F - Die DPG

EpiLogic GmbH
Analyse der Genexpression von
Kandidatengenen der metabolischen
Resistenz in Ackerfuchsschwanz
Michael U. Höfer - RLP AgroScience GmbH, AlPlanta, Breitenweg 71, 67435 Neustadt a.d.
Weinstrasse
&
Friedrich Felsenstein - EpiLogic GmbH, Hohenbachernstraße 19-21, 85354 Freising
&
Jan Petersen, Maria Rosenhauer Fachhochschule Bingen, Berlinstraße 109, 55411 Bingen am Rhein
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Ziel: Identifizierung von Kandidatengenen der metabolische
Resistenz in Acker-Fuchsschwanz (ALOMY).
Arbeitshypothese
• Gene, die zur metabolischen Resistenz beitragen, folgen einem
Mendel´schen Vererbungsschema (dominant/rezessiv).
• Metabolische Resistenz ist eine oligo- bis polygene Eigenschaft.
• Unterschiedliche Kombinationen dieser Gene - aus einem Pool an
potentiellen Kandidaten - können verschiedene metabolische
Resistenzmuster in ALOMY-Populationen hervorrufen.
• Mutationen, die zu metabolischer Resistenz führen, resultieren in
erhöhten mRNA-Expressionsspiegeln der zugehörigen Gene in
resistenten ALOMY-Populationen.
• Durch Vergleich der Genexpression in Wildtyp und resistenten ALOMYPopulationen können solche Kandidatengene identifiziert werden.
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Experimentelle Strategie – „Transcriptomics“
1. Bestimmen der Genexpression in 6 ausgewählten resistenten
ALOMY-Populationen und in einem repräsentativen Pool
sensitiver WT-Pflanzen mit NextGen-Sequenzierung.
2. Identifizieren der Gene durch Kartierung der (Teil-)Sequenzen
gegen ein Referenz-Transkriptom.
3. Quantifizierung und Vergleich der Genexpressionsstärke in
resistenten und Wildtyp-Proben, um differentiell exprimierte
Kandidatengene zu identifizieren.
4. Verifizierung der Genexpression mithilfe von qPCR in den
Ausgangspopulationen.
5. Validierung der Genexpression an weiteren resistenten und
sensitiven ALOMY-Pflanzen (BSA und Einzelpflanzen).
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F0-Populationen
R1 – R6
PLZ
Ort
2006
601
29451
Dannenberg/Elbe
2006
ST44
78667
Villingendorf
2007
710
59229
Ahlen/Westfalen
2007
ST26
97837
Erlenbach
2009
Elbe
21737
Wischhafen/Elbe
2009
9509
31036
Deinsen
Popul.
601
Elbe
710
9509
ST44
ST26
sen
K3
2
2.6
1.1
1.2
0.9
1
1
N
2.2
2.8
1.8
1.1
0.8
1.2
1
B
2.6
19.1
6
1.1
1.2
1.8
1
A
10.8
> 20
6.8
1.3
2.1
2.8
1
A
11.4
27.4
14.3
1.9
1.9
2.8
1
WT-Pool
Selektion
Ralon Super
Atlantis
Atlantis
Ralon Super
oto
lur
on
Ralon Super
Ralon Super
Ralon Super
R1 = 601
R2 = Elbe
R3 = 710
R4 = 9509
R5 = ST44
R6 = ST26
WT 1-30
Cl
or
Fl u
RF (50)
MACE-Code
R1
R2
R3
R4
R5
R6
WT
Pr
os
ul f
oc
arb
Me
s
Iod os u
os lfur
ulf on
ur
on
Fe
no
xa
pr
op
-P
- et
hy
Pin
l
ox
ad
en
Bezeichnung
fen
ac
et
Jahr
C2
15.6
9.5
13.9
5.1
7.1
8.4
1
N
15
9
13
6
6
7
72 (30)
F0
Ausschluß von bekannten TSR
Genexpressionsanalyse
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Genexpression in F0-Populationen
• MACE = Massive Analyse von
cDNA-Enden
• Kostengünstiger als RNASeq
wegen geringerem
Sequenzieraufwand
• Nur die 3´-Enden der mRNAs
werden erfasst
• Referenz(Transkriptom)
benötigt, um die 3´-“reads“ ihren
Genen zuzuordnen
Illumina
Hiseq2000
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Genexpression in F0-Populationen - MACE
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Genexpression in F0-Populationen - qPCR
Kandidaten, die in Metabolisierung involviert sein können
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Verifizierung der Genexpression
Zwischenfazit:
Es finden sich (mehr als genügend) Kandidatengene, die
differentiell zwischen den 6 resistenten und sensitiven ALOMYPools exprimiert werden.
Frage:
Welche Gene sind für eine metabolische Resistenz relevant (d.h.
Ausschluß bzw. Minimierung zufälliger Übereinstimmungen)
Möglichkeit:
Überprüfung der differentiellen Genexpression in F2Nachkommen einer Kreuzung resistenter F0-Pflanze x sensitiver
WT und Vergleich mit dem Expressionmuster der Eltern:
1) BSA-MACE sog. „bulked segregant“-Analyse von F2-Pools
2) Validierung an F2-Einzelpflanzen mit qPCR
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ALOMY BSA-Material
h
et
RF (50)
MACE-Code
R1
R2
R3
R4
R5
R6
WT
F
biotype
601
Elbe
710
9509
ST44
ST26
sen
lu
n
fe
a
t
ce
K3
2
2,6
1,1
1,2
0,9
1
1
su
ro
P
o
lf
N
2,2
2,8
1,8
1,1
0,8
1,2
1
rb
ca
yl
n
-P
p
ro ron
u
ro
en
lf lfu
p
d
a
a
su su
x
x
o o
o
o
es od
in
en
M I
F
P
C
B
2,6
19,1
6
1,1
1,2
1,8
1
C2
15,6
9,5
13,9
5,1
7,1
8,4
1
A
10,8
> 20
6,8
1,3
2,1
2,8
1
A
11,4
27,4
14,3
1,9
1,9
2,8
1
lo
ro
to
n
ro
ul
MACE
R
WT
F
0
X
MACE
F
1
Selection
1
X
WT
Expression - Analyse
sensitive bulk
F2*
Cloning 7x
2-7
BSA-MACE=>
601 & Elbe
resistant bulk
MACE
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+ 6 Herbizide => Segregations - Analyse
F
2
BSA-MACE – separate Normalisierung
absolute Expression
relative Expression
MACE-Daten von Eltern und F2-BSAs => unterschiedliche Umweltbedingungen
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BSA-MACE Referenzgene
Referenzen aus F0-Populationen
Optimierte Referenzen: F0 & BSA-F2
19.9%
46.1%
AlPlanta
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9.7%
Validierung mit Ref-Finder
http://www.leonxie.com/referencegene
.php
5.9%
MACE – BSA
• Aussortieren von Falsch-Positiven:
• Fokus auf “hoch-reguliert”
• Unterschiede in den Eltern (R vs. WT)
werden in F2-Pools gering
• Unterschiede kehren sich um
normalized expression ratio (rpm)
MACE - sarcosine oxidase
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
R1
R2
WT
bR1-R bR1-S bR2aR
bR2- bR2-B bR2-S
bR
• Auswahl von Kandidaten = Unterschiede in den Eltern und in den F2-Pools
zeigen die gleichen Tendenzen & Validierung über qPCR
• Auswahl von => 8 Kandidatengenen für die Einzelpflanzen-Analyse
AlPlanta
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qPCR an F2-Einzelpflanzen
601C (R1)
Elbe (R2)
710 (R3)
9509 (R4)
ST44 (R5)
ST26A (R6)
Σ=
RNA
cDNA-A
TR1
TR2
cDNA-B
TR3
TR4
26
25
63
39
30
47
230
Kandidatengene
Target
Target 1
Target 2
Target 3
Target 4
Target 5
Target 6
Target 7
Target 8
Referenz-Gene
Target
qPCR-Expressionsanalyse
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R1-R6
AM35176
4
AM27552 3´-UTR ?
8
contig36065 rev comp
6
AM4_comp38034&comp19433 consensus
3
245-1137
Contig46120
1
Contig35803
5
Contig35530
7
Ubiquitin (Petit et al)
2
Bsp. qPCR – ALOMY 601C (R1) – F2-Einzelpflanzen
?
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Σ-qPCR – ALOMY 601C (R1) – F2-Einzelpflanzen
Kandidatengene
Target
Target 1
Target 2
Target 3
Target 4
Target 5
Target 6
Target 7
Target 8
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Kombination
X
X
X
Bsp. qPCR – ALOMY Elbe (R2) – F2-Einzelpflanzen
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Σ-qPCR – ALOMY Elbe (R2) – F2-Einzelpflanzen
Kandidatengene
Target
Target 1
Target 2
Target 3
Target 4
Target 5
Target 6
Target 7
Target 8
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Kombination
X
X
X
X
X
Bsp. qPCR – ALOMY 9509 (R4) – F2-Einzelpflanzen
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Σ-qPCR – ALOMY 9509 (R4) – F2-Einzelpflanzen
Kandidatengene
Target
Target 1
Target 2
Target 3
Target 4
Target 5
Target 6
Target 7
Target 8
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Kombination
X
X
X
X
qPCR - F2-Einzelpflanzen - Zusammenfassung I
ANOVA, Alpha = 0,01 - alle resistenten F2 vs. alle sensitiven F2
Population
601C (R1)
Elbe (R2)
710 (R3)
9509 (R4)
ST44 (R5)
ST44 (R5)opt
ST26 (R6) opt
ST26 (R6) opt RS
ST26 (R6) TR
R vs. S
601C (R1)
Elbe (R2)
710 (R3)
9509 (R4)
ST44 (R5)
ST44 (R5)opt
ST26 (R6) opt RS
ST26 (R6) TR
AlPlanta
Target 1
nein
√
nein
√
√
√
√
√
n.d.
Target 1
nein
nein
nein
nein
nein
nein
nein
√
© Dr. M.Höfer 02/2015
Target 2
nein
nein
nein
√
nein
nein
nein
√
n.d.
Target 3
√
√
√
√
nein
nein
√
nein
n.d.
Target 4
√
nein
nein
√
nein
nein
nein
nein
n.d.
Target 5
nein
√
nein
√
nein
nein
n.d.
nein
n.d.
Target 6
√
√
√
√
nein
nein
n.d.
√
n.d.
Target 7
nein
√
nein
√
nein
nein
n.d.
nein
n.d.
Target 8
√
√
nein
√
√
√
n.d.
√
n.d.
100% Trennung - alle resistenten F2 vs. alle sensitiven F2
Target 2
Target 3
Target 4
Target 5
Target 6
nein
?
nein
nein
nein
nein
√
√
√
√
nein
nein
nein
nein
nein
√
√
nein
√
√
?
nein
nein
nein
nein
√
nein
nein
nein
√
nein
nein
nein
nein
nein
√
√
nein
nein
√
Target 7
nein
√
nein
nein
nein
nein
nein
nein
Target 8
nein
√
nein
nein
nein
nein
nein
√
qPCR - F2-Einzelpflanzen - Zusammenfassung II
Target 1
X
Target 2
X
601C (R1)
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Elbe (R2)
710 (R3)
9509 (R4)
ST44 (R5)
ST44 (R5) opt
ST26 (R6) opt RS
ST26 (R6) TR
X
X
X
X
X
X
Target 3
X
X
X
X
X
X
Target 4
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Target 5
X
X
Target 7
X
X
X
X
X
X
X
Target 6
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Target 8
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
R vs. S
nein
nein
√
√
√
√
√
nein
√
√
nein
√
nein
√
nein
nein
√
ANOVA
Alpha = 0,001
P-Wert
n.d.
n.d.
5.54089E-06
8.93428E-06
7.18988E-05
6.07126E-06
8.71558E-06
n.d.
1.31151E-12
5.26359E-14
0.00359
0.00275
n.d.
0.03492
n.d.
n.d.
0.03716
Pearson
0.651
0.799
0.730
0.717
0.756
0.800
0.823
0.726
0.823
0.794
0.515
0.528
Herbizid/e
F
F&P
F&P
F&P
F
F
F
F & P & M+I
F
F
F & P & M+I & C
F & P & M+I & C
0.431
F & P & M+I & C
0.591
P
Es wurden Kandidatengene identifiziert, die
a) eine - qualitative - Trennung in resistente und sensitive F2-Pflanzen
ermöglichen
b) Die dafür benötigte Kombination der Gene scheint Genotyp-abhängig
c) Die Liste der Kandidaten dürfte unvollständig sein
d) Eine mathematische Analyse/Modellierung der Daten zur qualitativen
Korrelation (Gendosis vs.Phänotyp/Herbizid) steht noch aus
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015
Danke für Ihre Aufmerksamkeit
und Dank an
- Alexandra Baßler (AlPlanta, RNA-Präps)
- Carsten-Gerrit Schulz (FH-Bingen, qPCR)
- Elsa Reck (FH-Mannheim, qPCR)
AlPlanta
© Dr. M.Höfer 02/2015

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