）ウエルをシリンジで掃除したのち，各試料を２種類のゲルの各レーン
に 10 µl ずつロードする．
４） 150 V で約 30 分間，泳動する．この間に電気泳動結果を予測し，ノー
トに書く．
５）泳動後，泳動プレートからゲルを丁寧にはがしゲル染色用トレイに入
れ，トルイジンブルーO をゲルがつかるように加え，染色する．染色液
は，ゲルをまんべんなく浸したらすぐに元の容器に戻す．
６）ゲル染色用トレイにお湯を入れ，目的のバンドが見えやすくなるまで
ゲルを脱色する．お湯は適時交換し，手で振りながら約 25 分間脱色す
る．
７） RNA のバンドを観察できたら，写真を撮る．
補足
ゲル
TBE
8 9 m M T r i s , 8 9 m M ホウ酸， 2 m M E D TA ・ 2 N a
TBM
89 mM Tris, 89 mM ホウ酸， 5 mM MgCl2
色素溶液
TBE 用
グリセロール，キシレンシアノール（ X C ），ブロモフェノールブルー（ B P B ）
TBM 用
1 mM MgCl2，グリセロール， XC， BPB
II-3
予習レポートの課題
① RNA の化学構造について調べる．
② RNA の二次構造および立体構造について調べる．
③ RNA の非変性条件での電気泳動について調べる
※引用文献を示すこと．できるだけ教科書や文献を引用すること．
報告書の課題
① 非変性 PA G E の各バンドは何を示しているか．
② ３種類の条件での処理によって二量体のコンホメーションはどのよう
になったか．
③ もとの試料のコンホメーションはどのようであったか．
※報告書は，文章で分かりやすく作成すること．
発展的な課題
① ３種類の条件での処理によって，それぞれどのようなことが起きたと考
えられるか．
② H I V- 1 ゲノム R N A の二量体化について調べ，今回の実験との関連を説明
する．
DIS に由来する 39 残基の RNA のコンホメーション
参考文献
・
河合・清澤編，機能性 RNA の分子生物学，クバプロ
・
その他，生化学あるいは分子生物学の教科書等
・
Structural
Requirement
Immunodeficiency
Vi r u s
for
the
Ty p e - 1
Tw o - S t e p
Genome,
Dimerization
Ta k a h a s h i ,
K.,
of
Human
Baba,
S.,
C h a t t o p a d h y a y, P. , K o y a n a g i , Y. , Ya m a m o t o , N . , Ta k a k u , H . , a n d K a w a i , G. ,
RNA 6, 96-102 (2000).
（河合剛太）
II-4
遺伝子工学実験
大腸菌の増殖と抗生物質の効果
１. 目
的
抗生物質の存在下で大腸菌を振とう培養し、最小発育阻止濃度 (MIC)を測定す
る。この実験を通じて微生物の基本的な取り扱い方を習得する。
２. 予
習
以下のことを調べて予習レポートを作成する。予習レポートは自筆とする。
(1)
大腸菌の形状、大きさと主な性質
(2)
細菌濃度の測定方法
(3)
細菌の増殖曲線（図に誘導期、対数期、定常期、死滅期を書き込み，それ
ぞれの期を説明する）
(4)
大腸菌の世代時間
(5)
世代時間の計算式
G = 0.301(t－ t 0 )/(log 10 N t － log 10 N 0 )を誘導する。
（ G：世代時間、 N 0 ：測定開始時 t 0 における菌濃度 (cells/ml)、
N t ：測定時 t における菌濃度 (cells/ml)）
(6)
抗生物質の定義
(7)
最小発育濃度の定義と測定方法
(8)
ストレプトマイシンの化学構造、作用機構と大腸菌に対する MIC 値
(9)
肉エキスとペプトンの主な成分
(10)
リン酸緩衝液と生理食塩水
３．実験方法
3.1 試薬および器具
3.1.1 器具
滅菌ピペット (全量 1 ml) 20 本、試験管 20 本、試験管立て 1 個、L 型試験管（ L
字管） 8 本、シリコ栓 8 個、アルミ栓 20 個、 300 ml 三角フラスコ 1 個、ガスバ
ーナー 1 個、 100 ml メスシリンダー１個、 10 ml メスピペット 1 本、ビーカー、
ガラス棒、 BTB 試験紙、軍手、油性ペン。
3.1.2 試薬および培地
III-1
塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリ
ウム 12 水塩、ペプトン、エルリッヒ肉エキス、ストレプトマイシン硫酸塩、70％
エタノール水溶液、逆性石鹸溶液。
3.1.3 装置
高圧滅菌装置（オートクレーブ）、試験管用吸光度計 (測定波長 660 nm)、試験
管ミキサー、インキュンベーター、振とう培養機、化学天秤。
3.1.4 使用菌株
大腸菌（ Escherichia coli NBRC 3301 株）：前培養した大腸菌懸濁液として用
意してあるものを用いる。
3.2 実験操作
3.2.1 培地の調製と高圧蒸気滅菌
リン酸緩衝化生理食塩水（ phosphate buffered saline，PBS，表１）100 ml を
調製し、試験管に分注する。液量は 2.0 ml を 6 本、 5.0 ml を 3 本とする。これ
らにアルミ栓をし、栓の上部に液量と班番号を記入する。普通ブイヨン培地（表
2）100 ml を調製し、1 N NaOH 水溶液または 1 N HCl 水溶液で pH を 7.0～ 7.2
に調整する（ BTB 試験紙）。これを L 字管 7 本に 8.9 ml ずつ分注し、シリコ栓
をする。シリコ栓の部分はアルミ箔で覆う。アルミ箔の上に班番号を書く。食塩
水および培地については高圧蒸気滅菌を行う。滅菌条件は 121℃ ，20 分間とする。
3.2.2 最少発育阻止濃度の測定
ストレプトマイシン硫酸塩を 10.0±0.5 mg 秤量し、これを滅菌 PBS 5.0 ml を
含む試験管に加え、試験管ミキサーで撹拌し、溶解させる (2000 µg/ml)。この溶
液の一定量を滅菌ピペットで滅菌 PBS 5.0 ml を含む試験管に加えてストレプト
マイシン硫酸塩の濃度を 160 µg/ml とする。この溶液 2.0 ml を滅菌 PBS 2.0 ml
を含む試験管に加えて濃度 80 µg/ml とする。同様に 2 倍希釈を繰り返し、 40，
20 µg/ml のストレプトマイシン硫酸塩の溶液をそれぞれ作成する。滅菌した普通
ブイヨン培地 8.9 ml を含むＬ字管に 20～ 160 µg/ml のストレプトマイシン溶液
1000 µl をそれぞれに加え ,最終ストレプトマイシン濃度 2,4,8,16 µg/ml を含む培
地溶液を作成する。また、滅菌した普通ブイヨン培地 8.9 ml を含むＬ字管 1 本に
滅菌した PBS 1000 µl を加え、ストレプトマイシン硫酸塩濃度を 0 µg/ml とする。
さらに、吸光度測定の０合わせ用として濃度 2000 µg/ml のストレプトマイシン
を 1100 µl を滅菌した普通ブイヨン培地 8.9 ml を含むＬ字管 1 本に加える。こ
III-2
の高濃度ストレプトマイシンを含む L 字管を基準として，5 本の L 字管の 660 nm
吸光度を測定する．さらに、前培養した大腸菌培養液 100 µl をストレプトマイシ
ン濃度 0～ 16 µg/ml の 5 本の L 字管それぞれに加え、吸光度を測定する。大腸菌
を接種した 5 本のＬ字管を 37℃ で振とう培養する。高濃度ストレプトマイシンを
含む L 字管には大腸菌を接種せず、振とう培養機に入れない。大腸菌を接種後に
振とう培養機にセットした時刻を開始時として、その後 30 分毎に 660 nm の吸光
度を測定し、発育曲線を作成する。振とう培養機から出して測定している時間も
培養時間に含める。吸光度測定は培養開始時から 3 時間行う。
3.2.3 消毒および後処理
菌の付着したガラス器具、培地はすべて高圧蒸気滅菌（ 121℃ ， 20 分間）を行
う．高圧蒸気滅菌できないプラスチック製品などは逆性石鹸溶液に 1 日浸す。机
の上，白衣，手などは 70％エタノール水溶液を噴霧する。
４．結
果
・大腸菌に対するストレプトマイシンの最少発育阻止濃度を決定する。
・ストレプトマイシン無添加の発育曲線から大腸菌の世代時間を算出する。
・ストレプトマイシンの化学構造と作用機作について調べておくこと。
５．考
察
得られた結果より何が言えるか、を簡潔な文章で記す。また、関連する文献な
どを参考にし、実験で得られた結果と比較検討してみる。
課題 ① 最小発育阻止濃度（ MIC）を決定する。図表などのデータを使って MIC
決定の根拠を示す。
課題② 抗生物質無添加の増殖曲線から世代時間を求める。
６．まとめ
実験結果を項目別に簡潔な文章にまとめる。
参考文献
日本生物工学会編：生物工学実験書，培風館 (1992).
日本生化学会編：新生化学実験講座 17 巻，微生物実験法，東京化学同人 (1992).
堀越弘毅ら：ビギナーのための微生物実験ラボガイド，講談社サイエンティフ
ィック (1993).
東京大学医科学研究所学友会編：微生物学実習提要，丸善 (1985).
III-3
杉山純多ら：新版微生物学実験法，講談社 (1999).
表１
リン酸緩衝化生理食塩水
KCl
0.20 g
KH 2 PO 4
0.20 g
Na 2 HPO 4 ・ 12H 2 O
2.90 g
NaCl
8.00 g
1000 ml
イオン交換水
pH 7.0-7.2
表2
普通ブイヨン培地
肉エキス
3.0 g
ペプトン
10.0 g
NaCl
5.0 g
1000 ml
イオン交換水
pH 7.0-7.2
（滝口泰之）
III-4
遺伝子工学実験
微生物形質転換実験
１．目的
プラスミドを用いた遺伝子操作は，遺伝子工学実験の基本技術である．生物
が行う反応やその機能を産業や医療に応用するために今日発展した, タンパク
質工学， RNA 工学，ゲノム工学，細胞工学といったバイオテクノロジー（生命
工学）分野の実験では，プラスミドの取扱いが欠かせない．
本実験では，第 1 週にプラスミド取込み能力（コンピテンシー）をもたせた
大腸菌（コンピテントセル）を作成し，プラスミドの導入（形質転換）と抗生
物質耐性による選択を行う. 第２週は，プラスミドの制限酵素処理とアガロー
ス電気泳動による DNA の分離を行う．これらの実験を通して，プラスミド取
扱いの基礎について学ぶ．なお，第３週では，実験結果の解説を行う．
２．実験方法
2.1. 注意事項
本実験では，物理的封じ込めレベル P1 の遺伝子組換え実験を行うので，遺
伝子組み換え大腸菌の取扱いに注意すること．
実験で使用する高速冷却遠心分離機と電気泳動層は，危険を伴うので注意し
て扱うこと．遠心分離機は，ローターの対角線上にサンプルを配置し，バラン
スを確認すること．電気泳動層は，通電中は蓋を空けないこと．
大腸菌を取扱う操作では，他の雑菌による汚染（コンタミネーション；通称
コンタミ）が発生しやすいので，実験台や手指の雑菌をアルコールで殺菌し，
清潔に保つこと．
2.2. 試薬および器具
2.2.1. 器具および装置
マイクロピペット，ピペットチップ，マイクロチューブ，チューブラック，
アイスボックス，コーンラージ棒, ビーカー, ガスバーナー，恒温槽，電気泳
動装置，高速冷却遠心分離機，ゲル写真撮影装置
2.2.2. 試薬および微生物
プラスミド溶液，5 0 m M 塩化カルシウム溶液 , 抗生物質入り L B 寒天培地 , L B
IV-1
液体培地，エタノール，制限酵素，制限酵素反応用緩衝液， DNA 電気泳動用ロ
ーディング緩衝液，分子量マーカー，1 % アガロースゲル（ D N A 染色材入り），
TA E 緩衝液，大腸菌培養液 ( E s c h e r i c h i a c o l i D H 5 α 株 )
2.3 実験方法
2.3.1. コンピテントセルの作成（１班あたり 2 サンプル分ずつ調製すること）
１）予め用意された対数増殖期に達した大腸菌の培養液（ 37℃ の LB 液体
培地で培養）を 1 . 5 m L ずつマイクロチューブに分取し , 氷上で急冷する．
２）高速冷却遠心分離機で , 6,000 rpm, 4℃ , 5 分間遠心し , 集菌する．
３）上清を捨て, 氷冷した 1
ml の 50 mM 塩化カルシウム溶液を加えて ,
温めないように注意しながら優しく懸濁する．
４）再度 , 高速冷却遠心分離機で , 6,000 rpm, 4℃ , 5 分間遠心し , 集菌する．
５）上清を捨て, 再度氷冷した 1
ml の 50 mM 塩化カルシウム溶液を加え
て, 温めないように注意しながら優しく懸濁する．
６）高速冷却遠心分離機で , 6,000 rpm, 4℃ , 5 分間遠心し , 集菌する．
７）上清を捨て , 氷冷した 100 µL の 50 mM 塩化カルシウム溶液を加えて ,
温めないように注意しながら優しく懸濁する．
2.3.2. 形質転換
１）コンピテントセルが入ったマイクロチューブに 1 µL のプラスミド溶
液 (200 ng)をそれぞれ加えて , チップの先で混ぜる．
２）氷上に 15 分間置く .
３） 42℃ で 1 分間 , 熱処理する．
４）氷上に 2 分間置く.
５） 500 µL の LB 液体培地を加えて , 37℃ で 45 分間培養する．
６）ガスバーナーの下で , マイクロチューブ内の溶液のうち 100 µL を抗
生物質入り LB 寒天培地にのせ , エタノールを付けて炙ったコーンラー
ジ棒を使って寒天培地全体に塗布する．
７）プレートを逆さまにして , 班名 , サンプル名を記入し , 37℃ で一晩培
養する.
2.3.3. プラスミドの制限酵素処理
１） 1.5 mL チューブに , 反応液全体が 10µL となるように , 5 µL の滅菌水 , 3
µL のプラスミド溶液 , 1 µL の 10x 制限酵素反応用緩衝液 , および 1 µL
の制限酵素をこの順で加えて, 優しく混ぜる．このとき, 制限酵素反応
用緩衝液と制限酵素の組み合わせに注意すること. また, 制限酵素を 2
IV-2
種類加える場合は, 滅菌水の量を減らすこと.
２） 37℃ で 30 分間保温する．
2.3.4.制限酵素処理済みサンプルの電気泳動
１）電気泳動層に TA E 緩衝液とアガロースゲルをセットする．
２）ゲル左端のレーンに 5 µL の分子量マーカー，それ以外の各レーンに
1 µL のローディング緩衝液を加えたサンプルを全量ロードする．
３） 100 V で 20 分程度泳動する．
４）ゲル写真撮影装置で DNA 断片のバンドを確認し , 写真を撮る .
予習レポートの課題
（実験方法を良く読み，必要な情報を調べること）
① “物理的封じ込めレベル P1 の遺伝子組換え実験 ” とはどういう意味
か調べ，実験環境や操作上の注意点， P2， P3 との違いをまとめる．
②
塩化カルシウム法による形質転換の方法と原理について調べる．
③
プラスミド pBR322 を制限酵素 BamHⅠ と SalⅠ で切断したときに
得られる DNA 断片のサイズはいくつか .
④
アガロースゲル電気泳動による DNA 断片の分離と DNA 検出の
方法について調べる．
報告書の課題その１（結果と考察の中で触れること）
①
実験で得られたコロニーの数から, 作成したコンピテントセルの
形質転換効率を計算する．用いたプラスミドによる違い, プレート
による違いについて理由を考察する.
②
実験で用いた制限酵素による切断個所をプラスミド地図上に図示
し ,予想される DNA 断片の長さと電気泳動して得られたバンドサイ
ズを比較する．切断なしのバンドについても考察する.
③
実験に用いた制限酵素の認識配列を調べて書く．
④
手渡されたプラスミドが何であったか, そのように考えた根拠と
共に示す．
報告書の課題その２（調べて報告書の最後にまとめること）
①
高効率 (108 cfu 以上 )のコンピテントセルが市販されている。どの
ようなときに高効率のコンピテントセルが必要か。また，効率を上
げるためにどのような注意が必要か.
②
実験に用いた抗生物質（アンピシリン，テトラサイクリン）の作用
機序と抗生物質耐性機構についてまとめる.
IV-3
参考文献
・
田村隆明
著：基礎から学ぶ遺伝子工学 , 羊土社（ 2012）
・
田村隆明
編：遺伝子工学実験ノート（上），羊土社（ 2 0 0 9 ）
・
柳田充弘, 西田栄介, 野田亮
・
野島博
補足１
編：分子生物学，東京化学同人（ 2009）
著：遺伝子工学・基礎から応用まで，東京化学同人（ 2013）
形質転換効率
1 µg のプラスミド（通常は pBR322）の形質転換で得られるコロニーの数を
コロニー形成単位 (colony forming unit : cfu)といい , 形質転換効率の指標に用
いられる．報告書では, 本実験で用いた全てのプラスミドについて, プラスミ
ドの量 , LB 寒天培地に塗布したコンビテントセルの量 , および得られたコロニ
ーの数から形質転換効率の計算を行うこと.
補足２分子量マーカー
1 k b l a d d e r, B i o n e e r 製
補足３
プラスミドの制限酵素地図
本実験で用いるプラスミドの制限酵素地図は,
初日に配布するが, 予習する際には以下の手順で
New England BioLabs (NEB)社のホームページを参
考にすること.
1. NEB 社のホームページを表示
（ h t t p s : / / w w w. n e b . c o m / ）
2 . To o l s & R e s o u r c e s のメニューバーから , D N A
sequences and Maps tool を選択
3. 登録されているプラスミドの表が表示される
4 . Ve c t o r s 欄からプラスミド名を探し , M a p s ( p d f )
と Sites(pdf)をそれぞれクリックして制限酵素
地図と切断場所の情報を得る。
本実験で使用するプラスミドは , pACYC184,
pBR322, pUC19 である .
補足４ LB（ Luria-Bertani）培地
1%アガロースゲルを
使用して泳動
L B 培地は細菌用富栄養培地の一種で，1 L あたり
の組成は，トリプトン 10 g，酵母エキス 5 g， NaCl
10 g である．本実験では調製したものを配るが，
前回の実験で使用した培地と組成を比較すること.
（根本直樹）
IV-4
組換え DNA（組換え体作製・増殖実験）実験計画申請書
No.
１
実験責任者
所属部局の所在
地
番号
所属機関・部
局・職
氏
便
275－ 0016)
千葉工業大学・工学部生命環境科学科・助教
名
根本
連絡者
名称・所在地
直樹
実験責任者に同じ
職・氏名
(郵
)
－
便番号
実験責任者に同じ
課題名
実験実施期間
(郵
千葉県習志野市津田沼２－１７－１
大腸菌由来プラスミドの形質転換実験
平成２７年４月１日
(注３ )
から
平成２７年８月３１日
実験の目的
生命環境科学科遺伝子工学コース 5S 科目の学生実験（科目名
遺伝子工学
実験）で, 遺伝子工学の基本となる遺伝子操作を習得させるために, プラス
ミドを用いた形質転換実験を行う。
DNA 供与体
作製実験
供与体生物及
クローン化し
び DNA の種
ようとする
類
クローン化
ラ
は行わない
ミ
ベクター
蛋白毒
めレベ
素産生
ル
能
DNA の種類
(注５ )
大腸菌由来プ
ス
宿主
封じ込
ド
DNA
増殖実験・大量
培養実験
クローン化する DNA の由
来
大腸菌
株
JM109
DH5α
宿主
IV-5
pUC19
pACYC184
pBR322
ベクタ
ー
全
て
備考
全て無
P1
封じ込
蛋白毒
めレベ
素産生
ル
能
備考
遺伝子工学実験
磁気結合抗体を用いた細胞の分離
１．目的
日常の中の免疫現象，たとえば花粉，ハウスダスト，食物に対するアレルギ
ー，または慢性的な病気である自己免疫病，治療の妨げになる臓器移植の際の
拒絶反応などの現象は，生体が『自分自身のからだを構成する物質』とそれ以
外の細菌やウイルス，花粉などの異物，他者からの臓器などのような『自分自
身のからだとは異なる物質』を区別する働きが原因である．ヒトの生体内では
２種類の免疫細胞が細胞性免疫というメカニズムの主役となって，他の多くの
免疫細胞とネットワークを構成して機能している．今回注目する細胞の一つは
B 細胞で，もう一つが T 細胞である．
それぞれの細胞の表面には、特有の分子が存在する．いわゆるマーカー（目
印）分子である．マーカー分子の多くはタンパク質と糖鎖から構成される物質
である．マーカー分子にはそれぞれに特異的な抗体が結合できる．本実験では
この性質を利用して，細胞表面分子に対する抗体を用いると多様な細胞が混在
する細胞溶液から 1 種類の細胞を，生きたまま短時間で分離・精製できること
を学ぶ．その手法の原理，および生きた細胞の取扱いについて理解を深めるこ
とを目的とする．
２．実験方法
2.1. 注意事項
生きている細胞は生理的な環境の外に置かれる（培養液から出る，生体組織
から分離されるなど）と，長時間存在することが難しい．実験の操作は迅速に
行う．
細胞だけでなく各種抗体や抗体に標識している磁気ビーズ，蛍光色素も，室
温で不安定である．遮光にする，氷上に置くなど実験前に説明される取り扱い
の注意に従う．
2.2. 試薬および器具
2.2.1. 器具および装置
マイクロピペット，ピペットチップ，コニカルチューブ， 1.5 mL マイクロチ
ューブ，チューブラック，チューブスタンド，遮光できるアイスボックス，細
V-1
胞計算板とカバーガラス，細胞カウンター，廃液用ビーカー，セルストレーナ
ー（細胞分離用メッシュ）付チューブ，微量高速遠心機，光学顕微鏡，磁気カ
ラム細胞分離装置（ M A C S ™ ） , 磁気カラム（カラム本体，プランジャー），細胞解
析装置（セルソーター）．
2.2.2. 試薬
細胞用培地，生理的緩衝液（ P B S ），
用バッファー（ P B S ,
％トリパンブルー溶液，抗体染色
％ BSA,
％アジ化ナトリウム），抗 B 細胞マー
カー分子抗体，抗 T 細胞マーカー分子抗体，磁気結合抗体，ブロッキングバッ
ファー，エタノール．
2.3 実験方法
＊実験の条件は当日の指示を聞いて，下線部に記入する．
2.3.1. 細胞の調製
1) 細胞が入っているチューブ内の細胞を、ピペットを用いて均一にする（ピペ
ッティング操作という）．
2) そこから
を
µL を別のマイクロチューブにとり，
％トリパンブルー液
µ L を加え，マイクロチューブを指で軽く叩いて混合する（タッピング
操作という）．
3)
細胞計算板にカバーガラスを合わせる．細胞計算板とカバーガラスの間の楔
形の溝から，２）の混合溶液を少量滑りこませる．計算板とカバーガラスの
間から混合液がはみ出ないよう、カバーガラスが浮き上がらないように注意
する．＊
注意：カバーガラスをきつく押す必要はない．圧着させなくても一定の容積の空間
が出来るように工夫されている計算板を使用する．
4) 光学顕微鏡で細胞計算板を観察する．視野の内部の 16 区画全体の中の細胞
数を数える（セルカウント操作という）．計算式にしたがって， 1 m L あたり
の細胞濃度を計算する．細胞液全体の細胞数を算出する．
5) 必要細胞数（
x 10
µL（斑によって異なる）を，新しい
細胞）/
マイクロチューブに移しかえる．
6) 微量高速遠心機で，
℃，
回転，
分間遠心する．
7) 遠心後，マイクロチューブの底に細胞の沈殿ができていることを確認し，上
清（細胞以外の液体部分）を，マイクロピペットを使って吸い取り，廃液ビ
ーカーに捨てる．
2.3.2. 抗体反応
1) 遠心後に得られた細胞沈殿物をタッピング操作でほぐした後，ブロッキング
V-2
µL 加え，
バッファーを
2)
分間氷上におく．
さらに細胞に抗体溶液（抗 B 細胞マーカー分子抗体と，抗 T 細胞マーカー分
子抗体）を加え遮光し，アイスボックスの中で
分間反応させる．実
際に
使用する抗体の種類や名称，反応時間は，当日の指示にしたがう．
µL 加えて，微量高
3) 反応後そのチューブに，抗体染色用バッファーを
速遠心機で
℃，
回転，
分間遠心する．遠心後，上清はマ
イクロピペットを使って取り除き，廃液ビーカーに捨てる．
4) 3）の操作をもう１度行う．
5) 遠心後，細胞沈殿物をタッピング操作でほぐし，それに抗体染色用バッファ
µL 加え，さらに磁気結合抗体を
ーを
クスの中で
µL 加え遮光し，アイスボッ
分間反応させる．
6) 3)と同じ操作をおこなう．
7) 細胞沈殿物をタッピング操作でほぐし，
µL の抗体染色用バッファ −
を加えて、ピペットを使って均一に混ぜる（ = 細胞溶液）．
2.3.3. 磁気カラムによる抗体結合細胞の分離
1 ) M A C S ™ に装着させた磁気カラムに，抗体染色用バッファーを
µL 滴下して，
カラムを平衡化する．
2 ) 2 . 3 . 2 の 7 ）で調製した細胞溶液
µL を磁気カラムに滴下しながら加える．
3) 磁気カラムへの非特異的な結合細胞を，抗体染色用バッファーを滴下して取
り除く．約
µL の抗体染色用バッファーを用いて洗い流す．廃液用ビー
カーをカラムの下に設置する．細胞の洗浄は
〜
回行う．（詳細は当
日指示）
4) 磁気カラムをスタンドの磁場から外し，
µL の抗体染色用バッファ
ーを磁気カラムに滴下し ,プランジャー（注射器の内筒のような形をしたも
の）を磁気カラムに差し込み，ゆっくりと押し出し，別の新しい 1.5 mL の
マイクロチューブに細胞を集める．
5) 微量高速遠心機で
℃，
回転，
分間遠心する．
6) 遠心後，マイクロチューブの底に細胞の沈殿ができていることを確認し，上
清（細胞以外の液体部分）を，マイクロピペットを使って吸い取り，廃液ビ
ーカーに捨てる．
7)
µL の抗体染色用バッファーを加えて，マイクロピペットを使ってゆる
やかにピペッティングしながら均一に混ぜる．
8) セルストレーナー付きチューブ（細胞分離用メッシュがついている）に，マ
イクロピペットを使ってマイクロチューブから細胞溶液を移す．
V-3
2.3.4. セルソーターを用いた解析
1) セルソーターを用いた解析を行う．セルソーターの操作には熟練が必要であ
るため，オペレータ (TA や教員 )の補助のもとで行う．解析について説明を聞
き，ディスカッションをしながら解析を進める．
2) 解析データを受け取り，結果を検討する．
3. 結果と考察
結果の解析：セルソーターによる解析のデータを配布する。そのデータから
細胞精製度（B 細胞または T 細胞の“純度”のこと）を解析する。精製度が良
かった場合と悪かった場合ともに，その理由を考察し，考察した内容をレポー
トに書き出す．
実験の結果についての考察：複数の細胞群から，抗体を用いて１種類の細胞
を分離する操作の結果、分離前と分離後で，どのような細胞の種類がどのよう
な比率で分離・精製されたのか検討する．またその理由について検討する．こ
れらの考察をレポートにまとめる．実験実施日にレポートの作成のポイントを
説明する．
4. 参考文献
1)
Roitt 著，多田富雄監訳：免疫学イラストレイテッド，第 3 刷南江堂
（ 2003）
2)
笹月健彦監訳 : 免疫生物学，第 5 版南江堂（ 2003）
3)
P. Parham 著，笹月健彦監訳：エッセンシャル免疫学，第 1 版，メディカ
ル・サイエンス・インターナショナル（ 2007）
4)
谷口克・宮坂昌之 :標準免疫学，第 2 版医学書院（ 2002）
5)
上野川修一監訳：免疫学キーノート，シュプリンガー・フェアラーク東
京第 5 刷（ 2005）
*上記の多くは図書館にあります。研究室でも貸し出しますので，適宜相談のこと。サイエンスは年々
進歩しているのであまり古い参考書は用いない．
5. 参考ウエブサイト
①GE ヘルスケア・ジャパン
 h t t p : / / w w w. g e l i f e s c i e n c e s . c o . j p / n e w s l e t t e r / b i o d i r e c t _ m a i l / t e c h n i c a l _ t i p s / t i p s 6 3 . h t m l
②ミルテニーバイオテク
 h t t p : / / w w w. m i l t e n y i b i o t e c . c o . j p / j a - j p / p r o d u c t s - a n d - s e r v i c e s / m a c s - c e l l - s e p a r a t i o n . a s p
x
V-4
③メルクミリポア
 h t t p : / / w w w. m e r c k m i l l i p o r e . c o m / J P / j a / l i f e - s c i e n c e - r e s e a r c h / c e l l - a n a l y s i s / m u s e - c e l l - a
n a l y z e r / h b 2 b . q B . l I 0 A A A E _ v z l k i f K v, n a v
 h t t p : / / w w w. m e r c k m i l l i p o r e . c o m / J P / j a / l i f e - s c i e n c e - r e s e a r c h / c e l l - a n a l y s i s / g u a v a - e a s y c
y t e - f l o w - c y t o m e t e r s / z L W b . q B . 7 e A A A A E _ 1 r F k i f K v, n a v
④ベックマンコールター
 h t t p : / / w w w. b e c k m a n c o u l t e r. c o . j p / p r o d u c t / p r o d u c t 0 1 / C y t o m i c s F C 5 0 0 . h t m l
⑤BD バイオサイエンス
 h t t p : / / w w w. b d b i o s c i e n c e s . c o m / j p / i n s t r u m e n t s / a c c u r i / i n d e x . j s p
 h t t p : / / w w w. b d b i o s c i e n c e s . c o m / j p / a p p l i c a t i o n s /
＊ Web site のみの参考資料のレポートは受け付けない．専門書から関連する部分を読み
取り、まとめて文章にする力をつける（卒業論文の時に役立つ）．
6. 予習レポートの課題＊
に適宜。
課題①
-5 課題を A4
提出日は実験第 1 日あるいはそれ以前の分子免疫学の講義の時
4〜 7 枚以内にまとめる．
B リンパ球細胞の構造上の特徴，それぞれの細胞のおもな働き，免疫シス
テムにおける重要性について調べる．
課題②
T リンパ球細胞の構造上の特徴，それぞれの細胞のおもな働き，免疫シス
テムにおける重要性について調べる．
課題③
抗体の基本構造や，種類，生体内にはどのくらい存在しているか，その
機能の特徴について調べる．
課題④
セルソーターや磁気結合抗体（磁気ビーズという表現もある）を用いた
細胞の分離法と ,その原理について調べる．
課題⑤
抗原と抗体の反応が日常の中で（医療の場や，わたしたちが受ける検査
などの中で），どのように利用されているかについて調べる．
(注意点 )以上について，参考文献を全文書き写すのではなく，要点をまとめる．必要
に応じて図なども示す（複雑な図以外は手書きで示すこと）．
手書きを推奨，パソコンの使用する場合は，レイアウトの一般的ルール (授
業支援サイト参照 )に従ったものを受け付ける．
（橋本香保子）
V-5
遺伝子工学実験
DNA の抽出・遺伝子型決定
１．目的
現在，非常に多くの品種のお米が流通しており，お米の品種を正確に
知りたい場合は DNA 鑑定する必要がある．
本実験ではお米から DNA を抽出し，遺伝子増幅技術 PCR(Polymerase
Chain Reaction)で増やした遺伝子の遺伝子型を決定する。一連の手法
の原理および DNA の取扱いについて理解を深めることを目的とする．
２．実験方法
2.1. 注意事項
エチジウムブロマイドは突然変異誘起剤である．取り扱う際は，必ず
使い捨ての手袋を装着すること．
2.2. 試薬および器具
2.2.1. 器具および装置
ミルサー，マイクロピペット，ピペットチップ，マイクロチューブ，
チューブラック，アイスボックス，ゲル撮影装置，ボルテックス，恒温
槽，電気泳動装置，微量高速遠心機
2.2.2. 試薬
DNA 抽出試薬，プレミックス PCR 溶液，ポジティブコントロール溶
液， 0 . 5 X TA E 緩衝液 , エチジウムブロマイド溶液 , L o a d i n g D y e ,
100bpDNA サイズマーカー，エタノール，滅菌水
VI-1
2.3 実験方法
2.3.1. DNA の抽出
1) お米（精白米）約 50g をミルサーで約 30 秒間粉砕し，均質か処理を
行い調整する．
2) サンプリングスプーン大サイズ面で試料をスリ切り３杯採取し，
D N A 抽出試薬チューブに入れる。その後，チューブの蓋をしっかりと
閉め， 10 回程度転倒混和する．
3 ) 約 5 分間静置し，上澄みを P C R 用試料とする。浮遊物過多の場合は，
遠心分離をする。
2.3.2. PCR
1) プレミックス PCR 溶液が入っているチューブを
本用意し，１本
にポジティブコントロール溶液を 5µL 添加し，別のチューブには
PCR 用試料溶液を 5µL 添加する．
2) チューブの蓋をしっかりと閉め，試薬を混ぜる．
3) それらを PCR 条件を設定したサーマルサイクラーにセットし，高速
PCR を行う．
<PCR 条件 >
94℃ 5 秒
55℃ 1 秒
35 サイクル
68℃ 5 秒
↓
4℃ Hold
2.3.3. アガロースゲル電気泳動
1) 2.5%アガロースゲルを作成する．
2) PCR 産物に Loading D ye を 3µL 加える．
3) ボルテックスで数秒間撹拌する．
4) 軽く遠心する．
5 ) 電気泳動装置に 0 . 5 X TA E 緩衝液を 3 0 0 〜 4 0 0 m L 入れ，ゲルを沈める．
6) ゲルのウェルにマイクロピペットでサンプルを 10µL アプライする．
7 ) サンプルの隣の空きレーンに，1 0 0 b p D N A サイズマーカーをアプライ
する．
VI-2
8) 100V で電気泳動する．
9) BPB がウェルからゲルの 2/3 位まで移動したら，泳動を止める．
10) 泳動槽からゲルを取り出し，エチジウムブロマイド溶液に約 10 分
間浸して染色し，ゲル撮影装置で DNA を確認する．
参考文献
・柴忠義 : 遺伝子工学，生物研究社 (2001)
・中山広樹: バイオ実験イラストレイテッド３
本当にふえる
PCR(1996)
・田村隆明 :遺伝子工学実験ノート〈上〉DNA 実験の基本をマスター
する，羊土社（ 2009）
・ Joseph Sambrook , David W. Russell : Molecular Cloning, A
Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)
<予習レポートの課題 >
・
マイクロサテライトについて調べる．
・
P C R の原理について調べる（プライマー．ポリメラーゼなどの用
語についても調べる）．
・
DNA 鑑定の原理と実用例について調べる．
（黒﨑直子）
VI-3

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