【特集】 Amanecer Topics 免疫染色でリンパ球の T 細胞と B 細胞を見分けよう免疫染色による T 細胞・B 細胞の鑑別の原理リンパ球を含め、細胞の表面には様々なタンパク質が存在します。その中には、特定の細胞種にのみ存在するタンパク質があり、それを指標として細胞を区別することができます。免疫染色では、特定のタンパク質に結合する抗体を用いて細胞を標識し、発色させます。これにより、目的の細胞だけを染色することが可能となります。発色の方法として、蛍光色素を用いて蛍光顕微鏡で観察する方法と、酵素反応により茶褐色の色素を沈着させて光学顕微鏡で観察する 2 種類の方法があります。蛍光色素は時間とともに褪色してしまうため、通常の病理診断では酵素を用いた方法が利用されています。表では T 細胞と B 細胞のそれぞれに発現する代表的なマーカー分子を挙げています。当社ではパラフィン標本で染色可能で特異性の高い分子として、T 細胞では CD3、B 細胞では CD20 を指標として免疫染色を行うことにより、T 細胞と B 細胞を区別しています。また、鳥類に対しては B 細胞のマーカー分子として、BLA.36 という分子を利用しています。酵素抗体 CD3 リンパ節の塗抹標本（ギムザ染色） T 細胞と B 細胞白血球の一種であるリンパ球には、大きく分けて T 細胞と B 細胞の 2 種類の細胞が存在します。T 細胞は、ウイルス感染細胞などへの細胞傷害や、免疫機能の活性化などを行い、B 細胞は活性化すると形質細胞に分化して抗体の産生を行います。骨髄でリンパ芽球が産生され、T 細胞は胸腺で分化・成熟し、B 細胞は骨髄で分化して、脾臓やリンパ節を通って成熟します。T 細胞の”T”は胸腺（Thymus）に由来し、B 細胞の”B”は、 B 細胞の分化器官として最初に発見された鳥類のファブリキウス嚢（Bursa of Fabricius）に由来します。 T 細胞・B 細胞の鑑別成熟リンパ球はクロマチンが凝集した類円形核と、淡青色に染まる狭い細胞質を持つ小型の細胞で、幼若なリンパ球はクロマチンの凝集が弱いやや大型の細胞として観察されます。T 細胞と B 細胞の形態は非常に似通っており、塗抹標本や組織標本の通常の染色では、明確に区別することはできません。リンパ球の腫瘍である悪性リンパ腫も、T 細胞性と B 細胞性の 2 種類に分類されますが、これらは臨床的に予後が異なり、また、それぞれに異なる治療法が提案されていることから、悪性リンパ腫の T 細胞性と B 細胞性を鑑別することは重要です。そこで病理学的検査では、免疫染色という特殊な染色を行い、T 細胞と B 細胞を判別しています。リンパ節の標本組織での免疫染色例リンパ濾胞の中心に抗 CD20 抗体で染まる B 細胞が、その周囲に抗 CD3 抗体で染まる T 細胞が集まっていることがわかります。 CD20 【特集】∼免疫染色でリンパ球の T 細胞と B 細胞を見分けよう∼ 悪性リンパ腫の免疫染色例免疫染色は組織標本、塗抹標本のどちらでも可能です（注：塗抹での免疫染色には、当社で販売しております塗抹免染キットで作製した標本が必要です）。悪性リンパ腫の診断は、まず普通染色（HE 染色、ギムザ染色）でリンパ球の細胞形態の異常や組織構築の乱れを診て行います。その次に、免疫染色によって T 細胞性、B 細胞性を判別します。診断の際には腫瘍細胞での染色性を確認することが重要で、腫瘍細胞の間に反応性の正常なリンパ球が混在することがあるので注意が必要です。＜組織標本＞ T 細胞性・B 細胞性悪性リンパ腫の発生頻度データ（イヌ） 2013 年度に当社で行った、イヌの悪性リンパ腫の免疫染色に関するデータです。合計 262 例の悪性リンパ腫の症例で免疫染色を実施しました。全体では B 細胞性リンパ腫の割合が約 64%とやや多く、性差はみられません。臓器別では脾臓での発生が多く、そのほとんど（94%）が B 細胞性でした。一方、皮膚に発生した悪性リンパ腫では 81% が T 細胞性と、発生部位によって異なる傾向がみられます。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 イヌ B細胞型 T細胞型 83 5 59 24 9 38 4 11 脾臓リンパ節皮膚口腔消化管（内臓型）眼瞼（粘膜）腹腔肝臓胃乳腺胸腔胸水前立腺鼻腔肛門周囲 5 2 1 0 2 0 1 0 1 1 0 5 2 3 3 0 2 0 1 0 0 1 悪性リンパ腫の診断における病理検査と遺伝子検査＜塗抹標本＞病理検査細胞形態の異常や増殖形態から悪性リンパ腫の診断をします。悪性リンパ腫はほとんどの症例において病理検査で診断可能ですが、ある程度以上の観察可能な細胞数が必要であり、内視鏡生検のごく小さな組織片や損傷の激しい検体の場合など、病理検査だけでは確定診断できないこともあります。遺伝子検査 (リンパ系腫瘍クローン性解析) クローナルな（遺伝子配列が同一な）リンパ球の増殖を、PCR 法を用いて検査します。ごく少量のサンプルから T 細胞もしくは B 細胞のリンパ球のクローナルな増殖を判別できますが、non-T、non-B 細胞の悪性リンパ腫や悪性リンパ腫以外の病変に関しては情報が得られません。当社で病理検査を行った組織検体や塗抹標本から、リンパ系腫瘍クローン性解析を追加で行うことも可能で、検査費用は右表のとおりです（別途消費税）。採取した検体に応じて検査法を使い分けることが必要であり、2 種類の検査を組み合わせて行うことで、より正確な診断を得ることができます。（病理診断部原田知享）テクニカルビュー細胞診および組織検査用の標本作製において、替えがきかない器材といえばなんでしょう？ …スライドガラスそうです、スライドガラスです。今回病理技術者傾当社で採用しているスライドガラス＆カバーガラス（いずれも松浪硝子工業製）フロスト加工により、検査番号が消えることなく安心して染色ができます。フロストがなかった時代は、ダイヤモンドペンで削り書きしていましたね！思どうやって接着しているの？＊文献によると、日本の剥離防止コートガラスの発展および品質は世界トップレベルとのことであり、我々はまさにその恩恵を肌で日々感じています。ここで簡単にコーティングガラスの接着機構について説明します（文献より引用、一部改変）。カバーガラスは 55mm を使用していますので、スライドガラスへの塗抹は片端から 55mm 以内でお願いします。 Technical view Technical view 検査の必需品細胞表面は、細胞膜に存在する糖鎖に被われており、糖鎖末端のシアル酸の COO 基により、マイナス電荷を有しています。この静電結合が、細胞・組織の接着固定機構です。アルコール毎日、数百枚を扱いますが縁の研磨加工により、ケガ防止に役立っています。洗浄済み製品のため、高親水性で塗抹や切片貼付けが難なく可能です。用途別のスライドガラス左に３枚のスライドガラスが並んでいますが違いがわかりますか？フロストカラーが違う？確かにフロストカラーは多種ありますので、ルール付けすると視覚的に仕分けしやすい利点はありますね。実は、３枚それぞれコーティング処理に違いがあります。 A はコーティング未処理ガラスで、検査の大部分はこのガラスを利用しています。B と C はコーティング処理がされており、組織・塗抹の種類や染色の違いで使い分けしています（ちなみに数十年前までは卵白グリセリンやゼラチンを病理技術者自らが塗布して作製していました）。B は骨、爪、歯や赤血球の多い A・ホワイト：スタンダード脾臓など剥がれやすい組織切片に利用しています。また、銀反 B・ピンク：MAS-GP コート応系染色や免疫染色では必ずこのコーティングガラスを利用し（松浪硝子工業株式会社）ています。そして、 C は切片が散逸しづらい特性があり脂肪腫などの組織切片に利用しています。 C・パープル：イムノコート弊社の悪性リンパ腫免疫染色（塗抹）器材セットのガラスは B （武藤化学株式会社）のコーティングガラスです。このコーティングガラスの存在により、剥離なく免疫染色を行えます。 A B C ガラス表面に化学的に安定な NH+基を配置したコーティング膜を形成させて、プラス電荷となっています。（図例：MAS コートガラス）なお、コーティング膜は保管環境中の水分やガス成分によって劣化し、剥離防止効果が低減するそうです。このため、使用期限（1 年）が設けられています。 *THE CHEMICAL TIMES; 2010, No.1（通巻 215 号）, p9-13 病理技術部からのワンポイントアドバイスフロスト付ガラスは、動物病院内での塗抹作業においてその手回しを格段に向上させるものと思われます。鉛筆で多くの情報を書き込めますので、わざわざラベル等に検体情報を記入し貼り付ける手間がいりません。洗浄済みスライドガラスでは、撥水作用による塗抹の偏りなども防ぐことができるため、検査に最良の塗抹標本を作製することができます。ガバーガラスへの塗抹標本は、輸送中および染色操作中の破損が生じやすく、破損の場合には顕微鏡観察に影響する場合がありますので避けてください。（病理技術部會田浄）エビデンスに基づく診断大分県別府市すえつぐ動物病院【院長】末次由和 0977-25-5556 【診療時間】平日：9：00∼正午 17：00∼20：00 土・祝日： 9：00∼正午 14：00∼16：00 *日曜日は休診【従業員数】 33 名（受付担当：6 名）お聞きした人マネージャー市原礼子さん IBD(炎症性腸疾患)と悪性リンパ腫高橋秀俊 IBD は特発性腸炎 ▲ 市原様アマネセルの取引先病院様をご紹介させていただきます！今回は、すえつぐ動物病院でマネージャーとして勤められている市原様にお話を伺ことができました。動物病院の受付で働いてみて、どんな印象をお持ちですか。実際、ここまで忙しいとは思いませんでした！でもすごくやりがいを感じます！1 日が終わった頃には“皆でやりこなしたね∼”という充実感でいっぱいです。受付業務の中には飼い主さんへの対応だけではなく、薬も用意したりするので、薬の知識など日々学ぶことも多いです。受付業務の魅力は何ですか。受付は、全ての飼い主さんと接することができます！獣医師を指定される飼い主さんは、他の先生はその方を知らないので、これは受付の特権ですね！そして、飼い主さんとちょっとした他愛もない話ができるのも、受付業務の大きな魅力だと思います。しかし、一番飼い主さんから見られているところでもあると思うので、抜かりの無い対応を常に心がけています。獣医師・看護師とはどのように接していますか。私は、それぞれが各業務のプロを目指すことで、さらに良い院内環境を築けると考えています！どれか 1 つでもレベルが落ちていると、飼い主さんからは病院全体のレベルが落ちていると捉えられてしまう可能性もあるので、受付も獣医師や看護師に負けないくらいスキルアップをして、お互いがお互いを支えあうことで病院が成立する、そうでありたいと思っています！ “うちの院長のここが好き！”というポイントを教えてください。もうとにかく優しいです！！仕事はとてもストイックですが、その根底にあるものは動物を助けたいという一心で、飼い主さんからの院長指定がものすごく多いのも、今までの丁寧な対応の積み重ねの結果だと思います。動物をはじめ、人も大切にする院長をとても尊敬しています。すえつぐ動物病院のアピールポイントを教えてください。診療時間外でも迅速な対応が可能なところです。現在、獣医師と看護師は当直制になっているので、緊急時に関しては 24 時間いつでも対応できます。しかし、現在の体制が整うまでは、診療時間外の緊急電話などを院長夫妻お 2 人で全て対応していました。電話が何時にかかってこようと必ず対応し、夜中に手術を行うこともあったので、ついには「24 時間病院ですよね？」と言われてしまうことも多かったようです。今後も、患者さんに寄り添った獣医療を提供し続けていきます。 ▼ PC 上の画面 10 年以上前から電子カルテを導入し、情報を一元管理しています。すえつぐ動物病院に勤められて 4 年目。前職の幼稚園教諭や人間の総合病院の受付業務経験を活かし、現病院の受受付カウンター付にて活躍されてい市原様、すえつぐ動物病院の皆様、ありがとうございました。る。（インタビュー：学術広報部樋口英里子） IBD は「炎症性腸疾患 Inflammatory Bowel Disease」の略称ですが、腸管の炎症一般を指しているのではなく、通常は「特発性」の腸炎を意味しています。「特発性」とは、原因が特定できない疾患に関する用語で、各種の感染症など種々の原因を除外していき、最後に残る病変を総合してつけられる診断名です。診断内視鏡検査で特定する下痢や嘔吐などの非特異的な症状のみが継続し、薬物療法に対する反応が鈍い場合には、より詳細な検査項目の 1 つとして、上部あるいは下部消化管の内視鏡検査が実施されます。イヌでもネコでも、病変の初期段階で肉眼所見がはっきりと出ないことが多い、消化器型の悪性リンパ腫と IBD との鑑別には、鉗子で採取した組織片での病理組織検査が必要となります。内視鏡採取組織で診断できる病変内視鏡で採取した組織片から診断できる他の病変としては、粘膜上皮由来の腺癌、リンパ管拡張症、好酸球性肉芽腫など、粘膜層に主病変がある場合に限り、粘膜筋板より深部の固有筋層を中心として形成される平滑筋腫や GIST（胃腸管間質腫瘍）の診断には、開腹して採取した組織が必要となります。 ◆ネコ十二指腸：リンパ球性-形質細胞性腸炎 ◆ネコ十二指腸：悪性リンパ腫肥厚した絨毛が観察されます。小腸では、絨毛部より深部の陰窩部での炎症がより強く見られる傾向にあり、できるだけ深い部分の粘膜層からの採取が正確な診断に結びつきます。管状に配列する粘膜上皮の隙間には、単調な小型細胞がびっしりと認められています。強拡大強拡大浮腫状の粘膜固有層を浸潤する炎症細胞の多くは異型のない小リンパ球です。半数程度の炎症細胞は形質細胞からなりますが、症例によって形質細胞の比率は異なります。リンパ球よりやや大きい独立円形細胞からなり、核小体明瞭でいびつな円形異型核を有して、細胞質は濃染しますが僅少です。症例紹介犬の肥満細胞腫の組織学的グレード分類＜5 月症例検討会より、病理診断部駒形真＞肥満細胞腫とは？白血球成分の一種である肥満細胞に由来する悪性腫瘍です。犬や猫で好発する腫瘍の一つで、弊社の集計でも犬猫の皮膚病変の 10∼20% を占め、最も発生頻度の高い病変といえます。グレード分類とは？特に犬の皮膚に発生する肥満細胞腫は、腫瘍細胞の分化度によって生物学的挙動が変化し、予後の良いものから致死的な経過を辿るものまで様々です。そのため、腫瘍細胞の分化度と予後との関連が古くから研究されています。現在は Patnaik らが考案した 3 段階のグレード分類法（グレードⅠ<予後の良い高分化型>、グレード Ⅲ<予後が悪い低分化型>、およびその中間型のグレードⅡに分類）が主流となっています。細胞境界明瞭な、均一な大きさの円形小型細胞。細胞質内には豊富な顆粒を有し、肥満細胞としてよく分化している。大小不同の腫瘍細胞がみられる。くびれを持つ不整な核の細胞（矢印）も出現し、顆粒の量にもばらつきがみられる。細胞の多形性や大小不同はより強くなる。巨大核（矢印）や多核を持つ細胞も出現し、核分裂像（小矢印）も多数みられる。 Patnaik 分類の問題点実際は腫瘍の多く（7 割近く）がグレードⅡに分類されてしまうこと、また、グレードⅡの 5 年生存率がほぼ 50％であり予後の評価が困難なことが、本分類法の問題点としてしばしば議論されてきました。また、分類基準の曖昧さのため、病理医による診断のばらつきも問題とされています（異なる病理医間でのグレード分類の一致確率は 60∼70％という報告もあり）。これらの問題から、Patnaik 分類法の信頼性・実用性を疑う声が上がってきています。新しいグレード分類法近年 Kiupel らによって、低グレード（低悪性度）、高グレード（高悪性度）に分類する 2 段階グレード法が提唱されました。この分類法と臨床的な予後を比較した報告によると、Patnaik グレードⅡと診断されたもののうち約 85%が Kiupel 低グレードに、約 15％が高グレードに分類され、それぞれの 1 年生存率は 94%、および 46%だったとされています。つまり、予後が曖昧だった Patnaik グレードⅡの評価をより明確に行うことができるという点が本分類法の大きなメリットです。さらに具体的な数値を評価基準(表 1)に用いることで、診断医間での誤差も軽減することができます。まだ導入されて間もない分類法ですが、 Patnaik 分類と組み合わせることで、より精度の高い予後の評価が可能になると思われます。以下 ① ④ 一当高核分裂像 ① ≧7個多核（核が3個以上）細胞 ② ≧3個切目伴高度異型核） ≧3個 ③ 奇怪な核（明瞭巨核細胞（腫瘍性肥満細胞の2倍以上） ④ ≧10％ ※観測視野 400倍（高倍率）×10視野表 1 Kiupel による組織学的グレード分類法の評価基準 Patnaik による組織学的グレード分類＜参考文献＞・Patnaik AK ,Ehler WJ ,MacEwen EG .Canine cutaneous mast cell tumor: morphologic grading and survival time in 83 dogs.Vet Pathol.1984;21:469-474. ・kiupel, M.et al. Proposal of a 2-Tier Histologic Grading System for Canine Cutaneous Mast Cell Tumors to More Accurately Predict Biological Behavior.Vet Pathol.2011;48:147 その疑問！お答えします！（2）アマネセルに関する様々なご質問について、お答えするコーナーです。今回は 2014 年 4 月より開始した遺伝子検査のサンプル提出に関するご質問にお答えします！病理組織検査、細胞診後に遺伝子検査を追加実施する場合、新たなサンプル提出が必要ですか？お便り紹介コーナー ◆とても面白い内容でした。ノイエスも PDF ファイルとして、メールマガジン送付にしてみては？また、アニュアルも PDF の方が良いです。青森県・久保様大変貴重なご意見、誠にありがとうございます。より多くの病院様に見ていただくためにも、ノイエス・アニュアル共に PDF 化し、メールにてお送りするというのはとても良い案だと思いました！ぜひ、今後実施に向けて検討させていただきます！！ c-kit 遺伝子変異検査等では、当社での病理組織検査サンプルより検査が可能なため、新たなサンプル提出は不要です。また、細胞診で悪性リンパ腫と診断された患者のリンパ系腫瘍クローン性解析検査につきましても、細胞診で使用した塗抹標本より検査が可能なため、同様に新たなサンプル提出は不要です。病理組織検査や細胞診から遺伝子検査へ移行する場合、サンプル採取は不要ということですね。遺伝子検査単独で依頼する場合は？まだまだたくさんのご感想お待ちしております！「第 157 回日本獣医学会学術集会」に出展します！！現在、遺伝子検査単独でのご依頼は承っておりません。病理組織検査や細胞診の検査後または同時にご依頼いただきますと、新たなサンプルの採取が不要となるため、お電話等でのご依頼後、遺伝子検査へスムーズに移行することが可能です。日時：2014 年 9 月 9 日∼12 日場所：北海道大学今回はアマネセル本社がある北海道で開催されます。これを機に道内をはじめ多くの病院様と交流できることを楽しみにしています。涼しい北海道ですので、ぜひお立ち寄りください！いよいよ、夏本番がやってきました！北海道の夏はあっという間に終わってしまうので、悔いの残らないよう夏を満喫したいです！さて、今回の特集はアマネセルならではのサービス、免疫染色についてです。染色の違いがよく分かるよう、診断医選りすぐりの染色画像をたくさん載せています！編集作業を行っていると、きれいな発色だなぁとつい見とれてしまうこともしばしば…。特にリンパ節に関しては、連続切片なので染色の様子がより分かりやすいです。免疫染色の顕微鏡写真を見る際には、ぜひ今回の特集を思い出していただけたらと思います。(樋口) 送信（業務部伊藤雅人）野付半島