Zusammenfassung Chromatographische und Elektrophoretische

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Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie,
Bewegungswissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
Zusammenfassung Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren
1. Theoretische Grundlagen
t R,B
Detektorsignal
t R,A
t M: solvent delay
B
M
A
1w
Zeit

Verteilungskoeffizient K ,

Retentionszeit tR
K=
[A ]stationär
,
[ A] mobil

Kapazitätsfaktor k’
t "t
k = R M
tM

Selektivitätsfaktor α
"=

Anzahl theoretische Böden N
" t %2
N = 16 $$ R ''
#w &

Bodenhöhe H
!
'
A
tR,B # tM
tR ,A # tM
L
N
t "t
Rs = R ,B R,A
wA wB
+
2
2
H=
 Auflösung Rs
!
Amobil
thermodynamisches
Astationär
Gleichgewicht
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 Van-Deemter-Gleichung H =
Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
B
+ c su + c m u
u
16
14
Bodenhöhe (H)
12
H
10
csu
8
6
4
cmu
2
B/u
0
2
4
Flussgeschwindigkeit, cm/s
6
8
Einflussfaktoren:
longitudinale Diffusion, Diffusion in der stationären Phase, Wirbel-Diffusion in
der Säule, Säulendurchmesser, Dicke der stationären Phase
 Optimieren von Retentionszeit und Auflösung
Einflussnahme auf α, k’, N, H
Änderung der Säulentemperatur,
der stationären Phase (z.B. Veränderung der Polarität),
der mobilen Phase (z.B. ändern des pH),
der Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase,
der Säulenlänge,
Erhöhen der k’-Werte (k >10 meist nicht mehr effektiv zur
Erhöhung der Auflösung),
Gradienten fahren (Temperatur, mobile Phase)
 Nicht-ideale Peakformen (tailing). Häufigster Grund: überladene Säule
 Quantitative Methoden
Externer Standard
Interner Standard
Standardaddition
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
2. Gaschromatographie
Datenverarbeitung
Hauptkomponenten:
•
•
•
•
•
•
•
Gasversorgung
Gasreinigung
Injektor
Säule
Ofen
Detektor
Datenverarbeitung
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
 Temperaturgradient: die meist verwendete Methode zur Änderung der
Trennleistung ohne die Kolonne zu wechseln
 Mobile Phase (Trägergas): inerte Gase wie He oder N2
 Stationäre Phase: feste und flüssige stationäre Phasen. Gepackte Säulen und
Kapillarsäulen. Am meisten verwendet: flüssige Phasen in Kapillarsäulen.
 Flüssige Phasen in Kapillarsäulen: meist auf der Basis von Polysiloxan:
R
O
Si
R
R
O
Si
R
R
R= Methyl, Phenyl, Cyanopropyl, Trifluoropropyl
zunehmende Polarität
 Elutionsreihenfolge kann je nach stationärer Phase ändern
(Polaritätsüberlegungen)
 Temperaturlimit der Säulen beachten (Säulenbluten)
 GC-Detektoren
• Flammenionisationsdetektor (FID), der universelle
• Elektroneneinfangdetektor (ECD), für Halogene
• Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD), nicht destruktiv
• Spektroskopische Methoden, relativ aufwendig
• Masenspektrometer (MS), universell, das grössten Potential
 Derivatisierungen: schwerflüchtigen Verbindungen werden messbar, erhöhen
z.T. Detektionsempfindlichkeit
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Elektrophoretische Trennverfahren
3. Flüssigchromatographie (HPLC)
Injektor
Filter
Säule
Detektor
Pumpe
Vorrat
 Verteilungsprinzipien:
• Adsorption: die Analyten werden an der Oberfläche physikalisch
adsorbiert (Adsorptionschromatographie).
• Verteilung: Absorption in die (organische) stationäre Phase
(Verteilungschromatographie, Verteilung zwischen mobiler Phase
und flüssiger stationärer Phase (oft problematisch) oder kovalent
gebundener Phase (am häufigsten verwendet))
• Ionische Wechselwirkung (Ionenaustauschchromatographie)
• Grössenabhängige Diffusion in enge Poren der stationären Phase
(Gelpermeationschromatographie)
Verteilungschromatographie
 Mobile Phase ist wesentlich am Trennvorgang beteiligt (v.a.
Polaritätsargumente)
Gradientenelution: Kontinuierliche Änderung der Eluentzusammensetzung
während eines Experiments.
 Säulenmaterial für chemisch gebundenen Phasen: Trägermaterial: meist
Kieselgel-Partikel (3-10µm Durchmesser), poröse oder nicht-poröse Teilchen
 Normalphasen (polare Eigenschaften) und Umkehrphasen (Reversed Phase,
aploare Eigenschaften
Stationäre Phase Mobile Phase
Elutionsreihenfolge
Bezeichnung
der Probenmoleküle
polar
apolar
apolar vor polar
Normalphasen
polar vor apolar
Umkehrphasen
(z.B. Hexan)
apolar
polar
(z.B. Wasser)
(Reversed-phase )
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Teil Chromatographische und
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 Umkehrphasen (meist chemisch gebunden):
Derivatisierung der Kieselgel-Oberfläche mit apolaren, C2-C18-AlkysilylVerbindungen, z.T. mit polaren Endgruppen
R
H 3C
OH
Si
OH
O
Si
OH
O
Si
OH
O
ClSi(CH3)2R
Si
OH
Si
R
Si
CH3
O
O
Si
H 3C
OH
O
Si
Si
O
O
Si
- HCl
→ Beeinflussung der Trennleistung, der Elutionsreihenfolge
Ionen(austausch)chromatographie (IC)
 Kieselgel- oder Polymer-Partikel mit Austauscherharz-Beschichtung:
Kationentrennung
Sulfonsäuren: -SO3- H+
Anionentrennung
Quartäre Amine: N(CH3)3+ HO-
Carbonsäuren: -CO2- H+
Primäre Amine: NH3+ OH-
 Mobile Phase: Wasser mit Puffer
 Mit IC werden hauptsächlich kleinere anorganische und organische Ionen
getrennt.
 Fast ausschliesslich Leitfähigkeitsdetektor
 Einsatz von Supressorsäulen
Ionenpaarchromatographie
 Der mobilen Phase wird ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als
Hilfskomponente zugegeben
 Mechanismus: Paarbildung in der mobilen Phase oder Ionenaustausch
(Gegenion-Analytion) an der stationären Phase
Gelpermeationschromatographie
 Trennung beruht auf der unterschiedlichen (“3D-“) Grösse der
Analytmoleküle
 Retentions-/Trennmechanismus: Diffusion der Analyten in die Poren des
Packungsmaterials
 Idealerweise keine weitere Wechselwirkung zwischen Analyt und
stationären/mobilen Phase
CH3
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
Affinitäts-Chromatographie
 Trennprinzip: spezifische Wechselwirkung, die bei vielen biochemischen
Systemen zu beobachten ist
 Selektive Adsorption eines Analyten an das Affinitätsharz
 Elution des Analyten durch Änderung der Zusammensatzung der mobilen
Phase (z.B. pH)
 Einsatz oft im präparativen Bereich
Detektoren






UV/VIS-Detektor: Absorption des Lösungsmittels beachten
Brechungsindex-Detektor: universell aber relativ unempfindlich
Fluoreszenz-Detektor: sehr empfindlich
Leitfähigkeits-Detektor: Ionenchromatographie
Massenspektrometrie-Detektor: empfindlich, aufwendig, APCI, ESI
Verdampfungs-Lichtstreu-Detektor: nur für spezielle Anwendungen,
Probleme mit Puffersalzen
Derivatisierungen: Vor- und Nachsäulenderivatisierung
Dünnschichtchromatographie (DC)






DC-Platten: Kantenlängen zwischen 5-20cm
stationäre Phase: 100-250µm dick
relativ geringe Auflösung
schnell und viele Experimente parallel möglich
2D – DC
Detektion: off-line, UV, Fluoreszenz, Laser-MS Methoden
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
4. Elektrophoretischen Trennverfahren
 Trennprinzip: unterschiedlich schnelle Wanderung von Ionen in einem
elektrischen Feld: Ladung/Grösse
Kapillarelektrophorese (CE)
Detektor
Kapillare
Elektrode (+)
(Anode)
Elektrode (-)
(Katode)
Outlet
Elektrolyt
Reservoir
Inlet Elektrolyt
(oder Probe)
Reservoir
Hochspannung
q
6"#r
 Elektrophoretische Beweglichkeit
µe =
 elektroosmotischer Fluss
µeof =
"# E
4$%
!
 Beobachtete Bewegung
µapp = µe + µeof =
Ld
tM E
!
 Flussprofil in der CE: flach (HPLC: parabolförmig)
 Elutionsreihenfolge: Kationen vor Anionen (neutralen Analyten meist nicht
!
getrennt)
+
_
_e
f
a
b
_
_
N
a
+
c,d
c
N
+
f
b
+
e
d
EOF
f
e
(Kationen)
c,d
(Neutrale)
Zeit
b
a
(Anionen)
_
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
Möglichkeiten zur Veränderung des Elektroosmotischen Flusses
Parameter
Ergebnis
Elektrische Feldstärke E
Kleineres E → kleinerer EOF → geringere Auflösung
pH-Wert
EOF-Abnahme bei niedrigerem pH
Puffer/Ionenstärke
Grössere Ionenstärke → Abnahme des Zetapotentials →
kleinerer EOF
Temperatur
Höhere Temperatur → höhere Viskosität → grösserer EOF
Organische Lösungsmittel
Veränderung des Zetapotentials
Tensid-Zusätze zum Puffer Unterhalb der Mizellenbildungs-konzentration Adsorption
an Kapillaroberfläche → Kation. Tenside: Abnahme oder
Umkehrung des EOF. Anion.Tenside: Zunahme des EOF
Hydrophobe Polymere
Adsorption an Kapillaroberfläche
Kovalente Beschichtung
Kovalente Beschichtung an Kapillaroberfläche
Mizellar elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)
 Speziell auch zur Trennung von neutralen Analyten
 Natriumdodecylsulfat (oder andere Tenside) bilden Mizellen = pseudostationäre Phase
 Verteilungsprinzip: neben der elektrophoretischen Trennung auch
chromatographische Verteilung zwischen Puffer und Mizellen
 Migration der Mizelle bestimmt die Kapazität der Methode
Kapillar-Gelelektrophorese
 Kapillare ist mit Gel gefüllt
 Trennung von grossen geladenen Molekülen, z.B. Proteine, DNA
Isoelektrische Fokussierung
 Elektrophorese in einem pH-Gradienten, der durch ein Gemisch von
Trägerampholyten aufrecht gehalten wird.
 Die Analyten wandern im pH-Gradienten zu der Stelle, die ihrem
isoelektrischen Punkt entspricht.
2-D PAGE
 Kombination von isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) und SDS-PAGE
(SDS: sodium dodecylsulfate, PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis, 2.
Dimension).
Detektoren
 meist optische Detektionsmethoden, aber auch elektrochemische Detektoren
und Massenspektrometrie.
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
5. Probenaufbereitung
Extraktion aus flüssigen Proben
 Ausschütteln in Scheidetrichter = klassische Methode, großer Lösungsmittelverbrauch
 Festphasen-Extraktion: grosse Bandbreite and Adsorptionseigenschaften des
Adsorbens (= stationäre Phase) steht zur Verfügung
 Festphasen-Mikroextraktion (SPME): Kein Lösungsmittel nötig; nur
kombinierbar mit GC
Extraktion aus festen Proben
 Batch-Extraktion: geringer Aufwand, oft mäßig erfolgreich
 Soxhlet-Extraktion: Extraktion im heißen Lösungsmittel, zeitaufwendig
 Ultraschall-Extraktion: Alternaive zur Soxhlet-Extraktion, besser für
thermisch labile Substanzen
 Mikrowellen-Extraktion: geringer Zeitaufwand, nur polare Lösungsmittel
einsetzbar
 Überkritische Fluid-Extraktion (SFE): Extraktion bei erhöhten Druck und
Temperatur, meist wird CO2 verwendet, kein Einsatz von Lösungsmittel
Aufkonzentrieren der Extrakte
 Rotavap: abdampfen von leicht flüchtigen Lösungsmitteln, für grössere
Mengen im Einsatz
 Einengen in Stickstoff-Strom: bei kleinen Volumina bevorzugt im Einsatz
Aufreinigung der Extrakte
 Präparative HPLC: abtrennen von störenden Komponenten in einem
chromatographischen System

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