皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 MRSA 株 に 見 ら れ る 新 規 MRSA ク ロ ー ン の 出 現 状 況 MRS A clones identified in outpatients’ clinics of dermatology 細 谷 志 乃 1 、 伊 藤 輝 代 1,2 、 三 澤 成 毅 3 、 吉 池 高 志 4 、 小 栗 豊 子 5 、 平 松 啓 一 1,2 Shino Hosoya, Teruyo Ito, Shigeki Misawa, Takashi Yoshiike, Kunimitsu Yamada, Toyoko Oguri, Keiichi Hiramatsu 1 順天堂大学大学院感染制御科学 2 順天堂大学医学部細菌学教室 3 順天堂大学医学部附属順天堂医院 4 順天堂静岡病院皮膚科 5 亀田総合病院 臨床検査部 臨床検査部 所属英文 1. Department of I nfection Control Science, Graduate School of Medicine, Juntendo University 2. Department of Bacteriology, School of Medicine, Juntendo University 3. Department of Clinical Laboratory, Juntendo University Hospital 5. Department of C linical Laboratory, Kameda General Hospital. Key Word community-acquried MRSA,MRSA clones,Staphylococcal cassette chromosome mec （ SCC mec ） , pathogenicity island,Phage open reading frame typing (POT) ラ ン ニ ン グ タ イ ト ル ： TSST-1 保 有 新 規 MRSA ク ロ ー ン の 増 加 別 冊 希 望 部 数 ： 30 別冊請求先：順天堂大学大学院感染制御科学 郵 便 番 号 113-8421 東 京 都 文 京 区 本 郷 2-1-1 ペ ー ジ 数 ： 20ペ ー ジ 図表の数：6 署名 印 要旨 我が国の市中に拡がるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の特徴を明ら か に す る 目 的 で ,2009年 2月 か ら 2012年 9月 に 順 天 堂 大 学 付 属 ４ 病 院 の皮膚科外来患者の検査材料から分離された methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 54株 の Staphylococcal cassette chromosome mec （ SCC mec ） の タ イ プ と Multi Locus Sequence Typing（ MLST） を 決 定 し た .加 え て ４ 種 の 毒 素遺伝子の保有を検討した. １ ０ の 染 色 体 タ イ プ（ Clonal Complex ）と １ ２ の SCC mec タ イ プ が 存 在 し ,こ の 二 つ の 組 み 合 わ せ で 定 義 さ れ る MRSAク ロ ー ン は 15種 類 以 上 あ っ た .最 も 多 く 検 出 さ れ た の は Clonal Complex (CC)5-typeIIa SCC mec 株 （ 16株 ） で あ っ た . 我 が 国 の 院 内 感 染 事 例 か ら 分 離 さ れ る 株 の 多 く が 毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群 毒 素 遺 伝 子（ toxic shock syndrome toxin gene; tst ） 陽 性 の CC5-typeIIa SCC mec 株 で あ る の に 比 べ ,今 回 の 供 試 菌 株 中 で は tst 陽 性 の CC5-typeIIa SCC mec 株 は わ ず か ２ 株 で , 他 は tst 陰 性 で あ っ た .CC5株 以 外 が 38株（ 70.4%）あ っ た .そ の 中 で は CC8株 が 12株 と 多 か っ た が , tst 陽 性 CC8-typeIVl SCC mec 株 9 株 ,Panton-Valentine Leukocidin(PVL)遺 伝 子 （ lukS,F-PV ） を 保 有 す る CC8-typeIVa SCC mec 株 １ 株 な ど ,既 知 の 毒 素 遺 伝 子 保 有 株 が 10 株 を 占 め た .続 い て 多 か っ た の は と び ひ と 関 連 す る ク ロ ー ン で 1 CC89-typeV SCC mec 株 お よ び CC89-typeIIb SCC mec 株 で は ,６ 株 中 ５ 株 お よ び ５ 株 中 ２ 株 が b型 表 皮 剥 奪 性 毒 素 遺 伝 子（ exofoliative toxin b； etb ） を 保 有 し て い た . CC121-typeV SCC mec 株 は ,2株 中 2株 が a型 表 皮 剥 奪 性 毒 素 遺 伝 子 （ exofoliative toxin a； eta ） を 保 有 し て い た .他 に CC1-type IVa SCC mec 株 , CC8-typeI SCC mec 株 , CC81-type IVg SCC mec 株 , CC97-type IVc SCC mec 株 , CC89-type IVa SCC mec 株 , CC91-type IVa SCC mec 株 , CC45-typeIIn SCC mec 株 （ サ ブ タ イ プ の 決 まらない株）, CC59-type IVg SCC mec 株 ,及 び 本 研 究 で 見 い だ さ れ た 新 規 サ ブ タ イ プ の CC8-typeIVm SCC mec, CC89-SCC mec 未 同 定 株 が 存 在 し ,多 様 な MRSAク ロ ー ン が 出 現 し て い る 状 況 が 本 検 討 で 明 ら か に された. To know the characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains disseminating at the Japanese community, we have determined types of Staphylococcal cassette chromosome mec (SCC me c) elements, Multi-Locus Sequence Typing (MLST), and carriages of four exotoxin genes (toxic-shock syndrome toxin, P anton-Valentine Leukocidine, and exfoliative toxins a and b) u s ing 54 MRSA strains isolated from outpatients of clinics of der matology at the four university hospitals of Juntendo University. Ten clonal complexes and 12 SCC mec types 2 have been identif ied. As results, more than 15 MRSA clones that were defined by th e combination of genotype and SCC mec type, were identified. Among them, Clonal Complex (CC)5-typeIIa SCC mec strains were the most major (16 strains). In contrast that CC5-typeIIa SCC mec strains known as hospital-associated MRSA clone in Japan carried toxic-shock syndrome toxin gene ( tst ) , only 2 of 16 strains carried tst. Thirty-eight (70.4 %) of isolates belonged to the clones distinct from CC5-typeIIa SCC mec strains. Among th em, CC8 strains were major(12 strains), which contained 9 tst -positive CC8-typeIVl SCC mec clone and CC8-typeIVa SCC mec strain carrying Panton Valentine Leukocidin gene ( luk S,F-PV). Clones related to impetigo were also identified:7 exfoliative toxin b ( etb )-positive clones, CC89-typeIIa SCC mec and CC89-typeV SCC mec strains; and 2 exfoliative toxin a ( eta ) -positive CC121-typeV SCC mec strains. Other clones were as follows: CC1-typeIVa SCC mec , CC8-typeI SCC mec , CC81-type IVg SCC mec , CC97-typeIVc SCC mec , CC91-typeIVa SCC mec , CC59-type IVg SCC mec , CC45- typeIIn SCC mec , CC89-SCC mec nontypeable, and CC8-type IVm, novel subtype of type IV SCC mec 3 identified in this study. Our data showed that many novel MRSA clones have emerged at the community. 序文 メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 （ methicillin-resistant Staphylococcus aureus ;MRSA）は 出 現 以 来 ,院 内 感 染 の 原 因 菌 と し て 問 題 と さ れ て き た .し か し 近 年 で は MRSAは 市 中 感 染 症 か ら 多 く 分 離 さ れ ,健 康 人 が 保 菌 し て い る こ と も 報 告 さ れ る よ う に な っ た 1 ） .と り わ け 2000年 代 に は い る と 全 世 界 で そ の 分 離 率 は 増 大 し ,深 刻 な 問 題 と な っ て い る . 市 中 感 染 症 か ら 分 離 さ れ る MRSAの う ち ,外 来 患 者 あ る い は 入 院 後 48時 間 以 内 の 入 院 患 者 か ら 分 離 さ れ ,か つ 各 種 医 療 関 連 の 危 険 因 子（ 人 工 装 置 の 装 着 ,MRSA感 染 の 履 歴 ,12ヶ 月 以 内 の 手 術 , 入 院 ,人 工 透 析 な ど の 経 歴 ） を 持 た な い 株 を Community-associated MRSA（ CA-MRSA） 2 ) と 呼 び ,医 療 関 連 施 設 か ら 分 離 さ れ る Healthcare-associated MRSA(HA-MRSA)と 区 別 さ れ る よ う に な っ た . MRSAは メ チ シ リ ン 耐 性 を 担 う 遺 伝 因 子 で あ る staphylococcal cassette chromosome mec （ SCC mec ） が メ チ リ ン 感 受 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus ; MSSA)株 に 挿 入 さ れ た も の で あ る ,そ し て SCC mec に は 構 造 の 異 な る 多 く の 種 類 が あ る こ と か ら 3 ） 現 在 で は ,MRSAク ロ ー ン を SCC mec タ イ プ と MSSA 4 染色体の違いの組み合わせで定義するという方法が全世界で使用さ れ て い る .MSSA染 色 体 の 分 類 に は 染 色 体 上 の 7つ の housekeeping遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を 決 定 し ,遺 伝 子 配 列 の 差 異 (alleles)を コ ン ピ ュ ー タ ー 解 析 す る こ と に よ っ て 菌 株 の 識 別 を 行 う Multi Locus Sequence Typing（ MLST） 4 ） が 用 い ら れ る . MRSAク ロ ー ン の 決 定 が 世 界 各 地 で 行 わ れ る と ,そ れ ぞ れ の 国 に 特 徴 的 な CA-MRSAク ロ ー ン が 出 現 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た .ま た CC1-typeIV SCC mec 株 ,CC8-typeIV SCC mec 株 （ 米 国 ） ,CC30-typeIV SCC mec 株 ,CC59-typeV SCC mec 株 （ 台 湾 ,中 国 ） ,CC80-typeIV SCC mec 株 （ ヨ ー ロ ッ パ ） な ど 海 外 で の 特 徴 的 な MRSAク ロ ー ン の 多 く は Panton-Valentine Leukocidin(PVL)と 呼 ば れ る 強 力 な 白 血 球 溶 解 毒 素産生株であった. 我 が 国 の CA-MRSA に つ い て は , と び ひ 患 者 由 来 株 の 中 で MRSA の 割 合 が 増 大 し て い る こ と が い ち 早 く 報 告 さ れ ,ま た 健 康 な 小 児 や 成 人 か らも分離されることが報告されている 5) . ま た 海 外 の MRSA の 日 本 へ の 持 ち 込 み も 報 告 さ れ て い る 6 ) 7 ) .本 研 究 で は 我 が 国 の 市 中 に 拡 が り つ つ あ る MRSA の 特 徴 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て , 順 天 堂 医 院 の 皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 株 の MRSA ク ロ ー ン を 決 定 し た . 同 時 に 近 年 院 内 感 染 MRSA の 解 析 に 用 い ら れ て い る Phage ORF Polymorphism Typing(POT) 8 ) を 実 施 し ,POT で 検 出 す る 23 遺 伝 子 の 保 有 の 有 無 と 5 MLSTと の 対 応 を 比 較 し た . 材料および方法 1. 供 試 菌 株 順 天 堂 大 学 医 学 部 附 属 4 病 院 よ り 分 与 さ れ た 2009 年 2 月 か ら 2012 年 9 月 に 皮 膚 科 外 来 患 者（ 入 院 後 48 時 間 以 内 を 含 む ）の 表 皮 病 巣 部 及 び 膿 瘍 部 位 （ 皮 下 、 頸 部 な ど ） か ら 分 離 さ れ た MRSA 54 株 : 14 株 （ 順 天 堂 医 院 ） ,17 株 （ 練 馬 病 院 ） ,７ 株 （ 浦 安 病 院 ） ,16 株 （ 静 岡 病院）を実験に供した. 2. 分 子 疫 学 的 解 析 1)染 色 体 DNA の 抽 出 染 色 体 DNA は QIAamp DNA Mini Kit（ Quiagen, MD, USA） 及 び シ カ ジ ー ニ ア ス DNA 抽 出 試 薬 （ 関 東 化 学 , 東 京 ） を 用 い た 簡 便 法 に て 抽 出した. 2)SCC mec タ イ プ の 決 定 Kondo ら の 開 発 し た Multiplex PCR を 使 用 し た 9 ) .TypeIV SCC mec の サ ブ タ イ プ の 決 定 に 用 い た primer setは Table 1 に 示 す 9 ) 1 0 ) . 3)MLST Enright ら の 方 法 11) に 従 っ て 行 い , MLST.net に ア ク セ ス し て Sequence type (ST ) を 決 定 し , さ ら に eBURSTv3 で Clonal complex (CC)及 び Founder Group(FG)を 決 定 し た . 6 4)毒 素 遺 伝 子 保 有 の 検 討 PVL遺 伝 子（ lukS,F-PV ）,毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群 毒 素 遺 伝 子 ( tst ) 表 皮 剥 奪 性 毒 素 遺 伝 子 ( et )の 有 無 を PCRに て 判 定 し た .使 用 し た primer setは Table 1 12)13) に示す. Table1 挿 入 3 . Typ eI V S CC mec の 全 塩 基 配 列 の 決 定 DNA は QIAamp DNA Mini Kit（ Quiagen, MD, USA） で 抽 出 し た も の を 使 用 し た . Expand High Fidelity PCR System (Roche,IN,USA) の キ ッ ト を 用 い ,Long-range PCR に て 2 株 （ JCSC8843, JCSC8975） の 持 つ typeIV SCC mec の 全 領 域 を 増 幅 し ,そ の 塩 基 配 列 を primer walking に て 決 定 し た .Long-range PCR に 使 用 し た primer 及 び そ の 位 置 は Fig. １ に 示 す . 決 定 し た 塩 基 配 列 は イ ン シ リ コ バ イ オ ロ ジ ー 社 の imc_ge を 用 い て 解 析 し た . 4 ． P OT 法 に よ る 菌 株 の 比 較 シ カ ジ ー ニ ア ス 分 子 疫 学 解 析 POTキ ッ ト （ 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 用 ）（ 関 東 化 学 , 東 京 ） を 用 い 添 付 の 説 明 書 に 従 っ て 2 組 の PCR を 実 施 し た 後 ,PCR産 物 を ３ ％ Metaphor agarose（ Lonza, ME USA） を 用 い て １ xTBE bufferに て 電 気 泳 動 を 行 っ た . ２ 組 の PCRに よ り SCC mec 上 の ５ つ の 遺 伝 子 ,黄 色 ブ ド ウ 球 菌 の femA 及 び 他 の ２ つ の 染 色 体 上 の ORFに 加 え て , バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ に 代 表 さ れ る 動 く 遺 伝 因 子 上 の 15 の 7 ORFの 検 出 で き ,こ れ ら の PCR産 物 の 有 無 に よ り 菌 株 を 比 較 す る 8 ) . 成績 １． S CC mec タ イ プ の 決 定 最 も 多 か っ た の は typeII SCC mec 株 で 22株 （ 40％ ） で あ り ,次 い で 多 か っ た の は typeIV SCC mec 株 で 21株 （ 39％ ） で あ っ た （ Table２ ） . そ の 他 は typeV SCC mec 株 は 9株 , typeI SCC mec 株 は 1株 で ,１ 株 は mec 遺 伝 子 複 合 体 の ク ラ ス は 決 定 で き た が , ccr 遺 伝 子 が 検 出 で き な か っ た た め SCC mec タ イ プ が 決 定 で き な か っ た . 次 に typeII SCC mec 及 び typeIV SCC mec に つ い て Kondoら の 方 法 9 ) に 基 づ き J１ 領 域 の サ ブ タ イ プ を 調 べ た と こ ろ ,typeII SCC mec 株 は IIa （ 16株 ） , IIb（ 5株 ） ,IIｎ （ サ ブ タ イ プ の 決 ま ら な い 株 ,1株 ） で あ り ,typeIV SCC mec 株 は IVa（ 7株 ） , IVc（ 1株 ） ,IVn(サ ブ タ イ プ の 決 ま ら な い 株 , 13株 )で あ っ た .更 に typeIVn SCC mec 株 13株 を 用 い て ,typeIVgを 検 出 す る primer 1 0 ) を 使 用 し て 調 べ た 結 果 ,IVg株 が 3株 見いだされた. 2 ． T ype I V SC C mec の 塩 基 配 列 の 決 定 そ こ で ,サ ブ タ イ プ の 決 ま ら な い 10株 の 中 か ら JCSC8975株 と JCSC8843株 を 選 び ,こ れ ら の 株 の 持 つ SCC mec の 全 塩 基 配 列 を 決 定 し た .JCSC8975株 の typeIV SCC mec は ,2012年 に 報 告 さ れ た typeIVl SCC mec と 同 じ で あ る こ と が 判 明 し た 1 4 ) .次 に typeIVl SCC mec の サ ブ 8 タ イ プ を 検 出 す る primer(table 1)を 用 い た PCRを 実 施 し た 結 果 ,10 株 中 の 9株 は typeIVl SCC mec で あ っ た . 他 の 一 株 ,JCSC88 43 の 持 つ typeIV SCC mec の 構 造 を Fig. １ に 示 す .SCC mec J C S C 8 8 4 3 の サ イ ズ は 28.4kb で , orfX の 下 流 か ら mec 遺 伝 子 複 合 体 , ccr 遺 伝 子 複 合 体 ま で の 約 17kbの 領 域 は こ れ ま で に 報 告 さ れ た typeIV SCC mec と ほ ぼ 同 じ で あ っ た .し か し , ccr 遺 伝 子 複 合 体 の 下 流 か ら SCC mec の 右 端 末 端 ま で の 領 域 （ J１ 領 域 ） は ,こ れ ま で に 報 告 さ れたものとは全く異なっていたので SCC mec J C S C 8 8 4 3 を typeIVm SCC mec と 命 名 し た .J1 領 域 に は 9 個 の ORF が 存 在 し た . 特 徴 的 な ORF と し て LPXTGモ チ ー フ を 持 つ ORF（ 3288bp ）が 存 在 し た .Type IVlSCC mec 上 に も 同 様 な 蛋 白 が 存 在 す る . こ れ ら の ORF の C 末 端 を 代 表 的 な 表 層 蛋 白 と 比 較 し た と こ ろ （ Figure 2） ,共 通 し て C末 端 側 に ,LPXTGモ チ ー フ ,疎 水 性 ア ミ ノ 酸 領 域 ,陽 性 に 荷 電 し た ア ミ ノ 酸 が 存 在 し た の で , こ れ ら の ORFは Staphylococcus aureus surface protein( sas )の 一 種 で あ る と 判 断 さ れ た 1 5 ) 1 6 ) . そ し て ,typeIVl SCC mec 上 に 存 在 す る sas を sasL , typeIVm SCC mec 上 に 存 在 す る sas を sasM と 命 名 す る こ と を 提 案する. 3 .皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 M RSAク ロ ー ン の 特 徴 54株 の MLSTを す べ て 決 定 し た （ Table３ ） .現 在 MLSTの Websiteで は ,旧 来 の Clonal com plex（ CC）を 新 し く 包 括 す る グ ル ー プ 分 け と し て 9 Founder group（ FG） を 用 い て い る の で ,そ れ に 従 っ た が ,特 に FG1に 属 す る 場 合 は ,従 来 の CCを 使 用 し た ほ う が よ り 明 確 に ク ロ ー ン の 違 い を 表 わ す こ と が で き る と 考 え ,両 者 を 併 記 す る と と も に ,MRSAク ロ ー ン 記 載 と し て は CCを 用 い た .既 知 の STに 属 さ ず ,今 回 新 た に ST番 号 を 登 録 し た 株 が ７ 株 存 在 し た が ,こ れ ら は FG10（ ２ 株 ） ,FG4（ １ 株 ） ,FG1（ ３ 株 ）,FG7（ １ 株 ）と FG3以 外 の す べ て の グ ル ー プ に 分 布 し て い た .54株 の 外 来 患 者 由 来 株 は ５ つ の FG,10の CCに 属 し た .MRSAク ロ ー ン を 保 持 す る SCC mec の タ イ プ と 染 色 体 タ イ プ を CCで 表 示 し た 場 合 ,FG1に 属 す る CC1-typeIVa SCC mec , CC5-typeIIa SCC mec ,CC8-typeI SCC mec , CC8-typeIVa SCC mec , CC8-typeIVl SCC mec , CC8-typeIVm SCC mec , CC81-typeIVg SCC mec , CC97-typeIVsSCC mec ,FG10に 属 す る CC89-typeIIb SCC mec ,CC89-typeIVaSCC mec , CC89-typeV SCC mec , CC89-untypabel SC C mec , CC91-typeIVa SCC mec を 始 め ,CC45-typeIIn SCC mec（ FG 3,CC121-typeV SCC mec (FG4), CC59-typeIVg SCC mec (FG7) と 16種 類 の MRSAク ロ ー ン が 存 在 し て い た .Table3に 示 す よ う に ,CC5-typeIIa SCC mec 株 が 最 も 多 く ,CC8-typeIVl SCC mec 株 が こ れ に 続 い た . 毒 素 遺 伝 子 の 保 有 を PCRに て 検 討 し た 結 果 は . tst 陽 性 株 は 12株 , lukS,F- PV陽 性 株 は １ 株 , eta 陽 性 株 は 2株 , etb 陽 性 株 は 7株 で あ っ た . tst は ,CC5-typeIIa SCC mec 株（ 2/16）, CC98-typeIVc SCC mec 株（ 1）,CC8-typeI Vl SCC mec 株（ 9/9）に 保 持 さ れ て い た . lukS,F- PV 10 は CC8-typeIVa SCC mec 株 に 保 持 さ れ て い た .米 国 で 蔓 延 す る USA300 の 可 能 性 を 検 討 す る た め arginine catabolic mobile element の 存 在 を PCRで 調 べ た が ,陰 性 で あ っ た . eta は CC121-typeV SCC mec 株 に 保 持 さ れ , etb は CC89-tyepIIb SCC mec 株 ,CC89-typeV SCC mec 株 に 保 持 さ れていた. Table 2挿 入 ４ ． P OT法 の 検 討 POT法 を 用 い て 54株 を 解 析 し た . POT法 で は ２ 組 の multiplex PCRを 実 施 し 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 の マ ー カ ー と し て の femA 遺 伝 子 の 検 出 に 加 え （ １ ） SCC mec 上 の ５ つ の 遺 伝 子 （ mecA ,type 2 ccrA , IS 1272の ト ラ ン ス ポ ゼ ー ス , mecI ,type II SCC mec の J1領 域 に 存 在 す る kdpC）,（ ２ ） N315株 及 び MW2株 の 染 色 体 上 の ORF(SA2259及 び MW0919), （ ３ ） 染 色 体 上 に 挿 入 さ れ た ト ラ ン ス ポ ゾ ン Tn 554 ,バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ な ど の 動 く 遺 伝 因 子 上 の 15 の ORF の 保 持 を 検 出 で き る .Table 3 に SCC mec 上 の ５ つ の 遺 伝 子 及 び 染 色 体 上 の ２ つ の ORF の 検 出 結 果 及 び こ れ ら の 結 果 を 基 に POT値 と し て 数 値 化 さ れ た 結 果 を 示 す （ Table 3） . 先 に 決 定 し た MRSA ク ロ ー ン と 対 比 し た 場 合 ,CC5-typeIIa SCC mec 株 で は , mecA , mecI ,classA type2 ccr 遺 伝 子 の 保 持 及 び typeIIa SCC mec の 特 徴 的 OR F で あ る kdpC が 検 出 さ れ , か つ N315 株 の 染 色 体 上 の ORF を 11 保 持 し て い る こ と が 確 認 さ れ た .し か し POT１ 値 が 106示 す 株 （ mecA , IS 1272 , type 2 ccr ,MW0919陽 性 ） に は CC1-typeIVa SCC mec ,CC8に 属 し typeIVa, IVl,IVnew SCC mec を 持 つ 株 , CC81-typeIVg SCC mec , CC97-typeIVc SCC mec 株 が 含 ま れ た . ま た POT １ 値 が 104 を 示 す 株 （ mecA , IS 1272 , type 2 ccr 陽 性 ） に は CC59-typeIVg SCC mec , CC89-IVa SCC mec ,CC91-typeIVa SCC mec が 含 ま れ た . CC8-tyepI SCC mec の 場 合 は mecA と IS 1272 の み が 検 出 さ れ ,CC121-StypeVCC mec 及 び CC89-typeV SCC mec の 場 合 は 検 出 さ れ た の は mecA の み で あ っ た . Table3挿 入 考察 こ れ ま で の 我 が 国 の 病 院 分 離 株 で は ST5-typeIIa SCC mec 株 が 主 要 で あ る と さ れ て い る .今 回 の 解 析 で は ,検 査 室 か ら 分 与 さ れ た 株 は 63株 で あ っ た .こ の 中 に は 後 に 入 院 患 者 由 来 株 と 判 明 し た た め 集 計 か ら 除 外 さ れ た 株 が ９ 株 存 在 し た .こ の 9株 中 で は ST5株 が ５ 株 と 大 半 を 占 め て お り , 依 然 と し て ST5-typeIIa SCC mec ク ロ ー ン が 病 院 感 染 の 起 因 菌 と し て 主 要 な 位 置 を 占 め て い る と 判 断 さ れ た .今 回 の 解 析 に お い て わ ず か 54 株 中 に 16 種 類 の ク ロ ー ン が 存 在 し た .CC5-typeIIa SCC mec ク ロ ー ン の う ち で も ST5に 属 す る 株 は 9株 で ,ま た 他 の 7株 は そ れ 以 外 の STで あ っ た .こ の 点 を 考 慮 に い れ た 場 合 ,病 院 に 主 に 蔓 延 し 12 て い る ST5-typeIIa SCC mec 以 外 の ク ロ ー ン は 54株 中 45株 （ 83％ ） で あ っ た . 今 回 分 離 さ れ た ク ロ ー ン は eta , etb 保 有 株 は と び ひ 由 来 株 と し て 報 告 さ れ た ク ロ ー ン と 同 じ で あ っ た .今 回 の 検 討 し た 株 の 中 に は 海 外 の MRSA の 持 ち 込 み と 推 定 さ れ た 株 は 存 在 し な か っ た . し か し ,我 々 の 以 前 の 検 討 で は 順 天 堂 病 院 の 皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 株 よ り 米 国 で 蔓 延 し て い る USA300 と 判 定 さ れ た 株 が １ 株 , 台 湾 で 蔓 延 し て い る ST5 9 と 判 定 さ れ た 株 が 分 離 さ れ た .USA300 は 我 が 国 で は 2008 年 に 最 初 に 報 告 さ れ て い る が ,そ の 後 ,報 告 例 は 増 加 し 爆 発 的 に で は な い が 徐 々 に そ の 分 離 株 が 増 加 し て い る と 思 わ れ る 6)7) . 毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群 毒 素 toxic shock syndrome toxin(TSST-1) は 1981 年 に 米 国 で 初 め て 報 告 さ れ た 毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群 toxic shock syndromeの 原 因 毒 素 で あ る . tst は 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 染 色 体 上 の pathogenicity isl and（ PI）上 に コ ー ド さ れ て い る .最 初 に 報 告 さ れ た RN4282株 の も つ SaPIは integraseの 相 同 性 か ら ゲ ノ ム 上 の 3時 の 位 置 に 挿 入 さ れ て い る と 推 定 さ れ る . こ れ に 対 し て 我 が 国 の typeII SCC mec 株 の 多 く が も つ tst は 10時 の 位 置 に 存 在 す る 別 の integraseを 持 つ PI（ νSa4）上 に コ ー ド さ れ て い る .ST8-type IVｌ 株 の 多 く は tst 遺 伝 子 を 保 持 し て い た が , こ れ は Iwao ら に よ り 既 に 報 告 さ れ て い る よ う に SaPImと 同 様 に 3 時 の 位 置 に 挿 入 さ れ て い る と 推 定 さ れ る 1 4 ) . 本 研 究 で 見 出 さ れ た も う １ 株 の tst 保 有 株 で あ る CC97株 の 場 合 も ,同 13 じ く 3 時 の 位 置 に 挿 入 さ れ て い る 別 の PI を 保 持 し て い る と 思 わ れ る （ Uehara,未 発 表 デ ー タ ） . 今回検討した菌株は外来患者あるいは 入 院 後 48 時 間 以 内 の 入 院 患 者 か ら 分 離 さ れ た 株 で は あ る が , 各 種 医 療関連の危険因子に関する情報は得ることができなかったので community-onset MRSA に 分 類 さ れ る 可 能 性 は 否 定 で き ず community-onset MRSAと community-associated MRSAの 混 合 し た も の と み な す の が 妥 当 で あ る と 考 え て い る が , 今 回 の デ ー タ は , tst を コ ー ド す る 新 し い PI が 出 現 し , 市 中 に 広 ま っ て い る こ と を 示 し て い る と 考 え ら れ た .ま た typeIVl SCC mec 上 に 存 在 す る は LPXTGモ チ ー フ を も つ ORF（ 5046bp）及 び 本 研 究 で 明 ら か に し た typeIVm SCC mec 上 の LPXTGモ チ ー フ を も つ ORF（ sasM,3288bp）な ど , Sas タ ン パ ク 質 を 持 つ TypeIVSCC mec を 持 つ 株 が 10株 存 在 し た の も 一 つ の 特 徴 で あ っ た . 黄色ブドウ球菌は宿主組織との結合や宿主の免疫を回避するため に 働 く 各 種 の 表 層 タ ン パ ク を 産 生 す る こ と で 知 ら れ る .免 疫 グ ロ ブ リ ン IgGと 結 合 す る protein A,フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン 結 合 蛋 白 な ど が 代 表 的 な も の と し て 古 く か ら 知 ら れ て い る が ,こ れ ら の タ ン パ ク 質 は 共 通 し て C末 端 側 に（ １ ）sortaseの 働 き に よ り 切 断 さ れ る LPXTGモ チ ー フ ,（ ２ ） 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 領 域 ,（ ３ ） 陽 性 に 荷 電 し た ア ミ ノ 酸 を 持 っ て い る 1 5 ) 1 6 ) .報 告 さ れ た ゲ ノ ム 配 列 を コ ン ピ ュ ー タ ー 解 析 し た 結 果 ,先 に 報 告 さ れ た 11の LPXTGモ チ ー フ を も つ タ ン パ ク 質 に 加 え て 14 更 に 10の 新 規 タ ン パ ク 質 が 見 出 さ れ た 1 6 ) 1 7 ) .こ れ ら の タ ン パ ク 質 は 先 の 報 告 1 5 ~ 1 7 ) に 基 づ き Staphylococcus aureus surface (Sas) proteinと 命 名 さ れ て い る .SCC mec 上 で 見 出 さ れ た 最 初 の sas蛋 白 は typeI SCC mec の コ ー ド す る plasmin sensitive protein ( pls )で あ る . 今 回 検 討 し た typeIVl SCC mec 上 の ORF 及 び 新 規 typeIV SCC mec 上 の ORFも sas蛋 白 に 分 類 す る の が 妥 当 と 考 え た .こ れ ら の ORFの 機 能 は ま だ 特 定 さ れ て い な い が ,何 ら か の 宿 主 へ の 定 着 ,宿 主 免 疫 か ら の 回 避 に働いていることが推測される. Figure2挿 入 POT法 は ２ 組 の multiplex PCRを 実 施 し ,生 成 さ れ た DNA断 片 か ら 菌 株 の 特 徴 を 推 定 す る 方 法 で Suzuki 等 に よ り 開 発 さ れ た 方 法 8) を基に, 改 良 さ れ た も の が 市 販 さ れ て い る .菌 株 か ら 簡 便 法 で 抽 出 し た DNAを 用 い て 菌 株 間 の 相 同 性 を 簡 便 に 比 較 す る 事 が で き る の で ,院 内 感 染 の 解 明 な ど に 役 立 つ と さ れ て い る . し か し , 特 定 の ORF を 検 出 し て MRSA ク ロ ー ン を 推 定 す る の は , 原 理 的 に も 非 常 に 難 し い と 推 定 さ れ る . 今 回 の 我 々 の 検 討 で は , 設 計 さ れ た primer か ら 予 想 さ れ た 通 り CC5 − typeIIa SCC mec 株 の 検 出 は 確 実 に で き , 菌 株 相 互 の 比 較 も で き る こ と が 示 さ れ た . ま た typeIV SCC mec 株 の 同 定 も で き る . し か し , 複 数 の MRSA ク ロ ー ン が 同 じ POT 値 を 示 す 事 か ら 他 の ゲ ノ タ イ プ の MRSA, 他 の SCC mec タ イ プ 株 は 特 定 の ク ロ ー ン を 同 定 で き る と い う 段 15 階 に は 至 っ て い な い と 判 断 さ れ た . Nakao ら は 入 院 小 児 患 者 の 糞 便 分 離 株 と 鼻 腔 由 来 株 を POT法 に て 比 較 し ,同 一 の 菌 株 が 鼻 腔 及 び 糞 便 から分離されたことを推定している 18) .POT 値 か ら MRSA ク ロ ー ン を 推 定 す る 作 業 は , MRSAク ロ ー ン を 推 定 す る 原 理 に 基 づ い た も の で は な い た め ,POT 値 か ら MRSA ク ロ ー ン を 推 定 す る こ と せ ず , 簡 便 法 と し て 利 用 し , 我 が 国 の 病 院 に 蔓 延 す る 代 表 的 な CC5-typeIIa SCC mec 株 の 同 定 あ る い は そ れ と の 識 別 ,及 び 増 幅 さ れ た DNA断 片 の パ タ ー ン の 比較により菌株間の相同性を見ることに留めるべきであると考え る. 謝辞 菌株の収集に御協力いただいた順天堂大学附属静岡病院検査部 山 田 邦 光 氏 ,順 天 堂 大 学 附 属 浦 安 病 院 検 査 部 中 澤 武 司 氏 ,順 天 堂 大 学 附 属 練 馬 病 院 検 査 部 立 花 勇 一 氏 に 感 謝 申 し 上 げ ま す .ま た 研 究 を 御 指 導 ,御 協 力 頂 い た 順 天 堂 大 学 感 染 制 御 科 学 韓 笑 博 士 ,張 萌 博 士 ,呂 宇 傑 氏 に 感 謝 申 し 上 げ ま す .本 研 究 は 文 部 科 学 省 基 盤 研 究 (C19590456) 及 び 私 立 大 学 戦 略 的 基 盤 形 成 支 援 事 業（ 2012 – 2017） の支援を受けた. 利益相反自己申告：申告すべきものなし 文献 1) Salgado CD, Farr BM, Calfee 16 DP:Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus : a meta-analysis of prevalence and risk factors. Clin Infect Dis 2003;36:131-139. 2) Klevens RM, Mor rison MA, Nadle J, Petit S, Gershman K, et al.: Invasive methi cillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA 2007;298: 1763-1771. 3) Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCC mec ): guid elines for reporting novel SCC mec elements.Antimicrob Agents Chemother 2009;53: 4961-4967. 4) Enright MC, D .A. Robinson, G. Randle, E. J. Feil, Grundmann, and H. B. G. Spratt:The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci 2002;99:7687-7692. 5)Ken Hisata, Kyoko Kuwahara-Arai, Munetaka Yamanoto, Teruyo Ito,Yasuo Nakatomi, et al.: Dissemination of Methicillin-Resistant Staphylococci among Healthy Japanese Children . J Clin Microbiol 2005;43:3364-3372 6) Shibuya Y, Hara M, Higuchi W, Takano T, Iwao Y, et al.:Emergence of the community-acquired methicillin -resistant Staphylococcus aureus USA300 clone in Japan. J Infect Chemother 2008;14: 439-441. 17 7)Higashiyama M, Ito T, Han X, Ono K, Minamimura K, et al.: Epidural abscess caused by community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain USA300 in Japan. J Infect Chemother 2010;16: 345-349. 8) Suzuki M, Tawada Y, Kato M, Hori H, Mamiya N,et al.: Development of a rapid strain differentiation method for methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated in Japan by detecting phage-derived open-reading frames. J Appl Microbiol 2006;101: 938-947. 9) Kondo Y, Ito T, Ma XX, Watanabe S, Kreiswirth BN, et al.: Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr , and major differences in junkyard regions. Antimicrob Agents Chemother 2007;51: 264-274. 10) Kwon,NH, Park,KT, Moon,JS, Jung,WK, Kim,SH, Kim,JM,et al.: Staphylococcal characterization cassette and chromosome molecular mec analysis (SCC mec ) for methicillin-resistant Staphylococcus aureus and novel SCC mec subtype IVg isolated from bovine milk in Korea. J Antimicrob Chemother 2005;56 : 624-632 18 11)Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SJ, Spratt BG : Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus . J Clin Microbiol 2000;38: 1008-1015. 12) Ma XX, Ito T, Chongtrakool P, Hiramatsu K:Predominance of clones carrying Panton-Valentine leukocidin genes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated in Japanese hospitals from 1979 to 1985.J Clin Microbiol 2006;44:4515-27. 13)Yamaguchi T, Nishifuji K, Sasaki M, Fudaba Y, Aepfelbacher M, Takata T, et al.: Identification of the Staphylococcus aureus etd pathogenicity island which encodes a novel exfoliative toxin, ETD, and EDIN-B Infect Immun 2002;70:5835-45. 14)Yasuhisa Iwao • Rumiko Ishii • Yusuke Tomita • Yasuhiro Shibuya • Tomomi Takano, et al.: The emerging ST8 methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone in the community in Japa n: associated infections, genetic diversity, and comparative genomics. J Infect Chemother 2012:18:228–240 15) Iwao Y, Takano T, Higuchi W, Yamamoto T : A new staphylococcal cassette chromosome mec IV encoding a novel cell-wall-anchored 19 surface protein in a major ST8 community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone in Japan. J Infect Chemother 2012;18: 96-104. 16) Mazmanian SK, Ton-That H, Schneewind O : Sortase- catalysed anchoring of surface proteins to the cell wall of Staphylococcus aureus . Mol Microbiol 2001;40: 1049-1057. 17) Roche FM, Massey R, Peacock SJ, Day NP, Visai L, et al.: Characterization Staphylococcus of aureus novel LPXTG-containing identified from proteins genome of sequences. Microbiology 2003;149: 643-654. 18) Akihiro Nakao, Teruyo Ito, Xiao Han, Yu Jie Lu, Ken Hisata,et al.:Intestinal carriage of methicillin-resistant Staphylococcus au reus in nasal MRSA carriers hospitalized in the neonatal intensi ve care unit. Antimicrobial Resistance and Infection Control 2014, 3:14 20 Fig. 1. Structure of two type IV SCCmec elements. Structures of type IV SCCmec of a new subtype and type IVl SCCmec are illustrated based on the nucleotide sequences deposited in the DDBJ/EMBL/Genbank databases under the accession nos.AB872254 and AB872255 respectively. The black triangles (▲) indicated the positions of direct repeat sequences located at the both ends of the elements. The arrows indicted locations of the primer’s pairs used for amplifying DNA fragments used for nucleotide sequencing. Nucleotide sequences of primers are as follows: cR2(5'-AAACGACATGAAAATCACCAT-3'), mA1(5'-TGCTATCCACCCTCAAACAGG-3'), mA2(5'-AACGTTGTAACCACCCCAAGA-3'), pSJ21-3(5’-TATCTCTTAAGGCGTTGACAACAT-3'), com13(5’-AGCTGTATCAGTCGCTGGTAA-3'), LO2-N (5'-CAGTCGCATCAAATGTCTCTAATG-3'). ORFs encoded by SCCmecJCSC8975 (21 ORFs) and SCCmecJCSC8843 (28 ORFs) are indicated by thick arrows. Fig. 2 Comparison of C-terminus amino acids of LPXTG-motif proteins. Amino acid sequences of C-terminus of two Staphylococcus aureus surface proteins (Sas) are compared to 3 representative LPXTG-motif proteins. LPXTG-motif (five amino acids sequence), which are composed of L(Leucine), P(Proline), X (Aspartic acid or Glutamic acid), T(Threonine), and G(Glycine), are marked with underlines. Three representative LPXTG motif proteins are S. aureus protein A (Spa), fibronectin-binding protein (FbpA), plasmin sensitive protein (Pls). All of them are cell-wall anchor proteins.Spa bind immunoglobulins through the Fc part of several kinds of IgG antibodies.FbpA influences host tissue adherence by binding to host fibronectin. Pls, which is associated with poor bacterial adherence to fibronectin and immunoglobulin G, are suggested to be a virulence factor for septic arthritis and sepsis. Asterisks indicate common sequences between five proteins. H(Histidine), K(Lysine), and R(Arginine) are positively-charged residues; D(Aspartic) and E(Glutamine) are negatively-charged residues. Table 2 Characteristics of 54 MRSA clones Founder groups FG１ Clonal complexes CC1 (n=2) CC5 (n=16) CC8 (n=12) SCCmec types IVa(n=2) IIa(n=16) I(n=1) IVa(n=1) IVl(n=9) IVm(n=1) CC81 (n=2) IVg(n=2) CC97 (n=1) IVc(n=1) FG3 CC45 (n=1) IIn(n=1) FG4 CC121 (n=2) V(n=2) FG7 CC59 (n=1) IVg(n=1) FG10 CC89 (n=16) IIb(n=5) IVa(n=4) V(n=6) ND*(n=1) CC91 (n=1) IVa(n=1) 1) Abbreviations:tst , toxic shock syndorome toxin; lukS, F-PV ; genes for Sa: etb , exfoliative toxin b. *ND :Not determined tst + (2/16) + (9/9) + (1/1) - carriage of exotoxin genes1) lukS,F-PV eta + (1/1) + (2/2) - etb + (2/5) + (5/6) - fragment and F-fragment for Panton Valentine Leucokidin; eta , exfoliative toxin SCCmecJCSC8843 classB J1 region 10,000bp 5,000bp IS431 ugpQ mecA △mecR1 IS1272 orfX 15,000bp ccrB ccrA com13 psj21-3 mA2 LO-2N 28.4kbp SCCmecJCSC8975 classB orfX IS431 ugpQ mecA △mecR1 IS1272 J1 region ccrB ccrA mA1 intA mA2 30,000bp sasM mA1 intA 25,000bp 20,000bp sasL com13 psj21-3 25.6kbp LO-2N Structures of C‐terminus of LPXTG proteins Spa FbpA Pls Sasl SasM KQPANHADANKAQA EENPF SNKNEAKDSKEP QSKNVNHSTINKDH S SEDEANTS RDHNDKTDKPNNKESNNTHKQNNSEAKA- TT F EL S NDAQNN EN D N NNEE S ETDGKQ T DNSKSN ** ** S S S S * S * ‐X (D or E)‐ N NEE N DNSE *
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