3. Flüssigchromatographie 3.1 Einleitung/Messprinzip Als

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3. Flüssigchromatographie
3.1 Einleitung/Messprinzip
Als Flüssigchromatographie werden jene chromatographischen Verfahren bezeichnet, bei denen
als mobile Phase eine Flüssigkeit verwendet wird. Die stationäre Phase wird entweder in Säulen
eingefüllt
(Säulenchromatographie)
oder auf Platten
aufgebracht (Flachbettverfahren:
Dünnschichtchromatographie, Papierchromatographie). Für die Bezeichnung der heute üblichen
Flüssigkeits-Chromatographie hoher Trennleistung werden die folgenden Ausdrücke verwendet:
Hochleistungs-Flüssigchromatographie
Hochdruck- Flüssigchromatographie
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Ein wesentlicher Unterschied der Flüssigchromatographie gegenüber der Gaschromatographie besteht darin, dass auch sehr polare und thermisch labile Substanzen
gemessen werden können.
Der grosse praktische Durchbruch der Flüssigchromatographie kam mit dem
Gebrauch von Hochdruckpumpen, die einen Druck von 300-400 bar aufrechterhalten
können. Dies erlaubt den Einsatz von sehr dicht gepackten Säulen, was wesentlich die
Trenneffizienz der Methode beeinflusst.
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3.2. Apparatur
a)
b)
Injektor
Vorrat
c)
d)
Filter
Säule
e)
Detektor
Pumpe
a) Eluentvorrat/Pumpe:
Der Eluent wird aus einem Vorratsgefäss mit einer Hochdruckpumpe auf die Säule
geleitet. Bevor der Eluent die Pumpe erreicht, werden in einem Entgaser (degasser)
gelöste Gase (Stickstoff, Sauerstoff) entfernt um Blasenbildung in der Pumpe oder der
Säule zu verhindern. Hierzu wird der Eluent z.B. in einem Teflonschlauch durch eine
Vakuumkammer geführt, wo die gelösten Gase von der Flüssigkeit durch die poröse
Schlauchwand in die Vakuumkammer diffundieren.
An HPLC-Pumpen werden sehr hohe Ansprüche gestellt, da sie reproduzierbar und
pulsationsfrei Drücke von bis zu 400 bar aufrechterhalten müssen.
b) Injektor
Die Probe wird meist mit einer Spritze durch eine spezielle Injektionsschleife in den
Eluentenstrom eingebracht. Typische Injektionsvolumina betragen 10-50µl.
Injektion der Probe:
Probe
Pumpe
Abfall
Säule
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Ausspülen der Probe in die Säule:
Pumpe
Abfall
Säule
c) Filter
Da Partikel im Eluent oder aus der Probe die sehr dicht gepackten HPLC-Säulen
verstopfen können, wird die Probe entweder vor der Injektion oder direkt vor der
Säule gefiltert.
d) Säule
HPLC-Säulen sind meist Stahlrohre (seltener Glas, wegen des hohen Drucks) mit
typischen Längen von 10-50cm und Innendruchmessern von 1-10mm. HPLC-Säulen
sind in den meisten Fällen mit porösen Partikeln von 3-10µm Durchmesser gepackt,
wobei eine dichte und einheitliche Packung wichtig ist.
Die Partikel bestehen meist aus Kieselgel, Aluminiumoxid, Zirkonoxid oder
Polymeren und weisen eine enge Grössenverteilung auf. Je nach Verwendungszweck
kommen poröse oder nicht poröse Partikel zum Einsatz, die häufig mit einer
organischen Phase beschichtet werden. Kieselgel ist die am häufigsten eingesetzte
stationäre Phase.
e) Detektoren
Es muss darauf geachtet werden, dass die Totvolumina zwischen Säulenende und
Detektor möglichst klein sind, damit keine unnötige Bandenverbreiterung auftritt.
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Gradientenelution
Wenn ein Substanzgemisch sehr unterschiedliche Polaritäten aufweist, kann es
hilfreich sein, die Zusammensetzung des Eluenten während eines Chromatograms zu
ändern. Dies nennt man Gradientenelution - im Gegensatz zur isokratischen Elution,
bei der die Eluentzusammensetzung über das ganze Experiment konstant bleibt.
Gradientenelution führt häufig zu schärferen Peaks und kürzeren Retentionszeiten.
Vergleich einer a) isokratischen Elution und b) einer Gradientenelution
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3.3 Flüssigkeitschromatographische Trennmethoden
Aufgrund der vielfältigen stationären Phasen unterscheidet man in der Flüssigkeitschromatographie verschiedene Unterarten.
Folgende Verteilungsprinzipien kommen zur Anwendung:
 Adsorption: die Analyten werden an der Oberfläche physikalisch adsorbiert
(Adsorptionschromatographie).
 Verteilung: Absorption in die (organische) stationäre Phase
(Verteilungschromatographie)
 Ionische Wechselwirkung (Ionenaustauschchromatographie)
 Grössenabhängige Diffusion in enge Poren der stationären Phase
(Gelpermeationschromatographie)
Stationäre Phasen, die nach dem Prinzip der Adsorption oder Absorption eine
Trennung von Analyten bewirken, werden weiter unterteilt in Normalphasen (polare
Eigenschaften) und Umkehrphasen (Reversed Phase, aploare Eigenschften). Die
Benennung in „Normalphase“ und „Umkehrphase“ hat historische Gründe, da zuerst
polare Phasen (Normalphasen) eingesetzt wurden, bevor man die heute häufiger
verwendeten Umkehrphasen entwickelte.
Die Trennung der meisten Normalphasen beruht auf der Stärke der Wechselwirkung
von den Analyten mit den aktiven Stellen der stationären Phase. (z.B. Silanolgruppen
bei Kieselgel). Dabei tritt der Analyt in Konkurrenz mit den Eluentmolekülen, die
ebenfalls an der Oberfläche der stationären Phase adsorbieren können. Man kann sich
vorstellen, dass die Analytmoleküle die Eluentmoleküle (die immer in grosser
Überzahl vorhanden sind) von der Oberfläche der stationären Phase verdrängen
müssen um retardiert zu werden. Sehr polare Eluenten können also nur geringfügig
von der stationären Phase verdrängt werden, wodurch die Analyten schneller in der
mobilen Phase ausgeschwemmt werden, d.h. es sind kleine Retentionszeiten zu
beobachten. Man spricht von einer elutropen Reihe von Lösungsmitteln für
Normalphasen-Säulen, wobei polare Eluenten eine grosse Elutionskraft besitzen und
kurze Retentionszeiten zur Folge haben.
Elutrope Reihe:
Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan < Trtrahydrofuran < Acetonitril <
Ethanol < Methanol < Wasser
Je nach Polarität der stationären Phase kann diese Reihenfolge auch leicht ändern.
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3.3.1 Adsorptionschromatographie
Die Adsorptionschromatographie (Flüssigkeits-Festkörper-Chromatographie) gehört zu den
ältesten chromatographischen Methoden (Tswett, 1906). Die Retention wird bei der
Adsorptions-chromatographie durch die Wechselwirkung zwischen den Probenmolekülen und
den aktiven Stellen einer festen stationären Phase (Adsorbens) verursacht. Das Adsorbens ist ein
poröser Festkörper mit grosser Oberfläche (50 - 1000 m2/g) wie z. B. Silicagel und
Aluminiumoxid.
Die Trennung der Probenmoleküle an polaren Adsorbentien wie Silicagel oder Aluminiumoxid
(Normalphasen) erfolgt durch Polaritätsunterschiede, wobei polare Probenmoleküle stärker
adsorbiert werden als apolare. Für die Abhängigkeit der Elution von der Art der funktionellen
Gruppen der Probenmoleküle lässt sich deshalb eine empirische Reihenfolge aufstellen:
Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe < gesättigte Kohlenwasserstoffe <
Aromaten < halogenierte Verbindungen < Aether < Nitrile < Nitroverbindungen <
Ester < Ketone < Aldehyde < primäre Amine < Amide < Phenole < Carbonsäuren.
Die
Adsorptionschromatographie
erzielt
oft
gute
Trennungen
Isomerengemischen, wird aber im Allgemeinen nicht sehr häufig angewandt.
von
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3.3.2 Verteilungschromatographie
Man unterscheidet zwei Formen der Verteilungschromatographie: Die „FlüssigkeitsFlüssigkeits-Chromatographie“ bei der flüssige stationäre Phasen verwendet werden
und „Chromatographie an gebundenen Phasen“, bei der die organische stationäre
Phase an einer Oberfläche immobilisiert wird.
3.3.2.1 Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie
Die Trennung in der Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie beruht auf der
unterschiedlichen Verteilung der Analyten zwischen der stationären Phase
(aufgesogen von einem porösen, inerten Festkörper (Träger)) und der mobilen Phase.
Die mobile und die stationäre Phase sollten dabei nicht miteinander mischbar sein.
stationärePhase
Phase: ein dünner
stationäre
inFilm
den in
Poren
den Poren
mobile
Phase
Verteilungsgleichgewicht
Die für die Chromatographie generell geforderte Nichtmischbarkeit von mobiler und
stationärer Phase führt oft zu praktischen Schwierigkeiten (Sättigungsprobleme,
mangelnde Stabilität, etc.), so ist z.B. keine Gradienten-Elution möglich. Zudem
bedingt der ständige Verlust der stationären Phase (die nur durch physikalische
Adsorption an den Teilchen des Packungsmaterials zurückgehalten wird) eine
periodische Erneuerung/Wiederauftragen der stationären Phase. Aus diesen Gründen
ist die Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie für Routineanalysen weniger gut
geeignet.
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Entsprechend der Polarität der stationären Phase unterscheidet man grundsätzlich
zwischen zwei Arten:
Stationäre Phase
Mobile Phase
Elutionsreihenfolge
Bezeichnung
der Analyten
polar
apolar (z.B. Hexan)
apolar vor polar
Normalphasen
apolar
polar (z.B. Wasser)
polar vor apolar
Umkehrphasen
(reversed-phase)
3.3.2.2 Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen
Wird die stationäre Phase chemisch kovalent an die Partikel der Packung gebunden,
spricht man von Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen. Dies erhöht die
Stabilität gegenüber auswaschen durch die mobile Phase. Chromatographie an
gebundenen Phasen ist deshalb heute eine der am häufigsten verwendeten Verfahren.
Säulenmaterial für chemisch gebundenen Phasen
Die organische stationäre Phase wird meist an Kieselgel-Partikel gebunden, die
Durchmesser von 3-10µm haben. Kieselgel hat den Vorteil, dass es mechanisch stabil
ist (was bei den hohen Drücken der HPLC nötig ist) und dass organische
Verbindungen relativ einfach und vor allem in dichter Packung daran gebunden
werden können. Es werden z.T: poröse Teilchen verwendet wobei auf eine enge
Verteilung der Porengrösse geachtet werden muss. Meist werden apolare
Beschichtungen verwendet, also Umkehrphasen; es gibt aber auch chemisch
gebundene Normalphasen.
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Für eine unpolare stationäre Phase werden meist Alkysilyl-Verbindungen an die
Oberfläche der Kieselgelpartikel gebunden.
R
Oberflaeche
des Partikels
H 3C
OH
Si
OH
O
Si
OH
O
Si
OH
O
+ ClSi(CH3)2R
Si
OH
Si
Si
R
CH3
O
O
Si
H 3C
OH
O
Si
Si
O
O
Si
- HCl
„R“ sind oft C2-C18-Alyklketten. Mit diesen Substitutionsreaktionen können aufgrund
sterischer Limitierungen oft nur die Hälfte oder weniger der Silanolgruppen
derivatisiert werden. Somit ist die stationäre Phase immer noch relativ polar. Um
einen Teil der restlichen OH-Gruppen auch noch umzusetzen kann ein „end-capping“
durchgeführt werden, indem man Si(CH3)3-Gruppen mit der Oberfläche reagieren
lässt.
Durch die Länge des Alkylrestes kann die Trenneigenschaft der Säule wesentlich
beeinflusst werden. Eine lange C18-Kette weist eine deutlich höhere Trennleistung auf
als eine C1-Phase.
Zusammen mit der Länge der Alkylkette beeinflussen auch die Packungsdichte, und
der Grad des end-cappings die Retentionseigenschaften einer Phase. Alle diese
Parameter werden zusammenfassend als Kohlenstoff-Gehalt einer Säule bezeichnet,
um verschiedene Säulen miteinander vergleichen zu können.
Diese sehr aploaren Phasen bedingen den Einsatz von polaren mobilen Phasen wie
Wasser oder Methanol.
An die organischen Alkylreste der stationären Phasen können polare Substituenten
gebunden werden, um die Polarität der gebundenen Phase zu erhöhen. Solche Säulen
sind also Normalphasen. Übliche Alklyderivate sind Cyano-, Alkohol- oder AminoGruppen. Bei diesen polareren Phasen können auch apolare Eluenten wie Hexan oder
Chloroform eingesetzt werden.
CH3
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Einer der wesentlichen Unterschiede zwischen Flüssigchromatographie und
Gaschromatographie besteht darin, dass die mobile Phase in der
Flüssigchromatographie wesentlich zur Trennung der Analyten beiträgt. Eine
wichtige Eigenschaft ist dabei die Polarität der mobilen Phase. Meist wird ein Eluent
gewählt, der eine möglichst unterschiedliche Polarität hat wie die Analyten und eine
stationäre Phase mit ähnlicher Polarität wie die Analyten.
Häufig werden sogenannte Gradientenelutionen durchgeführt, d.h., die Polarität des
Eluenten wird während des Experiments kontinuierlich verändert, meistens wird
dabei die Elutionskraft des Eluentgemisches gegen Ende des Chromatogramms
erhöht.
In einer Umkehrphasen-Chromatographie kann man z.B. mit einem rein polaren
Eluenten das Chromatogramm beginnen (z.B. 100% Wasser) und dann kontinuierlich
immer mehr von einem apolareren Lösungsmittel dazumischen (z.B. Acetonitril),
sodass der Eluent am Ende des Experiments z.B. zu 10% Wasser und 90% aus
Acetonitril besteht.
Bei HPLC-Säulen muss häufig auf den eingeschränkten pH-Bereich geachtet werden,
bei denen sie eingesetzt werden können. Polymer-Partikel als stationäre Phase sind
zudem relativ druckempfindlich, sie sind aber in extremen pH-Bereichen stabiler als
Kieselgel-Partikel.
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3.3.3 Ionen(austausch)chromatographie (IC)
Ionische Analyten können mit konventionellen Säulen kaum getrennt werden.
Beschichtet man jedoch Kieselgel- oder Polymer-Partikel mit Alkylketten an deren
Enden sich ionisierbare funktionelle Gruppen befinden, können ionische
Wechselwirkungen ausgenutzt werden um eine Trennung zu erreichen. Man nennt
diese stationären Phasen Austauscherharze.
Substituenten zur Trennung von Kationen und Anionen
Kationentrennung
Sulfonsäuren: -SO3- H+
Anionentrennung
Quartäre Amine: N(CH3)3+ HO-
Carbonsäuren: -CO2- H+
Primäre Amine: NH3+ OH-
Als mobile Phase wird oft Wasser eingesetzt, dem ein Puffer beigegeben wird, wobei
die Pufferionen mit den Analyten um die Austausch-Plätze an der stationären Phase
konkurrieren. Mit der mobilen Phase wird auch ein gewisser pH-Wert eingestellt, bei
dem die stationäre Phase ionisiert wird.
Elutionsreihenfolge für Kationen:
Ba2+ < Ca2+ < Zn2+ < Mg2+ < Cs+ < Rb+ < K+ < NH4+ < Na+ < H+ < Li+
Elutionsreihenfolge für Anionen:
Citrat < Sulfat < Oxalat < Iodid < Nitrat < Phosphat < Bromid < Nitrit < Chlorid <
Acetat < Hydroxid
Mit IC werden hauptsächlich kleinere anorganische und organische Ionen getrennt.
Als Detektoren werden fast ausschliesslich Leitfähigkeitsdetektoren eingesetzt. Die
hohe Empfindlichkeit dieser Detektoren wird jedoch stark von den Pufferionen
beeinträchtigt, sodass das Signal der Analytionen oft nicht mehr sichtbar ist. Es
werden deshalb Supressorsäulen zwischen die eigentliche Trennsäule und den
Detektor geschaltet, in der selektiv die Pufferionen neutralisiert werden.
Für Kationentrennungen wird oft HCl (H+ Cl-) als Puffer eingesetzt. In der
Supressorsäule findet folgende Reaktion statt:
Harz-OH- + H+ + Cl-  Harz-Cl + H2O
Die zu trennenden Kationen hingegen zeigen keine Wechselwirkung mit dem
anionischen Harz.
Für Anionentrennung (Puffer: Na+ HCO3-):
Harz-H+ + Na+ + HCO3-  Harz-Na + H2CO3
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3.3.4 Ionenpaarchromatographie (Ion-pair chromatography, IPC)
Mit Hilfe der Ionenpaar-Chromatographie lassen sich ebenfalls Proben analysieren,
die ionische Komponenten enthalten. Man unterscheidet folgende Arten von
Ionenpaar-Chromatographie:
Normalphasen- Ionenpaar-Chromatographie
Umkehrphasen Ionenpaar-Chromatographie
Ionenpaar-Adsorptionschromatographie
Im Falle der Ionenpaar-Chromatographie an einer Umkehrphasen-Säule wird der
mobilen Phase ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente
zugesetzt. Als Gegenion wird z. B. das Anion der Heptansulfonsäure für kationische
Proben und das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben
verwendet. Zur Erklärung des Trennmechanismus werden zwei Modelle
vorgeschlagen:
1) Paarbildung in der mobilen Phase. Das der mobilen Phase zugesetzte grosse
Gegenion bildet mit dem ionischen Probenmolekül ein Ionenpaar. Dieses Ionenpaar
verhält sich wie eine neutrale, nicht polare Verbindung, die von der UmkehrphasenSäule zurückgehalten wird.
2) Ionenaustausch an der stationären Phase. Das Gegenion wird mit seinem
organischen Teil an den Umkehrphasen-Teilchen adsorbiert. Seine ionische
Funktionalität bewirkt eine Trennung nach einem Ionenaustausch-Mechanismus.
Paarbildung
Ionentausch
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3.3.5 Gelpermeationschromatographie
(Gel-Filtration, Ausschluss-Chromatographie, Size-exclusion chromatography, SEC)
In der Gelpermeations-Chromatographie beruht die Trennung auf der
unterschiedlichen Grösse der Analytmoleküle, wobei das Porenvolumen des
Packungsmaterials ausgenützt wird. Die kleinen Moleküle haben die Möglichkeit, in
die Poren des Packungsmaterials (poröse Kieselgele oder Polymere, Porengrösse. 50 106Å) vorzudringen und verweilen daher länger in der Trennsäule als grosse
Moleküle, welche nicht in die Poren diffundieren können und schnell durch die
Zwischenräume zwischen den Packungskörnern hindurchgespült werden. Moleküle
bis zu einer Masse von ca. 106 Dalton können getrennt werden, wobei ein
Masseunterschied von ca. 10% für eine Trennung nötig ist.
Die mobile Phase bei der Gelpermeations-Chromatographie zeigt im Idealfall keine
Wechselwirkung mit dem Packungsmaterial und soll nur als Transportmittel für die
Probe dienen. Aus diesem Grunde sollte die Probe in der mobilen Phase gut löslich
sein. Die Probe sollte auch mit dem Packungsmaterial keine Wechselwirkungen, wie
z. B. Adsorption, aufweisen.
Die Beziehung zwischen der Elutionszeit (-volumen) und der Molekülgrösse (oder
relativen Molmasse) für ein bestimmtes Packungsmaterial wird mittels Eichkurven
dargestellt:
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Der lineare Bereich der Eichkurve wird im wesentlichen durch die Porengrösse
bestimmt. Somit kann durch die Wahl eines Packungsmaterials mit einer
entsprechenden Porengrösse der jeweils gewünschte Molmassenbereich abgedeckt
werden. Durch Verwendung von langen Trennsäulen erhält man genügend
Porenvolumen und Trennleistung. Zur Steigerung der Trennleistung wird oft bei
erhöhter Temperatur gearbeitet.
3.3.6 Affinitäts-Chromatographie
Die Affinitäts-Chromatographie nutzt spezifischen Wechselwirkungen aus, die bei
vielen biochemischen Systemen zu beobachten sind (z. B. Antigen/Antikörper;
Enzym/Substrat), um z.B. Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und anderen
Klassen von natürlich vorkommenden Verbindungen zu isolieren. Zu diesem Zweck
wird ein spezifisches Protein oder ein anderes, biospezifisches Molekül (oft als
Ligand bezeichnet) an einen unlöslichen Träger (z. B. Agarose-Gel,
Cellulosederivate, Polyacrylamid-Gel) kovalent gebunden
.
Die Affinitätschromatographie unterscheidet sich im experimentellen Verlauf leicht
von einem normalen chromatographischen Experiment. Es wird selektiv eine
entsprechende Substanz durch Komplexbildung mit dem trägergebundenen Liganden
auf der Säule festgehalten, während alle anderen Begleitsubstanzen von der Säule
gespült werden. Anschliessend wird der Komplex durch Änderung der mobilen Phase
(z. B. pH, Ionenstärke) zerlegt und die gewünschte Substanz in gereinigter,
konzentrierter Form von der Säule eluiert.
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3.4 Detektoren
Eine Vielzahl von Detektoren wird für HPLC-Analysen eingesetzt, wobei es keine
„universellen“ Detektoren gibt, wie etwa den FID in der Gaschromatographie. HPLCDetektoren können in zwei Gruppen eingeteilt werden: solche, die ausschliesslich auf
die Analyten ansprechen, wobei darauf zu achten ist, dass der Eluent nicht zu stark
auf solche Detektionsmehtoden anspricht. Andere Detektoren sprechen auf
Eigenschaften der gesammten Lösung an (=Eluent + Analyt), wobei Änderungen von
reinem Eluent und Eluent+Analyt gemessen werden.
3.4.1 UV/VIS-Detektor
Die Ultraviolett Absorption ist eine der meist verwendete LC-Detektionsmethode
aufgrund der guten Empfindlichkeit für viele Substanzklassen und der relativen
Unempfindlichkeit gegenüber Lösungsmittelgradienten.
Hauptnachteil: Nur empfindlich auf Substanzen mit UV Absorptionen bei grösserer
Wellenlänge als diejenige vom Lösungsmittel.
Typische absorbierende Gruppen:
- Br, I, S
- C=O
- 2 oder mehr konjugierte Doppelbindungen
- Aromatische Ringe
Um das Signal zu maximieren muss ein möglichst langer Absorptionspfad genutzt
werden, wobei zu lange Messwege die Auflösung beeinträchtigen können. Deshalb
sind die Messvolumina oft auf 1-10µl beschränkt.
Eluent von Säule
UV-Strahl
Bei einfachen Detektoren wird die Absorption bei nur einer Wellenlänge gemessen.
Bessere (und teurere) Detektoren können simultan ein ganzes UV-Spektrum
aufnehmen (Diodenarray-Detektoren). Somit kann ein Spektrum von ca. 200-800nm
für jeden Peak aufgenommen werden.
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3.4.2 Brechungsindex-Detektor
Der Brechungsindexdetektor ist ebenfalls weit verbreitet. Der Brechungsindex eines
reinen Lösungsmittels ist nicht (oder sehr selten) gleich jenem eines AnalytLösungsmittelgemisches. Der Brechungsindexdetektor ist allgemeiner einsetzbar als
der UV Detektor, da der Brechungsindex fast aller Substanzen unterschiedlich ist zu
jenen der Lösungsmittel.
Die Empfindlichkeit des Detektors ist eine Funktion des Analyt-Lösungsmittelpaars.
Sie hängt somit nicht nur vom Analyt, sondern auch vom Lösungsmittel ab. Einer der
grössten Nachteile ist jedoch seine geringe Empfindlichkeit.
Mobile Phase von
der
Säule
vonSäule
PhotodiodenPhotodiode
Detektor
Spiegel
Lichtstrahl
Lichtstrahl
OptischeKuvette
Kuvette
Optische
Die durchgezogene Linie in der Abbildung zeigt den Strahlengang, wenn reines
Lösungsmittel durch die Kuvette fliesst. Der Strahl kommt auf der Photodiode an. Die
gestrichelte Linie zeigt der Strahlengang wenn Analyt mit dem Lösungsmittel durch
die Kuvette fliesst. Der Lichtstrahl wird seitlich versetzt, und die Photodiode „sieht“
ihn weniger, oder nicht mehr. Falls mit Gradientenelution gearbeitet wird, muss eine
Refenzzelle benutzt werden.
3.4.3 IR-Detektor
Ein IR-Detektor ist im Prinzip ähnlich aufgebaut wir ein UV-Detektor, wobei ein
Infrarotstahl durch eine Kuvette geschickt wird und das IR-Absorptionsspektrum des
Eluenten (+Analyt) aufgenommen wird.
Da das Lösungsmittel auch IR-Absorptionsbanden hat, muss es sorgfältig ausgewählt
werden, um die Analytbanden nicht zu überdecken. Aufgrund dieser Limitierungen
kann ein IR-Detektor oft nur begrenzt eingesetzt werden.
Die Empfindlichkeit der IR-Detektoren ist nicht besonders gut, und
etwa
vergleichbar mit jener des Brechungsindexdetektors.
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3.4.4. Fluoreszenz-Detektor
Wenn die zu analysierende Substanzen fluoreszieren, ist dieser Detektor wegen seiner
hohen Empfindlichkeit, die rund 1000 mal besser ist als jene eines UV Detektors, sehr
vorteilhaft. Für nicht fluoreszierende Verbindungen können z.T. Derivate hergestellt
werden, welche fluoreszierende Eigenschaften haben.
Photodetektor
Wellenlängeselektives Element
Anregungslicht
Kuvette(von
(vonoben)
oben gesehen)
Kuvette
vom Eluat durchspült
Einfache Geräte benutzen eine fixe Anregungswellenlänge, und Glasfilter um das
Fluoreszenzlicht selektiv zu beobachten. Bessere Geräte benutzen Monochromatoren
am Ein- und Ausgang um Empfindlichkeit und Selektivität zu optimieren.
3.4.5 Leitfähigkeits-Detektor
Leitfähigkeit ist vor allem als Detektionseigenschaft für Ionen von Interesse. Die
Leitfähigkeit des Lösungsmittels darf aber nicht sehr hoch sein, da dies eine sehr
geringe Messempfindlichkeit zur Folge hätte. Zur Trennung von Ionen werden jedoch
häufig gepufferte mobile Phasen eingesetzt. Deshalb werden die Pufferionen in
kleinen Säulen vor dem Leitfähigkeitsdetektor neutralisiert (siehe Kap. 3.3.3).
3.4.6 Massenspektrometrie-Detektor
Das Grundproblem für die Kopplung von LC mit MS-Detektoren besteht darin, dass
die Probe für eine MS-Messung immer in gasförmiger Form vorliegen muss. Wenn
dies, wie bei der Flüssigchromatographie, nicht der Fall ist, muss eine geeignete
Methode gefunden werden, um die Probe in die Gasphase zu bringen.
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Die zwei üblichsten Arten, wie das Lösungsmittel von den Analyten getrennt wird
und wie die Analyten ionisiert werden sind APCI und ESI.
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
Das Eluat wird in einer geheizten Kapillare mit einem Nebulizergas zersprüht. In der
Ionisationskammer werden in einem ersten Schritt vor allem Moleküle des
Lösungsmittels und des Trägergases durch eine Corona-Entladung ionisiert. Die
Ionisation der Analyt-Moleküle erfolgt dann durch Reaktionen mit den
Lösungsmittel-/ Trägergasionen (chemische Ionisation), was eine sehr weiche
Ionisationsmethode darstellt. Weiche Ionisationsmethoden haben den Vorteil, dass die
Analytmoleküle wenig fragmentieren und so häufig Identifizierungen von
unbekannten Substanzen einfacher machen.
Die Ionen werden daraufhin in den Vakuumteil des MS überführt, wobei meist
mehrstufige Vakuumsysteme verwendet werden.
Elektrode
- OH
X
X
von derSäule
A
zum MS
A+
XA + OHA-- --> A-
X: Trägergas,
Lösungsmittel
A: Analyt
Elektroprayionsation (ESI)
Das Eluat wird mit einer dünnen Nadel, an der eine Hochspannung angelegt ist,
versprüht. So entstehen geladene, flüssige Tröpfchen, die im Nebulizergas schnell
abtrocknen. Die Ladung der Tröpfchen wird auf die Analyten übertragen. Die
Einleitung ins MS kann linear oder rechtwinklig zur Einspritzrichtung sein.
von der
Säule
3ooo V
A n+
zum MS
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3.4.7 Verdampfungs-Lichtstreu-Detektor
(Evaporative Light Scattering Detector, ELSD)
Der ELSD ist ein relativ universeller Detektor für Verbindungen, die einen kleineren
Dampfdruck als das Lösungsmittel besitzen. Der Eluent wird zersprüht und das
Lösungsmittel in einer nachfolgenden Heizstrecke verdampft. Die schwererflüchtigen
Analyten bleiben als kleine Partikel (mit Durchmesser im µm Bereich) im Gasstrom
zurück. Mit einem Laser wird nun die Lichtstreuung der Partikel gemessen, wobei die
Anzahl und Grösse der Partikel proportional zur Analytkonzentration ist. Da eventuell
vorhandene Pufferionen ebenfalls ein Signal ergeben ist dieser Detektor auf
Anwendungen ohne Puffer, oder nur mit flüchtigen Puffern, im Eluenten beschränkt.
3.4.8 Magnetresonanz-Spektroskopie (NMR)
Wegen den hervorragenden Strukturaufklärungsmöglichkeiten ist NMR prinzipiell
eine hervorragende Detektioinsmethode. NMR ist allerdings nicht sehr empfindlich,
was technisch aufwendige „stopped-flow“ Einrichtungen nötig macht, da eine NMR
Messung Minuten dauern kann. Eine weitere Voraussetzung ist das Verwenden von
deuterierten Lösungsmitteln. Da NMR zudem eine teure Methode ist, wird sie in der
Praxis selten direkt mit LC gekoppelt.
von Säule
Flussschalter
NMR
NMR
NMR füllen
normaler Fluss
3.4.9 Elektrochemische Detektoren
In diesen Detektoren wird ein Strom gemessen, der durch Analytmoleküle, die
oxidiert werden, entsteht. Es gibt verschiedene Anordnungen für elektrochemische
Detektoren, grundsätzlich wird aber immer ein Strom zwischen Arbeitselektrode und
Gegenelektrode gemessen.
60
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3.5 Derivatisierungen
Generell sind zwei Typen von Derivatisierungen möglich: Vor- und
Nachsäulenderivatisierungen. Die Vorsäulenderivatisierung wird meist eingesetzt,
wenn Probleme bei der Trennung der Substanzen auftreten (siehe Kapital GC). Falls
lediglich die Detektionseigenschaften verbessert werden sollen, kann auch eine
Nachsäulen-Derivatisierung durchgeführt werden. In der HPLC werden
Derivatisierungen meist in Verbindung mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren
verwendet.
Häufig verwendete Derivatisierungsreagenzien in der HPLC:
Funktionelle Gruppe
Derivatisierungsreagenz
-NH2 (Amine,
Aminosäuren)
5-(N,N-Dimethylamino)naphthalin-1sulphonylchlorid
2,4-dinitrofluorbenzol
3,5-Dinitrobenzochlorid
Silylierungsreagenzien
2,4-Dinitrophenylhydrazin
(DNPH)
4-Hydroazino-7nitrobenzofurazan
4-Brommethyl-7methoxycoumarin
Dansylaziridin
-OH (Alkohole)
-CHO (Aldehyde)
-CRO (Ketone)
-COOH (Säuren)
-SH (Thiole)
Beispiel: Derivatisierung von Carbonylen mit DNPH
Eine Standardmethode zur Bestimmung von Aldehyden ist die Derivatisierung mit
2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH), die nach folgendem Schema abläuft.
R1
NH2
N
HN
HN
R1
O2N
O2N
O
+
R2
R2
-H2O
+ Säure
NO2
NO2
Die Analyse der Reaktionsprodukte (Hydrazone) erfolgt meist mit einer RP-Säule und
einer UV-Detektion.
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Bewegungswissenschaften und Sport
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
3.6 Dünnschichtchromatographie (DC, Thin Layer Chromatography, TLC)
Bei der DC ist die stationäre Phase nicht in einer Säule aufgebracht, sondern als
dünne Schicht auf einer Glas-, Metall- oder Kunststoffträgerplatte aufgetragen. DC ist
gegenüber säulenchromatographischen Methoden meist schneller und billiger, da
viele Experimente gleichzeitig durchgeführt werden können. DC wird deshalb häufig
zu Tests bei der Methodenentwicklung eingesetzt. Ein Nachteil der DC ist die
beschränkte bzw. aufwendige Detektion.
3.6.1 DC-Platten
DC-Platten haben meist Kantenlängen zwischen 5-20cm. Die Platten sind mit einer
100-250µm dicken Schicht der stationären Phase (=Partikel von 3-20µm
Durchmesser) beschichtet, wobei dieselben Materialien verwendet werden wie bei der
Säulenchromatographie. Es sind also Normalphasen- und Umkehrphasen DCExperimente möglich.
Die Anzahl theoretischer Böden beträgt für Hochleistungs-DC-Platten 10’00015’000/10cm.
3.6.2 Ein DC-Experiment
Die Analyten werden als Lösung an einem Ende der Platte in einem möglichst kleinen
Tropfen aufgetragen, wobei viele verschiedene Proben gleichzeitig aufgetragen
werden können. Nach verdampfen des Lösungsmittels wird die Platte in die
Entwicklungskammer gestellt und somit in die mobile Phase getaucht.
Wanderrichtung
der mobilen Phase
und Probe
Entwicklungskammer
DC-Platte
Probe zu Beginn
des Experiments
mobile
Phase
62
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
Durch Kapillarkräfte wandert die mobile Phase gleichmässig der Platte entlang hoch
und trennt dabei die Substanzen im Probengemisch, die unterschiedlich schnell mit
dem Lösungsmittel mitwandern. Das Experiment wird beendet, indem die Platte aus
der Entwicklungskammer genommen und getrocknet wird.
DC-Platte nach der Auftrennung von 2 Proben und einem Standard:
aufgetrennte
Substanzen
Standard
Probe 1
Probe 2
Startlinie
Lösungsmittelfront
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Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
3.6.3 2D - DC
Mobile Phase 1
Oft wird keine gute Trennung bei einem DC mit nur einem Laufmittel erreicht. Wird
nach der Entwicklung die DC-Platte getrocknet, kann man eine zweite Entwicklung
mit einer mobilen Phase anderer Polarität durchführen und somit eine verbesserte
Trennung erzielen. Führt man die zweite Entwicklung in 90 Grad gedrehter
Laufrichtung durch spricht man von 2D-DC, die vergleichbar ist mit der
Gradientenelution.
Startpunkt
mobile Phase 2
3.6.4 Detektion
Der mobilen Phase kann eine fluoreszierende Substanz beigegeben werden. Nach
Ende des Experiments wird die DC-Platte im UV-Licht beobachtet und an Stellen, wo
sich ein Analyt befindet ist die Fluoreszenz des Laufmittels verringert.
Eine weitere sehr einfache und generelle Methode zum Sichtbarmachen von
Substanzen auf einer DC-Platte ist das Besprühen der Platte nach dem
Chromatographie-Experiment mit Schwefelsäure/Salpetersäure. Nach erhitzen auf
110-120°C für weinige Minuten werden fast alle organischen Substanzen oxidiert und
sind als braun/schwarze Flecken sichtbar.
Die Proben können nach Ermittlung ihrer Position auf der Platte weiter analysiert
werden, indem sie z.B. von der Platte gekratzt werden und mit MS, NMR oder IR
weiter analysiert werden. Mit Laser-Desorptionsmethoden (kombiniert mit MS) oder
Sekundärionen-MS (SIMS) kann die Platte auch direkt beprobt werden.
Alle Gleichungen zur quantitativen Charakterisierungen des Chromatogramms, die in
Kapitel 1 besprochen wurden, können auch auf DC-Experimente angewendet werden,
wobei die Retentionszeiten (aus der Säulenchromatographie) durch Entfernungen von
der Startlinie (der DC) ersetzt werden.

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